KR20240051214A - 변형 백시니아 바이러스 앙카라(mva)에 의한 세포독성 전이유전자 발현의 하향조절을 위한 마이크로rna의 활용 - Google Patents

변형 백시니아 바이러스 앙카라(mva)에 의한 세포독성 전이유전자 발현의 하향조절을 위한 마이크로rna의 활용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전이유전자에 연결된 miR블록에 배열된 일련의 miRNA 표적 서열을 포함하는 재조합 변형 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)에 관한 것이며, 여기서 각각의 miRNA 표적 서열은 진핵생물 MVA 생산자 세포의 miRNA에 상응한다. 본 발명은 또한 재조합 MVA의 의학적 용도에 관한 것이다.

Description

변형 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)에 의한 세포독성 전이유전자 발현의 하향조절을 위한 마이크로RNA의 활용
본 발명은 바이러스 벡터 분야, 특히 바이러스 벡터 기반 백신에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 전이유전자에 연결된 소위 miR블록 내에 배열된 일련의 마이크로RNA(miRNA) 표적 서열을 포함하는 재조합 변형 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)에 관한 것이며, 여기서 각각의 miRNA 표적 서열은 진핵생물 MVA 생산자 세포에서 발현되는 miRNA에 상응한다. 본 발명은 또한 재조합 MVA의 의학적 용도에 관한 것이다.
재조합 바이러스 벡터의 흔한 문제는 이러한 벡터에 의해 발현된 전이유전자 산물이 벡터 생산자 세포의 세포 과정에 영향을 미칠 수 있다는 부정적인 영향이다. 이는 궁극적으로 주어진 재조합 바이러스 벡터의 수율 약화로 이어질 수 있다(1). 세포독성 효과는 단일 또는 다중 전이유전자의 발현 결과일 수도 있고, 또는 특히 별도로 발현되는 경우에는 세포독성 효과를 나타내지 않는 전이유전자 생성물의 조합의 결과일 수도 있다. 바이러스 벡터 수율을 감소시키는 세포독성 전이유전자 생성물의 문제는 또한 폭스바이러스과(Poxviridae)에 속하는 오르토폭스바이러스(Orthopoxvirus) 속의 프로토타입 종인 백시니아 바이러스로부터 유래되는 재조합 MVA 벡터와 관계가 있다. 약화된 복제는 예를 들어 HIV-env 발현 MVA에서 관찰되었다(2).
MVA-BN®은 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA) 바이러스 스톡에서 단리된 잘 특성화된 바이러스 벡터이다. MVA는 복제성 백시니아 바이러스인 피부 백시니아 바이러스 앙카라 균주(융모요막 백시니아 바이러스 앙카라, CVA)에서 기원한다(3). 1차 닭 배아 섬유아세포(CEF 또는 CEF 세포)에서 570회 초과 계대에 걸친 CVA의 연속 전파를 통해 약독화된 CVA 유래 바이러스 MVA가 수득되었다. 이 MVA는 Bavarian Nordic에 의해 추가로 계대되어 추가로 약독화된 MVA 균주인 MVA-BN®을 초래했다(4). MVA-BN®은 선조 CVA 바이러스에 비해 게놈의 대략 15%가 결여되어 있다(31kb의 상실은 6개의 주요 결실 부위를 초래함). 이러한 결실은 다수의 병독성 및 숙주 범위 유전자, 뿐만 아니라 A형 봉입체 유전자에도 영향을 미친다. MVA-BN®은 인간 세포에 부착하고, 진입하여 바이러스 암호화된 유전자를 매우 효율적으로 발현할 수 있다. 그러나, 인간 세포에서는 자손 바이러스의 조립 및 방출이 발생하지 않는다. 따라서, MVA-BN®은 지금까지 충족되지 않은 의학적 요구가 있는 질환(예: 에볼라 바이러스 질환(5))을 표적으로 하는 백신접종 접근법에 사용하기 위한 항원-암호화 전이유전자를 효율적으로 발현할 수 있는 중요한 다용도성 백신 벡터이다. MVA-BN® 및 파생물의 제제는 면역결핍 개체를 포함한 임상 연구 중인 10,500명 초과의 인간 대상체 및 다양한 유형의 동물에게 심각한 임의의 부작용 없이 투여되었다.
세포독성 전이유전자를 발현하는 일부 MVA 재조합체의 바이러스 수율의 감소는 광범위하게 변동될 수 있어 심각한 복제 약화에 이르기까지 바이러스 수율의 유의미한 감소를 초래할 수 있고, 또는 심지어 특히 특정 전이유전자를 발현하는 재조합 MVA의 생성 실패를 초래할 수 있다. 재조합 MVA 복제의 약화는 단지 단일의 매우 세포독성인 전이유전자에 의해 촉발될 수 있지만, MVA-매개 발현 시 개별적으로는 세포독성인 것으로 나타나지 않으나, 이의 최소 세포 독성 효과가 쌓이거나 심지어 상승작용하여 유의미하게 감소된 MVA 수율을 초래할 수 있는 다중 전이유전자의 조합에 의해서도 촉발될 수 있다. 특정 전이유전자를 함유하는 재조합 MVA의 생성 실패는 복제가 너무 비효율적이어서 부모 MVA 배경으로부터 성공적으로 선택되고 단리될 수 없을 정도로 MVA 재조합체의 복제 과정에 유해한 전이유전자에 의해 부여되는 선택적인 단점에 기인할 수 있을 것이다. 또한, 전이유전자 삽입체 또는 이 전이유전자를 발현하는 바이러스 벡터 게놈의 유전자 안정성은 바이러스 벡터 생성 동안 유해한 전이유전자의 발현에 의해 손상될 수 있다(1, 2).
따라서, 바이러스 복제 능력이 가능한 한 적게 손상되면서 다수의 잠재적으로 세포독성인 전이유전자를 발현할 수 있는 재조합 MVA가 요구된다.
본 발명자들은 MVA 벡터 생산자 세포의 마이크로RNA 기구가 재조합 MVA 생성 동안 전이유전자 발현을 하향조절하는 데 활용될 수 있는지 여부를 평가하는 것을 목표로 하였다.
마이크로RNA(miRNA)는 유전자 발현의 전사후 조절을 위해 모든 진핵 세포에 의해 생성되는 전형적으로 길이가 21-23개 뉴클레오타이드(nt)인 작은 비암호 RNA이다. 이들은 1차 miRNA(pri-miRNA)라고 불리는 약 100~1000개의 뉴클레오타이드의 긴 비암호 RNA로서 세포 게놈에서 암호화되고, 핵에서 RNase Drosha에 의해 전구체 miRNA(pre-miRNA)라고 불리는 약 80nt 헤어핀 구조로 트리밍된다. 이러한 헤어핀-RNA는 세포질에서 RNase Dicer에 의해 추가로 트리밍되어 성숙한 21-23 nt miRNA를 산출한다. 성숙 miRNA는 miRNA 효과를 매개하는 소위 RISC 다중단백질 복합체에 로딩된다. 암호 서열 또는 5' 또는 3'-미해독 영역(UTR) 내에서 miRNA가 이들의 동족 표적 서열에 결합하면, 일치가 불완전한 경우에는 해독성의 감소, 또는 일치가 완전한 경우에는 심지어 mRNA 분해를 야기한다. 후자의 과정에서, mRNA 분해를 매개하는 miRNA는 스스로 분해되지 않고 마이크로RNA 이펙터 기구에 의해 회복된다. 따라서, 이들은 표적 서열을 인식하면 새로운 mRNA 분해 주기를 개시할 수 있다. 주목할 점은 miRNA에 의한 세포 단백질 수준의 하향조절은 일반적으로 2배보다 낮지만(6, 7), 이러한 효과는, 예를 들어 완전한 표적 매칭 및 표적 서열의 직렬 배열에 의해(8) 향상될 수 있다는 것이다.
많은 miRNA 유전자는 동물계 전반에 걸쳐 매우 고도로 보존되는 반면, 또한 계통, 종 또는 심지어 조직 특이적인 miRNA도 있다. 특정 조직 향성을 달성하거나 비종양 조직에서의 복제를 방지하기 위한 일반적인 목표를 가지고 세포 miRNA의 표적이 되도록 바이러스를 조작한 예가 많이 있다. 성공적인 복제 제한의 예는 2개의 별도 단일 miRNA 표적 서열을 삽입하여 변형시킨 폴리오바이러스, 및 삼중 표적 서열에 의해 변형된 수포성 구내염 바이러스(VSV)가 있다. 이러한 연구는 생체내 바이러스 복제가 miRNA에 의해 제어될 수 있음을 나타낸다(9, 10). 유사한 방식으로, 인플루엔자 바이러스 또는 종양용해성 피코나바이러스의 약독화는 종 특이적 또는 조직 특이적 마이크로RNA의 표적 서열을 바이러스 게놈에 삽입함으로써 달성되었다(11, 12). 또한 인플루엔자 ORF에 miRNA-93 표적 서열을 삽입함으로써 계란이 아닌, 마우스에서 인플루엔자 A 바이러스의 종 특이적 약독화가 입증되었다(13).
miRNA 표적화를 통해 바이러스 복제를 의도적으로 약독화시키는 것 외에도, 마이크로RNA 기구는 또한 바이러스 유전자 치료 벡터의 전이유전자 발현을 침묵시키기 위해서도 사용되었다. 벡터 입자에 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 게놈의 패키징은 전이유전자 생성물이 세포독성인 경우 진핵생물 프로모터의 제어 하에 암호화된 전이유전자의 발현에 의해 심각하게 손상될 수 있다. 세포독성 전이유전자 발현의 miRNA-매개의 하향조절은 각각의 AAV의 수율 및 패키징 효율을 증가시켰다(14). 지금까지 이 접근법은 AAV 수율을 향상시키기 위해 pri-miRNA 유사 스캐폴드(14) 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)(15)로서 인공 miRNA(amiRNA)를 과잉발현함에 의해서만 효과적인 것으로 시사되었다. AAV 벡터는 전형적으로 헬퍼 기능 및 벡터 게놈을 암호화하는 플라스미드의 세트의 형질감염에 의해 생산되며, 따라서 amiRNA 또는 shRNA 발현 플라스미드를 공동-형질감염하는 것이 기술적으로 실현가능했다. 그러나, miRNA 형질감염 접근법은 MVA 또는 일반적으로 감수성 생산자 세포의 감염에 의해 전파되는 폭스바이러스 기반 벡터에서는 실현가능하지 않았다. CEF-적응된 MVA의 경우, 흔한 생산자 세포는 1차 CEF 세포 또는 연속 닭 섬유아세포주 DF-1과 같은 몇몇 조류 세포주이다. 1차 CEF는 매우 제한된 형질감염 효율을 나타내므로, 일반적으로 형질감염 절차는 산업-규모 생산 공정에 이상적이지 않다.
