EA031453B1 - Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины анкара (mva) и его применение - Google Patents

Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины анкара (mva) и его применение Download PDF

Info

Publication number
EA031453B1
EA031453B1 EA201590304A EA201590304A EA031453B1 EA 031453 B1 EA031453 B1 EA 031453B1 EA 201590304 A EA201590304 A EA 201590304A EA 201590304 A EA201590304 A EA 201590304A EA 031453 B1 EA031453 B1 EA 031453B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
rsv
mva
seq
antigenic determinant
protein
Prior art date
Application number
EA201590304A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201590304A1 (ru
Inventor
Цедрик Кеминай
Робин Штайгервальд
Пол Чаплин
Original Assignee
Бавариан Нордик А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Бавариан Нордик А/С filed Critical Бавариан Нордик А/С
Publication of EA201590304A1 publication Critical patent/EA201590304A1/ru
Publication of EA031453B1 publication Critical patent/EA031453B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/863—Poxviral vectors, e.g. entomopoxvirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A61K39/285—Vaccinia virus or variola virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/065—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • C07K14/07—Vaccinia virus; Variola virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24142—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector virus or viral particle as vehicle, e.g. encapsulating small organic molecule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18571—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к новому штамму рекомбинантного модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA), используемому в качестве вакцины против инфекции, вызванной респираторно-синцитиальным вирусом (вирус RSV). В частности, изобретение относится к генно-инженерному рекомбинантному MVA, содержащему по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенную детерминанту мембранного гликопротеина F RSV и по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую матриксный белок М2 RSV. Изобретение также относится к композиции и способам, которые пригодны для воздействия на иммунный ответ у субъекта или пригодны для диагностики инфекции, вызванной RSV, а также для определения того, имеется ли опасность рецидива инфекции, вызванной RSV, у субъекта.