따라서, 본 발명자들은 백신접종 목적으로 더 높은 재조합 MVA 수율을 달성하기 위해 벡터 생산 동안 MVA 벡터에 의해 구동되는 전이유전자 발현을 하향조절하도록 1차 CEF에서 세포-내인성 miRNA를 활용하는 것을 목표로 했다.
miRNA 기구와 백시니아 바이러스 감염의 서로의 상호작용에 관한 공개적으로 이용 가능한 지식은 제한적일 뿐이다. 백시니아 바이러스는 miRNA 분해 유도(16, 17), 뿐만 아니라 miRNA 생합성에 필요한 세포 RNase Dicer(17, 18)의 하향조절을 포함한, 서로 다른 수준에서 세포 miRNA 기구를 하향조절하는 것으로 나타난다. 이는 miRNA가 백시니아 바이러스-유도의 전이유전자 발현을 조정하는 데 적합하지 않을 것임을 시사했다. B5 의존성 백시니아 바이러스 형태형성 및 결과적인 자손 바이러스 생산을 손상시키려는 목적으로 B5라는 백시니아 바이러스 단백질 발현을 표적화된 miRNA 매개로 하향조절하는 한 예가 있다(19, 20). 그러나, B5R 유전자의 발현을 유도하는 초기/후기 폭스바이러스 B5 프로모터는 그다지 강력한 프로모터가 아니다(21, 22). 대조적으로, 생산자 세포에서 폭스바이러스-유도 전이유전자 발현을 제어하는 데 있어서의 문제점은 전이유전자의 발현을 유도하는 데 사용되는 폭스바이러스 프로모터가 면역원으로서 작용하는 재조합 단백질의 최대 양의 합성을 유도할만큼 강력한 것으로 의도적으로 설계되고 선택되었다는 사실에 의해 확대된다(예를 들어 널리 사용되는 합성 초기/후기 PrS 프로모터(23) 및 강력한 즉시 초기 프로모터 Pr13.5long(24)).
본 발명의 목적은 재조합 MVA를 증가된 수율로 생산하기 위한 수단 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 근본적인 문제점은 전이유전자의 발현이 감수성 생산자 세포에서 MVA 전파 동안 하향조절되도록 변형된 재조합 MVA의 제공에 의해 해결된다. 특히, 본 발명은 첨부된 청구범위와 다음의 측면 및 이들의 실시양태에 의해 정의된다.
제1 측면에서, 본 발명은 폭스바이러스 프로모터에 작동가능하게 연결된 전이유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 변형 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)를 제공하며, 뉴클레오타이드 서열은 전이유전자에 연결된 miRNA 표적 서열을 추가로 포함하고, 여기서 miRNA는 표적 서열은 진핵생물 MVA 생산자 세포의 miRNA에 상응한다.
제2 측면에서, 본 발명은 폭스바이러스 프로모터에 작동 가능하게 연결된 전이유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 MVA를 제공하며, 뉴클레오타이드 서열은 전이유전자에 연결된 miR블록에 배열된 일련의 miRNA 표적 서열을 추가로 포함하며, 여기서 miR블록 내 각 miRNA 표적 서열은 진핵생물 MVA 생산자 세포의 miRNA에 상응한다.
추가 측면에서, 본 발명은 폭스바이러스 프로모터에 작동 가능하게 연결된 전이유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 전사 단위를 포함하는 재조합 MVA를 제공하며, 뉴클레오타이드 서열은 전이유전자에 연결된 miRNA 표적 서열, 또는 전이유전자에 연결된 miR블록에 배열된 일련의 miRNA 표적 서열을 추가로 포함하고, 여기서 miRNA 표적 서열 또는 miR블록 내 각 miRNA 표적 서열은 진핵생물 MVA 생산자 세포의 miRNA에 상응한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 제1 및 제2 전사 단위 또는 그 이상의 전사 단위를 포함하는 재조합 MVA를 제공하며, 각각의 전사 단위는 폭스바이러스 프로모터에 작동 가능하게 연결된 전이유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드 서열은 전이유전자에 연결된 miRNA 표적 서열, 또는 전이유전자에 연결된 miR블록에 배열된 일련의 miRNA 표적 서열을 추가로 포함하고, 여기서 miRNA 표적 서열 또는 miR블록의 각 miRNA 표적 서열은 진핵생물 MVA 생산자 세포의 miRNA에 상응한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 폭스바이러스 프로모터에 작동가능하게 연결된 전이유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 이 뉴클레오타이드 서열이 전이유전자에 연결된 miRNA 표적 서열 또는 전이유전자에 연결된 miR블록에 배열된 일련의 miRNA 표적 서열을 추가로 포함하는, 전사 단위, 바람직하게는 재조합 MVA에 사용하기에 적합한 전사 단위를 제공하며, 여기서 miRNA 표적 서열 또는 miR블록 내 각 miRNA 표적 서열은 진핵생물 MVA 생산자 세포의 miRNA에 상응한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 miR블록에 배열된 일련의 miRNA 표적 서열을 제공하며, 이는 바람직하게는 재조합 MVA에 사용하기에 적합하고, 여기서 각 miRNA 표적 서열은 진핵생물 MVA 생산자 세포의 miRNA에 상응한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 진핵생물 생산자 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결된 전이유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드를 제공하며, 이 뉴클레오타이드 서열은 전이유전자에 연결된 miRNA 표적 서열, 또는 전이유전자에 연결된 miR블록에 배열된 일련의 miRNA 표적 서열을 추가로 포함하고, 여기서 miRNA 표적 서열 또는 miR블록 내 각각의 miRNA 표적 서열은 진핵생물 생산자 세포의 miRNA에 상응한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 재조합 MVA를 생산하는 공정을 제공한다:
(1) 본 발명에 따른 miRNA 표적 서열 또는 miR블록에 배열된 일련의 miRNA 표적 서열을 제공하는 단계;
(2) 단계 (1)에서 제공된 miRNA 표적 서열 또는 miR블록을 사용하여 본 발명에 따른 전사 단위를 제조하는 단계;
(3) 단계 (2)에서 제조된 전사 단위를 MVA에 삽입하는 단계;
(4) 단계 (3)에서 수득한 MVA를 진핵생물 MVA 생산자 세포에 감염시키고 이를 전파시키는 단계;
(5) 단계 (4)에서 전파된 재조합 MVA를 수확하는 단계.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 공정에 의해 생산된 재조합 MVA를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 산업 규모의 백신 생산을 위한 본 발명에 따른 재조합 MVA의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 진핵생물 MVA 생산자 세포에서 MVA 암호화된 전이유전자의 발현을 하향조절하기 위한, 특히 산업 규모의 백신 생산을 위한 본 발명에 따른 miRNA 표적 서열의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 진핵생물 MVA 생산자 세포에서 MVA 암호화된 전이유전자의 발현을 하향조절하기 위한, 특히 대규모 백신 생산을 위한 본 발명에 따른 miR블록에 배열된 일련의 miRNA 표적 서열의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 MVA를 포함하고, 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물 또는 백신을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 약제 또는 백신으로서 사용하기 위한, 바람직하게는 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명에 따른 재조합 MVA를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 감염성 질환 또는 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명에 따른 재조합 MVA를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 감염성 질환 또는 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제 또는 백신의 제조를 위한 본 발명에 따른 재조합 MVA의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 본 발명에 따른 재조합 MVA를 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 감염성 질환 또는 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
이러한 측면 및 이의 실시양태는 본 발명의 설명과 관련하여 더 자세히 설명될 것이다.
도 1은 EGFP를 발현하고 EGFP 3'-UTR에서 이종-올리고머 miR블록에 배열된 miRNA 표적 서열을 함유하는 플라스미드 삽입체의 설계를 예시한다.
miRNA 표적 서열이 없는 EGFP 플라스미드("miRb 없는 EGFP")(A), 이종-올리고머 miR블록-1(B) 및 -2(C)를 갖는 EGFP 플라스미드, 및 4개의 스크램블된 miRNA 표적 서열을 함유하는 대조용 miR블록을 갖는 EGFP 플라스미드("EGFP-scrbl2")(D). pCMV = 인간 거대세포바이러스 즉시 초기 프로모터/인핸서; EGFP = 강화된 녹색 형광 단백질: SV40 폴리A = 유인원 바이러스-40의 폴리아데닐화 신호; nt = 뉴클레오타이드; ORF = 개방 판독 프레임.
도 2는 1차 CEF 세포에서 플라스미드-유도 EGFP 발현에 미치는 miR블록 효과의 비교를 보여준다.
VP-SFM 배지 내 CEF 세포는 0일째에 37℃에서 96-웰 플레이트(4x104개 세포/웰)에 파종했다. 세포를 1일째 EGFP- 및 청색 형광 단백질(BFP)-암호화 플라스미드로 3중 반복으로 공동-형질감염시켰다. EGFP 유전자의 3'-UTR에 10개의 상이한 이종-올리고머 miR블록을 갖는 EGFP 암호화 플라스미드는 miRb-1에서 miRb-10으로 명명된다(miRNA 표적 서열의 경우, 표 4 참조). miR블록을 함유하지 않은 EGFP를 암호화하는 플라스미드를 사용한 형질감염은 EGFP 발현에 대한 기준("miRb 없음")으로서 역할을 했다. 세포는 2일차에 유세포분석법으로 EGFP 및 BFP 발현에 대해 분석했다. BFP 양성 세포의 EGFP(상단) 및 BFP(하단)의 기하 평균 형광 강도(GMFI)가 제시된다(기하 표준 편차(geoSD)를 나타내는 오차 막대를 갖는 기하 평균(GM)). 백분율은 miR블록을 함유하지 않는 EGFP 발현 기준에 상대적인 EGFP 발현 수준 %를 나타낸다.
도 3은 CEF 및 DF-1 세포에서 플라스미드 형질감염 후 EGFP 발현에 미치는 30℃ 및 37℃에서의 miR블록 효과의 분석을 보여준다.
VP-SFM 배지에서의 CEF 세포(왼쪽) 및 DMEM/10% FCS에서의 DF-1 세포(오른쪽)를 0일째에 96웰 플레이트(4x104 세포/웰)에 파종했다. 세포는 1일차에 EGFP("miRb-1", "miRb-2", miR블록 대조용 "scrbl") 및 BFP를 암호화하는 플라스미드로 3중 반복으로 공동-형질감염시켰다. miR블록을 함유하지 않은 EGFP를 암호화하는 플라스미드를 사용한 형질감염은 EGFP 발현 기준("miRb 없음")로서 역할을 했다. 세포는 30℃ 또는 37℃에서 인큐베이션했고, 형질감염 23시간 후에 유세포분석법으로 EGFP 및 BFP 발현에 대해 분석했다. BFP 양성 세포의 EGFP(상단) 및 BFP(하단)의 GMFI가 제시된다(geoSD가 있는 GM). EGFP 발현 기준에 상대적인 EGFP 발현 수준 %.
도 4는 EGFP를 암호화하고 EGFP 3'-UTR에서 이종-올리고머 miR블록에 배열된 miRNA 표적 서열을 함유하는 재조합 MVA 삽입체의 설계를 예시한다.
miRNA 표적 서열이 없는 EGFP("EGFP"), 이종-올리고머 miR블록-1 및 -2를 갖는 EGFP("EGFP-miRb-1", "EGFP-miRb-2") 및 대조용 miR블록을 갖는 EGFP("EGFP-scrbl2")를 암호화하는 재조합 MVA. PrS = 합성 폭스바이러스 초기/후기 프로모터; RFP = 적색 형광 단백질; gpt = 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제; nt = 뉴클레오타이드; TTS = 초기 전사 종결 신호; IGR = MVA 게놈의 유전자간 영역.
도 5는 재조합 MVA에 의해 EGFP 발현 수준에 미치는 miR블록 효과의 분석을 보여준다.
VP-SFM 배지 중 CEF 세포(왼쪽) 및 DMEM/10% FCS 중 DF-1 세포(오른쪽)를 0일째에 96웰 플레이트에 파종했다(4x104 세포/웰). 1일차에 세포는 miR블록을 함유하지 않거나("miRb 없음", EGFP 발현 기준), miR블록-1 또는 -2를 함유하거나("miRb-1", "miRb-2"), 또는 miR블록-scrbl2 대조군("scrbl2")을 함유하는 EGFP 및 RFP 발현 MVA-BN 재조합체로 5의 감염 다중도(MOI)로 3중 반복으로 감염시켰다. 세포는 감염 동안 30℃ 또는 37℃에서 인큐베이션했다. p.i. 19시간째에 세포를 트립신 처리하고 세척한 후 PBS-FACS-FORM(1% FCS, 0.1% NaN3, 1% 파라포름알데하이드(PFA))에 재현탁시켰다. EGFP 및 RFP의 발현은 유세포분석법으로 분석했다. RFP 양성 세포의 EGFP(상단)와 RFP(하단)의 GMFI가 제시된다(geoSD가 있는 GM). EGFP 발현 기준에 상대적인 EGFP 발현 수준 %.
도 6은 상이한 MOI로 재조합 MVA에 감염 후 EGFP 발현에 미치는 miR블록 효과의 분석을 보여준다.
VP-SFM 배지 중 CEF 세포(왼쪽) 및 DMEM/10% FCS 중 DF-1 세포(오른쪽)를 0일째에 96웰 플레이트(4x104 세포/웰)에 3중 반복으로 파종했다. 1일째에 세포는 miR블록을 함유하지 않거나("miRb 없음", EGFP 발현 기준), miR블록-1 또는 -2를 함유하거나("miRb-1", "miRb-2"), 또는 miR블록-scrbl2 대조군("scrbl2")을 함유하는 EGFP 및 RFP 발현 MVA-BN 재조합체를 이용하여 표시된 바와 같이 MOI 5, 1, 또는 0.2로 감염시켰다. 감염 후 6시간째, 세포를 트립신처리하고 세척하고, PBS-FACS-FORM(1% FCS, 0.1% NaN3, 1% PFA)에 재현탁시켰다. EGFP의 발현은 유세포분석법으로 분석했다. EGFP의 GMFI(상단; geoSD가 있는 GM) 및 EGFP 발현 기준에 상대적인 EGFP 발현 수준 GMFI %(하단; 평균의 표준 오차(SEM)가 있는 평균)가 표시된다. RFP의 발현은 기록되지 않았다.
도 7은 낮은 MOI로 재조합 MVA에 감염된 후 시간 경과에 따른 EGFP 발현(다중 주기 복제)에 미치는 miR블록 효과의 분석을 보여준다.
VP-SFM 배지 내 CEF 세포는 0일째에 96-웰 플레이트에 3중 반복으로 파종했다(4x104개 세포/웰). 1일차에 세포는 miR블록을 함유하지 않거나("miRb 없음"), miR블록-1 또는 -2를 함유하거나("miRb-1", "miRb-2") 또는 miR블록-scrbl2("scrbl2", 대조군)를 함유하는 EGFP 및 RFP 발현 MVA-BN 재조합체로 0.1의 MOI로 감염시켰다. 표시된 p.i. 시간에, 세포를 트립신처리하고 세척하고, PBS-FACS-FORM(1% FCS, 0.1% NaN3, 1% PFA)에 재현탁시켰다. EGFP 및 RFP의 발현은 유세포분석법으로 분석했다. RFP 양성 세포의 EGFP(상단, 왼쪽) 및 RFP(상단, 오른쪽)의 SGMFI(geoSD가 있는 GM)가 EGFP 발현 기준에 상대적인 EGFP GMFI % 및 RFP GMFI %와 함께 제시된다.
도 8은 이종-올리고머 miR블록에 배열된 miRNA 표적 서열을 함유하고 상이한 프로모터 하에 EGFP를 발현하는 재조합 MVA 삽입체의 디자인을 예시한다. PrS = 합성 폭스바이러스 초기/후기 프로모터; Pr13.5long = 즉시 초기 프로모터.
도 9는 상이한 폭스바이러스 프로모터 하에서 EGFP 발현에 미치는 miR블록 효과의 비교를 보여준다.
VP-SFM 배지 중 CEF 세포(왼쪽) 및 DMEM/10% FCS 중 DF-1 세포(오른쪽)는 0일째에 96웰 플레이트에 파종했다(4x104 또는 3x104 세포/웰). 1일차에 PrS 프로모터 또는 Pr13.5long 프로모터의 제어 하에 miRNA 표적화된 EGFP 유전자를 갖는 miR블록-2("miRb-2") 또는 miR블록-scrbl2("scrbl2", 대조군)를 함유하는 EGFP 및 RFP 발현 MVA-BN 재조합체를 이용하여 세포를 3중 반복으로 감염시켰다(MOI 10). p.i. 6시간 및 18시간째에, 세포를 트립신처리하고 세척하고, PBS-FACS-FORM(1% FCS, 0.1% NaN3, 1% PFA)에 재현탁시켰다. EGFP 및 RFP의 발현은 유세포분석법으로 분석했다. "scrbl2" 대조군으로 감염된 RFP 양성 세포에서 EGFP 발현 수준에 상대적인 EGFP의 GMFI %가 표시된다(SEM이 있는 평균). 표시된 바와 같이 PrS 또는 Pr13.5long 프로모터 및 감염 시간. "scrbl2" 대조군에 상대적인 EGFP 발현 수준 %.
도 10은 플라스미드-유도 EGFP 발현에 미치는 효과에 관한 이종-올리고머 및 관련 동종-올리고머 miR블록의 비교를 보여준다.
VP-SFM 배지 중 CEF 세포(4x104개 세포/웰)를 0일째에 96-웰 플레이트에 파종했다. 세포를 1일째에 EGFP- 및 BFP-암호화 플라스미드로 3중 반복하여 공동-형질감염시켰다. 이종-올리고머 miR블록-1 또는 -2("miRb-1", "miRb-2") 또는 동종-올리고머 miR블록-13 내지 -20을 함유하는 플라스미드에 의한 EGFP 발현을 분석했다. miR블록-13 내지 -16은 miR블록-1에 함유된 miRNA 표적 서열의 3중 반복을 함유했다; miR블록-17 내지 -20에는 miR블록-2에 함유된 miRNA 표적 서열의 4중 반복이 함유되어 있다. miR블록을 함유하지 않는 플라스미드("miRb 없음")는 EGFP 발현 기준으로서 역할을 했고, miR블록-scrbl2를 함유하는 플라스미드("scrbl2")는 대조군으로서 역할을 했다. 형질감염 후 1일차에 유세포분석법에 의해 결정된 BFP 양성 세포의 EGFP(상단) 및 BFP(하단)의 GMFI(geoSD가 있는 GM)가 제시된다. EGFP 발현 기준에 상대적인 EGFP 발현 %. miR블록 함유 플라스미드 세트를 2회의 별도 실험으로 분석했다.
도 11은 EGFP를 발현하고 동종-올리고머 miR블록에 배열된 선택된 miR블록-2 유래 miRNA 표적 서열을 함유하는 재조합 MVA 삽입체의 설계를 보여준다.
miRNA 표적 서열이 없는("EGFP"), 이종-올리고머 miR블록-2를 갖는("EGFP-miRb-2"), 동종-올리고머 miR블록-17 또는 -18을 갖는("EGFP-miRb-17", "EGFP-miRb-18") 및 대조용 miR블록을 갖는("EGFP-scrbl2") 재조합 MVA.
도 12는 재조합 MVA에 의한 EGFP 발현에 미치는 효과에 관한 이종-올리고머 및 관련 동종-올리고머 miR블록의 비교를 보여준다.
VP-SFM 중 CEF 세포는 0일째에 96웰 플레이트에 파종했다(4x104 세포/웰). 1일째에 세포를 이종-올리고머 miR블록-2("miRb-2") 또는 동종-올리고머 miR블록-17 또는 -18("miRb-17", "miRb-18")을 함유하는 MVA-BN 재조합체(MOI 5)로 감염시켰다. miR블록-17 및 -18에는 miR블록-2에 함유된 miRNA 표적 서열의 4중 반복이 함유되어 있다. p.i. 18시간째에 세포를 트립신 처리하고 세척한 다음, PBS-FACS-FORM(1% FCS, 0.1% NaN3, 1% PFA)에 재현탁시켰다. EGFP 및 RFP의 발현은 유세포분석법으로 분석했다. RFP 양성 세포의 EGFP(왼쪽) 및 RFP(오른쪽) 발현의 GMFI가 표시된다(geoSD가 있는 GM). EGFP 발현 기준("miRb 없음)에 상대적인 EGFP 발현 수준 %.
도 13은 선택된 miRNA를 기반으로 설계된 동종-올리고머 miR블록에 의해 제어되는 플라스미드-유도 EGFP 발현의 비교를 보여준다.
VP-SFM 배지 중 CEF 세포(왼쪽)(4x104 세포/웰) 및 DMEM/10% FCS 중 DF-1 세포(오른쪽)(3x104 세포/웰)를 0일째에 96웰 플레이트에 파종했다. 세포를 1일째에 EGFP- 및 BFP-발현 플라스미드로 3중 반복으로 형질감염시켰다. miRNA 표적 서열의 4중 반복으로 구성된 동종-올리고머 miR블록-25 내지 -36을 함유하는 플라스미드에 의한 EGFP 발현을 분석했다. 이종-올리고머 miR블록-1 또는 -2를 함유하는 플라스미드는 비교를 위해 포함되었다. miR블록이 함유되지 않은 플라스미드("miRb 없음")는 EGFP 발현 기준으로서 역할을 했고, miR블록-scrbl2를 함유하는 플라스미드("scrbl2")는 대조군으로서 역할을 했다. 형질감염 후 1일째에 유세포분석법에 의해 결정된 BFP 양성 세포의 EGFP(상단) 및 BFP(하단)의 GMFI(geoSD가 있는 GM)가 제시된다. EGFP 발현 기준("miRb 없음")에 상대적인 EGFP 발현 %. miR블록-25 및 26에 대한 데이터를 포함하는 데이터세트는 독립된 실험에서 유래된 것이다.
도 14는 가장 효과적인 miRNA 표적 서열로 구성된 이종-올리고머 miR블록을 함유하는 재조합 MVA에 의해 감염된 세포에서 EGFP 하향조절의 분석을 보여준다.