Description

Изобретение относится к новому штамму рекомбинантного модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA), используемому в качестве вакцины против инфекции, вызванной респираторно-синцитиальным вирусом (вирус RSV). В частности, изобретение относится к генно-инженерному рекомбинантному MVA, содержащему по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенную детерминанту мембранного гликопротеина F RSV и по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую матриксный белок М2 RSV. Изобретение также относится к композиции и способам, которые пригодны для воздействия на иммунный ответ у субъекта или пригодны для диагностики инфекции, вызванной RSV, а также для определения того, имеется ли опасность рецидива инфекции, вызванной RSV, у субъекта.
Область техники
Настоящее изобретение относится к рекомбинантному модифицированному вирусу осповакцины Анкара (вирус MVA) в качестве улучшенной вакцины против инфекции респираторно-синцитиального вируса (вирус RSV) и связанных с ним продуктов, способов и применений. В частности, настоящее изобретение относится к генно-инженерному рекомбинантному вектору MVA, содержащему по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенную детерминанту мембранного гликопротеина RSV, и по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенную детерминанту нуклеокапсидного белка RSV. Изобретение также относится к продуктам, способам и их применениям, например, пригодным для воздействия на иммунный ответ у субъекта или пригодным для диагностики инфекции RSV, а также для определения того, имеется ли опасность рецидива инфекции RSV у субъекта.
Уровень техники
RSV является важным респираторным патогеном. Острая инфекция нижних дыхательных путей (LRT) вызывает значительную заболеваемость и смертность среди новорожденных и детей в возрасте до 5 лет во всем мире [A.M. Aliyu et al. (2010), Bayero J. Pure Appl. Sci. 3(1):147-155]. RSV представляет собой наиболее клинически важную причину инфекции нижних дыхательных путей (LRT); первичное инфицирование RSV обычно возникает к 2 годам [W.P. Glezen (1987), Ped. Virol. 2:1-4; Y. Murata (2009), Clin. Lab. Med. 29(4):725-739]. Поскольку первичная инфекция RSV не вызывает полный иммунитет к RSV, частые повторные инфекции случаются на протяжении всей жизни, с наиболее тяжелыми инфекциями, развивающимися у очень молодых, очень пожилых пациентов и у пациентов любого возраста с ослабленным иммунитетом [Y. Murata (2009)].
У 40% людей, инфицированных RSV, в конечном итоге развиваются серьезные заболевания LRT, требующие госпитализации, с тяжестью и интенсивностью заболевания, зависящих от величины и интенсивности инфекции и ответа организма [Aliyu et al. (2010)]. RSV также может вызвать серьезную болезнь нижних дыхательных путей у пациентов любого возраста, угрожающую иммунной, дыхательной или сердечной системам, а также может предрасполагать детей к развитию астмы в дальнейшем. В одних только Соединенных Штатах RSV является причиной 126000 госпитализаций и 300 случаев смерти детей в год [Y. Murata (2009)]. Кроме того, RSV составляет более 80000 госпитализаций и более чем 13000 случаев смерти в зимний период среди пожилых пациентов и пациентов с базовыми сердечно-легочными или иммуносупрессивными состояниями [Y. Murata (2009)]. Несмотря на важность RSV в качестве респираторного патогена, на рынке в настоящее время нет безопасной и эффективной вакцины от RSV.
RSV является оболочечным РНК вирусом из семейства Paramyxoviridae, подсемейства Pneumovirinae [Aliyu et al. (2010)]. Каждый вирион RSV содержит несегментированную, отрицательнополярную, одноцепочечную молекулу РНК из приблизительно 15191 нуклеотидов, содержащую десять генов, кодирующих одиннадцать отдельных белков (М2 содержит две открытые рамки считывания), в том числе восемь структурных (G, F, SH, M1, N, Р, М2.1 и L) и три неструктурных белка (NS1, NS2 и М2.2) [Y. Murata (2009)]. Геном транскрибируется последовательно от NS1 к L в следующем порядке: 3'-NS1-NS2-N-P-M1-SH-G-F-M2.1-М2.2-L-5'. Оболочка вируса содержит три трансмембранных гликопротеина (гликопротеин прикрепления (G), гликопротеин слияния (F) и небольшой гидрофобный белок (SH)), а также матриксный белок (M1) [Y. Murata (2009)]. Во время репликации вирус RSV сначала прикрепляется к клетке-мишени в процессе, опосредованном сильногликозилированным белком G. Затем вирус сливается с клеткой-хозяином в процессе, опосредованном белком F, благодаря чему проникает через клеточную мембрану и поступает в клетку-хозяин; белок F также необходим для формирования синцитиев, характерных для RSV-инфицированных клеток. Процессы прикрепления и слияния дополняются белком SH. Белок M1 регулирует сборку зрелого RSV, взаимодействуя с белками оболочки F и G и с нуклеокапсидными белками N, Р и М2.1 (см. ниже). В оболочке вирусная РНК заключается в капсид с помощью транскриптазного комплекса, состоящего из нуклеокапсидного белка (N), фосфопротеина (Р), фактора элонгации транскрипции (М2.1) и белков РНК-полимеразы (L) [Y. Murata (2009)]. N ассоциируется с геномной РНК, а Р представляет собой кофактор L, вирусную РНК-полимеразу. М2.1 является фактором элонгации, необходимым для вирусной транскрипции, а М2.2 регулирует транскрипцию вирусного генома. Наконец, NS1 и NS2 ингибируют тип I активности интерферона.
Клинические изоляты RSV классифицируются в соответствии с антигенной группой (А или В) и, в свою очередь, подразделяются на несколько генотипов (например, А2 или ALong для группы А и B1, CH-18537 или 8/60 для группы В), исходя из генетической изменчивости в вирусном геноме каждой антигенной группы [Y. Murata (2009)]. Классификация основана на способности вирусов реагировать с моноклональными антителами, направленными против гликопротеина прикрепления (белка G), и на основании различных генетических анализов. [М. Sato et al., J. Clin. Microbiol. 43(1):36-40 (2005)]. Среди вирусных изолятов некоторые RSV-закодированные белки являются высококонсервативными на уровне аминокислотной последовательности (например, F), в то время как другие широко варьируют (например, G) между и внутри двух основных антигенных групп [Y. Murata (2009)]. Белки F из групп А и В разделяют изрядную гомологию. В отличие от этого, белок G значительно отличается между двумя антигенными группами.
- 1 031453
Белок G является наиболее вариабельным белком RSV с его гипервариабельной С-концевой областью, отвечающей за большинство штаммоспецифических эпитопов. Молекулярная эпидемиология и эволюционные закономерности G белка предоставили важную информацию о клинических и эпидемиологических особенностях RSV. Обычно несколько различных генотипов циркулируют сразу, а тот, который преобладает в обществе, может меняться каждый год. Тем не менее, значение штаммового разнообразия для клинических и эпидемиологических особенностей RSV остается плохо изученным. По этой причине рекомбинантные белки RSV сопровождаются штаммовым обозначением для указания оригинального штамма RSV, из которого ген или белок были клонированы. Например, клонированный белок G из штамма ALong RSV обозначается G(ALong), RSV ALong G или RSV ALong G-белок.
RSV стимулирует различные иммунные ответы у инфицированных хозяев, в том числе секрецию хемокинов и цитокинов, выработку нейтрализующих гуморальных и мукозальных антител, выработку CD4+ (например, Th1 и Th2) и CD8+ (например, CTL) Т-клеток. Такие иммунные реакции хозяев в значительной степени ответственны за клинические проявления инфекции RSV, поскольку вирус вызывает ограниченную клеточную цитопатологию in vivo [Y. Murata (2009)]. Фенотипические проявления и тяжесть RSV-индуцированного заболевания, по-видимому, опосредуются балансом и взаимодействием в диапазоне иммунных реакций, стимулированных инфекцией RSV [Y. Murata (2009)].
Многие предыдущие исследования показывают, что клеточные и гуморальные иммунные реакции играют различные роли в индукции иммунитета к RSV и в разрешении инфекции RSV, а также в прогрессировании заболевания [Y. Murata (2009) и ссылки в нем]. Например, исследования с гуманизированным антителом к F показало, что в то время как антитела к RSV являются достаточными для предотвращения или ограничения тяжести инфекции, они не требуются для устранения вирусной инфекции [Y. Murata (2009); A.F.G. Antonis et al. (2007), Vaccine, 25:4818-4827]. В отличие от этого, Т-клеточные ответы нужны для устранения установленных инфекций RSV [Y. Murata (2009)]. Индуцированный RSV Т-клеточный ответ также играет ключевую роль в легочной патологии во время инфекции. Например, интерферон-γ (ШЛу)-секретирующие ТН1 клетки с ассоциированным CD8+ CTL-ответом или без него устраняют RSV с минимальной легочной патологией, тогда как интерлейкин 4 (ГБ-4)-секретирующие ТН2 клетки также устраняют RSV, но часто сопровождаются значительными легочными изменениями, включая эозинофильную инфильтрацию, представляющую собой отличительную черту усиленной болезни, наблюдаемой во время предыдущих испытаний вакцины (смотри ниже).
Несмотря на обилие информации, имеющейся в отношении иммунологии, вирусологии, физиологии инфекции RSV, однако, остается неясным, какого рода иммунный ответ, вероятно, будет наиболее эффективным для индуцирования длительного иммунитета, а также не будет вызывать усиленную болезнь после вакцинации против RSV, как описано более подробно в следующих разделах.
Предыдущие исследования по разработке вакцин.
Вакцины обычно используют одну из нескольких стратегий, чтобы вызвать защитный иммунитет против инфекционного агента-мишени или патогена (например, вируса, бактерии или паразита), включая (1) инактивированные патогенные препараты; (2) живые ослабленные патогенные препараты, включая генетически ослабленные патогенные штаммы; (3) очищенные белковые субъединичные вакцинные препараты; (4) вакцины на основе вирусных векторов, кодирующих патогенные антигены и/или адъюванты; и (5) вакцины на основе ДНК, кодирующей патогенные антигены.
Первоначальные усилия в области разработки вакцин RSV были ориентированы на инактивированный препарат вируса, пока в США в течение 1960-х гг. не были проведены клинические испытания, тестирующие эффективность инактивированной формалином вакцины RSV (FI-RSV) с катастрофическими результатами [M.R. Olson & S.M. Varga (2007), J. Immunol. 179:5415-5424]. У значительного количества вакцинированных пациентов развилась усиленная легочная болезнь, характеризующаяся эозинофильными и нейтрофильными инфильтрациями и существенными воспалительными реакциями после природной инфекции RSV [Olson & Varga (2007), Blanco J.C. et al. (2010), Hum Vaccin, 6:482-92]. Многие из этих пациентов нуждались в госпитализации, и несколько тяжелобольных пациентов умерли. Поэтому исследователи начали искать вирусные и/или хозяйские факторы, способствующие развитию усиленного заболевания после заражения, с целью разработки более безопасной вакцины RSV. Этот поиск дал много новой информации о биологии RSV и широком спектре иммунных ответов, которые он может индуцировать, но безопасная и эффективная вакцина RSV остается неуловимой.
После FI-RSV усилия по разработке вакцин в значительной степени были сосредоточены на одноантигенных вакцинах, использующих G, F и, в меньшей степени, N или М2, с вирусными антигенами, доставляемыми вирусными или плазмидными ДНК-векторами, экспрессирующими вирусные гены, или в виде очищенных белков. [См., например, W. Olszewska et al. (2004), Vaccine, 23:215-221; G. Taylor et al. (1997), J. Gen. Virol. 78:3195-3206 и L.S. Wyatt et al. (2000), Vaccine 18:392-397]. Вакцинация комбинацией F+G также тестировалась на телятах, хлопковых хомяках и мышах BALB/c с переменными результатами [Antonis et al. (2007) (телята); В. Moss, патентная заявка США № 06/849,299 (the '299 application), поданная 8 апреля 1986 г. (хлопковые хомяки); и L.S. Wyatt et al. (2000) (мыши BALB/c)]. F и G были иммуногенными у телят, мышей, хлопковых хомяков, людей и, по меньшей мере, в некоторой степени у новорожденных макак [A.F.G. Antonis et al. (2007) (телята); В. Moss, the '299 application (хлопковые хо
- 2 031453 мяки); L. de Waal et al. (2004), Vaccine, 22:923-926 (новорожденные макаки); L.S. Wyatt et al. (2000) (мыши BALB/c); Y. Murata (2009) (люди)].
При этом, однако, характер и тип иммунного ответа, индуцированного кандидатами RSV-вакцин, варьируют - часто весьма существенно - в зависимости от типа используемой вакцины, выбранных антигенов, пути введения и даже используемого модельного организма. Например, иммунизация живым RSV или реплицирующими векторами, кодирующими белок F RSV, индуцирует доминантную реакцию ТН1, сопровождающуюся продуцированием нейтрализующих антител к F и CD8+ CTL, ассоциированных с минимальной легочной патологией при поствакцинальном вирусном заражении [Y. Murata (2009) и ссылки в ней]. В отличие от этого, иммунизация FI-инактивированным препаратом RSV вызывает доминантную реакцию ТН2, полностью лишенную реакции CD8+ CTL, которая вызывает увеличение патологических изменений в легких [Y. Murata (2009) и ссылки в ней]. Интересно, что введение белка G RSV в качестве очищенной субъединичной вакцины или в реплицирующемся векторе индуцирует доминирующую реакцию ТН2, в конечном счете продуцирующую эозинофильные легочные инфильтраты и гиперреактивность дыхательных путей после вирусного заражения после вакцинации, реакция очень похожа на усиленную болезнь, наблюдаемую с FI-RSV [Y. Murata (2009) и ссылки в ней]. Кроме того, в то время как вакцинация модифицированным вирусом осповакцины Анкара (MVA), кодирующим белок F RSV, индуцировала антитела к F и F-специфические CD8+ Т-клетки у телят, вакцинация MVA-F + MVA-G индуцировала антитела к F и G, но не F- или G-специфичные CD8+ Т-клетки [A.F.G. Antonis et al. (2007)].
Вакцинация мышей вирусом осповакцины (W), экспрессирующим белок Р (W-F), индуцировала сильный ответ CD8+ Т-клеток, который приводил к клиренсу реплицирующего RSV из легких и сопровождался такой же или большей потере веса, чем у мышей, иммунизированных FI-RSV [W. Olszewska et al. (2004)]. Однако это не было связано с усиленной болезнью, вызванной FI-RSV или W, экспрессирующим белок G (W-G) (объединенные TH2 ответная эозинофилия легких и потеря веса), в результате повышения секреции TH2-цитокинов, таких как IL-4 и IL-5. Некоторые специалисты в данной области предположили, что у вакцины RSV, способной индуцировать относительно сбалансированный иммунный ответ, включая и клеточный, и гуморальный компонент, будет меньше шансов проявить расширенную иммунопатологию в ответ на поствакцинальное заражение [W. Olszewska et al. (2004)].
Однако, в то время как вакцинация мышей BALB/c модифицированным вирусом осповакцины Анкара (MVA), кодирующим F, G или F+G, индуцировала именно такую сбалансированную реакцию, включая гуморальную реакцию (т.е. сбалансированный ответ IgG1 и IgG2a) и реакцию TH1 (т.е. повышенные уровни ШЫу/интерлейкнна-12 (IL-12) и сниженные уровни интерлейкина-4 (ГЬ-4)/интерлейкина5 (IL-5)), вакцинированные животные, тем не менее, продолжали демонстрировать некоторую потерю веса [W. Olszewska et al. (2004)].
Несмотря на расширение значительных усилий, направленных на характеризацию природы и степени иммунных реакций, индуцированных разными вакцинными кандидатами в различных модельных системах, остается неясным, какого рода иммунная реакция требуется для передачи прочного и полного иммунитета к RSV без предрасположения реципиентов вакцины к усиленной болезни. Из-за явного дисбаланса между клинической значимостью RSV и доступными терапевтическими и профилактическими средствами разработка вакцины против RSV остается неудовлетворенной медицинской потребностью.
Описание
В то время как предыдущие неудачные попытки разработать RSV-вакцины сосредотачивались главным образом на вакцинации либо RSV-F, либо мембранным гликопротеином G RSV, либо обоими, авторы настоящего изобретения обнаружили, что вакцинация рекомбинантным вирусом осповакцины Анкара (MVA), экспрессирующим по меньшей мере одну антигенную детерминанту мембранного гликопротеина RSV и по меньшей мере одну антигенную детерминанту нуклеокапсидного белка RSV, индуцирует лучшую защиту. Кроме того, такие конструкции индуцируют почти полный стерильный иммунитет, когда применяются интраназально по сравнению с подкожным введением, или даже по сравнению с внутримышечным путем введения, использованным Wyatt и его коллегами [L.S. Wyatt et al. (2000)]. Усиленная защита может быть получена путем введения кандидатов RSV-вакцин интраназально по сравнению с внутримышечным введением.
При вакцинации рекомбинантными MVA, экспрессирующими мембранный гликопротеин RSV F или RSV G (или оба) (например, MVA-mBN199B), рекомбинантными MVA, экспрессирующими по меньшей мере одну антигенную детерминанту мембранного гликопротеина RSV и по меньшей мере одну антигенную детерминанту нуклеокапсидного белка RSV (например, MVA-mBN201B), авторы настоящего изобретения не наблюдали реплицирующегося RSV в легких в течение 4 дней после заражения, хотя геномы RSV еще обнаруживались с помощью RT-qPCR. Рекомбинантные MVA, экспрессирующие по меньшей мере одну антигенную детерминанту мембранного гликопротеина RSV и по меньшей мере одну антигенную детерминанту нуклеокапсидного белка RSV (например, MVA-mBN201B), индуцировали лучшую защиту и большее снижение вирусной нагрузки RSV, обнаруживаемой с помощью RT-qPCR, поскольку они вызывали сильную реакцию CD8+ Т-клеток против антигенной детерминанты нуклеокапсидного белка RSV. Введение таких рекомбинантных вирусов интраназальным путем, кроме того, индуцировало почти полный стерильный иммунитет (фактически отсутствовала RSV вирусная нагрузка, об
- 3 031453 наруживаемая RT-qPCR), потому что они индуцируют иммунный ответ слизистой оболочки и секрецию антител IgA - реакции, которые отсутствовали, когда такие конструкции вводили подкожно.
В отличие от FI-RSV, такие конструкты вызывают сбалансированный Thl-иммунный ответ, генерирующий хорошую реакцию антител, а также сильные, специфические клеточные иммунные ответы на антигены RSV. С интраназальным введением вакцины, продуцирующей уровни антител IgG даже выше, чем те, что получены в результате обычного подкожного введения, в дополнение к индукции хорошего ответа антител IgA, защита улучшается и уменьшается потеря массы тела. Однако величина клеточного иммунного ответа не зависит от пути введения. Интересно, что изобретатели наблюдали картину Т-клеточного ответа, индуцированного с помощью рекомбинантных MVA, экспрессирующих по меньшей мере одну гетерологичную последовательность нуклеотидов, кодирующую антигенную детерминанту мембранного гликопротеина RSV и по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенную детерминанту нуклеокапсидного белка RSV (например, MVAmBN201B, экспрессирующих белки F и G, Н и М2 RSV), который был похож на ответ Т-клеток, индуцированный введением RSV, хотя и гораздо выше.
Таким образом, в первом аспекте, настоящее изобретение предусматривает рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA), содержащий по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенную детерминанту мембранного гликопротеина RSV и по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенную детерминанту нуклеокапсидного белка RSV.
Модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA).
MVA был получен с помощью более чем 570 серийных пассажей на фибробластах куриных эмбрионов кожного штамма Анкара вируса осповакцины [хориоаллантоисный вакцинный вирус вируса осповакцины Анкара, CVA; для обзора см. Mayr et al. (1975), Infection 3, 6-14], который поддерживался в течение многих лет в Институте Вакцинации г. Анкара, Турция, и использовался для вакцинации людей. Однако, из-за зачастую серьезных поствакцинальных осложнений, связанных с коровьей оспой, было предпринято несколько попыток получения более ослабленной, безопасной вакцины против оспы.
В период с 1960 по 1974 гг., профессору Антону Майеру удалось ослабить CVA более чем 570 непрерывными пассажами в клетках CEF [Mayr et al. (1975)]. Как было показано в различных моделях на животных, полученный MVA был авирулентным [Mayr, А. & Danner, K. (1978), Dev. Biol. Stand. 41:225234]. Как часть раннего развития MVA в качестве предварительной противооспенной вакцины, были проведены клинические испытания с использованием MVA-517 в комбинации с Lister Elstree [Stickl (1974), Prev. Med. 3:97-101; Stickl and Hochstein-Mintzel (1971), Munich Med. Wochenschr. 113:1149-1153] у субъектов с риском неблагоприятных реакций от коровьей оспы. В 1976 г. MVA, полученный из семенного материала MVA-571 (что соответствует 571-му пассажу), был зарегистрирован в Германии в качестве праймер-вакцины в программе двухступенчатой парентеральной вакцинации против оспы. Впоследствии MVA-572 был использован у приблизительно 120000 лиц кавказской национальности, в большинстве у детей в возрасте от 1 до 3 лет, без сообщения о тяжелых побочных эффектах, хотя многие из субъектов были из популяции с высоким риском развития осложнений, связанных с коровьей оспой (Mayr et al. (1978), Zentralbl. Bacteriol. (В) 167:375-390). MVA-572 был депонирован в Европейской коллекции культур клеток животных как ЕСАСС V94012707.
В результате пассирования, используемого для ослабления MVA, имеется целый ряд различных штаммов или изолятов, в зависимости от числа пассажей в клетках CEF. Например, MVA-572 был использован в Германии во время программы ликвидации оспы, а MVA-575 широко используется в качестве ветеринарной вакцины. MVA-575 был передан на хранение 7 декабря 2000 г. в Европейскую коллекцию культур клеток животных (ЕСАСС) под депозитным номером V00120707. Ослабленный CVA-вирус MVA (модифицированный вирус осповакцины Анкара) был получен путем последовательного культивирования (более 570 пассажей) CVA на первичных фибробластах куриных эмбрионов.
Несмотря на то что Mayr и др. продемонстрировали в 1970-х гг., что MVA сильно ослаблен и авирулентен для человека и млекопитающих, некоторые исследователи сообщили, что MVA не полностью ослаблен в клеточных линиях млекопитающих и человека, поскольку может произойти остаточная репликация в этих клетках [Blanchard et al. (1998), J. Gen. Virol. 79:1159-1167; Carroll & Moss (1997), Virology, 238:198-211; патент США № 5185146; Ambrosini et al. (1999), J. Neurosci. Res. 55:569]. Предполагается, что результаты, представленные в этих публикациях, были получены с различными известными штаммами MVA, поскольку используемые вирусы существенно отличаются по своим свойствам, в частности, по их характеру роста в различных клеточных линиях. Такая остаточная репликация нежелательна по разным причинам, включая проблемы безопасности в связи с использованием у людей.
Штаммы MVA, имеющие повышенные профили безопасности для разработки более безопасных продуктов, таких как вакцины или лекарственные препараты, были разработаны Bavarian Nordic: MVA дополнительно пассировался Bavarian Nordic и назван MVA-BN. Вирусу MVA, так же как и MVA-BN, не хватает примерно 15% (31 т.н. из шести областей) генома по сравнению с предковым вирусом CVA. Делеции влияют на целый ряд вирулентности и круг генов-хозяев, а также на ген типа А телец включения. Образец MVA-BN, соответствующий пассажу 583, был депонирован 30 августа 2000 г. в Европейской
- 4 031453 коллекции клеточных культур (ЕСАСС) под регистрационным номером V00083008.
MVA-BN может прикрепляться и входить в человеческие клетки, где вирусно-кодированные гены экспрессируются очень эффективно. Однако, сборка и высвобождение потомства вируса не происходит. MVA-BN сильно адаптирован к клеткам первичных фибробластов куриного эмбриона (CEF) и не реплицируется в клетках человека. В клетках человека вирусные гены экспрессируются, а инфекционный вирус не продуцируется. MVA-BN классифицируется как организм уровня 1 биологической безопасности по данным Центров по контролю и профилактике заболеваний в США. Препараты MVA-BN и его производные были введены многим видам животных, а также более 2000 человеческих субъектов, в том числе людям с дефективной иммунной системой. Все вакцинации оказались безопасными и хорошо переносимыми. Несмотря на высокое истощение и сниженную вирулентность, в доклинических исследованиях MVA-BN, как было показано, вызывал как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ на вирус осповакцины и гетерологичные генные продукты, кодируемые генами, клонированными в геном MVA [E. Harrer et al. (2005), Antivir. Ther. 10 (2):285-300; A. Cosma et al. (2003), Vaccine 22(1):21-9; M. Di Nicola et al. (2003), Hum. Gene Ther. 14 (14):1347-1360; M. Di Nicola et al. (2004), Clin. Cancer Res., 10 (16):53815390].
Производные или варианты MVA относятся к вирусам, обладающим, по существу, теми же характеристиками репликаций, что и MVA, как описано в данном документе, но проявляющим различия в одной или более частей своих геномов. MVA-BN, так же как и производные или варианты MVA-BN, не в состоянии репродуктивно реплицироваться in vivo у людей и мышей, даже при сильно угнетенной иммунной системе мышей. В частности, MVA-BN или производное или вариант MVA-BN также обладают предпочтительной способностью репродуктивно реплицироваться в фибробластах куриных эмбрионов (CEF), но не способны к репродуктивной репликации в человеческой линии кератиноцитов НаСаТ [Boukamp et al. (1988), J. Cell Biol. 106:761-771], клеточной линии костной остеосаркомы человека 143В (ЕСАСС No. 91112502), клеточной линии почки эмбриона человека 293 (ЕСАСС No. 85120602) и клеточной линии HeLa цервикальной аденокарциномы человека (АТСС No. CCL-2). Кроме того, производные или варианты MVA-BN имеют степень амплификации вируса по меньшей мере в два раза меньше, а в основном в три раза меньше, чем MVA-575 в клетках HeLa и клеточных линиях НаСаТ. Тесты и анализ этих свойств вариантов MVA описаны в WO 02/42480 (США 2003/0206926) и WO 03/048184 (US 2006/0159699), обе включены в данное описание путем ссылки.
Амплификацию и репликацию вируса обычно выражают в виде отношения вируса, продуцированного из инфицированной клетки (выход), к количеству вируса, первоначально использованному для инфицирования клетки в первую очередь (затраты), названное степенью амплификации. Степень амплификации 1 определяет состояние амплификации, когда количество вируса, полученного из инфицированных клеток, такое же, как количество, первоначально использованное для инфицирования клеток, это означает, что инфицированные клетки являются пермиссивными для вирусной инфекции и воспроизведения. В отличие от этого степень амплификации меньше чем 1, т.е. снижение объемов производства по сравнению с уровнем затрат, указывает на отсутствие репродуктивной репликации и, следовательно, ослабление вируса.
Преимущества вакцины на основе MVA включают их профиль безопасности, а также доступность для крупномасштабного производства вакцины. Доклинические исследования показали, что MVA-BN демонстрирует превосходную аттенуацию и эффективность по сравнению с другими штаммами MVA (WO 02/42480). Дополнительным свойством штаммов MVA-BN является способность индуцировать существенно такой же уровень иммунитета при прайм-режиме вируса осповакцины/буст-режиме вируса осповакцины по сравнению с ДНК-прайм-режимом/буст-режимом вируса осповакцины.
Рекомбинантные вирусы MVA-BN, наиболее предпочтительный вариант в данном описании, как полагают, являются безопасными из-за характерного для них отчетливого дефицита репликации в клетках млекопитающих и четко определенной авирулентности. Кроме того, в дополнение к их эффективности, осуществимость производства в промышленных масштабах может быть полезной. Кроме того, вакцины на основе MVA могут доставлять несколько гетерологичных антигенов и позволяют одновременно индуцировать гуморальный и клеточный иммунитет.
В другом аспекте изобретения, вирусный штамм MVA, пригодный для получения рекомбинантного вируса, может быть штаммом MVA-572, MVA-575 или любым подобным образом ослабленным штаммом MVA. Также пригодным может быть мутант МВА, такой как делегированный хориоаллантоисный вирус осповакцины Анкара (dCVA). Вирус dCVA содержит сайты делеций del I, del II, del III, del IV, del V и VI генома MVA. Сайты особенно полезны для вставки нескольких гетерологичных последовательностей. Вирус может репродуктивно реплицироваться (со степенью усиления больше, чем 10) в линии клеток человека (например, в человеческих клеточных линиях 293, 143В и MRC-5), что затем позволит оптимизировать путем дальнейшей мутации полезную для вакцинации на основе вируса стратегию (см. WO 2011/092029).
- 5 031453
Определения
Термин антигенная детерминанта относится к любой молекуле, которая стимулирует иммунную систему хозяина производить антигенспецифический иммунный ответ или клеточный ответ и/или гуморальный ответ антител. Антигенные детерминанты могут включать белки, полипептиды, антигенные фрагменты белка, антигены и эпитопы, которые все еще вызывают иммунный ответ у хозяина и составляют часть антигена, гомологи или варианты белков, полипептидов и антигенных фрагментов белка, антигенов и эпитопов, в том числе, например, гликозилированные белки, полипептиды, антигенные фрагменты белка, антигены и эпитопы, а также нуклеотидные последовательности, кодирующие такие молекулы. Таким образом, белки, полипептиды, антигенные фрагменты белка, антигены и эпитопы не ограничиваются конкретными нативными нуклеотидными или аминокислотными последовательностями, но охватывают последовательности, идентичные нативной последовательности, а также модификации нативной последовательности, такие как делеции, добавки, вставки и замены.
Предпочтительно, чтобы такие гомологи или варианты имели по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60 или 65%, по меньшей мере приблизительно 70 или 75%, по меньшей мере приблизительно 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 или 89%, более типично по меньшей мере приблизительно 90, 91, 92, 93 или 94% и даже более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95, 96, 97, 98 или 99%, наиболее типично по меньшей мере приблизительно 99% идентичность с референсными белком, полипептидом, антигенным фрагментом белка, антигеном и эпитопом на уровне нуклеотидной или аминокислотной последовательности. Термин гомолог или вариант также охватывает усеченные, удаленные или иначе модифицированные нуклеотидные или белковые последовательности, такие как, например, (1) нуклеотидные последовательности RSV-F или RSV-G, кодирующие растворимые формы соответствующих белков RSV-F или RSV-G без сигнального белка, а также трансмембранных и/или цитоплазматических доменов непроцессированных белков RSV-F или RSV-G; (2) нуклеотидные последовательности RSV-M2 или RSV-N, кодирующие удаленные, усеченные или другим образом мутированные версии непроцессированных белков RSV-M2 или RSV-N (3) растворимые формы белков RSV-F или RSV-G без сигнального белка, а также трансмембранных и/или цитоплазматических доменов непроцессированных белков RSV-F или RSV-G или (4) удаленные, усеченные или другим образом мутированные версии непроцессированных белков RSV-M2 или RSV-N.
Методы определения идентичности последовательностей между нуклеиновыми кислотами и аминокислотами хорошо известны в данной области техники. Две или более последовательности можно сравнить путем определения их процента идентичности. Процент идентичности двух последовательно стей, последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислот - это количество точных совпадений между двумя выровненными последовательностями, деленное на длину более короткой последовательности и умноженное на 100.
Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности по отношению к белкам, полипептидам, антигенным фрагментам белка, антигенам и эпитопам, описанным в данном документе, определяется как процент аминокислотных остатков в последовательности кандидата, которые идентичны аминокислотным остаткам в эталонной последовательности (т.е. белка, полипептида, фрагмента антигенного белка, антигена или эпитопа, из которого она получена), после выравнивания последовательностей и введения пробелов, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и не рассматривает любые консервативные замены как части идентичности последовательности. Выравнивания в целях определения процента идентичности аминокислотной последовательности можно достичь различными способами, которые известны специалистам в данной области техники, например, с использованием общедоступных компьютерных программ, таких как BLAST, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить соответствующие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей.
То же самое относится и к проценту (%) идентичности нуклеотидной последовательности с соответствующими изменениями.
Например, приемлемое выравнивание последовательностей нуклеиновых кислот обеспечивается использованием алгоритма локальной гомологии Смита и Ватермана (Smith and Waterman, (1981), Advances in Applied Mathematics? 2:482-489). Этот алгоритм может быть применен к аминокислотным последовательностям при помощи матрицы замен, разработанной Dayhoff, Atlas of protein F Sequences and Structure, M.O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, и нормализированной Gribskov (1986), Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763. Пример реализации этого алгоритма для определения процента идентичности последовательности предоставлен Genetics Computer Group (Madison, Wis.) в служебной программе BestFit. Параметры по умолчанию для этого метода описаны в Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8 (1995) (доступны от Genetics Computer Group, Madison, Wis.). Предпочтительный способ установления процента идентичности в контексте настоящего изобретения состоит в использовании пакета программ MPSRCH, защищенных авторским правом в университете Эдинбурга, разработанного John F. Collins и Shane S. Sturrok, и распространяющихся IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, Calif). Из этого набора пакетов алгоритм
- 6 031453
Smith-Waterman может использоваться там, где параметры по умолчанию используются для таблицы подсчета очков (например, штраф на внесение делеции в выравнивание 12, штраф на продолжение делеции один и разрыва 6). Из полученных данных значение Match отражает идентичность последовательности. Другие подходящие программы для расчета процента идентичности или сходства между последовательностями, как правило, известны в данной области, например, другой программой выравнивания является BLAST, используемая с параметрами по умолчанию. Например, BLASTN и BLASTP могут применяться с использованием следующих параметров по умолчанию: genetic code = standard; filter = none; strand = both; cutoff = 60; expect = 10; Matrix = BLOSUM62; Descriptions = 50 sequences; sort by = HIGH SCORE; Databases = non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR. Подробную информацию об этих программах можно найти в Интернете по следующему адресу: http://http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/.
Под термином гетерологичный ген, нуклеиновая кислота, антиген или белок в настоящем описании понимается нуклеиновая кислота или аминокислотная последовательность, которая не присутствует в геноме поксвируса дикого типа (например, MVA). Специалисту в данной области понятно, что гетерологичный ген, если присутствует в поксвирусе, таком как MVA, должен быть включен в геном поксвируса таким образом, что после введения рекомбинантного поксвируса в клетку-хозяин, он экспрессируется в виде соответствующего гетерологичного генного продукта, т.е. как гетерологичный антиген и/или гетерологичный белок. Экспрессия обычно достигается путем функционального связывания гетерологичного гена с регуляторными элементами, которые делают возможной экспрессию в поксвирусинфицированной клетке. Предпочтительно регуляторные элементы включают природный или синтетический поксвирусный промотор.
Стерильный иммунитет в настоящем описании означает защитный иммунитет в отсутствие детектируемого генома RSV, когда применяются такие чувствительные методы обнаружения, как RTqPCR.
Следует отметить, что в настоящем описании формы единственного числа включают в себя ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, например, ссылка на эпитоп включает один или более эпитопов, а ссылка на способ включает ссылку на эквивалентные этапы и способы, известные специалистам в данной области техники, которые можно модифицировать или заменить способами, описанными в настоящем документе.
Если не указано иное, то термин по меньшей мере, предшествующий ряду элементов, следует понимать как относящийся к каждому элементу в серии. Специалистам в данной области техники будут понятны или они смогут установить, используя не более чем рутинные эксперименты, многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления изобретения, описанного в настоящем документе. Такие эквиваленты охватываются настоящим изобретением.
В данном описании и в следующей формуле изобретения, если контекст не требует иного, слово содержать и его вариации, такие как содержит и содержащий, следует понимать как включение указанного целого или стадии или группы целых чисел или стадий, но не исключая любое другое целое или стадии или группы целого числа или стадий. При использовании в данном описании термин содержащий может заменяться термином вмещающий или включающий или иногда при использовании в данном описании термином имеющий. Любой из указанных выше терминов (включающий, содержащий, вмещающий, имеющий), хотя и менее предпочтителен, когда используется в данном документе в связи с одним из аспектов или вариантов осуществления настоящего изобретения, может быть заменен термином состоящий из.
При использовании в данном документе состоящий из исключает любой элемент, шаг или ингредиент, не указанный в заявленном элементе. При использовании в данном документе термин состоящий в основном из не исключает материалы или действия, которые существенно не влияют на основные и новые характеристики притязания.
При использовании в данном документе соединительный термин и/или между несколькими перечисленными элементами следует понимать как охватывающий как индивидуальные, так и объединенные варианты. Например, когда два элемента соединяются путем и/или, то первый вариант относится к применимости первого элемента без второго. Второй вариант относится к применимости второго элемента без первого. Третий вариант относится к применимости первого и второго элементов друг с другом. Следует понимать, что любой из этих вариантов находится в пределах значения и, следовательно, удовлетворяет требованию термина и/или, как используется в данном документе. Также понятно, что одновременная применимость более чем одного из вариантов подпадает под значение и, следовательно, удовлетворяет требования термина и/или.
Нуклеотидные последовательности и белки RSV.
Гены RSV, как упоминается в настоящем описании, относятся к генам или гомологам или вариантам генов, кодирующим соответствующий белок в любом штамме RSV или изоляте, даже если точная последовательность и/или геномное расположение гена может отличаться от штаммов или изолятов.
Кроме того, белки RSV, упоминаемые в настоящем описании, относятся к белкам или гомологам или вариантам белков, кодируемым и экспрессируемым соответствующим геном белка, как определено
- 7 031453 выше.
В качестве примера в данном описании следующие термины используются взаимозаменяемо: термины ген белка F, ген гликопротеина F, ген белка F RSV, ген гликопротеина F RSV или ген F относятся к гену или гомологу или варианту гена, кодирующему трансмембранный слитый гликопротеин в любом штамме RSV или изоляте, хотя точная последовательность и/или геномное расположение гена белка F могут отличаться между штаммами или изолятами. Например, в штамме А2 RSV ген белка F(A2) содержит нуклеотиды 5601-7499 (конечные точки включены), как пронумеровано в GenBank под инвентарным номером M11486. Ген белка F(A2) дополнительно включает кодирующую открытую рамку считывания (ORF), охватывающую нуклеотиды 5614-7338 (конечные точки включены), как пронумеровано в GenBank под инвентарным номером М11486. Нуклеотидная последовательность гена белка F из А2 RSV указана в SEQ ID NO: 28.