VP-SFM 배지 중 CEF 세포(왼쪽)(4x104 세포/웰) 및 DMEM/10% FCS 중 DF-1 세포(오른쪽)(3x104 세포/웰)를 0일째에 96웰 플레이트에 파종했다. 세포는 1일째에 이종-올리고머 miR블록을 함유하는 EGFP 및 BFP 발현 플라스미드로 3중 반복으로 형질감염시켰다. miR블록-37 내지 -47은 동종-올리고머 miR블록-13, -17-, -18 -20(도 10 참조) 및 miR블록-25, -26, -31 내지 -33(도 13 참조)의 miRNA 표적 서열로 구성되었다. 이종-올리고머 miR블록-2를 함유하는 플라스미드는 비교를 위해 포함시켰다. miR블록을 함유하지 않는 플라스미드("miRb 없음")는 EGFP 발현 기준으로서 역할을 했고, miR블록-scrbl2를 함유하는 플라스미드("scrbl2")는 대조군으로서 역할을 했다. 형질감염 후 24시간째에, 세포를 유세포분석법으로 EGFP 및 BFP의 발현에 대해 분석했다. BFP 양성 세포의 EGFP(상단) 및 BFP(하단)의 GMFI(geoSD가 있는 GM)가 표시된다. EGFP 발현 기준("miRb 없음")에 상대적인 EGFP 발현 %.
도 15는 RSV 유래 전이유전자의 3'-UTR에 miR블록을 함유하는 재조합 MVA-BN-RSV 및 이의 변형 버전의 설계를 예시한다.
상이한 프로모터의 제어 하에 RSV 유래 전이유전자를 암호화하는 MVA-BN 재조합체("MVA-BN-RSV", "MVA-BN-RSV-miRb1/2", "MVA-BN-RSV-miRb39/41")가 표시된 바와 같이 묘사된다. MVA-BN-RSV에서 암호화된 RSV 유래 전이유전자는 miR블록에 연결되지 않는다. MVA-BN-RSV-miRb1/2 및 MVA-BN-RSV-miRb39/41에서는 3개 또는 전부 4개의 전이유전자가 각각 이종-올리고머 miR블록에 연결된다. G(A), G(B) = RSV G 단백질의 A 및 B 혈청형에 대한 ORF; N = RSV 핵단백질 ORF; 2A = 피코나바이러스 유래 자가 절단 2A 펩타이드; M2-1 = RSV M2 유전자로부터의 M2-1 ORF; F(A-long BN) = RSV-F 단백질의 변형된 A-long 혈청형에 대한 ORF; 표시된 바와 같은 폭스바이러스 프로모터.
도 16은 MVA 암호화 RSV G, F 및 N/M2-1 전이유전자의 miRNA 매개 하향조절의 분석을 보여준다.
VP-SFM의 1x106 CEF 세포를 0일째에 파종했다. 다음 날, 세포는 모의 감염시키거나 MVA-BN 또는 재조합체 MVA-BN-RSV, MVA-BN-RSV-miRb1/2 또는 MVA-BN-RSV-miRb39/41로 1의 MOI로 감염시켰다. 세포 용해물("CL")은 p.i. 12시간(왼쪽) 및 18시간(오른쪽)째에 제조했고, 단백질은 SDS-PAGE로 크기별로 분리하고 항-RSV G, 항-RSV F 또는 항-RSV N 항체 또는 항-D8 VACV 항체(MVA 벡터 대조군)를 사용하여 면역블로팅으로 분석했다.
도 17은 MVA-BN-RSV와 비교하여 MVA-BN-RSV-miRb1/2 및 MVA-BN-RSV-miRb39/41의 복제 능력을 보여준다.
CEF 세포는 감염 하루 전에 6-웰 플레이트에서 VP-SFM 배지에 파종했다. 융합성 단층에 1ml VP-SFM 중 MVA 재조합체: MVA-BN-RSV, MVA-BN-RSV-miRb1/2 또는 MVA-BN-RSV-miRb39/41을 MOI 0.1(왼쪽) 또는 0.01(오른쪽)로 3중 감염시켰다. MVA-BN 야생형(즉, 비-재조합체)은 비교를 위해 포함되었다. 감염된 세포를 30℃에서 배양했고 후속 TCID50 적정을 위해 p.i.3일 및 4일째에 직접 동결시켰다. 바이러스 수율은 SD와 함께 TCID50/2ml의 기하 평균으로 나타내었다. 표에는 도면(상단)에 제시된 데이터로부터 계산된 바이러스 역가의 배수 차이가 표시되어 있다.
도 18은 Dextramer 염색으로 분석한 마우스의 말초 혈액 세포에서의 RSV-특이적 CD8+ T 세포 반응의 분석을 보여준다.
10마리 암컷 BALB/c 마우스 그룹을 0일 및 21일째에 MVA-BN-RSV, MVA-BN-RSV-miRb1/2 또는 MVA-BN-RSV-miRb39/41을 사용하여 마우스당 1x108 TCID50으로 근육내 면역화했다. TBS-처리된 마우스(n=5)는 대조군으로 포함시켰다. PBMC는 프라임 후 7일, 28일(= 부스트 후 7일) 및 34일(= 부스트 후 13일)째에 수집하고, RSV M2-1 및 MVA E3 단백질(벡터 대조군) 내 면역우성 에피토프에 특이적인, 뿐만 아니라 표면 마커 CD4, CD8 및 CD44의 발현에 특이적인 MHC 클래스 I 덱스트라머로 염색했다. 활성화되고(CD44+) RSV M2-1(왼쪽) 또는 MVA-유래 E3(오른쪽)에 특이적인 살아있는 CD8+ T 세포의 백분율이 표시된다(SEM이 있는 평균).
도 19는 세포내 사이토카인 염색(ICCS) 및 ELISpot에 의해 분석된 마우스의 비장세포 내 RSV 특이적 T 세포 반응의 분석을 보여준다.
암컷 BALB/c 마우스를 도 18에 기술된 바와 같이 처리했다. 부스트 후 13일째에, T 세포의 ICCS 및 ELISpot 분석을 위해 단일 세포 비장세포 현탁액을 제조했다. (A) ICCS을 위해, 비장세포는 표시된 RSV 단백질 유래의 면역우성 펩타이드 또는 MVA E3(벡터 대조군) 유래의 면역우성 MVA 에피토프로 6시간 동안 재자극했다. 펩타이드 자극 후 CD8+ T 세포의 CD44+IFN-γ+ 세포의 빈도가 표시된다(SEM이 있는 평균). (B) ELISpot 분석을 위해, 비장세포는 표시된 바와 같이 면역우성 RSV G, F 및 M2-1 유래 펩타이드 또는 면역우성 MVA-E3 펩타이드를 사용하여 재자극했다. 1x106 비장세포당 IFN-γ+ 반점 형성 콜로니(SFC)가 표시된다(SEM이 있는 평균).
도 20은 마우스의 혈청 내 RSV-특이적 IgG 항체 역가 및 RSV 플라크 감소 중화 역가 분석을 보여준다.
암컷 BALB/c 마우스를 도 18에 기술된 바와 같이 처리했다. 혈청은 면역화 1일 전(-1일), 프라임 후 20일째 및 34일째(= 부스트 후 13일)에 수집했다. (A) RSV- 및 MVA-특이적 IgG 항체(각각 왼쪽 및 오른쪽)는 ELISA로 검출했고, 결과는 geoSD가 있는 기하 평균 역가(GMT)로 표시했다. (B) 혈청 샘플 내 RSV A2 균주 특이적 중화 항체 역가는 플라크 감소 중화 테스트(PRNT)로 결정했다(geoSD가 있는 GMT). 초기에 혈청 음성인 마우스에 대한 플라크 감소 중화 역가 ≥ 15의 출현으로서 정의된 혈청전환율 %가 표에 표시된다.
서열의 간단한 설명






목적은 생산자 세포에서 재조합 MVA의 성장을 개선하여, 특히 대규모 백신 생산에서 바이러스 수율을 증가시키는 것이었다.
문제점은 전파 중에 재조합 MVA에 의한 세포독성 전이유전자 발현을 감소시키면서, 백신 수혜자의 전이유전자-특이적 면역 반응을 유도하는 재조합 MVA의 잠재성을 보존하는 것이었다.
이 문제점을 해결하기 위해, 본 발명자들은 재조합 MVA에 의한 전이유전자 발현의 하향조절을 위해 조류 MVA 생산자 세포에서 내인적으로 발현되는 miRNA를 사용했다. 이를 위해 miRNA에 상응하는 miRNA 표적 서열을 전이유전자의 3'-UTR 영역에 삽입했다.
본 발명자들은 먼저 형질감염된 모델 전이유전자(EGFP)를 사용하여 재조합 MVA에 의한 전이유전자 발현을 하향조절하는 데 가장 높은 효율을 가진 miRNA에 대해 스크리닝한 다음, 선택된 miRNA 표적 서열을 평가하고 재조합 MVA에서 이들의 사용을 최적화하는 전략을 따랐다.
여기서, miRNA 표적 서열을 재조합 MVA에 의해 발현된 전이유전자에 연결하는 개념이 MVA 생산자 세포에서 전이유전자의 발현을 하향조절하기 위해 실행 가능한 것임이 입증되었다. 백시니아 바이러스가 세포의 마이크로RNA 기구의 약화를 매개하는 것으로 추정되는 이유만에 의해, 그리고 다량의 전이유전자 생성물을 달성하기 위해 사용된 폭스바이러스 프로모터의 거대한 활성으로 인해, 이러한 발견은 예상할 수 없었다.
각 시리즈가 소위 miR블록, 즉 miR블록-39 및 -42에 배열되는, miRNA 표적 서열의 2개의 이종 시리즈는 변형된 재조합 MVA-BN-RSV의 제조를 위해 선택되었다. miR블록 선택의 기준은 (i) MVA 생산자 세포에서 전이유전자 발현의 하향조절을 매개하는 높은 활성, (ii) miR블록 내 miRNA 표적 서열 간의 낮은 서열 유사성, 및 (III) 백신접종의 표적 조직, 즉 혈액 및 골격근 내 관련 miRNA의 낮은 발현이었다.
마지막으로, miRNA 표적 서열(예: miR블록-39 및 -42)의 삽입에 의해 변형된 MVA-BN-RSV 재조합체는 변형되지 않은 재조합 MVA-BN-RSV보다 MVA 생산자 세포에서의 전파 동안 더 높은 바이러스 수율을 제공한다는 것이 입증되었다. 또한, 마우스 면역화 실험에서는 재조합 MVA-BN-RSV 내 전이유전자에 연결된 miRNA 표적 서열이 생체내 RSV 유래 항원의 면역원성을 약화시키지 않는 것으로 밝혀졌다.