Также взаимозаменяемо применены в данном описании термины белок F, гликопротеин F, белок F RSV, гликопротеин F RSV или F, которые относятся к тяжелогликозилированным трансмембранным гликопротеинам слияния, или гомологам, или вариантам белка, кодируемого и экспрессируемого геном белка F RSV, как определено выше. Аминокислотная последовательность белка F из RSV A2 указана в SEQ ID NO: 29. Белок F RSV (A2) содержит сигнальный пептид, внеклеточный домен, трансмембранный домен и цитоплазматический домен (см., например, UniProtKB/Swiss-Prot инвентарный номер Р03420). Сигнальный пептид белка F RSV А2 состоит из аминокислот 1-21 из SEQ ID NO: 29; внеклеточный домен белка F RSV A2 состоит из аминокислот 1-529 из SEQ ID NO: 29 или аминокислот 22529 из SEQ ID NO: 29; трансмембранный домен белка F RSV A2 состоит из аминокислот 530-550 из SEQ ID NO: 29; и цитоплазматический домен белка F RSV A2 состоит из аминокислот 551-574 из SEQ ID NO: 29.
Также термины ген белка G, ген гликопротеина G, ген белка G RSV, ген гликопротеина G RSV или ген G используются в настоящем описании взаимозаменяемо. Например, в штамме А2 RSV ген белка G(A2) содержит нуклеотиды 4626-5543 (конечные точки включены), как пронумеровано в GenBank под инвентарным номером М11486. Ген белка G(A2) дополнительно содержит белок, кодируемый открытой рамкой считывания (ORF), охватывающей нуклеотиды 4641-5537 (конечные точки включены), как пронумеровано в GenBank под инвентарным номером М11486. Нуклеотидная последовательность гена белка G из А2 RSV указана в SEQ ID NO: 30.
Термины белок G, гликопротеин G, белок G RSV, гликопротеин G RSV или G относятся к тяжелогликозилированному трансмембранному гликопротеину присоединения, или к гомологу, или варианту белка. Аминокислотная последовательность белка G из RSV A2 указана в SEQ ID NO: 31. Белок G A2 RSV содержит внеклеточный домен, трансмембранный домен и цитоплазматический домен (см., например, UniProtKB/Swiss-Prot инвентарный номер Р03423). Внеклеточный домен белка G A2 RSV состоит из аминокислот 67-298 из SEQ ID NO: 31; трансмембранный домен белка G A2 RSV состоит из аминокислот 38-66 из SEQ ID NO: 31; и цитоплазматический домен белка G A2 RSV состоит из аминокислот 1-37 из SEQ ID NO: 31.
Используются взаимозаменяемо в данном документе также термины ген белка М2, ген нуклеокапсидного белка М2, ген белка М2 RSV, ген матриксного белка М2 RSV, ген нуклеокапсидного белка М2 RSV или ген М2. Например, в штамме А2 RSV ген белка М2(А2) содержит нуклеотиды 7550-8506 (конечные точки включены), как пронумеровано в GenBank под инвентарным номером М11486. Ген белка М2(А2) дополнительно содержит белок, кодируемый открытой рамкой считывания (ORF), охватывающей нуклеотиды 7559-8143 (конечные точки включены), как пронумеровано в GenBank под инвентарным номером М11486. Нуклеотидная последовательность гена белка М2 из А2 RSV указана в SEQ ID NO: 32.
Используются взаимозаменяемо в данном документе термины белок М2, нуклеокапсидный белок М2, RSV M2 протеин, нуклеокапсидный белок М2 RSV, матриксный белок М2 RSV или М2. Аминокислотная последовательность белка М2 из RSV А2 указана в SEQ ID NO: 33 (см., например, UniProtKB/Swiss-Prot инвентарный номер Р04545).
Также термины ген белка N, ген нуклеокапсидного белка N, ген белка N RSV, ген нуклеокапсидного белка N RSV или ген N в данном документе могут использоваться взаимозаменяемо. Например, в штамме А2 RSV ген белка N(A2) содержит нуклеотиды 1081-2277 (конечные точки включены), как пронумеровано в GenBank под инвентарным номером М11486. Ген белка N(A2) дополнительно содержит белок, кодируемый открытой рамкой считывания (ORF), охватывающей нуклеотиды 1096-2271 (конечные точки включены), как пронумеровано в GenBank под инвентарным номером М11486. Нуклеотидная последовательность гена белка N из А2 RSV указана в SEQ ID NO: 34.
Аминокислотная последовательность белка N, нуклеокапсидного белка N, белка N RSV, нуклеокапсидного белка N RSV или N, термины, которые используются в данном описании взаимозаменяемо, из А2 RSV указана в SEQ ID NO: 35 (см., например, UniProtKB/Swiss-Prot инвентарный номер Р03418).
- 8 031453
Некоторые варианты осуществления изобретения
Настоящее изобретение относится к рекомбинантному модифицированному вирусу осповакцины Анкара (MVA), обладающему иммуногенной активностью, при этом указанный вирус содержит:
(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенную детерминанту мембранного гликопротеина F респираторно-синцитиального вируса (RSV), где указанная нуклеотидная последовательность кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, 6 и/или 16; и (b) нуклеотидную последовательность, кодирующую матриксный белок М2 RSV, предпочтительно, где нуклеотидная последовательность согласно а) по меньшей мере приблизительно на 75% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5, еще более предпочтительно, где нуклеотидная последовательность, кодирующая антигенную детерминанту мембранного гликопротеина F респираторносинцитиального вируса (RSV), имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5.
Один из вариантов осуществления изобретения относится к рекомбинантному MVA по изобретению, дополнительно содержащему нуклеокапсидный белок N вируса RSV, в частности, где как нуклеокапсидный белок N вируса RSV, так и матриксный белок М2 вируса RSV кодируются единой открытой рамкой считывания, разделенной саморасщепляющимся протеазным доменом, в частности, где саморасщепляющийся протеазный домен представляет собой последовательность фрагмента протеазы 2А из вируса ящура, предпочтительно, где единая открытая рамка считывания содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 и/или SEQ ID NO: 33, еще более предпочтительно, где открытая рамка считывания содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 17.
Еще один вариант осуществления изобретения относится к рекомбинантному MVA по изобретению, дополнительно содержащему по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенную детерминанту мембранного гликопротеина G вируса RSV, в частности, где нуклеотидная последовательность (последовательности), кодирующая (кодирующие) антигенную детерминанту мембранного гликопротеина G вируса RSV, получена (получены) из штамма А вируса RSV, предпочтительно из штамма А2 и/или штамма В, предпочтительно, где нуклеотидная последовательность, кодирующая антигенную детерминанту мембранного гликопротеина G вируса RSV, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 или 8, более предпочтительно, где нуклеотидная последовательность, кодирующая антигенную детерминанту мембранного гликопротеина G вируса RSV, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или 7, еще более предпочтительно, где рекомбинантный MVA содержит нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1 и 7.
Следующим вариантом осуществления изобретения является рекомбинантный MVA по изобретению, полученный на основе MVA-BN или его производного, обладающих способностью репродуктивной реплицикации in vitro в фибробластах куриных эмбрионов (CEF), но не способных к репродуктивной репликации в человеческой линии кератиноцитов НаСаТ, клеточной линии костной остеосаркомы человека 143В, клеточной линии почки эмбриона человека 293 и клеточной линии HeLa цервикальной аденокарциномы человека.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный MVA по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель.
Кроме того, изобретение относится к вакцине, содержащей рекомбинантный MVA по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель, для лечения или предотвращения инфекции, вызванной вирусом RSV.
Следующим аспектом настоящего изобретения является применение рекомбинантного MVA по изобретению для лечения или предотвращения инфекции, вызванной RSV.
Изобретение также относится к применению рекомбинантного MVA по изобретению для получения фармацевтической композиции для лечения или предотвращения инфекции, вызванной RSV.
В следующем аспекте изобретение относится к применению рекомбинантного MVA по изобретению для получения фармацевтической композиции для лечения или предотвращения инфекции, вызванной RSV, путем интраназального введения, причем внутримышечное введение исключается.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является применение рекомбинантного MVA по изобретению для лечения или предотвращения инфекции, вызванной RSV, путем интраназального введения и/или подкожного введения.
В частности, настоящее изобретение относится к применению по изобретению, где инфекция вызвана у человека старше 2 лет или где инфекция вызвана у человека младше 2 лет.
В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантный MVA экспрессирует по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенную детерминанту мембранного гликопротеина RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, кодирующая антигенную детерминанту мембранного гликопротеина RSV, кодирует антигенную детерминанту F RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, кодирующая антигенную детерминанту мембранного гликопротеина RSV, кодирует антиген
- 9 031453 ную детерминанту G RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенную детерминанту F RSV получают из штамма А2 RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенную детерминанту G RSV получают из штамма А2 RSV.
В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантный MVA содержит две гетерологичные нуклеотидные последовательности, каждая кодирует антигенную детерминанту мембранного гликопротеина RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения первой антигенной детерминантой мембранного гликопротеина RSV является антигенная детерминанта F RSV, а второй антигенной детерминантой мембранного гликопротеина RSV является антигенная детерминанта G RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенную детерминанту F RSV получают из штамма А2 RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенную детерминанту G RSV получают из штамма А2 RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения обе антигенные детерминанты F RSV и G RSV могут быть получены из штамма А2 RSV.
В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантный MVA экспрессирует по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенную детерминанту мембранного гликопротеина RSV, и по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенную детерминанту нуклеокапсидного белка RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, кодирующая антигенную детерминанту мембранного гликопротеина RSV, кодирует антигенную детерминанту F RSV и по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, кодирующая антигенную детерминанту нуклеокапсидного белка RSV, кодирует антигенную детерминанту М2 RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, кодирующая антигенную детерминанту мембранного гликопротеина RSV, кодирует антигенную детерминанту F RSV и по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, кодирующая антигенную детерминанту нуклеокапсидного белка RSV, кодирует антигенную детерминанту N RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, кодирующая антигенную детерминанту мембранного гликопротеина RSV, кодирует антигенную детерминанту G RSV и по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, кодирующая антигенную детерминанту нуклеокапсидного белка RSV, кодирует антигенную детерминанту М2 RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, кодирующая антигенную детерминанту мембранного гликопротеина RSV, кодирует антигенную детерминанту G RSV и по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, кодирующая антигенную детерминанту нуклеокапсидного белка RSV, кодирует антигенную детерминанту N RSV.
В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантный MVA содержит две гетерологичные нуклеотидные последовательности, каждая из которых кодирует антигенную детерминанту мембранного гликопротеина RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения первая антигенная детерминанта мембранного гликопротеина RSV является антигенной детерминантой F RSV и вторая антигенная детерминанта мембранного гликопротеина RSV является антигенной детерминантом G RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантный MVA содержит две гетерологичные нуклеотидные последовательности, каждая из которых кодирует антигенную детерминанту мембранного гликопротеина RSV, и по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенную детерминанту нуклеокапсидного белка RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения первая антигенная детерминанта мембранного гликопротеина RSV является антигенной детерминантой F RSV, а вторая антигенная детерминанта мембранного гликопротеина RSV является антигенной детерминантой G RSV, и антигенной детерминантой нуклеокапсидного белка RSV является антигенной детерминантой М2 RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения первая антигенная детерминанта мембранного гликопротеина RSV является антигенной детерминантой F RSV, вторая антигенная детерминанта мембранного гликопротеина RSV является антигенной детерминантой G RSV, антигенная детерминанта нуклеокапсидного белка RSV является антигенной детерминантой N RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения обе антигенные детерминанты F и G RSV могут быть получены из штамма А2 RSV.
В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантный MVA содержит две гетерологичные нуклеотидные последовательности, каждая из которых кодирует антигенную детерминанту мембранного гликопротеина RSV, две гетерологичные нуклеотидные последовательности, каждая из которых кодирует антигенную детерминанту нуклеокапсидного белка RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения первая антигенная детерминанта мембранного гликопротеина RSV является антигенной детерминантой F RSV, вторая антигенная детерминанта мембранного гликопротеина RSV является антигенной детерминантой G RSV, первая антигенная детерминанта нуклеокапсидного белка RSV является антигенной детерминантой М2 RSV, а вторая антигенная детерминанта нуклеокапсидного белка RSV является антигенной детерминантой N RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения обе антигенные детерминанты F и G RSV получены из штамма А2 RSV.
- 10 031453
В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантный MVA содержит три гетерологичные нуклеотидные последовательности, каждая из которых кодирует антигенную детерминанту мембранного гликопротеина RSV, и две гетерологичные нуклеотидные последовательности, каждая из которых кодирует антигенную детерминанту нуклеокапсидного белка RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения первая антигенная детерминанта мембранного гликопротеина RSV является антигенной детерминантой F RSV, а вторая антигенная детерминанта мембранного гликопротеина RSV является антигенной детерминантой G RSV, первая антигенная детерминанта нуклеокапсидного белка RSV является антигенной детерминантой М2 RSV, а вторая антигенная детерминанта нуклеокапсидного белка RSV является антигенной детерминантой N RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения первая антигенная детерминанта мембранного гликопротеина RSV и вторая антигенная детерминанта мембранного гликопротеина RSV получены из штамма А2 RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения третья антигенная детерминанта мембранного гликопротеина RSV является антигенной детерминантой F RSV.
В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантный MVA содержит четыре гетерологичные нуклеотидные последовательности, каждая из которых кодирует антигенную детерминанту мембранного гликопротеина RSV, и две гетерологичные нуклеотидные последовательности, каждая из которых кодирует антигенную детерминанту нуклеокапсидного белка RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения первая антигенная детерминанта мембранного гликопротеина RSV является антигенной детерминантой F RSV, а вторая антигенная детерминанта мембранного гликопротеина RSV является антигенной детерминантой G RSV, первая антигенная детерминанта нуклеокапсидного белка RSV является антигенной детерминантой М2 RSV, а вторая антигенная детерминанта нуклеокапсидного белка RSV является антигенной детерминантой N RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения первая антигенная детерминанта мембранного гликопротеина RSV и вторая антигенная детерминанта мембранного гликопротеина RSV получены из штамма А2 RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения третья антигенная детерминанта мембранного гликопротеина RSV является антигенной детерминантой F RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения четвертая антигенная детерминанта мембранного гликопротеина RSV является антигенной детерминантой G RSV.
В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, кодирующая антигенную детерминанту мембранного гликопротеина RSV, кодирует антигенную детерминанту F RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта F RSV является непроцессированной. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта F RSV является усеченной. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта F RSV является вариантом антигенной детерминанты F RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения непроцессированную, усеченную или вариантную антигенную детерминанту F RSV получают из штамма А2 RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта непроцессированного F RSV (A2) содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 28, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта вариантного F RSV (A2) содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта усеченного F RSV (A2) не имеет цитоплазматических и трансмембранных доменов антигенной детерминанты непроцессированного F RSV (A2). В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта усеченного F RSV (A2) содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 15, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления изобретения непроцессированную, усеченную или вариантную антигенную детерминанту F RSV получают из штамма ALong RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта вариантного F RSV (ALong) содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта усеченного F RSV (ALong) не имеет цитоплазматических и трансмембранных доменов антигенной детерминанты непроцессированного F RSV (ALong).
В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, кодирующая антигенную детерминанту мембранного гликопротеина RSV, кодирует антигенную детерминанту G RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта G RSV является непроцессированной. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта G RSV является усеченной. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта G RSV является вариантной антигенной детерминантой RSV G. В некоторых вариантах осуществления изобретения непроцессированную, усеченную или вариантную детерминанту G RSV получают из штамма А2 RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта непроцессированного G RSV (A2) содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта усеченного G RSV (A2) не имеет цитоплазматических и трансмембранных доменов антигенной детерминаты непроцессированного G RSV
- 11 031453 (A2). В некоторых вариантах осуществления изобретения непроцессированную, усеченную или вариантную антигенную детерминату RSV G получают из штамма В RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта усеченного RSV(B) G не имеет цитоплазматических и трансмембранных доменов антигенной детерминанты непроцессированного G RSV(B). В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта усеченного G RSV(B) G содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, кодирующая антигенную детерминанту нуклеокапсидного белка RSV, кодирует антигенную детерминанту М2 RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта М2 RSV является непроцессированной. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта М2 RSV является усеченной. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта М2 RSV является вариантной антигенной детерминантой М2 RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения непроцессированную, усеченную или вариантную антигенную детерминанту М2 RSV получают из штамма А2 RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта М2 RSV (A2) содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 32, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33.
В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, кодирующая антигенную детерминанту нуклеокапсидного белка RSV, кодирует антигенную детерминанту N RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта N RSV является непроцессированной. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта N RSV является усеченной. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта N RSV является вариантной антигенной детерминантой N RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения непроцессированную, усеченную или вариантную антигенную детерминанту N RSV получают из штамма А2 RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта N RSV (A2) содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 34, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта N RSV и антигенная детерминанта М2 RSV кодируются единой открытой рамкой считывания и разделены саморасщепляющимся протеазным доменом. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта М2 RSV является непроцессированной. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта М2 RSV является усеченной. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта М2 RSV является вариантной антигенной детерминантой М2 RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения непроцессированную, усеченную или вариантную антигенную детерминанту М2 RSV получают из штамма А2 RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта N RSV является непроцессированной. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта N RSV является усеченной. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенная детерминанта N RSV является вариантной антигенной детерминантой N RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения усеченную или вариантную антигенную детерминанту N получают из штамма А2 RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения саморасщепляющийся протеазный домен получают из вируса ящура. В некоторых вариантах осуществления изобретения саморасщепляющийся протеазный домен является фрагментом протеазы 2А из вируса ящура, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 11, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, кодирующая антигенную детерминанту N RSV и антигенную детерминанту М2 RSV, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 17, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
Сайты интеграции в MVA.
В некоторых вариантах осуществления изобретения гетерологичные нуклеотидные последовательности, кодирующие одну или более антигенные детерминанты мембранных гликопротеинов RSV и одну или более антигенные детерминанты нуклеокапсидных белков RSV, включены в различные сайты интеграции в геноме MVA или в геноме MVA-BN. Гетерологичные нуклеотидные последовательности, кодирующие одну или более антигенные детерминанты белков RSV, могут быть включены в рекомбинантный MVA в качестве отдельных транскрипционных единиц или в качестве гибридных генов, как указано на фиг. 1.
В некоторых вариантах осуществления изобретения гетерологичные нуклеотидные последовательности RSV включены в одну или более межгенные области (IGR) MVA. IGR может быть выбранной из IGR07/08, IGR 44/45, IGR 64/65, IGR 88/89, IGR 136/137 и IGR 148/149, предпочтительно из IGR64/65, IGR88/89 и/или IGR 148/149. Гетерологичные нуклеотидные последовательности RSV могут быть, дополнительно или альтернативно, включены в один или более делеционный сайт природного происхождения I, II, II, IV, V или VI MVA. В некоторых вариантах осуществления изобретения меньше чем 5, 4, 3 или 2 сайтов интеграции содержат гетерологичные нуклеотидные последовательности RSV.
- 12 031453
Количество сайтов интеграции MVA, содержащих гетерологичные нуклеотидные последовательности RSV, может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или более. Рекомбинантный MVA может содержать гетерологичные нуклеотидные последовательности RSV, включенные в 4, 3, 2 или меньше сайтов интеграции, но предпочтительно используют два сайта интеграции. В некоторых вариантах осуществления изобретения используют три сайта интеграции. Предпочтительно рекомбинантный MVA содержит по меньшей мере 4, 5, 6 или 7 нуклеотидных последовательностей, включенных в 2 или 3 сайта интеграции.
Рекомбинантные вирусы MVA, предусмотренные в данном документе, могут быть получены с помощью общеизвестных рутинных методов. Методы получения рекомбинантных поксвирусов или включения гетерологичных нуклеотидных последовательностей в поксвирусный геном хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, методы стандартных технологий молекулярной биологии, такие как технологии клонирования ДНК, выделения ДНК и РНК, вестерн-блоттинга, RT-PCR и PCR-амплификации, описаны в Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed.) [J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], а технологии обработки и манипуляции вирусов описаны в Virology Methods Manual [B.W.J. Mahy et al. (eds.), Academic Press (1996)]. Кроме того, методы и ноу-хау для обработки, манипулирования и генной инженерии MVA описаны в Molecular Virology: A Practical Approach [A.J. Davison & R.M. Elliott (Eds.), The Practical Approach Series, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, UK (1993) (см., например, Chapter 9: Expression of genes by Vaccinia virus vectors)] и Current Protocols в Molecular Biology [John Wiley & Son, Inc. (1998) (см., например, Chapter 16, Section IV: Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vector)].
Для получения разных рекомбинантных MVA, описанных в данном документе, могут быть применимы разные способы. Нуклеотидные последовательности, которые нужно вставить в вирус, могут быть помещены в плазмидный конструкт L.coli. в который включены ДНК, гомологичные участку ДНК MVA. Отдельно последовательность ДНК для вставки может быть лигированной с промотором. Мостик промотор-ген может размещаться в плазмидном конструкте так, чтобы мостик промотор-ген с обоих концов примыкал к ДНК, гомологичной последовательности ДНК, фланкирующей область ДНК MVA, содержащую несущественный локус. Полученный плазмидный конструкт может быть амплифицирован путем размножения в бактерии F.coli и выделен. Выделенная плазмида, содержащая последовательность ДНК гена для вставки, может быть трансфицирована в клеточную культуру, например в фибробласты куриных эмбрионов (CEF), в это же время культуру инфицируют MVA. Рекомбинация между гомологичной ДНК MVA в плазмиде и вирусного генома, соответственно, может генерировать MVA, модифицированный присутствием чужеродных последовательностей ДНК.
Согласно предпочтительному варианту осуществления клетка подходящей культуры клеток, как, например, клетки CEF, может быть инфицирована поксвирусом. Инфицированная клетка может быть затем трансфицирована первым плазмидным вектором, содержащим чужеродный ген или гены, предпочтительно под транскрипционным контролем элемента, контролирующего экспрессию поксвируса. Как описано выше, плазмидный вектор также содержит последовательности, способные направлять вставку экзогенной последовательности в выбранную часть поксвирусного генома. Необязательно, плазмидный вектор также содержит кассету, содержащую маркер и/или селекционный ген, функционально связанный с поксвирусным промотором. Подходящими маркерами или селекционными генами являются, например, гены, кодирующие зеленый флуоресцентный белок, β-галактозидазу, неомицинфосфорибозилтрансферазу или другие маркеры. Применение селекционных или маркерных кассет упрощает идентификацию и выделение созданного рекомбинантного поксвируса. Однако рекомбинантный поксвирус также можно идентифицировать с помощью технологии PCR. Впоследствии, дополнительные клетки могут быть инфицированы рекомбинантным поксвирусом, полученным, как описано выше, и трансфицированы вторым вектором, содержащим второй чужеродный ген или гены. На тот случай, если этот ген может быть введен в другой сайт интеграции в поксвирусном геноме, второй вектор также отличается по поксвирусным гомологичным последовательностям, направляющим интеграцию второго чужеродного гена или генов в геном поксвируса. После того как состоится гомологичная рекомбинация, может быть выделен рекомбинантный вирус, содержащий два или более чужеродных гена. Для введения дополнительных чужеродных генов в рекомбинантный вирус этапы инфекции и трансфекции можно повторить с использованием рекомбинантного вируса, выделенного на предыдущих этапах для инфекции, и с использованием дополнительного вектора, содержащего дополнительный чужеродный ген или гены для трансфекции.
Альтернативно, этапы инфекции и трансфекции, как описано выше, являются взаимозаменяемыми, т.е. подходящая клетка может сначала быть трансфицирована с помощью плазмидного вектора, содержащего чужеродный ген, а затем инфицирована поксвирусом. В качестве дополнительной альтернативы также можно вводить каждый чужеродный ген в разные вирусы, коинфицировать клетку всеми полученными рекомбинантными вирусами и отбирать для рекомбинации, включая все чужеродные гены. Третьим вариантом является лигирование генома ДНК и чужеродных последовательностей in vitro и восстановления рекомбинированного генома ДНК вируса осповакцины с использованием вируса-помощника. Четвертой альтернативой является гомологичная рекомбинация в F.coli или другие виды бактерий между геномом вируса осповакцины, клонированным в виде бактериальной искусственной хромосомы (ВАС), и
- 13 031453 линейной чужеродной последовательностью, примыкающей к последовательностям ДНК, гомологичным последовательностям, фланкирующим желательный сайт интеграции в геноме вируса осповакцины.
Экспрессия генов RSV.
В одном варианте осуществления изобретения экспрессия одной, более или всех гетерологичных нуклеотидных последовательностей RSV происходит под контролем одного или более поксвирусных промоторов. В некоторых вариантах осуществления изобретения поксвирусным промотором является промотор Pr7.5 - гибридный ранний/поздний промотор, промотор PrS - синтетический или природный ранний или поздний промотор или промотор ATI вируса вакцины. В некоторых вариантах осуществления изобретения поксвирусный промотор выбирают из группы, состоящей из промотора PrS (SEQ ID NO: 39), промотора Pr7.5 (SEQ ID NO: 40), промотора PrSynllm (SEQ ID NO: 41), промотора PrLEl (SEQ ID NO: 42) и промотора PrH5m (SEQ ID NO: 43 [L.S. Wyatt et al. (1996), Vaccine, 14(15):14511458]). В некоторых вариантах осуществления изобретения поксвирусным промотором является промотор PrS (SEQ ID NO: 39). В некоторых вариантах осуществления изобретения поксвирусным промотором является промотор Pr7.5 (SEQ ID NO: 40). В некоторых вариантах осуществления изобретения поксвирусным промотором является промотор PrSynIIm (SEQ ID NO: 41). В некоторых вариантах осуществления изобретения поксвирусным промотором является промотор PrLE1 (SEQ ID NO: 42). В некоторых вариантах осуществления изобретения поксвирусным промотором является промотор PrH5m (SEQ ID NO: 43).
Гетерологичная нуклеотидная последовательность RSV или последовательности могут экспрессироваться в виде единой транскрипционной единицы. Например, гетерологичная нуклеотидная последовательность RSV может функционально связываться с промотором вируса осповакцины и/или присоединяться к терминатору транскрипции вируса коровьей оспы. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна или более гетерологичные нуклеотидные последовательности RSV экспрессируются в виде слитого белка. Слитый белок может дополнительно содержать сайт распознавания для пептидазы или гетерологичной саморасщепляющейся пептидной последовательности. Гетерологичная саморасщепляющаяся пептидная последовательность может быть 2А пептидазой от вируса ящура.
В некоторых вариантах осуществления изобретения транскрипционная единица вставляется сама по себе в сайт интеграции генома MVA, но может также вставляться с другой транскрипционной единицей (единицами) в сайт интеграции генома MVA. Транскрипционная единица не имеет природного происхождения (т. е. она является гетерологичной, экзогенной или чужеродной) в смысле генома MVA и способна к транскрипции в инфицированных клетках.
Предпочтительно рекомбинантный MVA содержит 1, 2, 3, 4, 5 или более транскрипционных единиц, введенных в геном MVA. В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантный MVA стабильно экспрессирует белки RSV, кодируемые 1, 2, 3, 4, 5 или более транскрипционными единицами. В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантный MVA содержит 2, 3, 4, 5 или более транскрипционных единиц, введенных в геном MVA в 1, 2, 3 или более сайтов интеграции в геноме MVA.
Вакцины RSV и фармацевтические композиции.
Так как рекомбинантные вирусы MVA, включая MVA-BN, описанный в данном документе, являются весьма ограниченными относительно репликации и, таким образом сильно ослабленными, то они являются идеальными кандидатами для лечения широкого круга млекопитающих, включая человека и даже людей с ослабленным иммунитетом. Следовательно, в данном документе предусмотрены рекомбинантные MVA согласно настоящему изобретению для применения в качестве активных фармацевтических веществ, а также фармацевтические композиции и вакцины, предназначенные для индуцирования иммунной реакции в живом организме животного, включая человека.
Для этого рекомбинантный MVA, вакцина или фармацевтическая композиция могут быть получены в растворе в диапазоне концентраций, составляющем 104-109 ТСГО50/мл, 105-5х108 ТСГО50/мл, 106-108 ТСГО50/мл или 107-108 ТСГО50/мл. Предпочтительная доза для человека содержит от 106 до 109 TCID50, включая дозу 106 TCID50, 107 TCID50, 108 TCID50 или 5х108 TCID50.
Фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, могут, как правило, включать один или более фармацевтически приемлемых и/или пригодных носителей, добавок, антибиотиков, консервантов, адъювантов, разбавителей и/или стабилизаторов. Такими вспомогательными веществами могут быть вода, физиологический раствор, глицерин, этанол, увлажняющие или эмульгирующие агенты, рН-буферные вещества и т. п. Подходящие носители обычно представляют собой большие, медленно метаболизируемые молекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, липидные агрегаты или т. п.
Для приготовления вакцин рекомбинантные вирусы MVA, предусмотренные в данном документе, могут быть преобразованы в физиологически приемлемую форму. Это может быть сделано, исходя из опыта приготовления поксвирусных вакцин, используемых для вакцинации против натуральной оспы, как описано у Н. Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99:2386-2392 (1974).
- 14 031453
Например, очищенные вирусы могут храниться при -80°C с титром 5х108 ТСШ50/мл с приблизительно 10 мМ Tris, 140 мМ NaCl рН 7,7. Для приготовления вакцинных инъекций, например, 102-108 или 102-109 частиц вируса можно лиофилизировать в 100 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) в присутствии 2% пептона и 1% человеческого альбумина в ампуле, предпочтительно стеклянной ампуле. Кроме того, вакцинные инъекции могут быть получены путем ступенчатой лиофилизации вируса в композиции. Такая композиция может содержать добавки, такие как маннит, декстран, сахар, глицин, лактозу или поливинилпирролидон или другие добавки, такие как антиоксиданты или инертный газ, стабилизаторы или рекомбинантные белки (например, человеческий сывороточный альбумин), подходящие для in vivo введения. Стеклянную ампулу затем герметизируют и она может храниться при температуре от 4°C до комнатной температуры в течение нескольких месяцев. Однако, до тех пор, пока нет необходимости, ампулу предпочтительно хранить при температуре ниже -20°C.
Для вакцинации или терапии лиофилизат можно растворить в водном растворе, предпочтительно физиологическом растворе, или трис-буфере и вводить либо системно, либо местно, т.е. парентерально, подкожно, внутривенно, внутримышечно, интраназально или любым другим путем введения, известным специалисту в данной области. Путь введения, доза и количество введений может быть оптимизировано специалистами в данной области. Однако чаще всего пациента вакцинируют второй инъекцией приблизительно от одного месяца до шести недель после первой вакцинной инъекции.
Наборы, содержащие рекомбинантные вирусы MVA.
Также в данном документе предусмотрены наборы, содержащие один или более рекомбинантных MVA, описанных в данном документе. Набор может содержать один или несколько контейнеров или флаконов рекомбинантного MVA вместе с инструкциями для введения рекомбинантного MVA субъекту с риском инфекции RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъектом является человек. Инструкции могут указывать, что рекомбинантный MVA вводят субъекту в виде одной дозы или в нескольких (т.е. 2, 3, 4 и т.д.) дозах. В некоторых вариантах осуществления изобретения инструкции указывают, что рекомбинантный вирус MVA вводят в первом (примирование) и втором (бустинг) введении ранее не подвергавшимся иммунизации или ранее иммунизированным субъектам. Дополнительно предусмотренным является набор, содержащий рекомбинантный вирус MVA в первом флаконе или контейнере для первого введения (примирования) и втором флаконе или контейнере для второго введения (бустинга). Набор также может содержать рекомбинантный MVA в третьем, четвертом или т. д. флаконе или контейнере для третьего, четвертого и т.д. введения (бустинга).
Способы и применения рекомбинантных вирусов MVA.
Также в данном документе предусмотрены способы иммунизации субъектов-животных, а также рекомбинантные MVA для применения в способах иммунизации субъектов-животных и применение рекомбинантных MVA, предусмотренных в данном документе, для приготовления медикамента или вакцины для иммунизации субъекта-животного. В некоторых вариантах осуществления изобретения животным является млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления изобретения млекопитающим является крыса, кролик, свиньи, мыши или человек, а также способы включают введение дозы любого одного или нескольких рекомбинантных MVA, предусмотренных в данном документе, субъекту.
Субъектом предпочтительно является человек, и он может быть взрослым, причем взрослым с ослабленным иммунитетом. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъектом является взрослый старше 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 или 85 лет. В других вариантах осуществления изобретения возраст субъекта составляет меньше 5 лет, меньше 3 лет, меньше 2 лет, меньше чем 15 месяцев, меньше чем 12 месяцев, меньше чем 9 месяцев, меньше чем 6 или меньше 3 месяцев. Возраст субъекта может также варьировать от 0-3 месяцев, 3-6 месяцев, 6-9 месяцев, 9-12 месяцев, 1-2 лет или 2-5 лет.
В некоторых вариантах осуществления изобретения любой рекомбинантный MVA, предусмотренный в данном документе, вводят субъекту в дозе от 106 до 109 TCID50, в дозе от 106 до 5х108 TCID50 или от 107 до 108 TCID50. Рекомбинантные MVA, предусмотренные в данном документе, могут также вводиться субъекту в дозе 106, 107, 108 или 5х108 TCID50. В некоторых вариантах осуществления изобретения любой рекомбинантный MVA, предусмотренный в данном документе, вводят человеку в дозе 107, 108 или 5х108 TCID50.
Рекомбинантные MVA, предусмотренные в данном документе, вводят субъекту в единичной дозе или в многократных (т.е. 2, 3, 4 и т.д.) дозах. В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные MVA вводят в первом (примирование) и втором (бустинг) введении. В некоторых вариантах осуществления изобретения первая доза содержит от 107 до 108 TCID50 рекомбинантного вируса MVA, а вторая доза содержит от 107 до 108 TCID50 рекомбинантного вируса MVA.
Рекомбинантные MVA можно вводить системно или местно, парентерально, подкожно, внутривенно, внутримышечно, интраназально или, предпочтительно, подкожно или интраназально. Рекомбинантные MVA можно также вводить любым другим путем введения, известным специалисту в данной области.
В другом аспекте изобретения в данном документе предусмотрены способы диагностирования инфекции RSV и методы определения, есть ли риск рецидива инфекции RSV у субъекта, который может