정의
본 명세서에서 사용된 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백히 달리 나타내지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어 "핵산 서열"에 대한 언급은 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 다수의 인용된 요소들 사이의 접속 용어 "및/또는"은 개별 옵션과 조합 옵션 모두를 포괄하는 것으로 이해한다. 예를 들어, 두 요소가 "및/또는"으로 결합된 경우, 첫 번째 옵션은 두 번째 요소 없이 첫 번째 요소의 적용 가능성을 지칭한다. 두 번째 옵션은 첫 번째 요소 없이 두 번째 요소의 적용 가능성을 지칭한다. 세 번째 옵션은 첫 번째 요소와 두 번째 요소를 함께 적용할 수 있는 가능성을 지칭한다. 이들 옵션 중 어느 하나는 의미 내에 속하고, 이에 따라 본원에 사용된 용어 "및/또는"의 요건을 총족하는 것으로 이해한다. 하나보다 많은 옵션의 동시 적용 가능성도 의미 내에 속하고, 이에 따라 용어 "및/또는"의 요건을 충족하는 것으로 이해한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)" 및 변형어, "포함하다(comprises)" 및 "포함하는"은 언급된 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지는 않음을 암시하는 것으로 이해될 것이다. 본 발명의 상세한 설명에서 측면 또는 실시양태의 맥락에서 사용된 경우, 용어 "포함하는"은 수정될 수 있고, 따라서 "함유하는" 또는 "포함하는(including)"이라는 용어로 대체될 수 있거나, 본원에서 사용된 경우, 용어 "갖는"으로 대체될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 상세한 설명에서 측면 또는 실시양태의 맥락에 사용될 때마다 전술한 임의의 용어(포함하는, 함유하는, 포함하는, 갖는)는 사실상 각각 관할권에 따라 구체적인 법적 의미를 나타내는 "이루어지는" 또는 "본질적으로 이루어지는"이라는 용어를 포함한다.
본원에 사용된 "이루어지는"은 청구범위 요소에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 제외한다. 본원에 사용된 "본질적으로 이루어지는"은 청구범위의 기본적이고 새로운 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다.
본원에 기술된 용어 "재조합 MVA"는 야생형 바이러스에는 자연적으로 존재하지 않는, 게놈에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 MVA를 지칭한다. 따라서, 재조합 MVA는 자연에서 발생하지 않거나, 또는 자연에서 발견되지 않는 배열로 다른 핵산에 연결된 합성 또는 반합성 기원의 핵산 서열의 2개 이상의 분절의 인위적인 조합에 의해 만들어진 MVA를 지칭한다. 인위적인 조합은 잘 확립된 유전 공학 기술을 사용하여 핵산의 단리된 분질을 인위적으로 조작함으로써 가장 흔하게 달성된다. 일반적으로, 본원에 기술된 "재조합 MVA"는 표준 유전 공학 방법에 의해 생성된 MVA를 지칭하며, 예를 들어 재조합 MVA는 따라서 유전자 조작되거나 유전자 변형된 MVA이다. 따라서 용어 "재조합 MVA"는 적어도 하나의 재조합 핵산이, 바람직하게는 전사 단위의 형태로, 게놈에 통합된 MVA(예를 들어, MVA-BN®)를 포함한다. 재조합 MVA는 조절 요소, 예를 들어 프로모터의 유도 시, 이종 항원 결정기, 폴리펩타이드 또는 단백질(항원)을 발현할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "이종"은 MVA에 자연적이지 않지만(또는 외래이지만) 재조합 기술을 사용하여 MVA에 인위적으로 삽입된 유전자, 전이유전자 또는 DNA 서열을 지칭한다. 유사하게, "이종 miR블록"이라는 표현은 이를 포함하는 MVA에 관하여 이종인 miR블록을 지칭한다.
"miRNA"("마이크로RNA"의 약어)라는 용어는 전형적으로 길이가 21-23개 뉴클레오타이드(nt)인 작은 단일 가닥의 비암호 RNA 분자를 지칭한다. miRNA는 mRNA에 결합하여 RNA 침묵 및 유전자 발현의 전사 후 조절 기능을 한다.
miRNA의 명명법은 주로 miRNA가 식별된 유기체에 대한 약어가 선행되는 식별된 miRNA의 간단한 순차적 넘버링을 기반으로 한다. 본원에 지칭된 모든 miRNA는 CEF 세포 또는 닭 조직에서 식별되었고, 따라서 각 miRNA 이름 앞에 갈루스 갈루스(닭)에 대한 gga가 와야 하고, 예를 들어, "miR-17-5p"(본원에 사용됨)의 전체 이름은 gga-miR-17-5p일 것이다. 닭 miRNA만이 본원에 제시된 연구에서 테스트되었으므로, 본 발명자들은 가독성을 위해 모든 miRNA 이름에서 gga를 생략했다.
본원에 사용된 용어 "miRNA 서열"은 성숙한 miRNA 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
용어 "시드(seed) 서열"은 miRNA와 mRNA 사이의 결합에 필수적인 miRNA의 뉴클레오타이드 서열 내의 섹션을 지칭한다. 이 섹션은 길이가 7~8개의 뉴클레오타이드이며 mRNA 서열의 관련 섹션과 완벽하게 상보적이다.
본원에 사용된 용어 "miRNA 표적 서열"은 miRNA의 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 핵산 서열을 의미한다. miRNA 서열과 이에 상응하는 표적 서열(즉, 뉴클레오타이드 상보성) 간의 일치성(matching)은 100% 적중도(fit) 이하일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "상응하는" 또는 "~에 상응하다"는 관련 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 miRNA의 관련 뉴클레오타이드 서열에 관한, 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 miRNA 표적 서열의 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다. 더 정확하게는, miRNA에 상응하는 miRNA 표적 서열은 상기 miRNA 서열에 대한 대응물 또는 보체이다.
용어 "상보적"은 뉴클레오타이드가 이중 가닥 구조를 형성할 수 있도록 뉴클레오타이드가 서로 일치하는 2개의 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "miR블록"은 일련의 miRNA 표적 서열을 지칭한다. 이 맥락에서 "일련의"는 2개, 3개 또는 그 이상의 연속적이거나 연쇄된 miRNA 표적 서열을 의미한다.
"동종-올리고머" miR블록은 일련의 동일한 miRNA 표적 서열로 구성된다.
"이종-올리고머" miR블록은 뉴클레오타이드 서열이 상이한 일련의 miRNA 표적 서열로 구성된다. 일반적으로, miR블록 내 모든 miRNA 표적 서열은 서로 상이하다. 대안적으로, 2개 이상의 miRNA 표적 서열은 서로 상이하지만, miR블록 내 다른 서열은 동일하다.
전이유전자 발현의 맥락에서 용어 "하향조절" 또는 "하향조정(downmodulation)"은 전이유전자 생성물 양의 감소 또는 저하에 관한 것이다. 이러한 감소 또는 저하는 전이유전자 mRNA 양의 감소 또는 전이유전자 mRNA의 해독 감소로 인해 발생한다.
본원에 사용된 "전사 단위"는 전이유전자 및 이에 작동가능하게 연결된 프로모터, 터미네이터 및 선택적으로 일련의 miRNA 표적 서열을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 제1 핵산 서열(예를 들어, 전이유전자)이 제2 핵산 서열(예를 들어, 프로모터)과 기능적 관계에 배치된 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터가 암호 서열의 전사를 유도할 수 있는 위치에 배치되는 경우, 프로모터는 전이유전자의 암호 서열에 작동가능하게 연결된 것이다.
약어
BFP 청색 형광 단백질
bp 염기쌍(들)
CEF 닭 배아 섬유아세포
CMV 거대세포바이러스
DF-1 연속 닭 섬유아세포 세포주의 명칭
EGFP 강화된 녹색 형광 단백질
miRb miR블록, 즉 일련의 miRNA 표적 서열
miRNA 마이크로RNA
MOI 감염 다중도
MVA 변형 백시니아 바이러스 앙카라
MVA-BN MVA-BN®(Bavarian Nordic)
nt 뉴클레오타이드
ORF 개방 판독 프레임
p.i. 감염 후
RFP 적색 형광 단백질
RSV 호흡기 세포융합 바이러스
TCID50 조직 배양 감염 용량 50
TTS 전사 종결 신호
실시양태
한 실시양태에서, miR블록 내 miRNA 표적 서열 중 적어도 하나는 진핵생물 MVA 생산자 세포 내 전이유전자의 발현 수준의 하향조절을 매개할 수 있다.
한 실시양태에서, miR블록 내 miRNA 표적 서열 중 적어도 하나는 miRNA 표적 서열이 상응하는 miRNA에 결합했을 때 진핵생물 MVA 생산자 세포 내 전이유전자의 발현 수준의 하향조절을 매개한다.
한 실시양태에서, 전이유전자 발현 수준의 하향조절은 임의의 miRNA 표적 서열에 연결되지 않은 전이유전자에 비해, 예를 들어 세포마다, 전이유전자 생성물의 양이 더 적은 것을 의미한다.
한 실시양태에서, 전이유전자 발현 수준의 하향조절은 전이유전자 mRNA 수준의 감소 또는 전이유전자 mRNA의 해독 감소를 의미한다.
한 실시양태에서, 임의의 miRNA 표적 서열에 연결되지 않은 전이유전자의 발현 수준에 상대적인 전이유전자의 발현 수준의 감소 또는 저하는 약 20, 40, 60, 80, 90 또는 99%이다.
한 실시양태에서, miR블록 내 일련의 miRNA 표적 서열은 일련의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 이상의 miRNA 표적 서열, 바람직하게는 3, 4, 5, 6 또는 7개의 miRNA 표적 서열, 보다 바람직하게는 3개 또는 4개의 표적 서열, 가장 바람직하게는 4개의 표적 서열이다.
한 실시양태에서, miR블록 내 일련의 miRNA 표적 서열은 일련의 2개 내지 10개, 바람직하게는 2개 내지 8개의 miRNA 표적 서열, 더 바람직하게는 3개 내지 7개의 miRNA 표적 서열, 더욱 더 바람직하게는 2개 내지 5개의 miRNA 표적 서열, 가장 바람직하게는 3개 내지 5개의 miRNA 표적 서열이다.
한 실시양태에서, miR블록은 전이유전자 개방 판독 프레임(ORF)의 3'-UTR 영역에 삽입된다.
한 실시양태에서, miR블록은 5'-제1 miRNA 표적 서열의 5'-제1 뉴클레오타이드가 전이유전자 ORF의 정지 코돈에 약 1 내지 500개 뉴클레오타이드 또는 약 2 내지 100개의 뉴클레오타이드 또는 약 3 내지 50개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 5 내지 25개의 뉴클레오타이드, 더 바람직하게는 약 10 내지 20개의 뉴클레오타이드, 더욱 더 바람직하게는 약 13 내지 17개의 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 15개의 뉴클레오타이드의 스페이서 뉴클레오타이드 서열을 통해 결합되도록 전이유전자에 연결된다. 대안적으로, 그러나 덜 바람직하게는, miR블록은 5'-제1 miRNA 표적 서열의 5'-제1 뉴클레오타이드가 전이유전자 ORF의 정지 코돈에 직접 결합되도록, 즉 스페이서 뉴클레오타이드 서열 없이 전이유전자에 연결된다.