- 15 031453 быть серьезной угрозой, особенно для новорожденных, детей в возрасте от 1 до 6 лет и/или пожилых людей.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что современные методы диагностики инфекции RSV могут обеспечивать неправильные результаты. Например, иммуноферментный анализ, используемый для определения антител против RSV, или определение вируса методом бляшек, необязательно точно определяют лица, подверженные риску рецидива инфекции. Так, авторы настоящего изобретения заметили, что даже при том, что образец взят у пациента, может вернуться отрицательный результат в методе вирусных бляшек [см., например, W. Olszewska et al., 2004.], такие результаты могут быть иногда ложно негативными, так как более чувствительные методы иногда демонстрируют, что все еще присутствуют инфекционные частицы RSV. На самом деле такие методы, как количественная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (qRT-PCR), обязательны для подтверждения того, что субъект в действительности может быть инфицирован RSV и подвергается риску рецидива инфекции, или же вакцинированный субъект приобрел стерильный иммунитет к RSV. Это определение может иметь решающее значение, потому что повторное заражение после вакцинации иногда вызывает усиленную болезнь, иногда приводит к смерти.
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления изобретения в данном документе предусмотрены способы определения того, имеется ли для субъекта риск рецидива инфекции RSV, включающие количественное определение того, содержит ли образец, полученный от субъекта, геномы RSV, причем присутствие геномов RSV указывает на вероятность рецидива инфекции RSV. В некоторых вариантах осуществления изобретения количественное определение того, содержит ли образец, полученный от субъекта, геномы RSV, проводят с помощью qRT-PCR.
Как использовано в данном документе, термин образец относится к любому биологическому образцу, полученному от человека, клеточной линии, культуры ткани или другого источника, содержащего полинуклеотиды и полипептиды или их части. Биологические образцы включают жидкости организма (такие как, например, кровь, сыворотка, плазма, моча, синовиальная жидкость, спинномозговая жидкость, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ)) и ткани организма, в которых обнаружены и/или предположительно содержатся RSV, в том числе клинические образцы, полученные, например, от субъектов, участвующих в клиническом испытании или другом экспериментальном исследовании. Способы получения биопсийных тканей и жидкостей организма от млекопитающих хорошо известны в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления изобретения биологический образец содержит нуклеиновые кислоты RSV.
Как используется в данном описании взаимозаменяемо, термины RT-qPCR или qRT-PCR относятся к способу, известному как количественная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени. В некоторых случаях этот метод может также упоминаться как кинетическая полимеразная цепная реакция (KPCR).
В некоторых вариантах осуществления изобретения в данном описании предусмотрены способы определения наличия у субъекта приобретенного стерильного иммунитета к RSV, включающие количественное определение того, содержит ли образец, полученный от субъекта, геномы RSV, причем присутствие геномов RSV указывает, что у субъекта нет приобретенного стерильного иммунитета к RSV. Также в данном описании предусмотрены способы иммунизации субъекта, у которого нет приобретенного стерильного иммунитета к RSV, включающие интраназальное введение любого рекомбинантного MVA, описанного в данном документе, субъекту. Дополнительно или альтернативно, любой рекомбинантный MVA, описанный в данном документе, предусмотрен для применения в способах иммунизации субъекта, у которого нет приобретенного стерильного иммунитета к RSV, где способ включает интраназальное введение любого рекомбинантного MVA, описанного в данном документе, субъекту. Также, в данном описании предусмотрено применение любого рекомбинантного MVA, описанного в данном документе, для приготовления медикамента и/или вакцины для иммунизации субъекта, у которого нет приобретенного стерильного иммунитета к RSV, причем медикамент или вакцину вводят интраназально.
В некоторых вариантах осуществления изобретения в данном описании предусмотрены способы индуцирования стерильного иммунитета к RSV у субъекта, который не имеет приобретенного стерильного иммунитета к RSV, включающие интраназальное введение любого рекомбинантного MVA, описанного в данном документе, субъекту. Также в данном описании предусмотрен один любой рекомбинантный MVA, описанный в данном документе, для применения в способе индуцирования стерильного иммунитета к RSV у субъекта, который не имеет приобретенного стерильного иммунитета к RSV, где способы включают интраназальное введение одного любого рекомбинантного MVA, описанного в данном документе.
Дополнительно или альтернативно, в данном описании предусмотрено применение любого рекомбинантного MVA, описанного в данном документе, для приготовления медикамента и/или вакцины для индуцирования стерильного иммунитета к RSV у субъекта, который не имеет приобретенного стерильного иммунитета к RSV, причем медикамент или вакцину вводят интраназально.
Следует понимать, что как и предшествующее общее, так и подробное описания являются только иллюстративными и пояснительными и не сужают или ограничивают изобретение. Прилагаемые черте
- 16 031453 жи, которые включены и составляют часть данного описания, иллюстрируют различные варианты осуществления изобретения и вместе с описанием служат для объяснения принципов изобретения.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показаны гетерологичные гены RSV, использованные в тестируемых рекомбинантных MVA-конструктах, MVA-mBN199B, MVA-mBN201B, MVA-mBN201BAM2, MVA-mBN294B, MVA-mBN295B и MVA-mBN330B.
На фиг. 2 показаны специфические IgG реакции на сывороточный RSV, измеренные с помощью ELISA на основе IBL Hamburg. Мышей иммунизировали (подкожно или интраназально) два или три раза TBS или 1x108 TCID50 любого из MVA-mBN199B, MVA-mBN201B или MVA-mBN201BAM2. Контрольных мышей иммунизировали дважды интраназально 106 БОЕ RSV. Сыворотку разводили 1/100 и анализировали с применением RSV-специфического IgG ELISA на основе набора IBL Hamburg, используя планшеты, покрытые белками F и G RSV.
На фиг. 3 показаны специфические IgG реакции на сывороточный RSV, измеренные с помощью ELISA на основе IBL Hamburg, после серийного разведения. Мышей иммунизировали два или три раза (подкожно или интраназально) TBS или 1x108 TCID50 любого из MVA-mBN199B, MVA-mBN201B или MVA-mBN201BAM2. Контрольных мышей иммунизировали дважды интраназально 106 БОЕ RSV. Сыворотку разводили (1/100, 1/200 и 1/400) и анализировали с применением RSV-специфического IgG ELISA на основе набора IBL Hamburg, используя планшеты, покрытые белками F и G RSV.
На фиг. 4 показаны специфические IgG реакции на сывороточный RSV, измеренные с помощью ELISA на основе IBL Hamburg, с использованием планшет, покрытых только белком F. Мышей иммунизировали подкожно два или три раза TBS или 1x108 TCID50 любого из MVA-mBN199B, MVA-mBN201B или MVA-mBN201BAM2. Контрольных мышей иммунизировали дважды интраназально 106 БОЕ RSV. Сыворотку разводили 1/100 и анализировали с применением RSV-специфического IgG ELISA на основе набора IBL Hamburg, используя планшеты, покрытые только белком F RSV.
На фиг. 5 показаны специфические IgG реакции на сывороточный RSV, измеренные с помощью ELISA на основе Serion. Мышей иммунизировали два или три раза (подкожно или интраназально) TBS или 1x108 TCID50 любого из MVA-mBN199B, MVA-mBN201B или MVA-mBN201BAM2. Контрольных мышей иммунизировали дважды интраназально 106 БОЕ RSV. Сыворотку разводили (1/100) и анализировали с применением RSV-специфического IgG ELISA на основе набора Serion, используя планшеты, покрытые лизатом RSV.
На фиг. 6 показаны специфические IgA реакции на сывороточный RSV по сравнению со специфическими IgG реакциями на сывороточный RSV, измеренные с помощью ELISA на основе IBL Hamburg в жидкости BAL и сыворотки. Мышей иммунизировали два или три раза (подкожно или интраназально) TBS или 1x108 TCID50 любого из MVA-mBN199B, MVA-mBN201B или MVA-mBN201BAM2. Контрольных мышей иммунизировали дважды интраназально 106 БОЕ RSV. Сыворотку и жидкость BAL разводили (1/100) и анализировали с применением RSV-специфического IgG или IgA ELISA на основе набора IBL Hamburg, используя планшеты, покрытые белками F и G RSV.
На фиг. 7 показаны RSV F-, RSV G- и RSV М2-специфические Т-клеточные реакции, измеренные с помощью ELISPOT. Мышей иммунизировали два или три раза (подкожно или интраназально) TBS или 1x108 TCID50 любого из MVA-mBN199B, MVA-mBN201B или MVA-mBN201BAM2. Контрольных мышей иммунизировали дважды интраназально 106 БОЕ RSV. Селезенки изолировали на 48 день, а спленоциты повторно стимулировали тремя разными RSV F-специфическими белками (RSV-1 (SEQ ID NO: 19), RSV-2 (SEQ ID NO: 20) и RSV-3 (SEQ ID NO: 21), одним RSV G-специфическим белком (RSV-4 (SEQ ID NO: 22)), одним RSV М2-специфическим белком (RSV-9 (SEQ ID NO: 27)) или MVA-BN. Ш^-секретирующие клетки выявляли с помощью ELISPOT. Индекс стимуляции рассчитывали, как описано в разделе Примеры.
На фиг. 8 показано относительное снижение массы тела после заражения RSV (A2). Мышей иммунизировали два или три раза (подкожно или интраназально) TBS или 1x108 TCID50 любого из MVA-mBN199B, MVA-mBN201B or MVA-mBN201BAM2. Контрольных мышей иммунизировали дважды интраназально 106 БОЕ RSV. Мышей затем заражали 106 БОЕ RSV (A2) на 49-й день. Вес измеряли ежедневно со дня заражения. Вес в день заражения использовали в качестве исходного уровня для расчета процента относительного изменения массы тела.
На фиг. 9 показана нагрузка RSV в легких, измеренная методом бляшек. Мышей иммунизировали два или три раза (подкожно или интраназально) TBS или 1x108 TCID50 любого из MVA-mBN199B, MVA-mBN201B или MVA-mBN201BAM2. Контрольных мышей иммунизировали дважды интраназально 106 БОЕ RSV. Мышей затем заражали 106 БОЕ RSV (A2) в день 49. Легкие изолировали через 4 дня, а нагрузку RSV (БОЕ на легкое) определяли с помощью метода бляшек.
На фиг. 10 показана нагрузка RSV в легких, измеренная с помощью RT-qPCR. Мышей иммунизировали два или три раза (подкожно или интраназально) TBS или 1x108 TCID50 любого из MVA-mBN199B, MVA-mBN201B или MVA-mBN201BAM2. Контрольных мышей иммунизировали дважды интраназально 106 БОЕ RSV. Мышей затем заражали 106 БОЕ RSV A2 на 49-й день. Легкие изоли
- 17 031453 ровали через 4 дня, а нагрузку RSV (оценивается, исходя из наблюдаемого количества копий гена L) определили с помощью RT-qPCR.
На фиг. 11 показан уровень IL4 в BAL через 4 дня после заражения RSV (A2), измеренный с помощью ELISA. Мышей иммунизировали дважды (подкожно или интраназально) TBS или 1х108 TCID50 любого из MVA-mBN199B или MVA-mBN201B. Контрольных мышей иммунизировали дважды интраназально 106 БОЕ RSV. Мышей затем заражали 106 БОЕ RSV A2. Легкие промывали 1 мл PBS спустя 4 дня, а уровень IL4 в BAL определили с помощью ELISA (n.d. = не обнаруживается).
На фиг. 12 показан уровень IL5 в BAL через 4 дня после заражения RSV (A2), измеренный с помощью ELISA. Мышей иммунизировали дважды (подкожно или интраназально) TBS или 1х108 TCID50 любого из MVA-mBN199B или MVA-mBN201B. Контрольных мышей иммунизировали дважды интраназально 106 БОЕ RSV. Мышей затем заражали 106 БОЕ RSV A2. Легкие промывали 1 мл PBS спустя 4 дня, а уровень IL5 в BAL определили с помощью ELISA (n.d. = не обнаруживается).
На фиг. 13 показаны специфические IgG реакции на сывороточный RSV, измеренные с помощью ELISA на основе Serion. Мышей иммунизировали подкожно дважды с трехнедельным интервалом TBS или 1х108 TCID50 любого из MVA-mBN199B, MVA-mBN201B или MVA-mBN294A. Контрольных мышей иммунизировали дважды интраназально 106 БОЕ RSV. Сыворотку от 5 мышей в каждой группе, полученную через 2 недели после последней иммунизации, разбавляли и анализировали с применением RSV-специфического IgG ELISA на основе набора Serion, используя планшеты, покрытые лизатом RSV.
На фиг. 14 показаны реакции нейтрализующих антител, специфических к сывороточному RSV, измеренные с помощью PRNT. Мышей иммунизировали подкожно дважды с трехнедельным интервалом TBS или 1х108 TCID50 любого из MVA-mBN199B, MVA-mBN201B или MVA-mBN294A. Контрольных мышей иммунизировали дважды интраназально 106 БОЕ RSV. Сыворотку от 5 мышей в каждой группе, полученную через 2 недели после последней иммунизации анализировали с применением PRNT.
На фиг. 15 показаны RSV F- и RSV М2-специфические Т-клеточные реакции, измеренные с помощью ELISPOT. Мышей иммунизировали подкожно дважды с трехнедельным интервалом TBS или 1х108 TCID50 любого из MVA-mBN199B, MVA-mBN201B или MVA-mBN294A. Контрольных мышей иммунизировали дважды интраназально 106 БОЕ RSV. Селезенки изолировали на 34й в день, а спленоциты рестимулировали одним RSV F-специфическим белком (RSV-2 (SEQ ID NO: 20), одним RSV М2-специфическим белком (RSV-9 (SEQ ID NO: 27)) или MVA-BN. ШЫу-секретирующие клетки выявляли с помощью ELISPOT. Индекс стимуляции рассчитывали, как описано в разделе Примеры.
На фиг. 16 показана нагрузка RSV в легких, измеренная методом бляшек. Мышей иммунизировали подкожно дважды с трехнедельным интервалом TBS или 1х108 TCID50 любого из MVA-mBN199B, MVA-mBN201B или MVA-mBN294A. Контрольных мышей иммунизировали дважды интраназально 106 БОЕ RSV или внутримышечно 50 мкл FI-RSV. Мышей затем заражали 106 БОЕ RSV (A2) на 49-й день. Легкие изолировали спустя 4 дня, а нагрузку RSV (БОЕ на легкое) определили по методу бляшек.
На фиг. 17 показана нагрузка RSV в легких, измеренная с помощью RT-qPCR. Мышей иммунизировали подкожно дважды с трехнедельным интервалом TBS или 1х108 TCID50 любого из MVA-mBN199B, MVA-mBN201B или MVA-mBN294A. Контрольных мышей иммунизировали дважды интраназально 106 БОЕ RSV или внутримышечно 50 мкл FI-RSV. Мышей затем заражали 106 БОЕ RSV A2 на 49-й день. Легкие изолировали спустя 4 дня, а нагрузку RSV (оценивается, исходя из наблюдаемого количества копий гена L) определяли с помощью RT-qPCR.
На фиг. 18 показаны эозинофильная и нейтрофильная инфильтрации в жидкостях BAL через 4 дня после заражения RSV (A2). Мышей иммунизировали подкожно дважды с трехнедельным интервалом TBS или 1х108 TCID50 любого из MVA-mBN199B, MVA-mBN201B или MVA-mBN294A. Контрольных мышей иммунизировали дважды интраназально 106 БОЕ RSV или внутримышечно 50 мкл FI-RSV. Мышей затем заражали 106 БОЕ RSV A2. Легкие промывали 1 мл PBS спустя 4 дня и определяли процент эозинофилов и нейтрофилов в жидкости BAL.
Краткое описание последовательностей
SEQ ID NO: 1 является последовательностью ДНК, кодирующей непроцессированный белок G из штамма А2 человеческого RSV (hRSV) А2 (GenBank Accession No. M11486).
SEQ ID NO: 2 является аминокислотной последовательностью непроцессированного белка G из штамма А2 hRSV (GenBank Accession No. M11486).
SEQ ID NO: 3 является последовательностью ДНК, кодирующей непроцессированный белок F (вариант BN) из штамма А2 hRSV.
SEQ ID NO: 4 является аминокислотной последовательностью непроцессированного белка F (вариант BN) из штамма А2 hRSV.
SEQ ID NO: 5 является последовательностью ДНК, кодирующей непроцессированный белок F (вариант BN) из штамма ALong hRSV.
SEQ ID NO: 6 является аминокислотной последовательностью непроцессированного белка F (вариант BN) из штамма ALong hRSV.
SEQ ID NO: 7 является последовательностью ДНК, кодирующей усеченный белок G, лишенной
- 18 031453 трансмембранного и цитоплазматического доменов из штамма В hRSV (GenBank Accession No. P20896).
SEQ ID NO: 8 является аминокислотной последовательностью усеченного белка G, лишенной трансмембранного и цитоплазматического доменов из штамма В hRSV (GenBank Accession No. P20896).
SEQ ID NO: 9 является последовательностью ДНК, кодирующей белок N, лишенной терминирующего кодона из штамма А2 hRSV (Genbank Accession No. M11486).
SEQ ID NO: 10 является аминокислотной последовательностью белка N, лишенной терминирующего кодона из штамма А2 hRSV (Genbank Accession No. M11486).
SEQ ID NO: 11 является последовательностью ДНК, кодирующей фрагмент протеазы 2А из вируса ящура, лишенной как стартового, так и терминирующего кодонов.
SEQ ID NO: 12 является аминокислотной последовательностью фрагмента протеазы 2 А из вируса ящура, лишенной как стартового, так и терминирующего кодонов.
SEQ ID NO: 13 является последовательностью ДНК, кодирующей непроцессированный белок М2, лишенной стартового кодона из штамма А2 hRSV (GenBank Accession No. M11486).
SEQ ID NO: 14 является аминокислотной последовательностью непроцессированного белка М2, лишенной стартового кодона из штамма А2 hRSV (GenBank Accession No. M11486).
SEQ ID NO: 15 является последовательностью ДНК, кодирующей усеченный белок F, лишенной трансмембранного и цитоплазматического доменов (вариант BN) из штамма А2 hRSV (GenBank Accession No. M11486).
SEQ ID NO: 16 является аминокислотной последовательностью усеченного белка F, лишенной трансмембранного и цитоплазматического доменов (аариант BN), из штамма А2 hRSV (GenBank Accession No. M11486).
SEQ ID NO: 17 является последовательностью ДНК, кодирующей белок N, лишенной терминирующего кодона штамма А2 hRSV (Genbank Accession No. M11486), + последовательность ДНК, кодирующая фрагмент протеазы 2А из вируса ящура, лишенная как стартового так и терминирующего кодонов, + последовательность ДНК, кодирующая непроцессированный белок М2, лишенный стартового кодона из штамма А2 hRSV (GenBank Accession No. M11486).
SEQ ID NO: 18 является аминокислотной последовательностью белка N из штамма А2 hRSV (Genbank Accession No. M11486) + аминокислотная последовательность фрагмента протеазы 2А из вируса ящура, лишенная стартового кодона, + аминокислотная последовательность непроцессированного белка М2, лишенная стартового кодона из штамма А2 hRSV (GenBank Accession No. M11486).
SEQ ID NO: 19 является аминокислотной последовательностью пептида RSV-1, полученного из белка F RSV.
SEQ ID NO: 20 является аминокислотной последовательностью пептида RSV-2, полученного из белка F RSV.
SEQ ID NO: 21 является аминокислотной последовательностью пептида RSV-3, полученного из белка F RSV.
SEQ ID NO: 22 является аминокислотной последовательностью пептида RSV-4, полученного из белка G RSV.
SEQ ID NO: 23 является аминокислотной последовательностью пептида RSV-5, полученного из белка G RSV.
SEQ ID NO: 24 является аминокислотной последовательностью пептида RSV-6, полученного из белка G RSV.
SEQ ID NO: 25 является аминокислотной последовательностью пептида RSV-7, полученного из белка G RSV.
SEQ ID NO: 26 является аминокислотной последовательностью пептида RSV-8, полученного из белка G RSV.
SEQ ID NO: 27 является аминокислотной последовательностью пептида RSV-9, полученного из белка М2 RSV.
SEQ ID NO: 28 является последовательностью ДНК, кодирующей непроцессированный белок F из штамма А2 hRSV.
SEQ ID NO: 29 является аминокислотной последовательностью непроцессированного белка F из штамма А2 hRSV.
SEQ ID NO: 30 является последовательностью ДНК, кодирующей непроцессированный белок G из штамма А2 hRSV.
SEQ ID NO: 31 является аминокислотной последовательностью непроцессированного белка G из штамма А2 hRSV.
SEQ ID NO: 32 является последовательностью ДНК, кодирующей непроцессированный белок М2 из штамма А2 hRSV.
SEQ ID NO: 33 является аминокислотной последовательностью непроцессированного белка М2 из штамма А2 hRSV.
SEQ ID NO: 34 является последовательностью ДНК, кодирующей непроцессированный белок N из штамма А2 hRSV.
- 19 031453
SEQ ID NO: 35 является аминокислотной последовательностью непроцессированного белка N из штамма А2 hRSV.
SEQ ID NO: 36 является праймером 1, использованным в RT-qPCR.
SEQ ID NO: 37 является праймером 2, использованным в RT-qPCR.
SEQ ID NO: 38 является зондом 6, использованным в RT-qPCR.
SEQ ID NO: 39 является нуклеотидной последовательностью промотора PrS.
SEQ ID NO: 40 является нуклеотидной последовательностью промотора Pr7,5.
SEQ ID NO: 41 является нуклеотидной последовательностью промотора PrSynIIm.
SEQ ID NO: 42 является нуклеотидной последовательностью промотора PrLE1.
SEQ ID NO: 43 является нуклеотидной последовательностью промотора PrH5m.
Примеры
Пример 1. Конструирование рекомбинантных MVA.
Получение рекомбинантного MVA было выполнено путем вставки RSV-кодирующих последовательностей вместе с индикаторными промоторами (фиг. 1) в геном MVA посредством гомологичной рекомбинации в клетки CEF с использованием селекционного маркера для отбора рекомбинантного MVA. Применение межгенных областей (IGR) в качестве сайтов вставки описано в WO 03/097845. Для удаления селекционного маркера был применен второй этап гомологичной рекомбинации.
Вирус MVA-BN® использовали в качестве исходного материала для получения рекомбинантного MVA-mBN199B, содержащего гены для RSV-A2-G и RSV-F-A2_BN в IGR88/89. Оригинальный материал MVA-mBN199 был использован в качестве исходного материала для получения MVA-mBN201B, описанного ниже.
Вставки в IGR88/89 (MVA-mBN199B).
Кодирующая последовательность для RSV-A2-G базируется на природной последовательности гликопротеина G штамма RSV-A2. Кодирующая последовательность белка слияния BN RSV-F-A2 также базируется на штамме RSV-A2, но была модифицирована Bavarian Nordic. Оба вставленных гена были синтезированы Geneart с использованием человеческого адаптированного кодона и применены для клонирования рекомбинационной плазмиды. Белковая последовательность RSV-A2-G демонстрирует 100% идентичность с последовательностью Р03423.1 GenBank. Белковая последовательность BN RSV-F-A2 демонстрирует только 99% идентичность с последовательностью Р03420.1 GenBank из-за одной единичной аминокислотной замены (Р на А) в положении 103.
Вставки в IGR148/149 (MVA-mBN201B).
Кодирующие последовательности для RSV-N-A2 и RSV-M2-A2 базируются на природных последовательностях соответствующих гликопротеинов штамма RSV-A2. Оба гена соединены саморасщепляющейся пептидной последовательностью 2А [M.D. Ryan et al. (1991), J. Gen. Virol. 72 (Pt 11): 2727-2732], что позволяет экспрессировать два отдельных нативных белка под контролем единого промотора. Кодирующие последовательности для RSV-G(B) и RSV-F ALong BN были усечены для удаления трансмембранных доменов с тем, чтобы можно было секретировать экспрессированные белки. Все вставленные гены были синтезированы Geneart с использованием оптимизированного кодона и применены для клонирования рекомбинационной плазмиды. Белковые последовательности RSV-N-A2 и RSV-M2-A2 демонстрируют 100% идентичность с последовательностью Р03418.1 и Р04545.1 GenBank соответственно. Белковая последовательность усеченного RSV-G(B) демонстрирует 100% идентичность с последовательностью Р20896.1 GenBank. Кодирующая последовательность усеченного RSV-F Along BN была разработана, чтобы содержать первые 526 аминокислот белка RSV-F, как описано R.P. Du et al. (1994), Biotechnology (NY), 12(8):813-818.
Мутант с делецией в М2(А2) из MVA-mBN210BAM2.
MVA-mBN210BAM2 включает делеционную мутацию в 12-м кодоне гена М2(А2), не позволяющую экспрессироваться функциональному М2. Эта делеция вызывает добавление двух аминокислот треонина и аланина к первым 11 аминокислотам из М2 (А2), за которыми следует транскрипционный терминатор (терминирующий кодон UGA).
Пример 2. Иммуногенность и эффективность вакцин рекомбинантных MVA, экспрессирующих белок F RSV, белок G RSV, белок N RSV и белок М2 RSV.
Вакцинный кандидат MVA-mBN199B кодирует гликопротеин (G) и белок слияния (F) из RSV, тогда как MVA-mBN201BAM2 и MVA-mBN201B экспрессируют усеченные версии F и G в дополнение к непроцессированным белкам F и G, нуклеокапсидный белок (N) и в случае MVA-mBN201B также матриксный белок (М2) из RSV (см. фиг. 1). Целью этих экспериментов был анализ иммуногенности и защитной эффективности MVA-mBN201BAM2 и MVA-mBN201B по сравнению с MVA-mBN199B после двух или трех иммунизации с путем подкожных (s.c.) или интраназальных (i.n.) введений.
Эффективность этих конструктов тестировали, используя модель заражения RSV (A2) на мышах BALB/c. Две иммунизации MVA-mBN199B или MVA-mBN201B предоставляли частичную защиту, как было оценено с помощью RT-qPCR, при подкожном применении и почти полную защиту при интраназальном применении. Защита, предоставленная MVA-mBN201B, была лучше, чем защита, предоставлен
- 20 031453 ная MVA-mBN199B. He наблюдалось отличий в гуморальных иммунных ответах, вызванных двумя конструктами, хотя значительные отличия наблюдались в Т-клеточных ответах. MVA-mBN199B вызывал хороший RSV F-специфический клеточный ответ, тогда как с MVA-mBN201B наблюдался сильный М2специфический Т-клеточный ответ, а также более ярко выраженный G-специфический ответ по сравнению с MVA-mBN199B. Так как IgG и Т-клеточные ответы, индуцированные после подкожной и интраназальной иммунизации, были похожими, то почти полный стерильный иммунитет, полученный с помощью интраназальных иммунизации, вероятно коррелирует с индукцией и секрецией RSV-специфического IgA в сайте мукозальной инфекции. Для MVA-mBN201BAM2 отсутствие М2-специфических Т-клеточных ответов коррелирует со сниженной защитой по сравнению с MVA-mBN201B и приводит к подобной защите, нежели чем MVA-mBN199B.
План исследования.
Мышам вводили подкожно (s.c.) или интраназально (i.n.) 1х108 TCID50 MVA-mBN199B (группы 3, 4 и 5), 1х108 TCID50 MVA-mBN201B (группы 6, 7 и 8) или 1х108 TCID50 MVA-mBN201BAM2 (группа 9). Мышей заражали два раза (группы 3, 4, 6, 7 и 9) или три раза (группы 5 и 8) согласно табл. 1. Двум контрольным группам вводили (s.c.) дважды TBS (группа 1) или интраназально RSV (группа 2) согласно табл. 7. Кровь брали за день до иммунизации или заражения, а также в день умерщвления. Титры RSVспецифического IgG определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). На 48-й день половину мышей умерщвляли. Удаляли их селезенки и готовили для анализа RSVспецифических Т-клеточных ответов с помощью метода иммуноферментных пятен (ELISPOT). На 49-й день оставшихся мышей заражали (i.n.) 106 БОЕ RSV A2. Внешний вид и вес тела контролировали ежедневно, начиная со дня заражения. Через 4 дня после заражения мышей умерщвляли путем инъекции повышенной дозы кетамина-ксилазина и обескровливали. После легочного лаважа легкие удаляли, а нагрузку RSV анализировали с помощью метода бляшек и RT-qPCR.
Таблица 1
План исследования
Введение исследуемых и
Кровопускание и
Численность контрольных образцов Заражение
Группа группы Клетка Схема Доза на ELISPOT (день)%, #
Инъекции (день)% Путь инъекцию (день)%
5 А 13, 34, 48 и 53 49
1 5 В TBS 14 и 35 s . с. η. a . 13, 34 и 48& -
5 С 13, 34, 48 и 53 49
2 5 D RSV 14 и 35 i.n. 106 БОЕ 13, 34 и 48& -
5 Е MVA- lxlO8 13, 34, 48 и 53 49
3 5 F mBN199B 14 и 35 s.c. tcid50 13, 34 и 48& -
5 G MVA- lxlO8 13, 34, 48 и 53 49
4 5 Н mBN199B 14 и 35 i.n. tcid50 13, 34 и 48& -
-1, 20 34, 48 и
5 J MVA- 0, 21 и lxlO8 49
5 mBN199B 35 s.c. tcid50 53
5 К -1, 20 34 и 48& -
5 L MVA- lxlO8 13, 34, 48 и 53 49
6 5 М mBN201B 14 и 35 s.c. tcid50 13, 34 и 48& -
5 N MVA- lxlO8 13, 34, 48 и 53 49
7 5 Р mBN201B 14 и 35 i.n. tcid50 13, 34 и 48& -
-1, 20 34, 48 и
5 Q MVA- 0, 21 и lxlO8 49
8 mBN201B 35 s.c. tcid50 53
5 R -1, 20 34 и 48& -
MVA- lxlO8
9 5 W Π1ΒΝ2 01ΒΔΜ2 14 и 35 s.c. tcid50 13, 34, 48 и 53 49
% Относительно первой иммунизации.
# Мыши были заражены интраназальным путем 106 БОЕ RSV А2. Через четыре дня после заражения мышам делали кровопускание и умерщвляли под наркозом. Отбирали образцы жидкости BAL и легких.
& В день 48 этих мышей умерщвляли, а селезенки анализировали с помощью ELISPOT.
- 21 031453
Схема исследования.
Схема прижизненной фазы приведена в табл. 2.
Таблица 2
Схема исследования прижизненной фазы
День** Процедуры
-16 Прибытие и помещение 85 мышей BALB/c в виварий, распределение клеточных карточек и выделение по 5 мышей на клетку
-1 Клиппирование ушей, включение/исключение обследования всех мышей
-1 Предварительное кровопускание у мышей из клеток J, К, Q и R (пункция лицевой вены справа)
0 1-е введение мышам из клеток J, К, Q и R
13 Предварительное кровопускание у всех мышей за исключением мышей из клеток J, К, Q и R (пункция лицевой вены справа)
14 1-е введение всем мышам за исключением мышей из клеток J, К, Q и R
20 Кровопускание у мышей из клеток J, К, Q и R (пункция лицевой вены слева)
21 2-е введение мышам из клеток J, К, Q и R
34 Кровопускание у всех мышей (ретро-бульбарная пункция вены левого глаза)
35 2- е введение всем мышам за исключением мышей из клеток J, К, Q и R 3- е введение мышам из клеток J, К, Q и R
48 Кровопускание у всех мышей (ретро-бульбарная пункция вены правого глаза) окончательное кровопускание для клеток В, D, F, И, К, Μ, Р и R
48 Селезенки мышей из клеток В, D, F, Н, К, М, Р и R будут удалены для анализа ELISPOT
49 Заражение всех оставшихся мышей
49-53 Ежедневная оценка внешнего вида и веса тела
53 Окончательное кровопускание, умерщвление & взятие образцов BAL & легких у оставшихся мышей
** Относительно дня первой иммунизации.
Материалы и методы.
Экспериментальные животные: 85 самок мышей BALB/cJ Rj (H-2d) в возрасте семи недель были получены от Janvier (Route des Chenes Secs, F-53940 Le Genest-Saint-Isle, France). У всех мышей не было специфических патогенов.
Содержание животных: Исследование проводили в комнате 117 вивария в баварском Nordic-Martinsreid. Этот блок снабжался фильтрованным воздухом при температуре 20-24°C и относительной влажности от 40 до 70%. Комнату искусственно освещали, чередуя 14 ч света и 10 ч темноты. Исследование периода аклиматизации составило 15 дней. Животных содержали в прозрачных клетках SealSafe™ (H Temp [polysulfon] cage Type II L - Euro standard) площадью 530 см2. Клетки закрывали крышкой H-Temp SealSafe™. Клетки помещали в систему TECNIPLAST-IVC SealSafe™ с циркуляционным блоком SLIMLine™, обеспечивая каждую клетку отдельно НЕРА-фильтром для воздуха. Подстилку
- 22 031453 для животных меняли раз в неделю.
Диета и выпаивание: Мыши были обеспечены свободным доступом к облученной поддерживающей диете (SSNIFF R/M-H, облученные, V1534-727) и воде (аутоклавированной при 121°C в течение 20 мин).
Процедуры предварительной обработки. Идентификация животных.
Чтобы индивидуально пометить животных в каждой клетке, проставление клейма на уши проводили согласно стандартным процедурам.
Исследование по методу включения/исключения. Исследование по методу включения/исключения проводили согласно стандартным процедурам.
Взятие проб крови для предварительного кровопускания: Образцы крови приблизительно по 150 мкл были получены пункцией лицевой вены в соответствии со стандартными процедурами. Образцы крови переносили в лабораторию для дальнейшей обработки в соответствии со стандартными процедурами.
Процедуры обработки. Приготовление и введение исследуемых препаратов 1-3 и препарата сравнения.
Приготовление и введение исследуемых препаратов и препарата сравнения проводили в кабинете класса II микробиологической безопасности (HERAsafe®/class II type H, Kendro) согласно стандартным процедурам. Вкратце, для подкожного введения рекомбинантные MVA разбавляли в TBS для получения рабочего раствора с концентрацией 2х108 TCID50/^. 1х108 TCID50 в 500 мкл инъецировали подкожно согласно стандартным процедурам. Для интраназального введения рекомбинантные MVA разбавляли в TBS для получения рабочего раствора с концентрацией 2х109 ТСГО50/мл. По 50 мкл разбавленных вирусов вводили в одну ноздрю анестезированных (ксилазином/кетамином) животных согласно стандартным процедурам. По 500 мкл TBS вводили подкожно согласно стандартным процедурам.
Приготовление и введение исследуемого препарата 4/вирус заражения: Флакон с RSV оттаивали и использовали настолько быстро, насколько это возможно из-за вирусной нестабильности (максимально 15 мин на льду). Вирус держали на льду все время и использовали сразу для заражения анестезированных (ксилазином/кетамином) животных 100 мкл раствора неразведенного вируса интраназальным путем согласно стандартным процедурам.
Постпроцедурные обработки.
Вес тела: Вес тела контролировали ежедневно, начиная со дня заражения и до умерщвления согласно стандартным процедурам.
Забор крови: Образцы крови (приблизительно по 150 мкл) получали путем ретробульбарной пункции или пункции лицевой вены (для получения дополнительной информации см. табл. 1 и 2) согласно стандартным процедурам. Образцы крови переносили в лабораторию для дальнейшей обработки в соответствии со стандартными процедурами.
Эвтаназия: Эвтаназию половины мышей проводили в день 48 путем смещения шейных позвонков. В день 53, оставшиеся мыши получали двойную дозу кетамина-ксилазина путем внутрибрюшинной инъекции, а эвтаназию осуществляли путем перерезания аорты в брюшной полости.
Удаление селезенок: Селезенки удаляли асептически. Их помещали в пробирки, наполненные средой согласно стандартным процедурам. Эти пробирки вносили в виварий, а затем выносили согласно стандартным процедурам.
Промывание легких и удаление легки: Жидкость BAL собирали путем промывания легких 4 раза 1 мл PBS. Затем легкие удаляли и мгновенно замораживали в виде двух половинок в жидком азоте для дальнейшего анализа бляшек и экстракции РНК.
Анализ: Обработка образцов крови и хранение сывороток. После доставки в лабораторию Образцы крови были обработаны в сыворотку согласно стандартным процедурам. После приготовления сыворотку хранили при -20°C (±5°C), пока не понадобится для анализа.
Анализ титров RSV-специфических антител из сывороточных образцов: Общие титры ELISA RSV-специфического IgG определяли во всех сывороточных образцах, используя модифицированный набор ELISA (Serion ELISA classic, Cat. No. ESR113G). Вместо конъюгированного щелочной фосфатазой антитела к человеческому IgG, которое входит в набор, конъюгированное щелочной фосфатазой козье антитело к мышиному IgG (Serotec, Cat. No. 103004) использовали в качестве вторичного антитела.
Титры ELISA RSV-F/G-специфического IgG определяли во всех сывороточных образцах и жидкости BAL, используя модифицированный набор ELISA (IBL-Hamburg Ref. RE56881). Вместо POD-конъюгированного антитела к человеческому IgG, которое входит в набор, HRP-конъюгированное овечье антитело к мышиному IgG (ref. BN-687-95/96, Serotec, Cat. No. AAC10P) использовали в качестве вторичного антитела.
За исключением групп 4 и 7, титры ELISA RSV-F-специфического IgG определяли в сывороточных образцах на 48-й день, используя модифицированный набор ELISA (IBL-Hamburg Ref. Реагенты RE56881 и микротитрационные полоски RSV (F-белок) IgG Ref. RE56692). Вместо POD-конъюгированного антитела к человеческому IgG, входящего в набор, HRP-конъюгированное овечье антитело к мышиному IgG (ref. BN-687-95/96 Serotec, Cat. No. AAC10P) использовали в качестве вто
- 23 031453 ричного антитела.
Титры ELISA RSV-специфического IgA в сыворотке и жидкости BAL определяли в образцах с 48дня по 53-й день соответственно, используя модифицированный набор ELISA (IBL-Hamburg Ref. RE56881): Вместо POD-конъюгированного антитела к человеческому IgG, входящего в набор, HRPконъюгированное овечье антитело к мышиному IgA (ref. BN-687-95/96 Serotec, Cat. No. STAR137P) использовали в качестве вторичного антитела.
Анализ RSV-специфических клеточных иммунных реакций спленоцитов: RSV F-, RSV G- и RSV М2-специфические клеточные реакции определяли спустя две недели после последней иммунизации путем повторного стимулирования спленоцитов специфическими пептидами, как описано в другом документе (см., например, S.M. Varga et al. (2000); S. Johnstone et al. (2004); S. Jiang et al., (2002) и А.В. Kulkarni et al., J. Virol. 67(7):4086-4092 (1993)), и выявляли высвобождение IFNy из спленоцитов с помощью анализа ELISPOT.
Метод анализа ELISPOT: Для анализа ELISPOT использовали набор мышиного IFNy (BD Biosciences, Cat. No. 551083). Этот анализ проводили согласно инструкциям производителя. Вкратце, планшеты покрывали иммобилизированным антителом за день до изолирования спленоцитов. После изолирования клетки переносили в планшеты ELISPOT и стимулировали разными пептидами (см. табл. 3) в течение 20 ч при 37°C. Продуцирование IFNy выявляли, используя детекторное антитело. Планшеты проявляли, используя BD™ ELISPOT AEC Substrate Set (BD Biosciences, Cat. No. 551951) согласно инструкциям производителя.
ELISPOT план стимулирования: Все условия были испытаны в двух повторениях. Пептиды RSV-1, RSV-2, RSV-3, RSV-4 и RSV-5 (см. табл. 3) использовали в конечной концентрации 5 мкг/мл (1 мкг/лунку) для стимулирования 5х105 и 2,5х105 спленоцитов на лунку. MVA (контроль иммунизации) использовали при множественном заражении (MOI) из 10 для стимуляции 5х105 и 2,5х105 спленоцитов на лунку и конкавалин А (ConA [положительный контроль]) использовали в конечной концентрации 0,5 мкг/мл для стимуляции 2,5х105 спленоцитов. В качестве негативного контроля 5х105 спленоциты культивировали только в среде (RPMI-1640, обогащенной Glutamax, пенициллином, стрептомицином, 10% фетальной телячьей сывороткой и 105М β-меркаптоэтанола).
Таблица 3
RSV-специфическая стимуляция
Название пептида Специфичность Пептидная последовательность
RSV-1 F TYMLTNSELL (SEQ ID N0:19)
RSV-2 F KYKNAVTEL (SEO ID N0:20)
RSV-3 F ELQLLMQSTPAANNR (SEQ ID N0:21)
RSV-4 G WAICKRIPNKKPG (SEQ ID N0:22)
RSV-5 М2 SYIGSINNI (SEQ ID N0:27)
Анализ жидкости BAL из легких: Клеточную характеристику BAL не удалось осуществить из-за проблем окрашивания. Нагрузку RSV в образцах легких определяли с помощью метода бляшек RSV и RT-qPCR.
Метод бляшек RSV: Одну половину каждого из мгновенно замороженных легких гомогенизировали в 1 мл холодной среды с использованием французского пресса (среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко, обогащенная 7% фетальной телячьей сывороткой). После короткого центрифугирования по две пробирки каждого супернатанта титровали в двукратных серийных разведениях для выращивания монослоев клеток Веро в 48-луночных плоскодонных планшетах. Через шесть дней монослои промывали и фиксировали 1% формальдегидом. Через 24 ч монослои окрашивали 0,04% нейтральным красным и подсчитывали бляшки.
RSV RT-qPCR: Тотчас же удаляли по 100 мкл гомогенезированной ткани легких и выделяли РНК, используя мини-набор RNeasy® от Qiagen (Cat. No. 74104). Реакцию обратной транскрипции проводили, используя болыпеемкостный набор РНК-к-кДНК от Applied Biosystems (Cat. No. 4387406). PCR, специфическую к гену L RSV, проводили в термоциклере со следующими параметрами: (1) 50°C в течение 2 мин; (2) 95°C в течение 10 мин; (3) 45 циклов (15 с при 95°C, 1 мин при 60°C), используя универсальный Master Mix для PCR от Applied Biosystems (Cat. No. 4352042) и смесь трех праймеров: (1) праймер 1 (5'-GAA CTC AGT GTA GGT AGA ATG TTT GCA-3'; SEQ ID NO: 36); (2) праймер 2 (5'-ТТС AGC TAT CAT ТТТ CTC TGC САА Т-3'; SEQ ID NO: 37) и (3) зонд 6 (5'-ТТТ GAA ССТ GTC TGA АСА ТТС CCG GTT-3'; (SEQ ID NO: 38). Число копий определяли по калибровочной кривой плазмидного вектора pMISC202, содержащего фрагмент гена L RSV. Подобные реакции для мышиного бета-актина использовали в качестве внутренних контролей для ввода кДНК, используя VIC/MGB-меченый зонд от Applied Biosystems (Cat. No. 4351315).
- 24 031453
Документирование исследования: Блок-схему прижизненной фазы готовили для сбора всей информации в течение отдельных этапов прижизненной фазы. Кроме того, информацию, специфическую относительно мышей или клетки, записывали на клеточной карточке. Клеточные карточки не рассматриваются в качестве исходных данных исследования, но являются требованием правительства Верхней Баварии.
Блок-схему аналитической фазы готовили для сбора всей информации в течение отдельных этапов аналитической фазы. Анализы документировали в специальных тестовых записях или лабораторных журналах; перекрестные ссылки документировали в блок-схеме аналитической фазы. Всю аналитическую документацию, включая исходные данные, пересматривали согласно стандартным процедурам. Кроме того, технические паспорта для образцов сыворотки готовили согласно стандартным процедурам.
Обработка данных: Необработанные данные переносили в соответствующие Excel-файлы для дальнейшего анализа согласно стандартным процедурам.
ELISA: Средние значения OD и стандартные ошибки среднего рассчитывали с помощью Excel.
ELISPOT: Планшеты ELISPOT считывали CTL-ридером согласно инструкциям производителя. Количество пятнообразующих клеток (SFC) определяли в каждой лунке и заносили в Excel-файл для дальнейшей оценки. Из инкубации с 5х105 и 2,5х105 клеток/лунку, количество пятен на 1х106 спленоцитов подсчитывали в каждой лунке. Рассчитывали среднее для негативного контроля и вычитали из каждого значения до вычисления среднего значения на мышь для получения значения индекса стимуляции (SI) (частота пептид-специфических спленоцитов мыши, выделяющих IFN-γ) в расчете на мышь.
Для пептидной стимуляции SI получали из лунок с 5х105 и 2,5х105 клеток, кроме случаев, когда пятен было слишком много, чтобы подсчитать или RSV-иммунизированных животных. В этих случаях использовали только концентрацию 2,5х105. Для MVA-BN стимуляции SI получали из лунок с 5х105 клетками, кроме случаев, когда пятен было слишком много, чтобы подсчитать. В таком случае использовали концентрацию 2,5х105. После определения SI для отдельных животных среднее SI (SFC на 1х106 спленоцитов) и стандартную ошибку среднего (SEM) рассчитывали для каждой группы.
Изменения веса тела: Индивидуальные значения веса тела (в граммах) перед заражением RSV были приняты в качестве базовых значений. С этими базовыми значениями изменения веса тела отдельных животных (в%), а также изменения среднего веса тела в группах рассчитывали для каждой контролируемой временной точки после заражения с использованием Microsoft Excel.
Метод бляшек RSV: Количество бляшек подсчитывали в лунке с тремя самыми высокими исчисляемыми разведениями вируса. Среднее количество бляшек, регулируемое фактором разведения, затем умножали на 10, чтобы получить титр раствора в БОЕ/мл, и, наконец, умножали на 2, чтобы получить титр на каждое легкое.
RSV RT-qPCR: PCR-амплификации измеряли в режиме реального времени, используя ABI 7500 от Applied Biosystems (Cat. No. 4351107), и анализировали, используя системное программное обеспечение, поставляемое Applied Biosystems. Все значения сравнивали с L-генным стандартом и нормировали к определению мышиного бета-актина для каждого образца.
Результаты.
Анализ гуморального иммунного ответа: Анализ ответа RSV-специфического антитела IgG из сывороточных образцов. Сыворотку сначала анализировали с помощью ELISA, исходя из набора IBL-Hamburg, используя планшеты, покрытые только белками F и G рекомбинантного RSV (фиг. 2 и 3). Как показано на фиг. 2, подобные RSV-специфические IgG ответы (OD в диапазоне от 0,870 до 1,347) наблюдались со всеми тремя конструктами (MVA-mBN199B, MVA-mBN201BAM2 и MVA-mBN201B) после единичной иммунизации и не зависели от пути введения, использованного для иммунизации (подкожно или интраназально). В то время как вторая иммунизация привела к почти 2,0-3,5-кратному повышению реакции антител (OD в диапазоне от 2,627 до 3,407), третья подкожная инъекция имела лишь незначительное влияние на реакцию В-клеток, вызывая увеличение приблизительно 0,500 единиц OD по сравнению с OD после второй иммунизации. Подобные результаты были получены с помощью ELISA, исходя из набора IBL Hamburg с использованием планшет, покрытых только белком F рекомбинантного RSV (фиг. 4).
После серийного разведения сыворотки (1/100, 1/200 и 1/400) RSV F- и RSV G-специфические ELISA результаты показали, что MVA-mBN199B, MVA-mBN201BAM2 и MVA-mBN201B вызывали подобные RSV F- и RSV G-специфические IgG ответы, несмотря на дополнительную экспрессию усеченного белка F RSV и усеченного белка G RSV конструктами MVA-mBN201BAM2 и MVA-mBN201B (фиг. 3). После двух подкожных иммунизаций конструктами ответ В-клеток все еще был ниже по сравнению с иммунизацией только RSV (положительный контроль). Для достижения уровня иммунного ответа, вызванного двумя интраназальными введениями RSV, потребовалась третья подкожная иммунизация конструктами MVA-mBN. В отличие от этого две интраназальные иммунизации MVA-mBN199B и MVA-mBN201B вызвали подобные В-клеточные реакции, как и две иммунизации только RSV или три подкожные иммунизации MVA-mBN199B, MVA-mBN201BAM2 и MVA-mBN201B, когда анализировали ELISA, исходя из набора IBL Hamburg (фиг. 3).
- 25 031453
Когда сыворотку снова анализировали с помощью ELISA на основе набора Serion, используя планшеты, покрытые лизатом RSV, не было обнаружено отличий между MVA-mBN199B, MVAmBN201BAM2 и MVA-mBN201B. Не наблюдалось отличий между 2 и 3 иммунизациями или между подкожным и интраназальным путями введения. Кроме того, ответы были ниже, чем реакции на антитела, индуцированные 2 интраназальными введениями RSV (фиг. 5).
Анализ ответов RSV-специфических антител IqA. RSV F- и RSV G-специфический IgA (исходя из набора IBL Hamburg) измеряли в жидкости BAL через 4 дня после заражения (на 53й день). Кроме того, также с помощью ELISA анализировали BAL и сыворотку RSV F-и RSV G-специфического IgG. Результаты сравнили с результатами, полученными в сыворотке прямо перед заражением (на 48-й день), и показали на фиг. 6.
Как и ожидалось, реакции IgA были выявлены только после интраназального введения RSV, MVA-mBN199B и MVA-mBN201B. Хотя IgG также может быть обнаружен в BAL, IgA был обнаружен при более высоком уровне после интраназального введения. Уровни IgA в сыворотке были значительно ниже, чем уровни IgG независимо от пути введения.
Анализ RSV-специфических клеточных иммунных ответов. Т-клеточные ответы анализировали в селезенке с помощью ELISPOT через две недели после последней иммунизации (фиг. 7). MVA-mBN199B, введенный интраназальным или подкожным путем, вызвал сильный RSV-F специфический Т-клеточный ответ. Иммунная реакция, главным образом, была направлена против RSV-Fспецифического пептида RSV-2, который является иммунодоминантным при отсутствии RSV-M2. Ответ составил приблизительно 2000 пятен на 106 спленоцитов после 2-й подкожной иммунизации и приблизительно 4000 после 3-й подкожной инъекции или 2-го интраназального применения. Подобно ответу на интраназальные введения RSV был обнаружен низкий G-специфический ответ на пептид RSV-4 после иммунизации MVA-mBN199B (приблизительно 500 пятен на 106 спленоцитов) и, как и ожидалось, MVA-mBN199B не индуцировал М2-специфические Т-клетки. Пептид М2 является иммунодоминантным пептидом RSV у мышей. Следовательно, интраназальные иммунизации RSV индуцировали хороший М2-специфический Т-клеточный ответ более 1000 пятен на 106 спленоцитов и почти не было F-специфического Т-клеточного ответа.
Как и MVA-mBN199B, MVA-mBN201B вызвал сильный Т-клеточный ответ, но в нем доминировал М2 (более 4000 пятен на 106 спленоцитов независимо от количества введенных доз и пути введения). Даже G-специфический ответ, вызванный MVA-mBN201B, был по меньшей мере в 3 раза выше, чем G-специфический ответ, вызванный MVA-mBN199B или RSV. В отличие от MVA-mBN199B, F-специфический ответ, вызванный MVA-mBN201B, был очень низким, меньше чем 600 пятен на 106 спленоцитов для пептида RSV-2.
RSV-заражение штаммом А2 RSV. Мышей заражали интраназально 106 БОЕ RSV (A2) спустя две недели после последней иммунизации. Вес тела проверяли каждый день. Через четыре дня после иммунизации мышей умерщвляли. После промывания легких 1 мл PBS легкие удаляли, а нагрузку RSV в легких определяли методом бляшек и RT-qPCR, проведенным, как описано выше.
Изменения веса тела. Все мыши теряли в весе через день после иммунизации, наиболее вероятно из-за анестезии или самого интраназального заражения (фиг. 8). TBS-обработанные мыши начинали существенно терять в весе через 4 дня после заражения RSV. В отличие от этого, мыши, которые получили RSV интраназально в течение трех иммунизаций, не демонстрировали потерю в весе. Все мыши, подкожно иммунизированные MVA-mBN199B, MVA-mBN201B или MVA-mBN201BAM2, потеряли приблизительно 20% веса через 4 дня после иммунизации. Такая потеря в весе была описана раньше Olszewska et al. (Vaccine 23:215 (2004)). Однако RT-qPCR результаты (фиг. 10) показывают, что она коррелирует с лучшей защитой и более ранним выведением RSV из легких из-за вызванного вакциной ответа CTL по сравнению с нормальным клиренсом исходной инфекции RSV. При интраназальном применении иммунизированные MVA-mBN201B мыши имели сходную потерю в весе, что и подкожно иммунизированные мыши через 2 дня после заражения, но восстанавливались на 4-й день после заражения из-за низкой нагрузки RSV в легких по сравнению с подкожным путем (фиг. 10).
Подобно RSV-иммунизированной группе, мыши, иммунизированные интраназально MVA-mBN199B, не теряли в весе.
Нагрузка RSV, измеренная с помощью метода бляшек. Через 4 дня после иммунизации было определено в среднем 57671 БОЕ на легкое для неиммунизированных мышей (фиг. 9). Как и в RSVиммунизированной контрольной группе, в легких животных, иммунизированных MVA-mBN199B, MVA-mBN201B или MVA-mBN201BAM2, не обнаружили бляшки А2 RSV после двцх подкожных или интраназальных введений.
Нагрузка RSV, измеренная с помощью RT-qPCR. Нагрузку RSV в легких также анализировали с помощью RT-qPCR (фиг. 10). Несмотря на то что у одной вакцинированной мыши с помощью метода бляшек не был обнаружен RSV, геномы RSV все еще обнаруживались у мышей, трижды иммунизированных MVA-mBN199B. После трех иммунизации MVA-mBN199B, нагрузка RSV была в 38 раз ниже по сравнению с контрольной группой TBS. Геномы RSV также обнаруживались после трех иммунизации
- 26 031453
MVA-mBN201B, но нагрузка была в 158 раз ниже по сравнению с контрольной группой TBS. Не было существенных различий между мышами, иммунизированными два или три раза. Примечательно, что снижение нагрузки RSV, наблюдаемое с MVA-mBN201B, не наблюдалась после вакцинации MVA-mBN201BAM2, которая была в отсутствие М2, эквивалентного MVA-mBN199B.
Почти полная защита, сравнимая с той, что получена в группе, обработанной RSV, наблюдалась после интраназальной иммунизации MVA-mBN201B, хотя пять копий гена L все еще обнаруживались у одной мыши из пяти. Интраназальная иммунизация MVA-mBN199B также вызывала сильное снижение нагрузки RSV, но ген L все еще обнаруживался при низких уровнях у трех мышей из пяти.
Обсуждение и выводы.
Хотя MVA-mBN201B экспрессирует усеченные версии белков F и G RSV в дополнение к непроцессированным белкам F и G RSV, также включенным в конструкт MVA-mBN199B, MVA-mBN201B индуцировал гуморальный иммунный ответ с подобной амплитудой. Оба конструкта вызывали ответ антител, направленный, главным образом, против белка F RSV, если судить по аналогичным хорошим ответам, измеренным только в F RSV ELISA по сравнению с F и G RSV ELISA. Уровень антител после двух интраназальных применений был выше, чем после двух подкожных введений. Третье подкожное введение потребовалось для достижения уровня ответов антител, вызванных двумя интраназальными применениями. В отличие от этого, никаких серьезных различий не наблюдалось в Т-клеточных ответах, индуцированных при помощи подкожного введения по сравнению с интраназальными путями введения или при использовании двух по сравнению с тремя подкожными применениями. Однако MVA-mBN199B индуцировал хороший RSV F-специфический клеточный ответ, в то время как на MVA-mBN201B наблюдался сильный М2-специфический Т-клеточный ответ. RSV G-специфический ответ, вызванный MVA-mBN201B, был также более явным по сравнению с MVA-mBN199B. Характер реакции Т-клеток, индуцированной MVA-mBN201B, был похож на Т-клеточный ответ, вызванный иммунизацией RSV, хотя и гораздо выше.
Независимо от путей и количества введений оба конструкта защищали мышей от заражения RSV (A2), и ни один реплицирующийся вирус не мог быть культивированным из легких. Однако, как наблюдалось ранее, подкожные иммунизации MVA-mBN199B или MVA-mBN201B не приводили к стерильному иммунитету (т.е. иммунитет, который сохраняется даже после выведения целевого инфекционного агента из организма). Геномная нагрузка RSV (измеряют уровни вирусной РНК-полимеразы гена L) в легких мышей, иммунизированных подкожным введением любого из MVA-mBN199B или MVA-mBN201B, была значительно снижена, но все еще обнаруживалась с помощью количественной RT-PCR, а третья подкожная иммунизация не имела благотворного влияния на вирусную нагрузку, несмотря на ее увеличение при уровнях RSV-специфического IgG. Снижение экспрессии белка L RSV было немного более выраженным после вакцинации MVA-mBN201B по сравнению с MVA-mBN199B, что может быть связано с повышением М2-специфического CD8+ Т-клеточного ответа, как и геномная нагрузка RSV была выше у животных, вакцинированных MVA-mBN201BAM2, чем у животных, вакцинированных MVA-mBN201B, подобно MVA-mBN199B.
Стерильный иммунитет почти был получен после двух интраназальных введений любого из MVA-mBN199B или MVA-mBN201B. Это наблюдение коррелирует с индукцией и секрецией RSV-специфических IgA в участках слизистой инфекции.
Пример 3. Безопасность вакцин рекомбинантных MVA, экспрессирующих белок F RSV, белок G RSV, белок N RSV и белок М2 RSV, по сравнению с FI-RSV.
Вакцинный кандидат MVA-mBN199B кодирует гликопротеин (G) и белок слияния (F) RSV, тогда как MVA-mBN201B экспрессирует усеченный версии F и G в дополнение к непроцессированным белкам, нуклеокапсидный белок (N) и матриксный белок (М2) RSV (см. фиг. 1). Цель этих экспериментов заключалась в анализе безопасности любого из MVA-mBN199B и MVA-mBN201B по сравнению с FI-RSV после двух иммунизаций с помощью подкожных (s.c.) или интраназальных (i.n.) путей введения.
Безопасность этих конструктов была проверена с помощью модели заражения RSV (A2) в линии мышей BALB/c. две иммунизации MVA-mBN199B или MVA-mBN201B не индуцировали повышенной секреции IL-4 и IL5 в BAL после заражения RSV (A2) по сравнению с FI-RSV.
План исследования.
Мышей заражали дважды в три недели подкожно (s.c.) или интраназально (i.n.) 1х108 TCID50 MVAmBN199B (группы 3 и 4), 1х108 TCID50 MVA-mBN201B (группы 5 и 6) согласно табл. 4. Три контрольные группы заражали (s.c.) дважды TBS (группа 1) или интраназально RSV (группа 2), или внутримышечно 30 мкг FI-RSV (группа 7), согласно табл. 4. На 35-й день мышей заразили (i.n.) 106 БОЕ RSV A2. Через 4 дня после иммунизации мышей умерщвляли инъекцией повышенной дозы кетамина-ксилазина и обескровливали. После промывания легких анализировали уровни IL4 и IL5 в BAL с помощью ELISA.
- 27 031453
Таблица 4
План исследования
Группа Численность группы Введение исследуемых и контрольных образцов Заражение (день)%, #
Инъекции Схема (день)% Путь Доза на инъекцию
1 5 TBS 0 и 21 s . с. η . a . 35
2 5 RSV i . η. 106 БОЕ
3 5 MVAmBN199B s . с . lxlO8 TCID50
4 5 i . η. lxlO8 tcid50
5 5 MVAmBN201B s . c . lxlO8 tcid50 lxlO8 tcid50
6 5 i. η.
7 5 FI-RSV i .m. 3 0 мкг
% Относительно первой иммунизации.
# Мышей заразили интраназальным путем 106 БОЕ RSV А2.
Через 4 дня после заражения мышей обескровливали и умерщвляли под анестезией. Жидкость BAL собрали для образцов.
Схема исследования. Схема прижизненной фазы приведена в табл. 5.
Таблица 5
Схема исследования прижизненной фазы
День** Процедуры
-9 Прибытие и помещение мышей BALB/c в виварий, распределение клеточных карточек и выделение по 5 мышей на клетку
-1 клиппирование ушей, исследование по методу включения/исключения всех мышей
0 1-е введение мышам
21 2-е введение мышам
35 заражение RSV(А2)
39 окончательное кровопускание, умерщвление и взятие образцов BAL
** Относительно дня первой иммунизации.
Материалы и методы.
Экспериментальные животные. Самки мышей BALB/cJ Rj (H-2d) в возрасте семи недель были получены от Janvier (Route des Chenes Secs, F-53940 Le Genest-Saint-Isle, France). У всех мышей не было специфических патогенов.
Содержание животных. Исследование проводили в комнате 117 вивария в баварском Nordic-Martinsreid. Этот блок снабжался фильтрованным воздухом при температуре 20-24°C и относительной влажности от 40 до 70%. Комнату искусственно освещали, чередуя 14 ч света и 10 ч темноты. Исследование периода акклиматизации составило 15 дней. Животных содержали в прозрачных клетках SealSafe™ (H Temp [polysulfon] cage Type II L - Euro standard), площадью 530 см2. Клетки закрывали крышкой H-Temp SealSafe™. Клетки помещали в систему TECNIPLAST-IVC SealSafe™ с циркуляционным блоком SLIMLine™, обеспечивая каждую клетку отдельно НЕРА-фильтром для воздуха. Подстилку для животных меняли раз в неделю.
Диета и выпаивание. Мыши были обеспечены свободным доступом к облученной поддерживающей диете (SSNIFF R/M-H, облученные, V1534-727) и воде (автоклавированной при 121°C в течение 20 мин).
- 28 031453
Процедуры предварительной обработки: Идентификация животных. Чтобы индивидуально пометить животных в каждой клетке, проставление клейма на уши проводили согласно стандартным процедурам.
Исследование по методу включения/исключения. Исследование по методу включения/исключения проводили согласно стандартным процедурам.
Взятие проб крови для предварительного кровопускания. Образцы крови приблизительно по 150 мкл были получены пункцией лицевой вены в соответствии со стандартными процедурами. Образцы крови переносили в лабораторию для дальнейшей обработки в соответствии со стандартными процедурами.
Процедуры обработки: Приготовление и введение исследуемых препаратов и препарата сравнения. Приготовление и введение исследуемых препаратов и препарата сравнения проводили в кабинете класса II микробиологической безопасности (HERAsafe®/class II type H, Kendro) согласно стандартным процедурам. Вкратце, для подкожного введения рекомбинантные MVA разбавляли в TBS для получения рабочего раствора с концентрацией 2х108 TCID50/^. 1х108 TCID50 в 500 мкл инъецировали подкожно согласно стандартным процедурам. Для интраназального введения, рекомбинантные MVA разбавляли в TBS для получения рабочего раствора с концентрацией 2х109 TCIDsc/мл. По 50 мкл разбавленных вирусов вводили в одну ноздрю анестезированных (ксилазином/кетамином) животных согласно стандартным процедурам. По 500 мкл TBS вводили подкожно согласно стандартным процедурам.
Приготовление и введение вируса RSV (A2). Флакон с RSV оттаивали и использовали настолько быстро, насколько это возможно из-за вирусной нестабильности (максимально 15 мин на льду). Вирус держали на льду все время и использовали сразу для заражения анестезированных (ксилазином/кетамином) животных 100 мкл раствора неразведенного вируса интраназальным путем согласно стандартным процедурам.
Приготовление и введение FI-RSV. 30 мкг FI-RSV в 40 мкл инъецировали внутримышечно.
Эвтаназия. На 35-й день оставшиеся мыши получали двойную дозу кетамина-ксилазина путем внутрибрюшинной инъекции, а эвтаназию осуществляли путем перерезания аорты в брюшной полости.
Легочный лаваж. Жидкость BAL собирали путем промывания легких 4 раза 1 мл PBS.
Анализ.
Уровни IL-4 и IL-5 измеряли в супернатанте BAL, используя коммерчески доступные наборы ELISA (mIL4 PLATINUM ELISA от eBIOSCIENCE Cat. No. BMS613 и READY-SET-GO MIL-5 ELISA от eBIOSCIENCE Cat. No. 88-7054-22).
Документирование исследования. Блок-схему прижизненной фазы готовили для сбора всей информации в течение отдельных этапов прижизненной фазы. Кроме того, информацию, специфическую относительно мышей или клетки, записывали на клеточной карточке. Клеточные карточки не рассматриваются в качестве исходных данных исследования, но являются требованием правительства Верхней Баварии.
Блок-схему аналитической фазы готовили для сбора всей информации в течение отдельных этапов аналитической фазы. Анализы документировали в специальных тестовых записях или лабораторных журналах; перекрестные ссылки документировали в блок-схеме аналитической фазы. Всю аналитическую документацию, включая исходные данные, пересматривали согласно стандартным процедурам. Кроме того, технические паспорта для образцов сыворотки готовили согласно стандартным процедурам.
Обработка данных. Необработанные данные переносили в соответствующие Excel-файлы для дальнейшего анализа согласно стандартным процедурам.
ELISA. Концентрации цитокинов определяли по калибровочной кривой соответствующего набора ELISA.
Результаты.
Увеличение выработки IL-4 (фиг. 11) и IL-5 (фиг. 12) подобное тому, что наблюдается с FI-RSV, не наблюдалось для MVA-mBN199B или MVA-mBN201B. Оба цитокины были ниже уровня обнаружения, когда мышей иммунизировали интраназально MVA-mBN199B или MVA-mBN201B.
Обсуждение и выводы.
И MVA-mBN199B, и MVA-mBN201B не индуцируют усиленное заболевание по сравнению с FI-RSV по оценке ответа ТН2.
Пример 4. Сравнение эффективности иммуногенности и безопасности разных вакцин рекомбинантных MVA, экспрессирующих белок F RSV, белок G RSV, белок N RSV и белок М2 RSV.
Вакцинный кандидат MVA-mBN199B кодирует гликопротеин (G) и белок слияния (F) RSV, тогда как MVA-mBN201B экспрессирует усеченные версии F и G в дополнение к непроцессированным белкам, нуклеокапсидный белок (N) и матриксный белок (М2) RSV, a MVA-mBN2 94B экспрессирует один F и два G непроцессированных белка, нуклеокапсидный белок (N) и матриксный белок (М2) RSV (см. фиг. 1). MVA-mBN294A является промежуточным продуктом при клонировании MVA-mBN294B, который все еще имеет одну кассету клонирования. Эта кассета клонирования не влияет на экспрессию трансгена или иммуногенные свойства трансгенных белков. Цель данного эксперимента заключалась в анализе иммуногенности, эффективности и безопасности MVA-mBN294A по сравнению с
- 29 031453
MVA-mBN199B и MVA-mBN201B после двух иммунизаций подкожным (s.c.) путем введения.
Эффективность иммуногенности и безопасности этих конструктов проверяли, используя модель заражения RSV (A2) у мышей BALB/c. Авторы изобретения подтвердили, что несмотря на изменения в MVA-mBN294A (эквивалентен MVA-mBN294B) по сравнению с MVA-mBN201B, он индуцирует подобные В- и Т-клеточные ответы и предоставляет аналогичную защиту. Этот эксперимент показал, что конструкты (MVA-mBN201B или MVA-mBN294A), экспрессирующие по меньшей мере одну антигенную детерминанту мембранного гликопротеина RSV (F и G) и по меньшей мере одну антигенную детерминанту нуклеокапсидного белка RSV (N или М2), индуцируют лучшую защиту, чем конструкт, экспрессирующий только антигенные детерминанты мембранных гликопротеинов RSV (MVA-mBN199B).
План исследования.
Мышей вакцинировали (s.c.) 1х108 TCID50 MVA-mBN294A, MVA-mBN199B или MVA-mBN201B по схеме прайм-буст (день 0 и 21) согласно табл. 6. Контрольные группы обрабатывали дважды подкожно TBS или RSV-A2 согласно табл. 6. Инактивированный формалином (FI)-RSV инъецировали внутримышечно (i.m.) один или два раза согласно табл. 6.
Кровь собирали за сутки до каждой иммунизации и до заражения, а также в день умерщвления. Для пяти животных из групп 1-5 на 34-й день определяли титры RSV-специфических IgG и титры RSVспецифических нейтрализующих антител с помощью ELISA и PRNT соответственно.
На 34-й день некоторых мышей (табл. 6) умерщвляли путем инъекции летальной дозы кетаминаксилазина и окончательно обескровливали. Селезенки удаляли и подготавливали для анализа RSVспецифических ответов Т-клеток с помощью ELISPOT.
На 35-й день оставшихся мышей (табл. 6) заражали 106 БОЕ RSV-A2. Через четыре дня после заражения мышей умерщвляли летальной дозой кетамина-ксилазина и окончательно обескровливали. После легочного лаважа легкие удаляли, а нагрузку RSV анализировали методом бляшек и RT-qPCR. Анализировали клеточную инфильтрацию и уровни цитокинов в жидкости BAL.
Таблица 6
План исследования
Группа Численность группы Введение исследуемых и контрольных образцов Кровопускание (день) 1 Заражение (Day) 2
Инъекции Схема инъекций (день) 1 Путь Доза на инъекцию
1 10 TBS S . С . -1, , 20, 34 и 39 35
5 -1, , 20 и 34& -
2 10 RSV i. η. Ю6 БОЕ -1, , 20, 34 и 39 35
5 -1, , 20 и 34& -
3 10 MVA-mBN199B -1, , 20, 34 и 39 35
5 0 и 21 -1, , 20 и 34& -
4 10 MVA-mBN201B S.C. lxlO8 tcid50 -1, , 20, 34 и 39 35
5 -1, , 20 и 34& -
5 10 MVA-mBN294A -1, , 20, 34 и 39 35
5 -1, , 20 и 34& -
6 10 FI-RSV i.m. 5 0 мк1 -1, , 20, 34 и 39 35
5 -1, , 20 и 34& -
7 5 FI-RSV 0 i.m. 5 0 мк1 -1, , 20, 34 и 39 35
1 Относительно первой иммунизации.
2 Мышей заразили интраназальным путем 106 БОЕ RSV-A2. Через четыре дня после заражения мышей обескровили и умертвили под анестезией, а жидкость BAL и легкие собрали для образцов.
&: В день 34 этих мышей умертвили, а селезенки анализировали с помощью ELISPOT.
- 30 031453
Схема исследования.
Схема прижизненной фазы приведена в табл. 7.
Таблица 7
Схема исследования части I прижизненной фазы
День1 Процедуры
-9 Прибытие и помещение мышей BALB/c в виварий, распределение клеточных карточек и выделение по 5 мышей на клетку
-1 клиппирование ушей, исследование по методу включения/исключения всех мышей
-1 предварительное кровопускание у всех мышей (пункция лицевой вены справа)
0 1-е введение
20 кровопускание у всех мышей (пункция лицевой вены слева)
21 2-е введение
34 окончательное кровопускание, умерщвление и взятие образцов селезенки для клеток В, D, F, И, К и М
34 кровопускание у оставшихся мышей (ретробульбарная пункция вены правого глаза)
35 заражение всех оставшихся мышей
35-39 ежедневная оценка внешнего вида и веса тела
39 окончательное кровопускание, умерщвление и взятие образцов BAL и легких у оставшихся мышей
1 Относительно дня первой иммунизации.
Материалы и методы.
Экспериментальные животные. Самки мышей BALB/cJ Rj (H-2d) в возрасте семи недель были получены от Janvier (Route des Chenes Secs, F-53940 Le Genest-Saint-Isle, France). У всех мышей не было специфических патогенов.
Содержание животных. Исследование проводили в комнате 117 вивария в баварском Nordic-Martinsreid. Этот блок снабжался фильтрованным воздухом при температуре 20-24°C и относительной влажности от 40 до 70%. Комнату искусственно освещали, чередуя 14 ч света и 10 ч темноты. Исследование периода акклиматизации составило 15 дней. Животных содержали в прозрачных клетках SealSafe™ (H Temp [polysulfon] cage Type II L - Euro standard), площадью 530 см2. Клетки закрывали крышкой H-Temp SealSafe™. Клетки помещали в систему TECNIPLAST-IVC SealSafe™ с циркуляционным блоком SLIMLine™, обеспечивая каждую клетку отдельно НЕРА-фильтром для воздуха. Подстилку для животных меняли раз в неделю.
Диета и выпаивание. Мыши были обеспечены свободным доступом к облученной поддерживающей диете (SSNIFF R/M-H, облученные, V1534-727) и воде (автоклавированной при 121°C в течение 20 мин).
Процедуры предварительной обработки.
Идентификация животных. Чтобы индивидуально пометить животных в каждой клетке, проставление клейма на уши проводили согласно стандартным процедурам.
Исследование по методу включения/исключения. Исследование по методу включения/исключения проводили согласно стандартным процедурам.
Взятие проб крови для предварительного кровопускания. Образцы крови приблизительно по 150 мкл были получены пункцией лицевой вены в соответствии со стандартными процедурами. Образцы крови переносили в лабораторию для дальнейшей обработки в соответствии со стандартными процедурами.
Процедуры обработки: Приготовление и введение исследуемых препаратов и препарата сравнения. Приготовление и введение исследуемых препаратов и препарата сравнения проводили в кабинете класса II микробиологической безопасности (HERAsafe®/class II type H, Kendro) согласно стандартным процедурам. Вкратце, для подкожного введения рекомбинантные MVA разбавляли в TBS для получения рабо
- 31 031453 чего раствора с концентрацией 2х108 TCID^/мл. 1х108 TCID50 в 500 мкл инъецировали подкожно согласно стандартным процедурам. По 500 мкл TBS вводили подкожно согласно стандартным процедурам.
Приготовление и введение вируса RSV (A2). Флакон с RSV оттаивали и использовали настолько быстро, насколько это возможно из-за вирусной нестабильности (максимально 15 мин на льду). Вирус держали на льду все время и использовали сразу для заражения анестезированных (ксилазином/кетамином) животных 100 мкл раствора неразведенного вируса интраназальным путем согласно стандартным процедурам.
Приготовление и введение FI-RSV: По 50 мкл FI-RSV вводили.
Постпроцедурные обработки.
Забор крови. Образцы крови (приблизительно по 150 мкл) получали путем ретро-бульбарной пункции или пункции лицевой вены (для подробностей см. табл. 7) согласно стандартным процедурам. Образцы крови переносили в лабораторию для дальнейшей обработки в соответствии со стандартными процедурами.
Эвтаназия. Мыши получили двойную дозу кетамина-ксилазина путем внутрибрюшинной инъекции, а эвтаназию осуществляли путем перерезания аорты в брюшной полости.
Удаление селезенок. Селезенки удаляли асептически. Их помещали в пробирки, наполненные средой согласно стандартным процедурам. Эти пробирки вносили в виварий, а затем выносили согласно стандартным процедурам.
Промывание легких и удаление легких. Жидкость BAL собирали путем промывания легких 4 раза 1 мл PBS. Затем легкие удаляли и мгновенно замораживали в виде двух половинок в жидком азоте для дальнейшего анализа бляшек и экстракции РНК.
Анализ.
Обработка образцов крови и хранение сывороток. После доставки в лабораторию образцы крови были обработаны в сыворотку согласно стандартным процедурам. После приготовления сыворотку хранили при -20°C (±5°C), пока не понадобится для анализа.
Анализ титров RSV-специфических антител из сывороточных образцов. Общие титры RSVспецифического IgG ELISA определяли во всех сывороточных образцах, используя модифицированный набор ELISA (Serion ELISA classic, Cat. No. ESR113G). Вместо конъюгированного щелочной фосфатазой антитела к человеческому IgG, которое входит в набор, конъюгированное щелочной фосфатазой козье антитело к мышиному IgG (Serotec cat: 103004) использовали в качестве вторичного антитела.
Анализ титров RSV-специфических нейтрализующих антител из сывороточных образцов. Вкратце, готовили двукратные серийные разведения тестируемой сыворотки и определенное количество БОЕ RSV добавляли к сывороточному разведению. После 185 мин инкубирования при 36°C (±2°C) и 5% СО2 (±1%) его добавляли в предварительно засеянные чашки, содержащие клетки Vero. Через два дня чашки фиксировали, иммуно окрашивали смесью RSV-специфических антител и подсчитывали бляшки.
Анализ RSV-специфических клеточных иммунных реакций спленоцитов. RSV F- и RSV М2специфические клеточные реакции определяли спустя две недели после последней иммунизации путем повторного стимулирования спленоцитов специфическими пептидами, согласно стандартной методике, и выявляли высвобождение IFN-γ из спленоцитов с помощью анализа ELISPOT.
Метод анализа ELISPOT. Для анализа ELISPOT использовали Mouse IFN-Gamma-Kit (BD Biosciences, Cat. No. 551083). Этот анализ проводили согласно инструкциям производителя. Вкратце, планшеты покрывали иммобилизированным антителом за день до изолирования спленоцитов. После изолирования клетки переносили в планшеты ELISPOT и стимулировали разными пептидами (см. табл. 3) в течение 20 ч при 37°C. Выработку IFN выявляли, используя детекторное антитело. Планшеты проявляли, используя BD™ ELISPOT АЕС Substrate Set (BD Biosciences, Cat. No. 551951) согласно инструкциям производителя.
План стимулирования ELISPOT. Все условия были испытаны в двух повторениях. Пептиды RSV-2 и RSV-5 (см. табл. 8) использовали в конечной концентрации 5 мкг/мл (1 мкг/лунку) для стимулирования 5х105 и 2,5х105 спленоцитов на лунку. MVA (контроль иммунизации) использовали при множественном заражении (MOI) 10 для стимуляции 5х105 и 2,5х105 спленоцитов на лунку, а конковалин А (ConA [положительный контроль]) использовали в конечной концентрации 0,5 мкг/мл для стимуляции 2,5х105 спленоцитов. В качестве негативного контроля 5х105 спленоцитов культивировали только в среде (RPMI-1640, обогащенная Glutamax, пенициллином, стрептомицином, 10% фетальной телячьей сывороткой и 105 М β-меркаптоэтанола).
Таблица 8
RSV-специфическая стимуляция
Название пептида Специфичность Пептидная последовательность
RSV-2 F KYKNAVTEL (SEQ ID N0:20)
RSV-5 М2 SYIGSINNI (SEQ ID N0:27)
- 32 031453
Анализ жидкости BAL.
Два образца были получены цитоспиновым центрифугированием (800 об/мин, 5 мин) 100 мкл жидкости BAL. Образцы сушили в течение ночи, а затем окрашивали. Образцы анализировали методом микроскопии, чтобы определить процент эозинофилов и нейтрофилов. Затем центрифугировали оставшуюся часть BAL (12000 об/мин 5 мин). После подготовки супернатанты BAL хранили при -20°C (±5°C) до анализа. Уровни IL-4 и IL-5 измеряли в супернатанте BAL, используя коммерчески доступные наборы ELISA (mIL4 PLATINUM ELISA от eBIOSCIENCE Cat. No. BMS613 и READY-SET-GO MIL-5 ELISA от eBIOSCIENCE Cat. No. 88-7054-22).
Анализ нагрузки RSV в легких.
Нагрузку RSV в образцах легких определяли с помощью метода бляшек RSV и RT-qPCR.
Метод бляшек RSV. Одну половину каждого из мгновенно замороженных легких гомогенизировали в 1 мл холодной среды с использованием французского пресса (среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко, обогащенная 7% фетальной телячьей сывороткой). После короткого центрифугирования по две пробирки каждого супернатанта титровали в двукратных серийных разведениях для выращивания монослоев клеток Vero в 48-луночных плоскодонных планшетах. Через шесть дней монослои промывали и фиксировали 1% формальдегидом. Через 24 ч монослои окрашивали 0,04% нейтральным красным и подсчитывали бляшки.
RSV RT-qPCR. По 100 мкл гомогенезированной ткани легких тут же удаляли и выделяли РНК, используя мининабор RNeasy® от Qiagen (Cat. No. 74104). Реакцию обратной транскрипции проводили, используя большеемкостный набор РНК-к-кДНК от Applied Biosystems (Cat. No. 4387406). PCR, специфическую к гену L RSV, проводили в термоциклере со следующими параметрами: (1) 50°C в течение 2 мин; (2) 95°C в течение 10 мин; (3) 45 циклов (15 с при 95°C, 1 мин при 60°C), используя универсальный Master Mix для PCR от Applied Biosystems (Cat. No. 4352042) и смесь трех праймеров: (1) праймер 1 (5'-GAA CTC AGT GTA GGT AGA ATG TTT GCA-3'; SEQ ID NO: 36); (2) праймер 2 (5'-ТТС AGC TAT CAT TTT CTC TGC CAA T-3'; SEQ ID NO: 37); и (3) зонд 6 (5'-TTT GAA CCT GTC TGA АСА TTC CCG GTT-3'; (SEQ ID NO: 38). Число копий определяли по калибровочной кривой плазмидного вектора pMISC202, содержащего фрагмент гена L RSV. Подобные реакции для мышиного бета-актина использовали в качестве внутренних контролей для ввода кДНК, используя VIC/MGB-меченый зонд от Applied Biosystems (Cat. No. 4351315).
Документирование исследования.
Блок-схему прижизненной фазы готовили для сбора всей информации в течение отдельных этапов прижизненной фазы. Кроме того, информацию, специфическую относительно мышей или клетки, записывали на клеточной карточке. Клеточные карточки не рассматриваются в качестве исходных данных исследования, но являются требованием правительства Верхней Баварии.
Блок-схему аналитической фазы готовили для сбора всей информации в течение отдельных этапов аналитической фазы. Анализы документировали в специальных тестовых записях или лабораторных журналах; перекрестные ссылки документировали в блок-схеме аналитической фазы. Всю аналитическую документацию, включая исходные данные, пересматривали согласно стандартным процедурам. Кроме того, технические паспорта для образцов сыворотки готовили согласно стандартным процедурам.
Обработка данных. Необработанные данные переносили в соответствующие Excel-файлы для дальнейшего анализа согласно стандартным процедурам.
ELISA. Средние значения OD и стандартные ошибки среднего рассчитывали с помощью Excel. PRNT. Бляшки перенесли в макро для подсчета титра PRNT согласно стандартным процедурам. ELISPOT. Планшеты ELISPOT считывали CTL-ридером согласно инструкциям производителя. Количество пятнообразующих клеток (SFC) определяли в каждой лунке и заносили в Excel-файл для дальнейшей оценки. Из инкубации с 5х105 и 2,5х105 клеток на лунку, количество пятен на 1х106 спленоцитов подсчитывали в каждой лунке. Рассчитывали среднее для негативного контроля и вычитали из каждого отдельного значения перед вычислением среднего значения на мышь для получения значения индекса стимуляции (SI) (пептид-специфическая частота IFN-высвобождающих спленоцитов) в расчете на мышь.
Для пептидной стимуляции, SI получали из лунок с 5х105 и 2,5х105 клеток, кроме случаев, когда пятен было слишком много, чтобы подсчитать, или RSV-иммунизированных животных. В этих случаях использовали только концентрацию 2,5х105. Для стимуляции MVA-BN SI получали из лунок с 5х105, кроме случаев, когда пятен было слишком много, чтобы подсчитать. В таком случае использовали концентрацию 2,5х105. После определения SI для отдельных животных, среднее SI (SFC на 1х106 спленоцитов) и стандартную ошибку среднего (SEM) рассчитывали для каждой группы.
Метод бляшек RSV. Количество бляшек подсчитывали в лунке с тремя самыми высокими исчисляемыми разведениями вируса. Среднее количество бляшек, регулируемое фактором разведения, затем умножали на 10, чтобы получить титр раствора в БОЕ/мл, и, наконец, умножали на 2, чтобы получить титр на каждое легкое.
RSV RT-qPCR. PCR-амплификации измеряли в режиме реального времени, используя ABI 7500 от Applied Biosystems (Cat. No. 4351107) и анализировали, используя системное программное обеспечение,
- 33 031453 поставляемое Applied Biosystems. Все значения сравнивали с L-генным стандартом и нормировали к определению мышиного бета-актина для каждого образца.
Цитокины ELISA. Концентрации цитокинов определяли по калибровочной кривой соответствующего набора ELISA.
Результаты.
Анализ гуморального иммунного ответа.
Для обоих ответов - RSV-специфического IqG (ELISA, фиг. 13) и RSV-специфического нейтрализующего антитела (PRNT, фиг. 14) - не наблюдали каких-либо различий между тремя конструктами (MVA-mBN199B, MVA-mBN201B и MVA-mBN294A).
Анализ клеточного иммунного ответа.
Как и ожидалось, MVA-mBN294A имел подобный характер Т-клеточного ответа, что и MVA-mBN201B (фиг. 15), вызывая как F-, так и М2-специфические ответы, доминировал М2 Т-клеточный ответ. В противоположность этому, только MVA-mBN199B вызывал F-специфический ответ, но на более высоком уровне, чем MVA-mBN201B и MVA-mBN294A.
Анализ нагрузки RSV в легких.
RSV-заражение штаммом А2 RSV. Мышей заражали интраназально 106 БОЕ RSV (A2) спустя две недели после последней иммунизации. Через четыре дня после заражения мышей умерщвляли. После промывания легких 1 мл PBS легкие удаляли, а нагрузку RSV в легких определяли методом бляшек и RT-qPCR, проведенными, как описано выше.
Нагрузка RSV, измеренная методом бляшек. Через четыре дня после иммунизации в среднем было определено 29842 БОЕ на легкое не иммунизированных мышей (фиг. 16). Как и в RSVиммунизированной контрольной группе, не были обнаружены бляшки А2 RSV в легких животных, иммунизированных MVA-mBN199B, MVA-mBN201B или MVA-mBN294A после 2 подкожных введений.
Нагрузка RSV, измеренная RT-qPCR в режиме реального времени. Нагрузку RSV в легких также анализировали с помощью RT-qPCR (фиг. 17). В то время как RSV не был обнаружен методом бляшек у любой из вакцинированных мышей, геномы RSV еще обнаруживались у мышей, иммунизированных подкожно дважды MVA-mBN199B, MVA-mBN201B или MVA-mBN294A. Для MVA-mBN199B нагрузка RSV была в 45 раз ниже по сравнению с контрольной группой TBS. Геномы RSV также обнаруживались для MVA-mBN201B и MVA-mBN294A, но нагрузка была сильно снижена по сравнению с MVA-mBN199B, в 416 раз и 281 раз ниже по сравнению с контрольной группой TBS соответственно.
Анализ признаков повышенного заболевания.
В отличие от партии FI-RSV, используемой в экспериментах, описанных в примере 3, новая партия, используемая в этом исследовании, не показала какого-либо повышения продуцирования IL-4 или IL-5. Однако авторы изобретения смогли с этой партией обнаружить инфильтрации эозинофилов и нейтрофилов в жидкости BAL, что является основным признаком повышенного заболевания для FI-RSV. Никаких признаков повышенных заболеваний не было обнаружено для MVA-mBN199B, MVA-mBN201B и MVA-mBN294A
Обсуждение и выводы.
Несмотря на различия между MVA-mBN294A (эквивалент MVA-mBN294B) и MVA-mBN201B, оба индуцировали аналогичные В- и Т-клеточные реакции и предоставляли аналогичную защиту, не вызывая повышенного заболевания. Оба конструкта вызывали лучшую защиту, чем MVA-mBN199B, который экспрессирует только антигенные детерминанты мембранных гликопротеинов (F и G).
Другие варианты осуществления изобретения будут очевидны для специалистов в данной области из рассмотрения описания и практического применения изобретения, раскрытого в данном документе. Предполагается, что описание и примеры следует рассматривать только как иллюстративные, а истинный объем и сущность изобретения указаны в следующей формуле изобретения.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Bavarian Nordic A/S <120> РЕКОМБИНАНТНЫЙ МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ВИРУС ОСПОВАКЦИНЫ АНКАРА (MVA) И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ <130> BNI14747PCT <140> Еще не установлено <141> 2013-03-15 <150> US 61/678,367 <151> 2012-08-01
- 34 031453 <150> EP 12005594.2 <151> 2012-08-01 <160>43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211>897 <212> ДНК <213> Респираторно-синцитиальный вирус человека (hRSV), штамм А2 <400> 1
atgagcaaga acaaggacca gcggaccgcc aagaccctgg aacggacctg ggacaccctg 60
aaccatctgc tgttcatcag tagctgcctg tacaagctga acctgaagtc cgtggcccag 120
atcaccctga gcatcctggc catgatcatc agcaccagcc tgatcattgc cgccatcatc 180
tttatcgcca gcgccaacca caaagtgacc cccaccacag ccatcatcca ggacgccacc 240
tcccagatca agaacaccac ccccacctac ctgacccaga accctcagct gggcatcagc 300
cccagcaacc ccagcgagat caccagccag atcacaacca tcctggcctc caccacccct 360
ggcgtgaagt ccaccctgca gagcaccacc gtgaaaacca agaataccac caccacacag 420
acccagccca gcaagcccac caccaagcag agacagaaca agcccccctc caagcccaac 480
aacgacttcc acttcgaggt gttcaacttc gtgccctgca gcatctgcag caacaacccc 540
acctgttggg ccatctgcaa gcggatcccc aacaagaagc ccggcaagaa aaccacaacc 600
aagcctacca agaagcctac cctgaaaacc accaagaagg accccaagcc ccagaccacc 660