한 실시양태에서, 전이유전자에 연결된 miR블록과 함께 폭스바이러스 프로모터에 작동가능하게 연결된 전이유전자는 재조합 MVA의 유전자간 영역(IGR), 바람직하게는 IGR 44/45, 64/65, 88/89 및 148/149로 이루어지는 군으로부터 선택되는 영역에 삽입된다.
한 실시양태에서, 전사 단위는 재조합 MVA의 유전자간 영역(IGR), 바람직하게는 IGR 44/45, 64/65, 88/89 및 148/149로 이루어지는 군으로부터 선택되는 영역에 삽입된다.
miRNA 표적 서열에 관한 실시양태
한 실시양태에서, miRNA 표적 서열은 miRNA 표적 서열이 miRNA에 결합하거나 부분적으로 결합할 수 있도록 miRNA에 상응한다.
한 실시양태에서, miRNA에 상응하는 miRNA 표적 서열은 miRNA의 뉴클레오타이드 서열에 부분적으로 또는 완전히 상보적이다.
한 실시양태에서, miR블록 내 적어도 하나의 miRNA 표적 서열은 약 80 내지 100%, 바람직하게는 약 90 내지 100%, 더욱 바람직하게는 약 95 내지 100%, 가장 바람직하게는 약 100%의 서열 유사성으로 miRNA 서열에 상응한다. 가장 바람직한 것은 100% 서열 동일성이다.
한 실시양태에서, miR블록 내 적어도 하나의 miRNA 표적 서열은 약 80 내지 100%, 바람직하게는 약 90 내지 100%, 보다 바람직하게는 약 95 내지 100%, 가장 바람직하게는 약 100%의 서열 유사성으로 miRNA 서열에 상응하는 시드 서열 외측의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 가장 바람직한 것은 100% 서열 동일성이다.
한 실시양태에서, miR블록 내 적어도 하나의 miRNA 표적 서열은 miRNA 서열에 상보적이며, 바람직하게는 약 100%의 서열 유사성으로 상보적이다. 가장 바람직한 것은 100% 서열 동일성이다.
한 실시양태에서, miR블록 내 적어도 하나의 miRNA 표적 서열은 서열번호 1(miR-17-5p에 상응), 서열번호 2(miR-20a-5p), 서열번호 3(miR-21-5p), 서열번호 4(miR-221a-3p), 서열번호 5(miR-18a-5p), 서열번호 6(miR-19a-3p), 서열번호 7(miR-199-3p), 서열번호 8(miR-33-5p), 서열번호 9(miR-218b-5p)에 묘사된 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, miR블록 내 적어도 하나의 miRNA 표적 서열은 서열번호 1(miR-17-5p에 상응), 서열번호 2(miR-20a-5p), 서열번호 3(miR-21-5p), 서열번호 4(miR-221a-3p), 서열번호 6(miR-19a-3p), 및 서열번호 7(miR-199-3p)에 묘사된 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
miR블록 에 관한 실시양태
한 실시양태에서, miR블록 내 일련의 miRNA 표적 서열은 약 200bp 미만, 바람직하게는 약 150bp 미만, 보다 바람직하게는 약 90 내지 100bp를 포함하거나 이것으로 이루어진다.
한 실시양태에서, miR블록 내 miRNA 표적 서열은 이종-올리고머 또는 동종-올리고머 miR블록, 바람직하게는 이종-올리고머 miR블록에 배열된다.
한 실시양태에서, 이종-올리고머 miR블록 내 모든 miRNA 표적 서열은 서로 상이하다. 대안적인 실시양태에서, 이종-올리고머 miR블록 내 적어도 2개 또는 대부분의 miRNA 표적 서열은 서로 상이하다. 특히, miRNA 표적 서열은 이들의 뉴클레오타이드 서열이 상이하다.
한 실시양태에서, 3개 또는 4개, 바람직하게는 4개의 miRNA 표적 서열은 이종-올리고머 miR블록에 배열된다. 바람직하게는 이종-올리고머 miR블록 내 모두 3개 또는 4개, 바람직하게는 4개의 miRNA 표적 서열은 서로 상이하다. 특히 miRNA 표적 서열은 이들의 뉴클레오타이드 서열이 상이하다.
한 실시양태에서, miR블록 내 각각의 miRNA 표적 서열로부터의 2개의 miRNA 표적 서열은 약 1 내지 10개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 약 2 내지 8개 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 약 3 내지 6개 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 4개의 뉴클레오타이드의 스페이서 뉴클레오타이드 서열에 의해 분리된다. 대안적으로, 덜 바람직하지만, miR블록 내 miRNA 표적 서열은 스페이서 뉴클레오타이드 서열에 의해 분리되지 않는다.
한 실시양태에서, miR블록 뒤에는 폭스바이러스 전사 종결 신호(TTS)가 뒤따른다.
한 실시양태에서, 이종-올리고머 miR블록 내 miRNA 표적 서열은 서열번호 1(miR-17-5p에 상응), 서열번호 2(miR-20a-5p에 상응), 서열번호 3(miR-21-5p), 서열번호 4(miR-221a-3p), 서열번호 5(miR-18a-5p), 서열번호 6(miR-19a-3p), 서열번호 7(miR-199-3p), 서열번호 8(miR-33-5p), 서열번호 9(miR-218b-5p)에 묘사된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 이종-올리고머 miR블록 내 miRNA 표적 서열은 서열번호 1(miR-17-5p에 상응), 서열번호 2(miR-20a-5p에 상응), 서열번호 3(miR-21-5p), 서열번호 4(miR-221a-3p), 서열번호 6(miR-19a-3p), 및 서열번호 7(miR-199-3p)에 묘사된 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, miR블록은 서열번호 1(miR블록-1 내 miR-17-5p에 상응)에 묘사된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, miR블록은 서열번호 2(miR블록-2 내 miR-20a-5p에 상응), 서열번호 3(miR-21-5p ― miR블록-2) 및 서열번호 4(miR-221a-3p ― miR블록-2)에 묘사된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, miR블록은 서열번호 1(miR블록-37 내 miR-17-5p에 상응), 서열번호 2(miR-20a-5p ― miR블록-37), 서열번호 3(miR-21-5p ― miR블록-37), 및 서열번호 6(miR-19a-3p ― miR블록-37)에 묘사된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, miR블록은 서열번호 1(miR블록-38 내 miR-17-5p에 상응), 서열번호 3(miR-21-5p ― miR블록-38), 서열번호 5(miR-18a-5p ― miR블록-38), 및 서열번호 6(miR-19a-3p ― miR블록-38)에 묘사된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, miR블록은 서열번호 1(miR블록-39 내 miR-17-5p에 상응), 서열번호 5(miR-18a-5p ― miR블록-39), 서열번호 6(miR-19a-3p ― miR블록-39), 및 서열번호 7(miR-199-3p ― miR블록-39)에 묘사된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, miR블록은 서열번호 1(miR블록-41 내 miR-17-5p에 상응) 및 서열번호 4(miR-221a-3p ― miR블록-41), 서열번호 8(miR-33-5p ― miR블록-41), 및 서열번호 9(miR-218b-5p ― miR블록-41)에 묘사된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, miR블록은 서열번호 48(miR블록-1에 상응), 서열번호 49(miR블록-2), 서열번호 55(miR블록-scrbl-2), 서열번호 51(miR블록-37), 서열번호 52(miR블록-38), 서열번호 53(miR블록-39), 및 서열번호 54(miR블록-41)에 묘사된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진다.
한 실시양태에서, miR블록은 서열번호 48(miR블록-1에 상응), 서열번호 49(miR블록-2), 서열번호 53(miR블록-39), 및 서열번호 54(miR블록-41)에 묘사된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진다.
한 실시양태에서, miR블록은 서열번호 53(miR블록-39에 상응) 및 서열번호 54(miR블록-41)에 묘사된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진다.
한 실시양태에서, miR블록은 서열번호 54(miR블록-41에 상응)에 묘사된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진다.
프로모터에 관한 실시양태
한 실시양태에서, 프로모터는 초기/후기 프로모터 또는 초기 프로모터, 바람직하게는 즉시 초기 프로모터이다.
한 실시양태에서, 초기/후기 프로모터는 PrS, Pr7.5 및 PrH5m 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 즉시 초기 프로모터는 Pr13.5long, Pr1328, PrLE1(pHyb) 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 프로모터는 Pr13.5long 프로모터이다.
전이유전자에 관한 실시양태
한 실시양태에서, 전이유전자는 단백질 또는 펩타이드, 바람직하게는 하나 이상의 항원 결정기를 포함하는 단백질 또는 펩타이드, 더욱 바람직하게는 단백질성 또는 펩타이드성 항원을 암호화한다.
한 실시양태에서, 전이유전자는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 기생충, 비인간 동물 및 인간 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원 또는 이의 항원성 부분을 암호화한다.
한 실시양태에서, 전이유전자는 바이러스 항원 또는 이의 일부를 암호화한다.
한 실시양태에서, 바이러스 항원은 알파바이러스, 아데노바이러스, 콕사키바이러스, 크리미안-콩고 출혈열 바이러스, 거대세포바이러스(CMV), 뎅기열 바이러스, 에볼라 바이러스, 엡스타인-바 바이러스(EBV), 동부, 서부 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(EEV), 구아나리토 바이러스, 단순 포진 바이러스 유형 1(HSV-1), 단순 포진 바이러스 유형 2(HSV-2), 인간 헤르페스 바이러스 유형 8(HHV-8), A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), D형 간염 바이러스(HDV), E형 간염 바이러스(HEV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인플루엔자 바이러스, 주닌 바이러스, 라사 바이러스, 마추포 바이러스, 마르부르크 바이러스, 홍역 바이러스, 인간 메타뉴모바이러스, 볼거리 바이러스, 노워크 바이러스, 인간 유두종 바이러스(HPV), 파라인플루엔자 바이러스, 파보바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 라이노바이러스, 로타바이러스, 풍진 바이러스, 사비아 바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스 2(SARS-CoV-2), 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스(MERS-CoV), 수두 대상포진 바이러스, 천연두 바이러스, 웨스트 나일 바이러스 및 황열병 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바이러스로부터 유래된다.
한 실시양태에서, 바이러스 항원은 RSV로부터 유래된다.
한 실시양태에서, 전이유전자는 RSV에서 유래되는 단백질, 또는 이의 항원성 부분, 바람직하게는 RSV G(A), G(B), F, N 및 M2-1 단백질, 및 N/M2-1 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 암호화한다.
한 실시양태에서, 바이러스 항원은 동부, 서부 또는 베네수엘라 EEV로부터 유래된다.
한 실시양태에서, 전이유전자는 동부, 서부 또는 베네수엘라 EEV로부터 유래된 단백질, 또는 이의 항원성 부분, 바람직하게는 외피 다중단백질 E3, E2, 6k 및 E1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 암호화한다.
한 실시양태에서, 바이러스 항원은 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스로부터 유래된다.