aagagcaaag aggtgccaac caccaagccc accgaggaac ccaccatcaa caccaccaag 720
accaacatca tcaccaccct gctgacctcc aacaccaccg gcaaccccga gctgacaagc 780
cagatggaaa ccttccacag caccagcagc gagggcaacc ctagccctag ccaggtgtcc 840
accacctccg agtaccccag ccagcctagc agccccccca acacccccag acagtga 897
<210> 2 <211>298 <212> БЕЛОК <213> штамм А2 hRSV <400> 2
Met 1 Ser Lys Asn Lys 5 Asp Gln Arg Thr Ala 10 Lys Thr Leu Glu Arg 15 Thr
Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Leu Phe Ile Ser Ser Cys Leu Tyr Lys
20 25 30
Leu Asn Leu Lys Ser Val Ala Gln Ile Thr Leu Ser Ile Leu Ala Met
35 40 45
- 35 031453
Ile Ile 50 Ser Thr Ser Leu Ile 55 Ile Ala Ala Ile Ile 60 Phe Ile Ala Ser
Ala Asn His Lys Val Thr Pro Thr Thr Ala Ile Ile Gln Asp Ala Thr
65 70 75 80
Ser Gln Ile Lys Asn Thr Thr Pro Thr Tyr Leu Thr Gln Asn Pro Gln
85 90 95
Leu Gly Ile Ser Pro Ser Asn Pro Ser Glu Ile Thr Ser Gln Ile Thr
100 105 110
Thr Ile Leu Ala Ser Thr Thr Pro Gly Val Lys Ser Thr Leu Gln Ser
115 120 125
Thr Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser
130 135 140
Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Ser Lys Pro Asn
145 150 155 160
Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys
165 170 175
Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys
180 185 190
Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Leu
195 200 205
Lys Thr Thr Lys Lys Asp Pro Lys Pro Gln Thr Thr Lys Ser Lys Glu
210 215 220
Val Pro Thr Thr Lys Pro Thr Glu Glu Pro Thr Ile Asn Thr Thr Lys
225 230 235 240
Thr Asn Ile Ile Thr Thr Leu Leu Thr Ser Asn Thr Thr Gly Asn Pro
245 250 255
Glu Leu Thr Ser Gln Met Glu Thr Phe His Ser Thr Ser Ser Glu Gly
260 265 270
Asn Pro Ser Pro Ser Gln Val Ser Thr Thr Ser Glu Tyr Pro Ser Gln
275 280 285
Pro Ser Ser Pro Pro Asn Thr Pro Arg Gln
290 295
- 36 031453
<210> 3
<211> 1725
<212> ДНК
<213> штамм А2 hRSV
<400> 3 atggaactgc tgatcctgaa ggccaacgcc atcaccacaa tcctgaccgc cgtgaccttc 60
tgcttcgcca gcggccagaa catcaccgag gaattctacc agagcacctg tagcgccgtg 120
agcaagggct acctgagcgc cctgagaacc ggctggtaca cctccgtgat caccatcgag 180
ctgtccaaca tcaaagaaaa caagtgcaac ggcaccgacg ccaaagtgaa gctgatcaag 240
caggaactgg acaagtacaa gaacgccgtg accgaactcc agctcctcat gcagtccacc 300
cctgccacca acaaccgggc cagaagagaa ctgccccggt ttatgaacta cacactgaac 360
aacgccaaaa agaccaatgt cactctgagc aagaagcgga agcggcggtt cctgggcttt 420
ctgctgggcg tgggcagcgc cattgccagc ggcgtggccg tgtccaaggt gctgcacctg 480
gaaggcgaag tgaacaagat caagagtgcc ctgctctcca caaacaaggc cgtggtgtcc 540
ctgagcaacg gcgtgagcgt gctgaccagc aaggtcctgg atctgaagaa ctacatcgac 600
aagcagctcc tgcccatcgt gaacaagcag agctgcagca tcagcaacat cgagactgtc 660
atcgagttcc agcagaagaa caaccggctg ctggaaatca cccgggagtt cagcgtgaac 720
gcaggcgtga ccacccccgt gtccacctac atgctgacca acagcgagct gctgtccctg 780
atcaatgaca tgcccatcac caacgatcag aagaaactca tgagcaacaa cgtgcagatc 840
gtgcggcagc agagttacag tatcatgagc atcatcaaag aagaggtgct ggcctacgtg 900
gtgcagctgc ccctgtacgg cgtgatcgac accccctgct ggaagctgca caccagcccc 960
ctgtgcacca ccaacacaaa agagggcagt aacatctgcc tgacccggac cgacagaggc 1020
tggtactgcg acaacgccgg cagcgtgtca ttctttccac aggccgagac atgcaaggtg 1080
cagagcaacc gggtgttctg cgacaccatg aacagcctga ccctgccctc cgaagtcaac 1140
ctgtgcaacg tggacatctt caaccccaag tacgactgca agatcatgac ttccaagacc 1200
gacgtgtcca gcagcgtgat tacctccctg ggcgccatcg tgtcctgcta cggcaagacc 1260
aagtgcaccg ccagcaacaa gaatagagga atcatcaaga ccttcagcaa cggctgcgac 1320
tacgtgtcca ataagggcat ggacaccgtg tccgtgggca acacactgta ctacgtgaat 1380
aagcaggaag gcaagagcct gtacgtgaag ggcgagccca tcatcaactt ctacgacccc 1440
ctggtgttcc ccagcgacga gttcgacgcc agtatcagcc aggtcaacga gaagatcaac 1500
cagagcctgg ccttcatcag aaagagcgac gaactgctgc acaatgtgaa cgctggcaag 1560
agtaccacaa acatcatgat caccaccatc atcatcgtga tcattgtgat cctgctgagt 1620
ctgatcgccg tgggcctgct gctgtactgc aaggcccgca gcacccctgt gaccctgtcc 1680
- 37 031453 aaggatcagc tgtccggcat caacaatatc gccttctcca actga
1725 <210> 4 <211> 574 <212> БЕЛОК <213> штамм А2 hRSV <400> 4
Met 1 Glu Leu Leu Ile 5 Leu Lys Ala Asn Ala 10 Ile Thr Thr Ile Leu 15 Thr
Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro
100 105 110
Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr
115 120 125
Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn
195 200 205
- 38 031453
Lys Gln 210 Ser Cys Ser Ile Ser 215 Asn Ile Glu Thr Val 220 Ile Glu Phe Gln
Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp
355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val
370 375 380
Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr
385 390 395 400
Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys
405 410 415
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile
420 425 430
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Met Asp
435 440 445
Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly
450 455 460
- 39 031453
Lys 465 Ser Leu Tyr Val Lys 470 Gly Glu Pro Ile Ile 475 Asn Phe Tyr Asp Pro 480
Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn
485 490 495
Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu
500 505 510
Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr
515 520 525
Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val
530 535 540
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser
545 550 555 560
Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn
565 570
<210> 5 <211> 1725 <212> ДНК <213> штамм А-Long hRSV <400> 5
atggaactgc ccatcctgaa ggccaacgcc atcaccacaa tcctggccgc cgtgaccttc 60
tgcttcgcca gcagccagaa catcaccgag gaattctacc agagcacctg tagcgccgtg 120
agcaagggct acctgagcgc cctgagaacc ggctggtaca cctccgtgat caccatcgag 180
ctgtccaaca tcaaagaaaa caagtgcaac ggcaccgacg ccaaagtgaa gctgatcaag 240
caggaactgg acaagtacaa gaacgccgtg accgaactcc agctcctcat gcagtccacc 300
cctgccgcca acaaccgggc cagaagagaa ctgccccggt ttatgaacta cacactgaac 360
aacaccaaaa agaccaatgt gaccctgagc aagaagcgga agcggcggtt cctgggcttt 420
ctgctgggcg tgggcagcgc cattgccagc ggcattgccg tgtccaaggt gctgcacctg 480
gaaggcgaag tgaacaagat caagagcgcc ctgctgtcca ccaacaaggc cgtggtgtcc 540
ctgagcaacg gcgtgagcgt gctgaccagc aaggtgctgg atctgaagaa ctacatcgac 600
aagcagctcc tgcccatcgt gaacaagcag agctgccgga tcagcaacat cgagacagtg 660
atcgagttcc agcagaagaa caaccggctg ctggaaatca cccgggagtt cagcgtgaac 720
gtgggcgtga ccacccccgt gtccacctac atgctgacca acagcgagct gctgtccctg 780
atcaatgaca tgcccatcac caacgaccag aagaaactga tgagcaacaa cgtgcagatc 840
- 40 031453
gtgcggcagc agagctacag catcatgagc atcatcaaag aagaggtgct ggcctacgtg 900
gtgcagctgc ccctgtacgg cgtgatcgac accccctgct ggaagctgca caccagcccc 960
ctgtgcacca ccaacacaaa agagggcagt aacatctgcc tgacccggac cgacagaggc 1020
tggtactgcg acaacgccgg cagcgtgtca ttctttccac aggccgagac atgcaaggtg 1080
cagagcaacc gggtgttctg cgacaccatg aacagcctga ccctgccctc cgaagtcaac 1140
ctgtgcaacg tggacatctt caaccccaag tacgactgca agatcatgac ttccaagacc 1200
gacgtgtcca gcagcgtgat tacctccctg ggcgccatcg tgtcctgcta cggcaagacc 1260
aagtgcaccg ccagcaacaa gaatagagga atcatcaaga ccttcagcaa cggctgcgac 1320
tacgtgtcca ataagggcgt ggacaccgtg tccgtgggca acacactgta ctacgtgaat 1380
aagcaggaag gcaagagcct gtacgtgaag ggcgagccca tcatcaactt ctacgacccc 1440
ctggtgttcc ccagcgacga gttcgacgcc agcatcagcc aggtcaacga gaagatcaac 1500
cagagcctgg ccttcatcag aaagagcgac gaactgctgc acaatgtgaa cgctggcaag 1560
agtaccacaa acatcatgat caccaccatc atcatcgtga tcattgtgat cctgctgagt 1620
ctgatcgccg tgggcctgct gctgtactgc aaggcccgca gcacccctgt gaccctgtcc 1680
aaggatcagc tgtccggcat caacaatatc gccttctcca actga 1725
<210> <211> <212> <213> 6 574 БЕЛОК штамм А-Long hRSV
<400> 6
Met 1 Glu Leu Pro Ile 5 Leu Lys Ala Asn Ala 10 Ile Thr Thr Ile Leu 15 Ala
Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Ser Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro
- 41 031453
100 105 110
Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Thr Lys Lys Thr Asn Val Thr
115 120 125
Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn
195 200 205
Lys Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
Val Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
- 42 031453
Pro Gln Ala 355 Glu Thr Cys Lys Val 360 Gln Ser Asn Arg Val 365 Phe Cys Asp
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val
370 375 380
Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr
385 390 395 400
Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys
405 410 415
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile
420 425 430
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp
435 440 445
Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly
450 455 460
Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro
465 470 475 480
Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn
485 490 495
Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu
500 505 510
Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr
515 520 525
Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val
530 535 540
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser
545 550 555 560
Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn
565 570
<210> 7
<211> 738
<212> ДНК
<213> штамм В hRSV
<400> 7 atgattattt ccactagtct cattatcgct gctattatct tcatcattag tgccaatcat
- 43 031453
aaagtcaccc tcacaaccgt caccgtgcag accattaaaa accataccga gaagaatatc 120
tcaacatatc tgacacaggt cccccccgaa agagtgaact cttccaaaca gcccacaacc 180
acctccccca ttcataccaa tagtgccaca atttctccca acacaaagtc tgaaacacac 240
cacactactg ctcagacaaa gggccgaatc accacctcta ctcagaccaa taagccatca 300
acaaaatccc gctccaaaaa cccacctaaa aaacctaaag atgactatca tttcgaagtc 360
tttaatttcg tcccatgttc catttgcgga aacaaccagc tctgtaaatc tatctgtaaa 420
accatcccct ctaacaagcc aaaaaagaaa cctactatta aaccaactaa taagcccacc 480
actaagacta ctaacaaacg cgatccaaaa acacccgcca aaatgcctaa aaaagagatc 540
attacaaacc cagccaagaa accaactctc aaaactaccg aacgggacac ctccatttct 600
cagtctaccg tgctcgatac catcactccc aaatacacta tccagcagca gtcactccac 660
tcaacaacct ccgagaacac cccctcctca acccagattc ctactgcttc cgaaccatcc 720
accctcaacc ccaattga 738
<210> <211> <212> <213> 8 245 БЕЛОК штамм В hRSV
<400> 8
Met 1 Ile Ile Ser Thr 5 Ser Leu Ile Ile Ala 10 Ala Ile Ile Phe Ile 15 Ile
Ser Ala Asn His Lys Val Thr Leu Thr Thr Val Thr Val Gln Thr Ile
20 25 30
Lys Asn His Thr Glu Lys Asn Ile Ser Thr Tyr Leu Thr Gln Val Pro
35 40 45
Pro Glu Arg Val Asn Ser Ser Lys Gln Pro Thr Thr Thr Ser Pro Ile
50 55 60
His Thr Asn Ser Ala Thr Ile Ser Pro Asn Thr Lys Ser Glu Thr His
65 70 75 80
His Thr Thr Ala Gln Thr Lys Gly Arg Ile Thr Thr Ser Thr Gln Thr
85 90 95
Asn Lys Pro Ser Thr Lys Ser Arg Ser Lys Asn Pro Pro Lys Lys Pro
100 105 110
Lys Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile
115 120 125
- 44 031453
Cys Gly 130 Asn Asn Gln Leu Cys 135 Lys Ser Ile Cys Lys 140 Thr Ile Pro Ser
Asn Lys Pro Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn Lys Pro Thr
145 150 155 160
Thr Lys Thr Thr Asn Lys Arg Asp Pro Lys Thr Pro Ala Lys Met Pro
165 170 175
Lys Lys Glu Ile Ile Thr Asn Pro Ala Lys Lys Pro Thr Leu Lys Thr
180 185 190
Thr Glu Arg Asp Thr Ser Ile Ser Gln Ser Thr Val Leu Asp Thr Ile
195 200 205
Thr Pro Lys Tyr Thr Ile Gln Gln Gln Ser Leu His Ser Thr Thr Ser
210 215 220
Glu Asn Thr Pro Ser Ser Thr Gln Ile Pro Thr Ala Ser Glu Pro Ser
225 230 235 240
Thr Leu Asn Pro Asn
245
<210> 9
<211> 1176
<212> ДНК
<213> штамм А2 hRSV
<400> 9 atggccctga tccaagtaca cagaagcaca ttcaccggcc aagatcctgc cggcaggaca accgagatcc gaaatgggcg ctgtgtatcg gccgtgatca ctgcccaagg gacgtgttcg gcaaagtgaa ccatccagag tcaataagct tgatcgggat gggacgccgg tcaacggcaa agatcaacat aggtggcccc ccgccctggt gacgggccaa atatcgccaa tgcacttcgg gctgaacgac aagcaccggc gtgcggcatg gctgtacgcc ctaccacgtg agaaatgaag cgagatcgag cgagtacaga catcacaaag caacgtgctg cagcttctac cattgcccag accctgaaca gacagcatcg ctgctgatca atgagccggc aaggccaacg ttcgaggtgc agccggaagt cacgacagcc ctggccgctg aagaacgaga gaggtgttcg agcagcacca aggaccagct acacccccaa ccgaggacgc tgggccggga gcgtggacgt tgaccctggc cctacaagaa ccgactgcgg gcgacagatc tgaagcggta aaaagcaccc gaggcggcag gctgtccagc ctacgacgtg caaccacaag ggacaccatc gaccacccac cagcctgacc aatgctgaaa catgatcatc tggcctgacc caagggcctg ccacttcatc cagagtggag
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
- 45 031453
ggcatcttcg ccggcctgtt catgaacgcc tacggcgctg gccaggtcat gctgagatgg 780
ggcgtgctgg ccaagagcgt gaagaacatc atgctgggcc acgccagcgt gcaggccgag 840
atggaacagg tggtggaggt gtacgagtac gcccagaagc tgggcggcga ggccggcttc 900
taccacatcc tgaacaaccc caaggcctcc ctgctgtccc tgacccagtt cccccacttt 960
agcagcgtgg tgctcggaaa tgcagccgga ctgggcatca tgggcgagta ccgcggcacc 1020
cccagaaacc aggacctgta cgacgccgcc aaggcctacg ccgagcagct gaaagaaaac 1080
ggcgtgatca actacagcgt gctggacctg acagccgagg aactggaagc cattaagcac 1140
cagctgaacc ctaaggacaa cgacgtggag ctgtga 1176
<210> 10 <211> 391 <212> БЕЛОК <213> штамм А2 hRSV <400> 10
Met 1 Ala Leu Ser Lys 5 Val Lys Leu Asn Asp 10 Thr Leu Asn Lys Asp 15 Gln
Leu Leu Ser Ser Ser Lys Tyr Thr Ile Gln Arg Ser Thr Gly Asp Ser
20 25 30
Ile Asp Thr Pro Asn Tyr Asp Val Gln Lys His Ile Asn Lys Leu Cys
35 40 45
Gly Met Leu Leu Ile Thr Glu Asp Ala Asn His Lys Phe Thr Gly Leu
50 55 60
Ile Gly Met Leu Tyr Ala Met Ser Arg Leu Gly Arg Glu Asp Thr Ile
65 70 75 80
Lys Ile Leu Arg Asp Ala Gly Tyr His Val Lys Ala Asn Gly Val Asp
85 90 95
Val Thr Thr His Arg Gln Asp Ile Asn Gly Lys Glu Met Lys Phe Glu
100 105 110
Val Leu Thr Leu Ala Ser Leu Thr Thr Glu Ile Gln Ile Asn Ile Glu
115 120 125
Ile Glu Ser Arg Lys Ser Tyr Lys Lys Met Leu Lys Glu Met Gly Glu
130 135 140
Val Ala Pro Glu Tyr Arg His Asp Ser Pro Asp Cys Gly Met Ile Ile
145 150 155 160
- 46 031453
Leu Cys Ile Ala Ala 165 Leu Val Ile Thr Lys 170 Leu Ala Ala Gly Asp 175 Arg
Ser Gly Leu Thr Ala Val Ile Arg Arg Ala Asn Asn Val Leu Lys Asn
180 185 190
Glu Met Lys Arg Tyr Lys Gly Leu Leu Pro Lys Asp Ile Ala Asn Ser
195 200 205
Phe Tyr Glu Val Phe Glu Lys His Pro His Phe Ile Asp Val Phe Val
210 215 220
His Phe Gly Ile Ala Gln Ser Ser Thr Arg Gly Gly Ser Arg Val Glu
225 230 235 240
Gly Ile Phe Ala Gly Leu Phe Met Asn Ala Tyr Gly Ala Gly Gln Val
245 250 255
Met Leu Arg Trp Gly Val Leu Ala Lys Ser Val Lys Asn Ile Met Leu
260 265 270
Gly His Ala Ser Val Gln Ala Glu Met Glu Gln Val Val Glu Val Tyr
275 280 285
Glu Tyr Ala Gln Lys Leu Gly Gly Glu Ala Gly Phe Tyr His Ile Leu
290 295 300
Asn Asn Pro Lys Ala Ser Leu Leu Ser Leu Thr Gln Phe Pro His Phe
305 310 315 320
Ser Ser Val Val Leu Gly Asn Ala Ala Gly Leu Gly Ile Met Gly Glu
325 330 335
Tyr Arg Gly Thr Pro Arg Asn Gln Asp Leu Tyr Asp Ala Ala Lys Ala
340 345 350
Tyr Ala Glu Gln Leu Lys Glu Asn Gly Val Ile Asn Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Asp Leu Thr Ala Glu Glu Leu Glu Ala Ile Lys His Gln Leu Asn Pro
370 375 380
Lys Asp Asn Asp Val Glu Leu
385 390 <210> 11
- 47 031453 <211> 54 <212> ДНК <213> Вирус ящура (FMDV) <400> 11 ctgaacttcg atctgctgaa actggccggc gacgtggaaa gcaaccctgg cccc <210>
<211>
<212>
<213>
<400>
БЕЛОК
FMDV
Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro
5 10 15
Gly Pro <210> 13
<211> 585
<212> ДНК
<213> штамм А2 hRSV
<400> 13 atgagcagac tgccacttca tttatgctga agcggagccg gaaagctaca aagctgctga aactccccca aacaacaagc atcaagaaca gtgtccgaca ggaacccctg gccacaacta accggatcct ccgaactgga tcggcagcat ccgagctgaa agatccgggt agaccatcca ccctggacat ccaacgacca caagttcgag cttcgagtgg gaagtccatg tagaaccgag caacaacatc cagcgacgat gtacaacaca tctgctgaag ccacaagtcc cgccaagaac atccggggcc ccccctcatg gacaagagca gaatacgccc accaagcaga atcaagaagc gtgatcagct cggctgcccg atcaccatca aacgacacca actgcctgaa ctctgctggt tcgataccct tgggcgtggt gcgcctgcgt tgcgcgacaa acattgagag ccgacgtgct ataaccccaa cctga cggcaagcgg ccggcagaac gagcgagatc cggagtgctg ggccatgagc cgaagaactg caaccggaag gaaaaagacc agaaagcacc
120
180
240
300
360
420
480
540
585 <210> 14 <211> 194 <212> БЕЛОК <213> штамм А2 hRSV <400> 14
Met Ser Arg Arg Asn Pro Cys Lys Phe Glu Ile Arg Gly His Cys Leu
1 5 10 15
Asn Gly Lys Arg Cys His Phe Ser His Asn Tyr Phe Glu Trp Pro Pro
20 25 30
- 48 031453
His Ala Leu 35 Leu Val Arg Gln Asn 40 Phe Met Leu Asn Arg 45 Ile Leu Lys
Ser Met Asp Lys Ser Ile Asp Thr Leu Ser Glu Ile Ser Gly Ala Ala
50 55 60
Glu Leu Asp Arg Thr Glu Glu Tyr Ala Leu Gly Val Val Gly Val Leu
65 70 75 80
Glu Ser Tyr Ile Gly Ser Ile Asn Asn Ile Thr Lys Gln Ser Ala Cys
85 90 95
Val Ala Met Ser Lys Leu Leu Thr Glu Leu Asn Ser Asp Asp Ile Lys
100 105 110
Lys Leu Arg Asp Asn Glu Glu Leu Asn Ser Pro Lys Ile Arg Val Tyr
115 120 125
Asn Thr Val Ile Ser Tyr Ile Glu Ser Asn Arg Lys Asn Asn Lys Gln
130 135 140
Thr Ile His Leu Leu Lys Arg Leu Pro Ala Asp Val Leu Lys Lys Thr
145 150 155 160
Ile Lys Asn Thr Leu Asp Ile His Lys Ser Ile Thr Ile Asn Asn Pro
165 170 175
Lys Glu Ser Thr Val Ser Asp Thr Asn Asp His Ala Lys Asn Asn Asp
180 185 190
Thr Thr <210> 15 <211> 1575 <212> ДНК <213> штамм А2 hRSV <400> 15
atggaactcc ctattctcaa agccaatgct attactacca ttctcgccgc tgtcaccttt 60
tgtttcgcct cttcccagaa tattaccgaa gagttttacc agtctacctg ttccgccgtc 120
agtaaaggat acctgtccgc cctccgcact ggttggtata ctagtgtcat tacaatcgaa 180
ctctcaaata taaaagaaaa taagtgtaat gggaccgatg ctaaagtcaa actcattaaa 240
caagaactcg ataagtataa gaatgctgtc actgagctgc aactgctgat gcagtctaca 300
cccgcagcca ataatcgagc cagacgcgag ctgcctcgct ttatgaatta tactctcaat 360
- 49 031453
aatactaaaa agacaaacgt caccctcagt aaaaagcgaa aaagacggtt tctcggattc 420
ctcctcggcg tgggctctgc tatcgctagc ggaattgctg tctccaaagt cctccatctg 480
gaaggggagg tcaacaaaat taagtctgct ctcctctcta caaacaaagc cgtcgtgtct 540
ctctccaatg gcgtgtctgt gctcacctct aaagtgctcg acctcaaaaa ttacattgat 600
aaacagctgc tccctattgt gaacaaacag tcttgccgca ttagcaatat cgaaaccgtc 660
attgaatttc aacaaaagaa taataggctc ctcgaaatta cccgcgaatt ctccgtgaat 720
gtgggagtca caacacctgt ctctacctat atgctcacta actccgaact cctctccctc 780
attaacgata tgcccattac aaatgatcag aaaaaactca tgtctaataa cgtccagatt 840
gtccgccagc agtcttatag cattatgtcc attatcaaag aggaagtcct cgcttacgtc 900
gtccagctcc ctctgtatgg ggtcatcgat acaccttgtt ggaaactcca tacctcccca 960
ctgtgtacaa ccaataccaa agaagggtcc aatatttgcc tgacaagaac cgaccgcggg 1020
tggtactgtg ataatgccgg ctctgtctcc tttttccccc aggccgaaac ctgtaaagtc 1080
cagtctaatc gagtcttttg cgatactatg aattccctca ccctcccttc agaagtgaat 1140
ctctgtaacg tcgatatttt caaccctaaa tatgattgca aaattatgac cagtaaaact 1200
gacgtgtcct cttccgtcat cacctccctc ggtgctattg tgtcttgtta cggaaaaact 1260
aaatgcacgg ctagtaataa gaaccgaggc attattaaga ccttttccaa cggctgtgat 1320
tatgtgtcta acaaaggcgt ggatactgtc agtgtcggaa atacactcta ctatgtcaac 1380
aaacaggaag ggaaaagtct ctacgtcaaa ggggagccga taatcaattt ttacgatccc 1440
ctcgtctttc cctccgatga atttgatgcc agtatttccc aggtgaacga aaaaatcaat 1500
cagtctctcg cttttattag aaaatctgat gaactcctgc ataacgtcaa tgcaggcaaa 1560
agcactacta attga 1575
<210> 16 <211> 524 <212> БЕЛОК <213> штамм А2 hRSV <400> 16
Met 1 Glu Leu Pro Ile 5 Leu Lys Ala Asn Ala 10 Ile Thr Thr Ile Leu 15 Ala
Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu
35 40 45
- 50 031453
Arg Thr 50 Gly Trp Tyr Thr Ser 55 Val Ile Thr Ile Glu 60 Leu Ser Asn Ile
Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Ser Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro
100 105 110
Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Thr Lys Lys Thr Asn Val Thr
115 120 125
Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn
195 200 205
Lys Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
Val Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
- 51 031453
Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys
305 310
Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly 325
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn
340 345
Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln
355 360
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser
370 375
Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys
385 390
Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser 405
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser
420 425
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr
435 440
Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr
450 455
Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro
465 470
Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp 485
Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe
500 505
Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser
Lys 315 Leu His Thr Ser Pro 320
Asn Ile Cys Leu Thr 335 Arg
Gly Ser Val Ser 350 Phe Phe
Asn Arg Val 365 Phe Cys Asp
Val Asn 380 Leu Cys Asn Val
Ile 395 Met Thr Ser Lys Thr 400
Gly Ala Ile Val Ser 415 Cys
Lys Asn Arg Gly 430 Ile Ile
Ser Asn Lys 445 Gly Val Asp
Val Asn 460 Lys Gln Glu Gly
Ile 475 Asn Phe Tyr Asp Pro 480
Ser Ile Ser Gln Val 495 Asn
Arg Lys Ser Asp 510 Glu Leu
Thr Asn
515
<210> 17
<211> 1809
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
- 52 031453 <223> кДНК, кодирующая слитый белок, содержащий белок N полной длины штамма А2 hRSV, слитый с фрагментом 2А протеазы FMDV, слитым с белком М2 полной длины штамма А2 hRSV.
<400> 17 atggccctga gcaaagtgaa gctgaacgac accctgaaca aggaccagct gctgtccagc 60
tccaagtaca ccatccagag aagcaccggc gacagcatcg acacccccaa ctacgacgtg 120
cagaagcaca tcaataagct gtgcggcatg ctgctgatca ccgaggacgc caaccacaag 180
ttcaccggcc tgatcgggat gctgtacgcc atgagccggc tgggccggga ggacaccatc 240
aagatcctgc gggacgccgg ctaccacgtg aaggccaacg gcgtggacgt gaccacccac 300
cggcaggaca tcaacggcaa agaaatgaag ttcgaggtgc tgaccctggc cagcctgacc 360
accgagatcc agatcaacat cgagatcgag agccggaagt cctacaagaa aatgctgaaa 420
gaaatgggcg aggtggcccc cgagtacaga cacgacagcc ccgactgcgg catgatcatc 480
ctgtgtatcg ccgccctggt catcacaaag ctggccgctg gcgacagatc tggcctgacc 540
gccgtgatca gacgggccaa caacgtgctg aagaacgaga tgaagcggta caagggcctg 600
ctgcccaagg atatcgccaa cagcttctac gaggtgttcg aaaagcaccc ccacttcatc 660
gacgtgttcg tgcacttcgg cattgcccag agcagcacca gaggcggcag cagagtggag 720
ggcatcttcg ccggcctgtt catgaacgcc tacggcgctg gccaggtcat gctgagatgg 780
ggcgtgctgg ccaagagcgt gaagaacatc atgctgggcc acgccagcgt gcaggccgag 840
atggaacagg tggtggaggt gtacgagtac gcccagaagc tgggcggcga ggccggcttc 900
taccacatcc tgaacaaccc caaggcctcc ctgctgtccc tgacccagtt cccccacttt 960
agcagcgtgg tgctcggaaa tgcagccgga ctgggcatca tgggcgagta ccgcggcacc 1020
cccagaaacc aggacctgta cgacgccgcc aaggcctacg ccgagcagct gaaagaaaac 1080
ggcgtgatca actacagcgt gctggacctg acagccgagg aactggaagc cattaagcac 1140
cagctgaacc ctaaggacaa cgacgtggag ctgctgaact tcgatctgct gaaactggcc 1200
ggcgacgtgg aaagcaaccc tggccccagc agacggaacc cctgcaagtt cgagatccgg 1260
ggccactgcc tgaacggcaa gcggtgccac ttcagccaca actacttcga gtggccccct 1320
catgctctgc tggtccggca gaactttatg ctgaaccgga tcctgaagtc catggacaag 1380
agcatcgata ccctgagcga gatcagcgga gccgccgaac tggatagaac cgaggaatac 1440
gccctgggcg tggtcggagt gctggaaagc tacatcggca gcatcaacaa catcaccaag 1500
cagagcgcct gcgtggccat gagcaagctg ctgaccgagc tgaacagcga cgatatcaag 1560
aagctgcgcg acaacgaaga actgaactcc cccaagatcc gggtgtacaa cacagtgatc 1620
agctacattg agagcaaccg gaagaacaac aagcagacca tccatctgct gaagcggctg 1680
cccgccgacg tgctgaaaaa gaccatcaag aacaccctgg acatccacaa gtccatcacc 1740
- 53 031453 atcaataacc ccaaagaaag caccgtgtcc gacaccaacg accacgccaa gaacaacgac 1800 accacctga
1809 <210> 18 <211> 602 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> Слитый белок, содержащий белок N полной длины штамма А2 hRSV, слитый с фрагментом 2А протеазы FMDV, слитым с белком М2 полной длины штамма А2 hRSV.
<400> 18
Met 1 Ala Leu Ser Lys 5 Val Lys Leu Asn Asp 10 Thr Leu Asn Lys Asp 15 Gln
Leu Leu Ser Ser Ser Lys Tyr Thr Ile Gln Arg Ser Thr Gly Asp Ser
20 25 30
Ile Asp Thr Pro Asn Tyr Asp Val Gln Lys His Ile Asn Lys Leu Cys
35 40 45
Gly Met Leu Leu Ile Thr Glu Asp Ala Asn His Lys Phe Thr Gly Leu
50 55 60
Ile Gly Met Leu Tyr Ala Met Ser Arg Leu Gly Arg Glu Asp Thr Ile
65 70 75 80
Lys Ile Leu Arg Asp Ala Gly Tyr His Val Lys Ala Asn Gly Val Asp
85 90 95
Val Thr Thr His Arg Gln Asp Ile Asn Gly Lys Glu Met Lys Phe Glu
100 105 110
Val Leu Thr Leu Ala Ser Leu Thr Thr Glu Ile Gln Ile Asn Ile Glu
115 120 125
Ile Glu Ser Arg Lys Ser Tyr Lys Lys Met Leu Lys Glu Met Gly Glu
130 135 140
Val Ala Pro Glu Tyr Arg His Asp Ser Pro Asp Cys Gly Met Ile Ile
145 150 155 160
Leu Cys Ile Ala Ala Leu Val Ile Thr Lys Leu Ala Ala Gly Asp Arg
165 170 175
Ser Gly Leu Thr Ala Val Ile Arg Arg Ala Asn Asn Val Leu Lys Asn
180 185 190
- 54 031453
Glu Met Lys 195 Arg Tyr Lys Gly Leu 200 Leu Pro Lys Asp Ile 205 Ala Asn Ser
Phe Tyr Glu Val Phe Glu Lys His Pro His Phe Ile Asp Val Phe Val
210 215 220
His Phe Gly Ile Ala Gln Ser Ser Thr Arg Gly Gly Ser Arg Val Glu
225 230 235 240
Gly Ile Phe Ala Gly Leu Phe Met Asn Ala Tyr Gly Ala Gly Gln Val
245 250 255
Met Leu Arg Trp Gly Val Leu Ala Lys Ser Val Lys Asn Ile Met Leu
260 265 270
Gly His Ala Ser Val Gln Ala Glu Met Glu Gln Val Val Glu Val Tyr
275 280 285
Glu Tyr Ala Gln Lys Leu Gly Gly Glu Ala Gly Phe Tyr His Ile Leu
290 295 300
Asn Asn Pro Lys Ala Ser Leu Leu Ser Leu Thr Gln Phe Pro His Phe
305 310 315 320
Ser Ser Val Val Leu Gly Asn Ala Ala Gly Leu Gly Ile Met Gly Glu
325 330 335
Tyr Arg Gly Thr Pro Arg Asn Gln Asp Leu Tyr Asp Ala Ala Lys Ala
340 345 350
Tyr Ala Glu Gln Leu Lys Glu Asn Gly Val Ile Asn Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Asp Leu Thr Ala Glu Glu Leu Glu Ala Ile Lys His Gln Leu Asn Pro
370 375 380
Lys Asp Asn Asp Val Glu Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
385 390 395 400
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Ser Arg Arg Asn Pro Cys Lys
405 410 415
Phe Glu Ile Arg Gly His Cys Leu Asn Gly Lys Arg Cys His Phe Ser
420 425 430
His Asn Tyr Phe Glu Trp Pro Pro His Ala Leu Leu Val Arg Gln Asn
- 55 031453
435 440 445
Phe Met Leu Asn Arg Ile Leu Lys Ser Met Asp Lys Ser Ile Asp Thr
450 455 460
Leu Ser Glu Ile Ser Gly Ala Ala Glu Leu Asp Arg Thr Glu Glu Tyr
465 470 475 480
Ala Leu Gly Val Val Gly Val Leu Glu Ser Tyr Ile Gly Ser Ile Asn
485 490 495
Asn Ile Thr Lys Gln Ser Ala Cys Val Ala Met Ser Lys Leu Leu Thr
500 505 510
Glu Leu Asn Ser Asp Asp Ile Lys Lys Leu Arg Asp Asn Glu Glu Leu
515 520 525
Asn Ser Pro Lys Ile Arg Val Tyr Asn Thr Val Ile Ser Tyr Ile Glu
530 535 540
Ser Asn Arg Lys Asn Asn Lys Gln Thr Ile His Leu Leu Lys Arg Leu
545 550 555 560
Pro Ala Asp Val Leu Lys Lys Thr Ile Lys Asn Thr Leu Asp Ile His
565 570 575
Lys Ser Ile Thr Ile Asn Asn Pro Lys Glu Ser Thr Val Ser Asp Thr
580 585 590
Asn Asp His Ala Lys Asn Asn Asp Thr Thr
595 600
<210> 19
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Синтетический пептид.
<400> 19
Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu
1 5 10
<210> 20
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
- 56 031453 <223> Синтетический пептид.
<400> 20
Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu
1 5
<210> 21
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Синтетический пептид.
<400> 21
Glu Leu Gln Leu Leu Met Gln Ser Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg
5 10 15
<210> <211> <212> <213> 22 13 БЕЛОК Искусственная
<220> <223> Синтетический пептид.
<400> 22
Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 23 9 БЕЛОК Искусственная
<220> <223> Синтетический пептид.
<400> 23
Lys Tyr Thr Ile Gln Arg Ser Thr Gly
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Синтетический пептид.
<400> 24
Leu Ser Leu Thr Gln Phe Pro Asn Phe
- 57 031453 <210> 25 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетический пептид.
<400>25
Ser Arg Leu Gly Arg Glu Asp Thr Ile <210> 26 <211>9 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетический пептид.
<400> 26
Ile Pro Lys Asp Ile Ala Asn Ser Phe
1 5
<210> <211> <212> <213> 27 9 БЕЛОК Искусственная
<220> <223> Синтетический пептид.
<400> 27
Ser Tyr Ile Gly Ser Ile Asn Asn Ile
5
<210> 28
<211> 1725
<212> ДНК
<213> штамм А2 hRSV
<400> 28 atggagttgc tgttttgctt agcaaaggct ttaagtaata caagaattag ccaccaacaa aatgccaaaa taatcctcaa ctggtcaaaa atcttagtgc tcaaggaaaa ataaatataa acaatcgagc aaaccaatgt agcaaatgca catcactgaa tctgagaact taagtgtaat aaatgctgta cagaagagaa aacattaagc attaccacaa gaattttatc ggttggtata ggaacagatg acagaattgc ctaccaaggt aagaaaagga tcctcactgc aatcaacatg ccagtgttat ctaaggtaaa agttgctcat ttatgaatta aaagaagatt agtcacattt cagtgcagtt aactatagaa attgataaaa gcaaagcaca tacactcaac tcttggtttt
120
180
240
300
360
420
- 58 031453
ttgttaggtg ttggatctgc aatcgccagt ggcgttgctg tatctaaggt cctgcaccta 480
gaaggggaag tgaacaagat caaaagtgct ctactatcca caaacaaggc tgtagtcagc 540
ttatcaaatg gagttagtgt cttaaccagc aaagtgttag acctcaaaaa ctatatagat 600
aaacaattgt tacctattgt gaacaagcaa agctgcagca tatcaaatat agaaactgtg 660
atagagttcc aacaaaagaa caacagacta ctagagatta ccagggaatt tagtgttaat 720
gcaggtgtaa ctacacctgt aagcacttac atgttaacta atagtgaatt attgtcatta 780
atcaatgata tgcctataac aaatgatcag aaaaagttaa tgtccaacaa tgttcaaata 840
gttagacagc aaagttactc tatcatgtcc ataataaaag aggaagtctt agcatatgta 900
gtacaattac cactatatgg tgttatagat acaccctgtt ggaaactaca cacatcccct 960
ctatgtacaa ccaacacaaa agaagggtcc aacatctgtt taacaagaac tgacagagga 1020
tggtactgtg acaatgcagg atcagtatct ttcttcccac aagctgaaac atgtaaagtt 1080
caatcaaatc gagtattttg tgacacaatg aacagtttaa cattaccaag tgaaataaat 1140
ctctgcaatg ttgacatatt caaccccaaa tatgattgta aaattatgac ttcaaaaaca 1200
gatgtaagca gctccgttat cacatctcta ggagccattg tgtcatgcta tggcaaaact 1260
aaatgtacag catccaataa aaatcgtgga atcataaaga cattttctaa cgggtgcgat 1320
tatgtatcaa ataaagggat ggacactgtg tctgtaggta acacattata ttatgtaaat 1380
aagcaagaag gtaaaagtct ctatgtaaaa ggtgaaccaa taataaattt ctatgaccca 1440
ttagtattcc cctctgatga atttgatgca tcaatatctc aagtcaacga gaagattaac 1500
cagagcctag catttattcg taaatccgat gaattattac ataatgtaaa tgctggtaaa 1560
tccaccacaa atatcatgat aactactata attatagtga ttatagtaat attgttatca 1620
ttaattgctg ttggactgct cttatactgt aaggccagaa gcacaccagt cacactaagc 1680
aaagatcaac tgagtggtat aaataatatt gcatttagta actaa 1725
<210> 29 <211> 574 <212> БЕЛОК <213> штамм А2 hRSV <400> 29
Met 1 Glu Leu Leu Ile 5 Leu Lys Ala Asn Ala 10 Ile Thr Thr Ile Leu 15 Thr
Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu
35 40 45
- 59 031453
Arg Thr 50 Gly Trp Tyr Thr Ser 55 Val Ile Thr Ile Glu 60 Leu Ser Asn Ile
Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Ser Thr Pro Pro Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro
100 105 110
Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr
115 120 125
Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn
195 200 205
Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
- 60 031453
Leu 305 Tyr Gly Val Ile Asp 310 Thr Pro Cys Trp Lys 315 Leu His Thr Ser Pro 320
Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp
355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Ile Asn Leu Cys Asn Val
370 375 380
Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr
385 390 395 400
Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys
405 410 415
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile
420 425 430
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Met Asp
435 440 445
Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly
450 455 460
Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro
465 470 475 480
Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn
485 490 495
Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu
500 505 510
Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr
515 520 525
Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val
530 535 540
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser
- 61 031453
545 550 555560
Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn
565570 <210>30 <211>897 <212> ДНК <213> штамм А2 hRSV
<400> 30
atgagcaaga acaaggacca gcggaccgcc aagaccctgg aacggacctg ggacaccctg 60
aaccatctgc tgttcatcag tagctgcctg tacaagctga acctgaagtc cgtggcccag 120
atcaccctga gcatcctggc catgatcatc agcaccagcc tgatcattgc cgccatcatc 180
tttatcgcca gcgccaacca caaagtgacc cccaccacag ccatcatcca ggacgccacc 240
tcccagatca agaacaccac ccccacctac ctgacccaga accctcagct gggcatcagc 300
cccagcaacc ccagcgagat caccagccag atcacaacca tcctggcctc caccacccct 360
ggcgtgaagt ccaccctgca gagcaccacc gtgaaaacca agaataccac caccacacag 420
acccagccca gcaagcccac caccaagcag agacagaaca agcccccctc caagcccaac 480
aacgacttcc acttcgaggt gttcaacttc gtgccctgca gcatctgcag caacaacccc 540
acctgttggg ccatctgcaa gcggatcccc aacaagaagc ccggcaagaa aaccacaacc 600
aagcctacca agaagcctac cctgaaaacc accaagaagg accccaagcc ccagaccacc 660
aagagcaaag aggtgccaac caccaagccc accgaggaac ccaccatcaa caccaccaag 720
accaacatca tcaccaccct gctgacctcc aacaccaccg gcaaccccga gctgacaagc 780
cagatggaaa ccttccacag caccagcagc gagggcaacc ctagccctag ccaggtgtcc 840
accacctccg agtaccccag ccagcctagc agccccccca acacccccag acagtga 897
<210>31 <211>298 <212> БЕЛОК <213> штамм А2 hRSV <400> 31
Met 1 Ser Lys Asn Lys 5 Asp Gln Arg Thr Ala 10 Lys Thr Leu Glu Arg 15 Thr
Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Leu Phe Ile Ser Ser Cys Leu Tyr Lys
20 25 30
Leu Asn Leu Lys Ser Val Ala Gln Ile Thr Leu Ser Ile Leu Ala Met
35 40 45
- 62 031453
Ile Ile 50 Ser Thr Ser Leu Ile 55 Ile Ala Ala Ile Ile 60 Phe Ile Ala Ser
Ala Asn His Lys Val Thr Pro Thr Thr Ala Ile Ile Gln Asp Ala Thr
65 70 75 80
Ser Gln Ile Lys Asn Thr Thr Pro Thr Tyr Leu Thr Gln Asn Pro Gln
85 90 95
Leu Gly Ile Ser Pro Ser Asn Pro Ser Glu Ile Thr Ser Gln Ile Thr
100 105 110
Thr Ile Leu Ala Ser Thr Thr Pro Gly Val Lys Ser Thr Leu Gln Ser
115 120 125
Thr Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser
130 135 140
Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Ser Lys Pro Asn
145 150 155 160
Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys
165 170 175
Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys
180 185 190
Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Leu
195 200 205
Lys Thr Thr Lys Lys Asp Pro Lys Pro Gln Thr Thr Lys Ser Lys Glu
210 215 220
Val Pro Thr Thr Lys Pro Thr Glu Glu Pro Thr Ile Asn Thr Thr Lys
225 230 235 240
Thr Asn Ile Ile Thr Thr Leu Leu Thr Ser Asn Thr Thr Gly Asn Pro
245 250 255
Glu Leu Thr Ser Gln Met Glu Thr Phe His Ser Thr Ser Ser Glu Gly
260 265 270
Asn Pro Ser Pro Ser Gln Val Ser Thr Thr Ser Glu Tyr Pro Ser Gln
275 280 285
Pro Ser Ser Pro Pro Asn Thr Pro Arg Gln
290 295
- 63 031453
<210> 32
<211> 585
<212> ДНК
<213> штамм А2 hRSV
<400> 32 atgtcacgaa tgtcatttta tttatgttaa agtggagctg gagagttata aaactcctca aattcaccca aacaataaac atcaaaaaca gttagtgata ggaatccttg gtcataatta acagaatact cagagttgga taggatcaat ctgaactcaa agataagagt aaactatcca cattggatat caaatgacca caaatttgaa ttttgaatgg taagtctatg cagaacagaa aaacaatata tagtgatgat gtacaatact tctgttaaaa ccataagagc tgccaaaaat attcgaggtc ccaccccatg gataaaagta gagtatgctc actaaacaat atcaaaaagc gtcatatcat agattgccag ataaccatca aatgatacta attgcttaaa cactgcttgt tagatacctt ttggtgtagt cagcatgtgt tgagggacaa atattgaaag cagacgtatt acaacccaaa cctga tggtaagagg aagacaaaac atcagaaata tggagtgcta tgccatgagc tgaagagcta caacaggaaa gaagaaaacc agaatcaact
120
180
240
300
360
420
480
540
585 <210> 33 <211> 194 <212> БЕЛОК <213> штамм А2 hRSV <400> 33
Met 1 Ser Arg Arg Asn 5 Pro Cys Lys Phe Glu 10 Ile Arg Gly His Cys 15 Leu
Asn Gly Lys Arg Cys His Phe Ser His Asn Tyr Phe Glu Trp Pro Pro
20 25 30
His Ala Leu Leu Val Arg Gln Asn Phe Met Leu Asn Arg Ile Leu Lys
35 40 45
Ser Met Asp Lys Ser Ile Asp Thr Leu Ser Glu Ile Ser Gly Ala Ala
50 55 60
Glu Leu Asp Arg Thr Glu Glu Tyr Ala Leu Gly Val Val Gly Val Leu
65 70 75 80
Glu Ser Tyr Ile Gly Ser Ile Asn Asn Ile Thr Lys Gln Ser Ala Cys
85 90 95
Val Ala Met Ser Lys Leu Leu Thr Glu Leu Asn Ser Asp Asp Ile Lys
100 105 110
- 64 031453
Lys Leu Arg 115 Asp Asn Glu Glu Leu 120 Asn Ser Pro Lys Ile 125 Arg Val Tyr
Asn Thr Val Ile Ser Tyr Ile Glu Ser Asn Arg Lys Asn Asn Lys Gln
130 135 140
Thr Ile His Leu Leu Lys Arg Leu Pro Ala Asp Val Leu Lys Lys Thr
145 150 155 160
Ile Lys Asn Thr Leu Asp Ile His Lys Ser Ile Thr Ile Asn Asn Pro
165 170 175
Lys Glu Ser Thr Val Ser Asp Thr Asn Asp His Ala Lys Asn Asn Asp
180 185 190
Thr Thr
<210> 34
<211> 1176
<212> ДНК
<213> штамм А2 hRSV
<400> 34
atggctctta gcaaagtcaa gttgaatgat acactcaaca aagatcaact tctgtcatcc 60
agcaaataca ccatccaacg gagcacagga gatagtattg atactcctaa ttatgatgtg 120
cagaaacaca tcaataagtt atgtggcatg ttattaatca cagaagatgc taatcataaa 180
ttcactgggt taataggtat gttatatgcg atgtctaggt taggaagaga agacaccata 240
aaaatactca gagatgcggg atatcatgta aaagcaaatg gagtagatgt aacaacacat 300
cgtcaagaca ttaatggaaa agaaatgaaa tttgaagtgt taacattggc aagcttaaca 360
actgaaattc aaatcaacat tgagatagaa tctagaaaat cctacaaaaa aatgctaaaa 420
gaaatgggag aggtagctcc agaatacagg catgactctc ctgattgtgg gatgataata 480
ttatgtatag cagcattagt aataactaaa ttagcagcag gggacagatc tggtcttaca 540
gccgtgatta ggagagctaa taatgtccta aaaaatgaaa tgaaacgtta caaaggctta 600
ctacccaagg acatagccaa cagcttctat gaagtgtttg aaaaacatcc ccactttata 660
gatgtttttg ttcattttgg tatagcacaa tcttctacca gaggtggcag tagagttgaa 720
gggatttttg caggattgtt tatgaatgcc tatggtgcag ggcaagtgat gttacggtgg 780
ggagtcttag caaaatcagt taaaaatatt atgttaggac atgctagtgt gcaagcagaa 840
atggaacaag ttgttgaggt ttatgaatat gcccaaaaat tgggtggtga agcaggattc 900
taccatatat tgaacaaccc aaaagcatca ttattatctt tgactcaatt tcctcacttc 960
tccagtgtag tattaggcaa tgctgctggc ctaggcataa tgggagagta cagaggtaca 1020
- 65 031453 ccgaggaatc ggtgtgatta cagcttaatc aagatctata actacagtgt caaaagataa tgatgcagca actagacttg tgatgtagag aaggcatatg acagcagaag ctttga ctgaacaact aactagaggc caaagaaaat tatcaaacat
1080
1140
1176 <210>35 <211>391 <212> БЕЛОК <213> штамм А2 hRSV <400>35
Met 1 Ala Leu Ser Lys 5 Val Lys Leu Asn Asp 10 Thr Leu Asn Lys Asp 15 Gln
Leu Leu Ser Ser Ser Lys Tyr Thr Ile Gln Arg Ser Thr Gly Asp Ser
20 25 30
Ile Asp Thr Pro Asn Tyr Asp Val Gln Lys His Ile Asn Lys Leu Cys
35 40 45
Gly Met Leu Leu Ile Thr Glu Asp Ala Asn His Lys Phe Thr Gly Leu
50 55 60
Ile Gly Met Leu Tyr Ala Met Ser Arg Leu Gly Arg Glu Asp Thr Ile
65 70 75 80
Lys Ile Leu Arg Asp Ala Gly Tyr His Val Lys Ala Asn Gly Val Asp
85 90 95
Val Thr Thr His Arg Gln Asp Ile Asn Gly Lys Glu Met Lys Phe Glu
100 105 110
Val Leu Thr Leu Ala Ser Leu Thr Thr Glu Ile Gln Ile Asn Ile Glu
115 120 125
Ile Glu Ser Arg Lys Ser Tyr Lys Lys Met Leu Lys Glu Met Gly Glu
130 135 140
Val Ala Pro Glu Tyr Arg His Asp Ser Pro Asp Cys Gly Met Ile Ile
145 150 155 160
Leu Cys Ile Ala Ala Leu Val Ile Thr Lys Leu Ala Ala Gly Asp Arg
165 170 175
Ser Gly Leu Thr Ala Val Ile Arg Arg Ala Asn Asn Val Leu Lys Asn
180 185 190
- 66 031453
Glu Met Lys 195 Arg Tyr Lys Gly Leu 200 Leu Pro Lys Asp Ile 205 Ala Asn Ser
Phe Tyr Glu Val Phe Glu Lys His Pro His Phe Ile Asp Val Phe Val
210 215 220
His Phe Gly Ile Ala Gln Ser Ser Thr Arg Gly Gly Ser Arg Val Glu
225 230 235 240
Gly Ile Phe Ala Gly Leu Phe Met Asn Ala Tyr Gly Ala Gly Gln Val
245 250 255
Met Leu Arg Trp Gly Val Leu Ala Lys Ser Val Lys Asn Ile Met Leu
260 265 270
Gly His Ala Ser Val Gln Ala Glu Met Glu Gln Val Val Glu Val Tyr
275 280 285
Glu Tyr Ala Gln Lys Leu Gly Gly Glu Ala Gly Phe Tyr His Ile Leu
290 295 300
Asn Asn Pro Lys Ala Ser Leu Leu Ser Leu Thr Gln Phe Pro His Phe
305 310 315 320
Ser Ser Val Val Leu Gly Asn Ala Ala Gly Leu Gly Ile Met Gly Glu
325 330 335
Tyr Arg Gly Thr Pro Arg Asn Gln Asp Leu Tyr Asp Ala Ala Lys Ala
340 345 350
Tyr Ala Glu Gln Leu Lys Glu Asn Gly Val Ile Asn Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Asp Leu Thr Ala Glu Glu Leu Glu Ala Ile Lys His Gln Leu Asn Pro
370 375 380
Lys Asp Asn Asp Val Glu Leu
385 390
<210> 36
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Праймер RT-PCR.
<400> 36
gaactcagtg taggtagaat gtttgca 27
- 67 031453
<210> 37
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220> <223> Праймер RT-PCR
<400> 37
ttcagctatc attttctctg ccaat
<210> 38
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Зонд RT-PCR.
<400> 38
tttgaacctg tctgaacatt cccggtt
<210> 39
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Синтетический промотор.
<400> 39
aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg aatataaata 40
<210> 40
<211> 104
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Синтетический промотор.
<400> 40
tccaaaccca cccgcttttt atagtaagtt tttcacccat aaataataaa tacaataatt 60
aatttctcgt aaaagtagaa aatatattct aatttattgc acgg 104
<210> 41
<211> 73
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220> <223> Синтетический промотор.
<400> 41
taaaaattga aaaaatattc taatttatag gacggttttg attttctttt tttctattct 60
ataaataata aat 73
- 68 031453 <210> 42 <211> 227 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетический промотор.
<400> 42
gttttgaaaa tttttttata ataaatatcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat 60
tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat tgcacggtcc ggtaaaaatt 120
gaaaaactat tctaatttat tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat 180
tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat tgcacgg 227
<210> 43
<211> 112
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Синтетический промотор.
<400> 43
tacttaaaaa ttgaaaataa atacaaaggt tcttgagggt tgtgttaaat tgaaagcgag 60
aaataatcat aaataatttc attatcgcga tatccgttaa gtttgtatcg ta 112