한 실시양태에서, 전이유전자는 종양 특이적 항원(TSA) 또는 종양 연관 항원(TAA), 또는 이의 항원성 부분을 암호화한다.
miRNA에 관한 실시양태
한 실시양태에서, 진핵생물 MVA 생산자 세포의 miRNA는 진핵생물 MVA 생산자 세포에 존재하거나, 이 세포에서 검출가능하거나 또는 발현된다.
한 실시양태에서, miRNA는 진핵생물 MVA 생산자 세포에 내인성이다.
한 실시양태에서, miRNA는 전이유전자 세포주에서 이종 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되고, 바람직하게는 이에 의해 발현된다.
바람직한 실시양태에서, miRNA는 골격근 세포 및 백혈구와 같은 혈액 세포에서 발현되지 않거나 단지 낮게 또는 중간 정도로 발현된다.
진핵생물 MVA 생산자 세포에 관한 실시양태
한 실시양태에서, 진핵생물 MVA 생산자 세포는 조류(예를 들어, 닭) 세포, 바람직하게는 1차 조류 세포 또는 영구 조류 세포주의 세포이다.
한 실시양태에서, 진핵생물 MVA 생산자 세포, 바람직하게는 1차 조류 세포는 닭 배아 섬유아세포(CEF) 세포이다.
한 실시양태에서, 진핵생물 MVA 생산자 세포, 바람직하게는 영구 조류 세포주의 세포는 DF-1 또는 메추라기 세포이다.
MVA에 관한 실시양태
한 실시양태에서, 재조합 MVA는 시험관내 닭 배아 섬유아세포(CEF) 세포에서 생식 복제 능력을 갖지만 인간 각질세포 세포주 HaCaT, 인간 뼈 골육종 세포주 143B, 인간 배아 신장 세포주 293, 및 인간 자궁경부 선암종 세포주 HeLa에서는 생식 복제 능력이 없는 MVA 또는 MVA 파생물로부터 유래된다.
한 실시양태에서, 재조합 MVA는 2000년 8월 30일자로 수탁 번호 V00083008로 유럽 동물 세포 배양 수집소(European Collection of Animal Cell Cultures(ECACC))에 기탁된 MVA-BN®으로부터 유래된다.
여러 전이유전자를 갖는 재조합 MVA에 관한 실시양태
한 실시양태에서, 재조합 MVA는 1개 초과, 예를 들어 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 훨씬 더 많은 전이유전자 또는 전사 단위를 포함한다.
한 실시양태에서, 재조합 MVA는 제1, 제2 및 제3, 또는 제1 내지 제4, 또는 제1 내지 제5, 또는 제1 내지 제6 또는 그 이상의 전사 단위를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 재조합 MVA는 4개 또는 제1 내지 제4 전사 단위를 포함한다.
2개 초과의 전이유전자를 포함하는 재조합 MVA의 한 실시양태에서, 각각의 전이유전자는 상이하고, 바람직하게는 각각의 전사 단위는 상이한 전이유전자를 포함한다.
한 실시양태에서, 재조합 MVA는 miRNA 표적 서열을 포함하지 않는 하나 이상의 전사 단위를 추가로 포함하고, 바람직하게는 폭스바이러스 프로모터에 작동 가능하게 연결된 전이유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 전이유전자에 연결된 miRNA 표적 서열은 없는 하나 이상의 전사 단위를 포함한다.
RSV 유래 단백질을 암호화하는 전이유전자를 갖는 재조합 MVA에 관한 실시양태
한 실시양태에서, 재조합 MVA는 폭스바이러스 프로모터에 작동 가능하게 연결된 전이유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 전사 단위를 포함하고, 뉴클레오타이드 서열은 전이유전자에 연결된 miR블록에 배열된 일련의 miRNA 표적 서열을 추가로 포함하며, 여기서 각 miRNA 표적 서열은 진핵생물 MVA 생산자 세포에서 발현된 miRNA에 상응하거나 상보적이며, 여기서
(a) 전이유전자는 RSV G(A) 단백질을 암호화하고, 바람직하게는 폭스바이러스 프로모터는 Pr7.5 프로모터이고;
(b) 전이유전자는 RSV G(B) 단백질을 암호화하고, 바람직하게는 폭스바이러스 프로모터는 PrS 프로모터이고;
(c) 전이유전자는 RSV F 단백질을 암호화하고, 바람직하게는 폭스바이러스 프로모터는 PrH5m 프로모터이고; 및/또는
(d) 전이유전자는 RSV N/M2-1 융합 단백질을 암호화하고, 바람직하게는 폭스바이러스 프로모터는 PrLE1 프로모터이다.
한 실시양태에서, 재조합 MVA는 폭스바이러스 프로모터에 작동 가능하게 연결된 전이유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 전사 단위를 포함하고, 뉴클레오타이드 서열은 전이유전자에 연결된 miR블록에 배열된 일련의 miRNA 표적 서열을 추가로 포함하며, 여기서 각 miRNA 표적 서열은 진핵생물 MVA 생산자 세포에서 발현된 miRNA에 상응하거나 이에 상보적이며, 여기서 전이유전자는 RSV N/M2-1 융합 단백질을 암호화하고 폭스바이러스 프로모터는 PrLE1 프로모터이다.
한 실시양태에서, 재조합 MVA는 제1 내지 제3 전사 단위에서 RSV 유래 단백질을 암호화하는 전이유전자를 포함하고, 각각의 전사 단위는 폭스바이러스 프로모터에 작동가능하게 연결된 전이유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드 서열은 전이유전자에 연결된 miR블록에 배열된 일련의 miRNA 표적 서열을 추가로 포함하며, 여기서 각 miRNA 표적 서열은 진핵생물 MVA 생산자 세포 내 miRNA 서열에 상응하거나 이에 상보적이며, 여기서
(aa) 제1 전사 단위 내 전이유전자는 RSV G(A) 단백질을 암호화하고;
(bb) 제2 전사 단위 내 전이유전자는 RSV G(B) 단백질을 암호화하고; 그리고
(cc) 제3 전사 단위 내 전이유전자는 RSV F 단백질을 암호화한다.
제1 내지 제3 전사 단위에 RSV 유래 단백질을 암호화하는 전이유전자를 포함하는 재조합 MVA의 한 실시양태에서,
(aa') RSV G(A) 단백질을 암호화하는 전이유전자에 연결된 miR블록은 서열번호 49(miR블록-2에 상응)에 묘사된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지고;
(bb') RSV G(B) 단백질을 암호화하는 전이유전자에 연결된 miR블록은 서열번호 48(miR블록-1)에 묘사된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지며; 그리고
(cc') RSV F 단백질을 암호화하는 전이유전자에 연결된 miR블록은 서열번호 48(miR블록-1)에 묘사된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
바람직한 실시태양인 한 실시태양에서, 재조합 MVA는 제1 내지 제4 전사 단위에 RSV 유래 단백질을 암호화하는 전이유전자를 포함하고, 각각의 전사 단위는 폭스바이러스 프로모터에 작동가능하게 연결된 전이유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드 서열은 전이유전자에 연결된 miR블록에 배열된 일련의 miRNA 표적 서열을 추가로 포함하고, 여기서 각각의 miRNA 표적 서열은 진핵생물 MVA 생산자 세포의 miRNA 서열에 상응하거나 이에 상보적이고, 여기서
(aaa) 제1 전사 단위 내 전이유전자는 RSV G(A) 단백질을 암호화하고;
(bbb) 제2 전사 단위 내 전이유전자는 RSV G(B) 단백질을 암호화하고;
(ccc) 제3 전사 단위 내 전이유전자는 RSV F 단백질을 암호화하고; 그리고
(ddd) 제4 전사 단위 내 전이유전자는 RSV-N/M2-1 단백질을 암호화한다.
제1 내지 제4 전사 단위에 RSV 유래 단백질을 암호화하는 전이유전자를 포함하는 재조합 MVA의 한 실시양태에서,
(aaa') RSV G(A) 단백질을 암호화하는 전이유전자에 연결된 miR블록은 서열번호 54(miR블록-41에 상응)에 묘사된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지고;
(bbb') RSV G(B) 단백질을 암호화하는 전이유전자에 연결된 miR블록은 서열번호 53(miR블록-39)에 묘사된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지며;
(ccc') RSV F 단백질을 암호화하는 전이유전자에 연결된 miR블록은 서열번호 53(miR블록-39)에 묘사된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지고; 그리고
(ddd') RSV-N/M2-1 단백질을 암호화하는 전이유전자에 연결된 miR블록은 서열번호 54(miR블록-41)에 묘사된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
한 실시양태에서,
(w) 전이유전자는 RSV G(A) 단백질을 암호화하고, 폭스바이러스 프로모터는 Pr7.5 프로모터이고;
(x) 전이유전자는 RSV G(B) 단백질을 암호화하고, 폭스바이러스 프로모터는 PrS 프로모터이고;
(y) 전이유전자는 RSV F 단백질을 암호화하고, 폭스바이러스 프로모터는 PrH5m 프로모터이고; 및/또는
(z) 전이유전자는 RSV N/M2-1 융합 단백질을 암호화하고, 폭스바이러스 프로모터는 PrLE1 프로모터이다.
한 실시양태에서, 재조합 MVA는 폭스바이러스 프로모터에 작동 가능하게 연결된 전이유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 전사 단위를 포함하고, 뉴클레오타이드 서열은 전이유전자에 연결된 miR블록에 배열된 일련의 miRNA 표적 서열을 추가로 포함하며, 여기서 각 miRNA 표적 서열은 진핵생물 MVA 생산자 세포 내 miRNA 서열에 상응하거나 상보적이며, 전이유전자는 RSV N/M2-1 융합 단백질을 암호화하고, 폭스바이러스 프로모터는 PrLE1 프로모터이고 miR블록은 서열번호 54(miR블록-41)에 묘사된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
의학적 용도 또는 치료에 관한 실시양태
한 실시양태에서, 약제 또는 백신으로 사용하기 위한, 바람직하게는 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 더욱 바람직하게는 감염성 질환 또는 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 재조합 MVA는 대상체에 사용하기 위한 것이다.
한 실시양태에서, 대상체는 조류가 아니며, 바람직하게는 인간 또는 비-인간 포유동물이다.
한 실시양태에서, 감염성 질환은 RSV 감염 또는 동부, 서부 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(EEV)에 의한 감염 또는 엡스타인-바 바이러스에 의한 감염이고, 바람직하게는 RSV 감염이다.
한 실시양태에서, 재조합 MVA는 근육내 또는 피하, 바람직하게는 근육내로 투여된다.
추가 실시양태
한 실시양태에서, 재조합 MVA는 약 30℃ 내지 37℃의 온도, 바람직하게는 약 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃ 및 37℃로 이루어지는 온도의 군으로부터 선택되는 온도, 가장 바람직하게는 약 30℃ 또는 37℃의 온도에서 진핵생물 생산자 세포에서 전파된다.
한 실시양태에서, 재조합 MVA는 DF-1 세포에서 약 30℃ 또는 37℃의 온도에서 진핵생물 생산자 세포에서 전파된다.