Claims (22)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA), обладающий иммуногенной активностью, при этом указанный вирус содержит:
    (a) нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенную детерминанту мембранного гликопротеина F респираторно-синцитиального вируса (RSV), где указанная нуклеотидная последовательность кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, 6 и/или 16; и (b) нуклеотидную последовательность, кодирующую матриксный белок М2 RSV.
  2. 2. Рекомбинантный MVA по п.1, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность согласно а) по меньшей мере приблизительно на 75% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5.
  3. 3. Рекомбинантный MVA по п.2, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая антигенную детерминанту мембранного гликопротеина F респираторно-синцитиального вируса (RSV), имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5.
  4. 4. Рекомбинантный MVA по любому из пп.1-3, дополнительно содержащий нуклеокапсидный белок N вируса RSV.
  5. 5. Рекомбинантный MVA по п.4, отличающийся тем, что как нуклеокапсидный белок N вируса RSV, так и матриксный белок М2 вируса RSV кодируются единой открытой рамкой считывания, разделенной саморасщепляющимся протеазным доменом.
  6. 6. Рекомбинантный MVA по п.5, отличающийся тем, что саморасщепляющийся протеазный домен представляет собой последовательность фрагмента протеазы 2А из вируса ящура.
  7. 7. Рекомбинантный MVA по п.5 или 6, отличающийся тем, что единая открытая рамка считывания содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 и/или SEQ ID NO: 33.
  8. 8. Рекомбинантный MVA по пп.5-7, отличающийся тем, что открытая рамка считывания содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 17.
  9. 9. Рекомбинантный MVA по пп.1-8, дополнительно содержащий по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенную детерминанту мембранного гликопротеина G вируса RSV.
    - 69 031453
  10. 10. Рекомбинантный MVA по п.9, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность(и), кодирующая^) антигенную детерминанту мембранного гликопротеина G вируса RSV, получена(ы) из штамма А вируса RSV, предпочтительно из штамма А2 и/или штамма В.
  11. 11. Рекомбинантный MVA по п.9 или 10, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая антигенную детерминанту мембранного гликопротеина G вируса RSV, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 или 8.
  12. 12. Рекомбинантный MVA по пп.9-11, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая антигенную детерминанту мембранного гликопротеина G вируса RSV, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или 7.
  13. 13. Рекомбинантный MVA по пп.9-12, содержащий нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1 и 7.
  14. 14. Рекомбинантный MVA по любому из пп.1-13, полученный на основе MVA-BN или его производного, обладающих способностью репродуктивной репликации in vitro в фибробластах куриных эмбрионов (CEF), но не способных к репродуктивной репликации в человеческой линии кератиноцитов HaCaT, клеточной линии костной остеосаркомы человека 143В, клеточной линии почки эмбриона человека 293 и клеточной линии HeLa цервикальной аденокарциномы человека.
  15. 15. Фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный MVA по пп.1-14 и фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель.
  16. 16. Вакцина, содержащая рекомбинантный MVA по пп.1-14 и фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель, для лечения или предотвращения инфекции, вызванной вирусом RSV.
  17. 17. Применение рекомбинантного MVA по пп.1-14 для лечения или предотвращения инфекции, вызванной RSV.
  18. 18. Применение рекомбинантного MVA по пп.1-14 для получения фармацевтической композиции для лечения или предотвращения инфекции, вызванной RSV.
  19. 19. Применение рекомбинантного MVA по пп.1-14 для получения фармацевтической композиции для лечения или предотвращения инфекции, вызванной RSV, путем интраназального введения, причем внутримышечное введение исключается.
  20. 20. Применение рекомбинантного MVA по пп.1-14 для лечения или предотвращения инфекции, вызванной RSV, путем интраназального введения и/или подкожного введения.
  21. 21. Применение по любому из пп.19, 20, где инфекция вызвана у человека старше 2 лет.
  22. 22. Применение по любому из пп.19, 20, где инфекция вызвана у человека младше 2 лет.
EA201590304A 2012-08-01 2013-03-15 Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины анкара (mva) и его применение EA031453B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261678367P 2012-08-01 2012-08-01
EP12005594 2012-08-01
PCT/EP2013/055483 WO2014019718A1 (en) 2012-08-01 2013-03-15 Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) respiratory syncytial virus (rsv) vaccine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201590304A1 EA201590304A1 (ru) 2015-06-30
EA031453B1 true EA031453B1 (ru) 2019-01-31

Family

ID=46614287

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201891945A EA201891945A3 (ru) 2012-08-01 2013-03-15 Вакцина рекомбинантного модифицированного вируса осповакцины анкара (mva) респираторно-синцитиального вируса (rsv)
EA201590304A EA031453B1 (ru) 2012-08-01 2013-03-15 Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины анкара (mva) и его применение

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201891945A EA201891945A3 (ru) 2012-08-01 2013-03-15 Вакцина рекомбинантного модифицированного вируса осповакцины анкара (mva) респираторно-синцитиального вируса (rsv)

Country Status (19)

Country Link
US (6) US9480738B2 (ru)
EP (2) EP3656396A1 (ru)
JP (2) JP6523955B2 (ru)
KR (3) KR102264852B1 (ru)
CN (2) CN109266622B (ru)
AU (1) AU2013298915B2 (ru)
BR (1) BR112015002131B1 (ru)
CA (2) CA3158572A1 (ru)
CY (1) CY1122717T1 (ru)
EA (2) EA201891945A3 (ru)
HK (1) HK1205459A1 (ru)
IL (1) IL236744B (ru)
IN (1) IN2015DN01448A (ru)
MX (3) MX362511B (ru)
MY (1) MY171498A (ru)
NZ (1) NZ704005A (ru)
SG (1) SG11201500696VA (ru)
SI (1) SI2879702T1 (ru)
WO (1) WO2014019718A1 (ru)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2879702T3 (da) * 2012-08-01 2020-02-24 Bavarian Nordic As Rekombinant modificeret vacciniavirus ankara (mva)-vaccine mod respiratorisk syncytialvirus (rsv)
EP2968524A1 (en) * 2013-03-15 2016-01-20 Bavarian Nordic A/S Single high dose of mva induces a protective immune response in neonates and infants
EP3888676A1 (en) 2014-06-13 2021-10-06 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogenic combinations
US9630994B2 (en) 2014-11-03 2017-04-25 University Of Washington Polypeptides for use in self-assembling protein nanostructures
MX2017016105A (es) 2015-06-12 2018-05-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa Polinucleotidos y polipeptidos de adenovirus.
FR3042121A1 (fr) 2015-10-08 2017-04-14 Jean-Marc Limacher Composition anti-tumorale
CN115947873A (zh) 2017-04-04 2023-04-11 华盛顿大学 显示副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白的自组装蛋白纳米结构及其用途
WO2018211419A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
US11306292B2 (en) 2017-05-15 2022-04-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
AU2018392884B2 (en) 2017-12-20 2021-11-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Epstein-Barr Virus antigen constructs
EP3758747A1 (en) 2018-02-28 2021-01-06 University of Washington Self-asssembling nanostructure vaccines
AU2019336940A1 (en) 2018-09-06 2021-03-11 Bavarian Nordic A/S Storage improved poxvirus compositions
US20220195016A1 (en) * 2019-04-18 2022-06-23 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Biological and synthetic molecules inhibiting respiratory syncytial virus infection
WO2021030582A2 (en) * 2019-08-13 2021-02-18 Altimmune, Inc. Therapeutic agent effectiveness and its route of administration
WO2021180943A1 (en) 2020-03-12 2021-09-16 Bavarian Nordic A/S Compositions improving poxvirus stability
AU2022338199A1 (en) 2021-09-03 2024-03-14 Bavarian Nordic A/S Utilization of micro-rna for downregulation of cytotoxic transgene expression by modified vaccinia virus ankara (mva)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2798857A1 (fr) * 1999-09-23 2001-03-30 Pf Medicament Utilisation d'une proteine de membrane ompa d'enterobacterie associee a un peptide immunogene du vrs pour la preparation de vaccins administrables par voie nasale
WO2002028422A2 (en) * 2000-10-02 2002-04-11 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Split enveloped virus preparation for intranasal delivery
WO2009038270A1 (en) * 2007-09-21 2009-03-26 Ewha University - Industry Collaboration Foundation Respiratory syncytial virus vaccine
US20120009254A1 (en) * 2010-07-07 2012-01-12 Artificial Cell Technologies, Inc. Respiratory Syncytial Virus Antigenic Compositions and Methods
WO2012085936A2 (en) * 2010-12-20 2012-06-28 Panacea Biotech Ltd Recombinant respiratory syncytial virus plasmids and vaccines

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US5833975A (en) 1989-03-08 1998-11-10 Virogenetics Corporation Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence
US5110587A (en) 1981-12-24 1992-05-05 Health Research, Incorporated Immunogenic composition comprising synthetically modified vaccinia virus
US5149650A (en) 1986-01-14 1992-09-22 University Of North Carolina At Chapel Hill Vaccines for human respiratory virus
US5223254A (en) 1987-09-29 1993-06-29 Praxis Biologics, Inc. Respiratory syncytial virus: vaccines
US5639853A (en) 1987-09-29 1997-06-17 Praxis Biologics, Inc. Respiratory syncytial virus vaccines
AU617739B2 (en) 1987-12-23 1991-12-05 Pharmacia & Upjohn Company Chimeric glycoproteins containing immunogenic segments of the glycoproteins of human respiratory syncytial virus
CA1341245C (en) 1988-01-12 2001-06-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant vaccinia virus mva
US6730305B1 (en) 2000-05-08 2004-05-04 The Uab Research Foundation Nucleotide sequences encoding bovine respiratory syncytial virus immunogenic proteins
WO1992001471A1 (en) 1990-07-24 1992-02-06 The Uab Research Foundation Methods of use of bovine respiratory syncytial virus recombinant dna, proteins vaccines, antibodies, and transformed cells
GB9200117D0 (en) 1992-01-06 1992-02-26 Connaught Lab Production of recombinant chimeric proteins for vaccine use
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
FR2718452B1 (fr) 1994-04-06 1996-06-28 Pf Medicament Elément d'immunogène, agent immunogène, composition pharmaceutique et procédé de préparation.
WO1996006112A1 (en) 1994-08-25 1996-02-29 Instituut Voor Veehouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Antigenic peptides derived from the g protein of rsv for type- and subtype-specific diagnosis of respiratory syncytial virus (rsv) infection
FR2726471B1 (fr) 1994-11-07 1997-01-31 Pf Medicament Procede pour ameliorer l'immunogenicite d'un compose immunogene ou d'un haptene et application a la preparation de vaccins
US6083925A (en) 1995-06-07 2000-07-04 Connaught Laboratories Limited Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines
US6019980A (en) 1995-06-07 2000-02-01 Connaught Laboratories Limited Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines
US6180398B1 (en) 1996-07-12 2001-01-30 Virogeneitics Corporation Two-step immunization procedure against the pyramyxoviridae family of viruses using recombinant virus and subunit protein preparation
US6020182A (en) 1996-07-12 2000-02-01 Connaught Laboratories Limited Subunit respiratory syncytial virus vaccine preparation
FR2751229B1 (fr) 1996-07-19 1998-11-27 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique notamment contre la pathologie respiratoire des bovins
US6699478B1 (en) 1997-09-19 2004-03-02 Wyeth Holdings Corporation Enhanced immune response to attachment (G) protein of Respiratory Syncytial Virus
US6651655B1 (en) 2000-01-18 2003-11-25 Quadrant Technologies Limited Inhaled vaccines
SG106639A1 (en) 2000-10-10 2004-10-29 Gen Electric Apparatus and method for introducing small amounts of refractory elements into a vapor deposition coating
AU2002224416A1 (en) 2000-10-18 2002-04-29 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Compositions and methods for modulating RSV infection and immunity
NZ524661A (en) 2000-11-23 2005-03-24 Bavarian Nordic As Modified vaccinia ankara virus variant
US6855493B2 (en) 2000-11-28 2005-02-15 Medimmune, Inc. Methods of administering/dosing anti-RSV antibodies for prophylaxis and treatment
FR2827605B1 (fr) 2001-07-20 2004-07-16 Pf Medicament Nouveaux peptides derives de la proteine g du vrs et leur utilisation dans un vaccin
CA2466413C (en) 2001-12-04 2014-11-04 Bavarian Nordic A/S Flavivirus ns1 subunit vaccine
EA007811B1 (ru) 2002-05-16 2007-02-27 Бавариан Нордик А/С Межгенные области, используемые в качестве инсерционных сайтов в геноме модифицированного вируса коровьей оспы анкара (mva)
US7368537B2 (en) 2003-07-15 2008-05-06 Id Biomedical Corporation Of Quebec Subunit vaccine against respiratory syncytial virus infection
WO2006023029A2 (en) 2004-06-16 2006-03-02 The Johns Hopkins University The cysteine-rich region of respiratory syncytial virus and methods of use therefor
EP1793852A1 (en) * 2004-08-27 2007-06-13 Panacea Biotec Ltd. Inactivated poliomyelitis vaccine derived from sabin strain of polio virus
WO2008115199A2 (en) * 2006-08-18 2008-09-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chimeric virus vaccines
WO2008133663A2 (en) * 2006-11-30 2008-11-06 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Codon modified immunogenic compositions and methods of use
DE102006060799A1 (de) 2006-12-21 2008-06-26 RUHR-UNIVERSITäT BOCHUM RSV F-Protein und seine Verwendung
EP2181121A4 (en) * 2007-03-21 2012-07-11 Id Biomedical Corp Quebec CHIMÄRE ANTIGENE
EP3508505A1 (en) 2007-12-24 2019-07-10 ID Biomedical Corporation of Quebec Recombinant rsv antigens
WO2010039224A2 (en) 2008-09-30 2010-04-08 University Of Massachusetts Medical School Respiratory syncytial virus (rsv) sequences for protein expression and vaccines
EP2367844A4 (en) 2008-11-18 2012-08-01 Ligocyte Pharmaceuticals Inc RSV-F VLP AND MANUFACTURING METHOD AND METHOD OF USE THEREOF
JP2012509073A (ja) 2008-11-21 2012-04-19 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ 複数の相同ヌクレオチド配列を含むベクター
HUE051666T2 (hu) 2008-12-09 2021-03-29 Novavax Inc Módosított RSV F fehérjék és alkalmazásuk módszerei
WO2010075491A2 (en) 2008-12-24 2010-07-01 University Of Rochester Recombinant expression of self-folding neutralizing epitope-bearing subdomains of the respiratory syncytial virus attachment and fusion proteins
PL2445526T3 (pl) 2009-06-24 2017-08-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Rekombinowane antygeny rsv
SG176807A1 (en) 2009-06-24 2012-01-30 Id Biomedical Corp Quebec Vaccine
WO2011008974A2 (en) * 2009-07-15 2011-01-20 Novartis Ag Rsv f protein compositions and methods for making same
AU2010279492B2 (en) 2009-08-04 2015-04-09 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of The Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Anti-RSV immunogens and methods of immunization
BR112012008338A2 (pt) 2009-09-10 2019-09-24 Novartis Ag combinação de vacinas contra doenças do trato respiratório.
US20110097358A1 (en) 2009-10-12 2011-04-28 Techno Vax, Inc. RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS (RSV) VIRUS-LIKE PARTICLES (VLPs)
CN102596436A (zh) 2009-11-12 2012-07-18 特洁安科技有限公司 清洗设备，辐射源模块和流体处理系统
AU2011209175B2 (en) 2010-01-28 2016-02-04 Bavarian Nordic A/S Vaccinia virus mutants containing the major genomic deletions of MVA
EP2651771A1 (en) * 2010-12-17 2013-10-23 Philip Morris Products S.a.s. Container having interacting surface elements including design element
WO2012089231A1 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Okairòs Ag Paramyxovirus vaccines

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2798857A1 (fr) * 1999-09-23 2001-03-30 Pf Medicament Utilisation d'une proteine de membrane ompa d'enterobacterie associee a un peptide immunogene du vrs pour la preparation de vaccins administrables par voie nasale
WO2002028422A2 (en) * 2000-10-02 2002-04-11 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Split enveloped virus preparation for intranasal delivery
WO2009038270A1 (en) * 2007-09-21 2009-03-26 Ewha University - Industry Collaboration Foundation Respiratory syncytial virus vaccine
US20120009254A1 (en) * 2010-07-07 2012-01-12 Artificial Cell Technologies, Inc. Respiratory Syncytial Virus Antigenic Compositions and Methods
WO2012085936A2 (en) * 2010-12-20 2012-06-28 Panacea Biotech Ltd Recombinant respiratory syncytial virus plasmids and vaccines

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDREW FRETZAYAS, MARIA MOUSTAKI: "The Challenges of RSV Vaccines. Where do we Stand?", RECENT PATENTS ON ANTI-INFECTIVE DRUG DISCOVERY, BENTHAM SCIENCE PUBLISHERS, vol. 5, no. 2, 1 June 2010 (2010-06-01), pages 99 - 108, XP055008503, ISSN: 1574891X, DOI: 10.2174/157489110791233504 *
ANTONIS, A.F.G. VAN DER MOST, R.G. SUEZER, Y. STOCKHOFE-ZURWIEDEN, N. DAUS, F. SUTTER, G. SCHRIJVER, R.S.: "Vaccination with recombinant modified vaccinia virus Ankara expressing bovine respiratory syncytial virus (bRSV) proteins protects calves against RSV challenge", VACCINE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 25, no. 25, 30 May 2007 (2007-05-30), AMSTERDAM, NL, pages 4818 - 4827, XP022098626, ISSN: 0264-410X, DOI: 10.1016/j.vaccine.2007.04.002 *
DE WAAL, L. WYATT, L.S. YUKSEL, S. VAN AMERONGEN, G. MOSS, B. NIESTERS, H.G.M. OSTERHAUS, A.D.M.E. DE SWART, R.L.: "Vaccination of infant macaques with a recombinant modified vaccinia virus Ankara expressing the respiratory syncytial virus F and G genes does not predispose for immunopathology", VACCINE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 22, no. 8, 25 February 2004 (2004-02-25), AMSTERDAM, NL, pages 923 - 926, XP004489102, ISSN: 0264-410X, DOI: 10.1016/j.vaccine.2003.10.010 *
DEWHURST-MARIDOR G, ET AL: "Development of a quantitative TaqMan RT-PCR for respiratory syncytial virus", JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS, ELSEVIER BV, NL, vol. 120, no. 1, 1 September 2004 (2004-09-01), NL, pages 41 - 49, XP002556727, ISSN: 0166-0934, DOI: 10.1016/j.jviromet.2004.03.017 *
FU, Y. ; HE, J. ; ZHENG, X. ; WU, Q. ; ZHANG, M. ; WANG, X. ; WANG, Y. ; XIE, C. ; TANG, Q. ; WEI, W. ; WANG, M. ; SONG, J. ; QU, : "Intranasal immunization with a replication-deficient adenoviral vector expressing the fusion glycoprotein of respiratory syncytial virus elicits protective immunity in BALB/c mice", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 381, no. 4, 17 April 2009 (2009-04-17), AMSTERDAM, NL, pages 528 - 532, XP026045583, ISSN: 0006-291X, DOI: 10.1016/j.bbrc.2009.02.075 *
HURWITZ J L: "Respiratory syncytial virus vaccine development", EXPERT REVIEW OF VACCINES, FUTURE DRUGS, LONDON, GB, vol. 10, no. 10, 1 October 2011 (2011-10-01), GB, pages 1415 - 1433, XP009163825, ISSN: 1476-0584, DOI: 10.1586/erv.11.120 *
LIEN ANH HA DO; H. ROGIER VAN DOORN; JULIET E. BRYANT; MY NGOC NGHIEM; VINH CHAU NGUYEN VAN; CONG KHANH VO; MINH DUNG NGUYEN; TINH: "A sensitive real-time PCR for detection and subgrouping of human respiratory syncytial virus", JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS, ELSEVIER BV, NL, vol. 179, no. 1, 10 November 2011 (2011-11-10), NL, pages 250 - 255, XP028355361, ISSN: 0166-0934, DOI: 10.1016/j.jviromet.2011.11.012 *
M. MAGDALENA GHERARDI AND MARIANO ESTEBAN: "Recombinant poxviruses as mucosal vaccine vectors", JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY., SOCIETY FOR GENERAL MICROBIOLOGY, SPENCERS WOOD., GB, vol. 86, no. Part 11, 1 November 2005 (2005-11-01), GB, pages 2925 - 2936, XP002685593, ISSN: 0022-1317, DOI: 10.1099/VIR.0.81181-0 *
S. HALLE, H. C. DUJARDIN, N. BAKOCEVIC, H. FLEIGE, H. DANZER, S. WILLENZON, Y. SUEZER, G. HAMMERLING, N. GARBI, G. SUTTER, T. WORB: "Induced bronchus-associated lymphoid tissue serves as a general priming site for T cells and is maintained by dendritic cells", JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, ROCKEFELLER UNIVERSITY PRESS, vol. 206, no. 12, 23 November 2009 (2009-11-23), pages 2593 - 2601, XP055041459, ISSN: 00221007, DOI: 10.1084/jem.20091472 *
WU, H. ; DENNIS, V.A. ; PILLAI, S.R. ; SINGH, S.R.: "RSV fusion (F) protein DNA vaccine provides partial protection against viral infection", VIRUS RESEARCH, AMSTERDAM, NL, vol. 145, no. 1, 1 October 2009 (2009-10-01), NL, pages 39 - 47, XP026564433, ISSN: 0168-1702, DOI: 10.1016/j.virusres.2009.06.012 *
WYATT LINDA S ET AL: "Priming and boosting immunity to respiratory syncytial virus by recombinant replication-defective vaccinia virus MVA", VACCINE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 18, no. 5-6, 1 October 1999 (1999-10-01), AMSTERDAM, NL, pages 392 - 397, XP002316543, ISSN: 0264-410X, DOI: 10.1016/S0264-410X(99)00257-1 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2879702A1 (en) 2015-06-10
MX2015001479A (es) 2015-08-12
CA2879915C (en) 2022-07-05
KR102435054B1 (ko) 2022-08-22
US20170043008A1 (en) 2017-02-16
SG11201500696VA (en) 2015-02-27
IN2015DN01448A (ru) 2015-07-03
MX2023003746A (es) 2023-04-24
US20210196814A1 (en) 2021-07-01
IL236744A0 (en) 2015-02-26
EA201891945A2 (ru) 2019-01-31
KR20150038431A (ko) 2015-04-08
KR102264852B1 (ko) 2021-06-14
WO2014019718A1 (en) 2014-02-06
MX362511B (es) 2019-01-22
BR112015002131A2 (pt) 2017-11-07
US10532094B2 (en) 2020-01-14
CN104540520B (zh) 2018-10-23
JP2023139095A (ja) 2023-10-03
AU2013298915B2 (en) 2018-03-01
BR112015002131B1 (pt) 2022-11-01
US10124058B2 (en) 2018-11-13
US9717787B2 (en) 2017-08-01
JP2015524660A (ja) 2015-08-27
MX2019000933A (es) 2022-06-27
EP2879702B1 (en) 2019-11-27
MY171498A (en) 2019-10-15
CA2879915A1 (en) 2014-02-06
US20200171142A1 (en) 2020-06-04
US20190117764A1 (en) 2019-04-25
KR20210072144A (ko) 2021-06-16
CA3158572A1 (en) 2014-02-06
CN104540520A (zh) 2015-04-22
KR20220119527A (ko) 2022-08-29
CY1122717T1 (el) 2021-03-12
CN109266622B (zh) 2023-05-09
US9480738B2 (en) 2016-11-01
EA201891945A3 (ru) 2019-05-31
IL236744B (en) 2022-04-01
CN109266622A (zh) 2019-01-25
EA201590304A1 (ru) 2015-06-30
US20170326228A1 (en) 2017-11-16
SI2879702T1 (sl) 2020-02-28
BR112015002131A8 (pt) 2022-08-23
HK1205459A1 (en) 2015-12-18
NZ704005A (en) 2016-07-29
AU2013298915A1 (en) 2015-02-19
US20150209421A1 (en) 2015-07-30
EP3656396A1 (en) 2020-05-27
EP2879702B9 (en) 2020-02-26
JP6523955B2 (ja) 2019-06-05
US10946089B2 (en) 2021-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10946089B2 (en) Recombinant modified vaccinia virus ankara (MVA) respiratory syncytial virus (RSV) vaccine
CN106999565B (zh) 重组修饰的痘苗病毒安卡拉(mva)丝状病毒疫苗
JP7317896B2 (ja) 組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）ｒｓウイルス（ｒｓｖ）ワクチン
US20230233670A1 (en) A Recombinant Modified Vaccinia Virus (MVA) Vaccine Against Coronavirus Disease
CN115040644A (zh) 新冠肺炎重组狂犬病病毒载体疫苗
CN113227360A (zh) 具有新型流感病毒来源的血凝素蛋白基因的DIs株来源的重组牛痘病毒

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG TJ TM