한 실시양태에서, 재조합 MVA는 0.001 내지 5의 감염 다중도(MOI), 바람직하게는 0.001, 0.05, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 1, 2, 또는 5의 MOI에서 재조합 MVA로 감염 후 진핵생물 생산자 세포 배양물에서 전파된다.
한 실시양태에서, 재조합 MVA는 다중 주기 복제 환경에서 진핵생물 생산자 세포 배양물에서 전파된다.
추가 설명
변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)
과거에 MVA는 백시니아 바이러스 앙카라 계통(CVA)을 닭 배아 섬유아세포에서 516회 연속 계대 배양을 통해 생성했다(검토를 위해 Mayr et al. 1975 참조). 이 바이러스는 이의 실질적으로 변경된 특성을 나타내기 위해 계대 570회째에 이름이 CVA에서 MVA로 변경되었다. MVA는 570회 초과의 계대 횟수까지 추가 계대로 처리되었다. 이러한 장기간 계대의 결과로서 생성된 MVA 바이러스의 게놈은 게놈 서열 중 약 31킬로베이스가 결실되었고, 따라서 복제가 조류 세포에 대해 고도로 숙주 세포 제한적인 것으로 기술되었다(Meyer et al. 1991). 생성된 MVA가 완전한 복제 적격성 출발 물질에 비해 상당히 무독성임은 다양한 동물 모델에서 밝혀졌다(Mayr and Danner 1978).
본 발명의 실시에 유용한 MVA로는 MVA-572(1994년 1월 27일에 ECACC V94012707로 기탁됨); MVA-575(2000년 12월 7일 ECACC V00120707로 기탁됨), MVA-I721(Suter et al. 2009에서 참조됨), NIH 클론 1(2003년 3월 27일에 ATCC® PTA-5095로 기탁됨) 및 MVA-BN(2000년 8월 30일에 번호 V00083008로 유럽 세포 배양물 수집소(ECACC)에 기탁됨)을 포함한다.
보다 바람직하게는 본 발명에 따라 사용되는 MVA는 MVA-BN 및 MVA-BN 파생물을 포함한다. MVA-BN은 WO 02/042480에 기재되어 있다. "MVA-BN 파생물"은 본원에 기술된 바와 같이 MVA-BN과 본질적으로 동일한 복제 특성을 나타내지만 게놈의 하나 이상의 부분에서 차이를 나타내는 임의의 바이러스를 지칭한다.
MVA-BN, 뿐만 아니라 MVA-BN 파생물은 복제 부적격성이고, 이는 생체내 및 시험관내에서 생식 복제 실패를 의미한다. 보다 구체적으로 시험관내에서 MVA-BN 또는 MVA-BN 파생물은 닭 배아 섬유아세포(CEF)에서 생식 복제가 가능할 수 있지만, 인간 각질세포 세포주 HaCaT(Boukamp et al 1988), 인간 골육종 세포주 143B(ECACC 기탁 번호 91112502), 인간 배아 신장 세포주 293(ECACC 기탁 번호 85120602) 및 인간 자궁경부 선암종 세포주 HeLa(ATCC 기탁 번호 CCL-2)에서는 생식 복제가 불가능한 것으로 기술되어 있다. 추가적으로, MVA-BN 또는 MVA-BN 파생물은 Hela 세포 및 HaCaT 세포주에서 MVA-575보다 바이러스 증폭 비율이 적어도 2배 더 적고, 더욱 바람직하게는 3배 더 적다. MVA-BN 및 MVA-BN 파생물의 이러한 특성에 대한 테스트 및 검정은 WO 02/42480 및 WO 03/048184에 기술되어 있다.
상기 기재된 바와 같이 시험관내 인간 세포주에서 "생식 복제가 불가능한"이라는 용어는 예를 들어 WO 02/42480에 기재되어 있으며, 이 역시 상기 언급된 바와 같이 원하는 특성을 갖는 MVA를 수득하기 위한 방법을 교시하고 있다. 이 용어는 WO 02/42480 또는 US 6,761,893에 기술된 검정을 사용하여 감염 후 4일째에 시험관내 바이러스 증폭 비율이 1 미만인 바이러스에 적용된다.
재조합 MVA 바이러스의 예시적인 생성
본 명세서에 개시된 바와 같은 재조합 MVA의 생성을 위해서는 여러 방법이 적용 가능할 수 있다. 바이러스에 삽입될 DNA 서열은 폭스바이러스의 DNA 섹션에 상동성인 DNA가 삽입된 E. 콜라이 플라스미드 작제물에 배치될 수 있다. 별도로, 삽입될 DNA 서열은 프로모터에 결찰될 수 있다. 프로모터-유전자 연결은 비필수 유전자좌를 함유하는 폭스바이러스 DNA의 영역 측면에 있는 DNA 서열과 상동성인 DNA에 의해 양 말단 측면에 있도록 플라스미드 작제물에 위치시킬 수 있다. 생성된 플라스미드 작제물은 E. 콜라이 박테리아 내에서 전파에 의해 증폭되고 단리될 수 있다. 삽입될 DNA 유전자 서열을 함유하는 단리된 플라스미드는 예를 들어 닭 배아 섬유아세포(CEF)의 세포 배양물에 형질감염될 수 있고, 동시에 배양물은 MVA로 감염될 수 있다. 플라스미드 내 상동성 MVA 바이러스 DNA와 바이러스 게놈 사이의 재조합은 각각 외래(이종) DNA 서열의 존재에 의해 변형된 MVA를 생성할 수 있다.
예를 들어, CEF 세포로서, 적합한 세포 배양물의 세포는 MVA 바이러스에 의해 감염될 수 있다. 감염된 세포는 이어서 본원에 제공된 하나 이상의 핵산과 같은 외래 또는 이종 유전자 또는 유전자들을 포함하는 제1 플라스미드 벡터에 의해, 바람직하게는 폭스바이러스 발현 제어 인자의 전사 제어 하에, 형질감염될 수 있다. 전술한 바와 같이, 플라스미드 벡터는 또한 MVA 바이러스 게놈의 선택된 부분으로 외인성 서열의 삽입을 유도할 수 있는 서열을 포함한다. 선택적으로, 플라스미드 벡터는 또한 폭스바이러스 프로모터에 작동 가능하게 연결된 마커 및/또는 선택 유전자를 포함하는 카세트를 함유한다. 선택 또는 마커 카세트의 사용은 생성된 재조합 MVA의 식별 및 단리를 단순화한다. 하지만, 재조합 폭스바이러스는 PCR 기술로도 식별될 수 있다. 이어서, 추가 세포는 전술한 바와 같이 수득한 재조합 MVA를 이용하여 감염될 수 있고, 제2의 외래 또는 이종 유전자 또는 유전자들을 포함하는 제2 벡터에 의해 형질감염될 수 있다. 경우에 따라, 이 유전자는 폭스바이러스 게놈의 상이한 삽입 부위에 도입될 것이고, 제2 벡터는 또한 폭스바이러스 게놈에 제2 외래 유전자 또는 유전자들의 통합을 유도하는 폭스바이러스-상동성 서열이 상이하다. 상동성 재조합이 발생한 후, 2종 이상의 외래 또는 이종성 유전자를 포함하는 재조합 바이러스가 단리될 수 있다. 재조합 바이러스에 추가적인 외래 유전자를 도입하기 위해, 이전 감염 단계에서 단리된 재조합 바이러스를 사용하고 형질감염을 위해 추가 외래 유전자 또는 유전자들을 포함하는 추가 벡터를 사용함으로써 감염 및 형질감염 단계를 반복할 수 있다. 재조합 MVA를 생성하는 것으로 알려진 다른 기술도 충분히 있다.
본 발명의 실시는 달리 명시되지 않는 한, 모두 관련 기술분야의 기술 내에 있는 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 기술의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 예를 들어, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM, et al., eds, 1987; 시리즈인 Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.); PCR2: A Practical Approach, MacPherson MJ, Hams BD, Taylor GR, eds, 1995; Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds, 1988 참조.
실시예
다음 실시예는 본 개시내용을 추가로 예시하는 역할을 한다. 이는 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안 되며, 이의 범위는 첨부된 청구범위에 의해 결정된다.
실시예 1: 재료 및 방법
1.1 세포 및 바이러스
닭 섬유아세포 세포주 DF-1은 ATCC로부터 입수했다. 1차 CEF 세포는 11일된 부화 계란으로부터 준비했다. CEF 세포는 형질감염 및 바이러스 스톡 생산을 위해 1% 젠타마이신 및 4mM L-글루타민이 보충된 VP-SFM 배지(ThermoFisher Scientific)에서 배양하거나, 또는 복제 분석 및 바이러스 적정을 위해 10% FCS가 보충된 DMEM에서 배양했다. 본 연구에 사용된 MVA는 MVA-BN®(Bavarian Nordic; 본원에서 "MVA-BN"으로 지칭됨)으로부터 작제된 박테리아 인공 염색체(BAC) 클론에서 유래되었으며 이전에 기술된 바 있다(35)(WO 02/42480). MVA-BN 야생형 및 MVA-BN 재조합체는 CEF 또는 DF-1 세포에서 전파시켰고 TCID50 방법을 사용하여 CEF 세포에서 적정했다. MVA-BAC 재활성화를 위한 Shope 섬유종 바이러스는 ATCC(VR-364)에서 입수하여 토끼 각막 SIRC 세포에서 전파시키고 적정했다.
1.2 감염성 재조합 MVA의 BAC 재조합 및 재활성화
MVA-BAC의 작제는 이전에 설명된 바 있다(35). 간략하게 설명하면, 삽입된 BAC 카세트는 E. 콜라이에서의 유지를 위해 플라스미드 pMBO131(36)에서 유래된 miniF 플라스미드 서열을 함유한다. BAC 카세트는 VACV-코펜하겐 유전자 I3L 및 I4L의 MVA 오솔로그(MVA064L/MVA065L) 사이에 삽입했다. 원래 함유된 네오마이신-포스포트랜스퍼라제(npt) II ― IRES-EGFP 마커 카세트는 박테리아 테트라사이클린 발현 카세트로 대체되어 BAC 백본에서 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP) 유전자를 제거하고 miRNA 표적 서열에 연결된 EGFP 전이유전자의 삽입 및 분석을 가능하게 했다. MVA-BAC는 설명된 바와 같이 역선택 가능한 rpsL/neo 카세트를 사용하여 대립유전자 교환 돌연변이유발로 변형시켰다(35). EGFP 유전자는 합성 폭스바이러스 초기/후기 프로모터 PrS의 제어 하에 VACV 코펜하겐 명명법에서의 유전자 MVA044L/MVA045L(F14L 및 F15L) 사이의 유전자간 영역(IGR)에 PrS-gpt-RFP 카세트(도 4 참조)와 함께 삽입되었다(23). 각 miRNA(표 1 및 2에 나열됨) 또는 miR블록-2의 스크램블된 버전을 갖는 대조용 miR블록인 miR블록-scrbl2(표 3 참조)에 대한 표적 서열은 EGFP 유전자의 3'-UTR 내 정지 코돈 바로 뒤에 삽입했다. miR블록-13(miR블록의 경우, 표 5 및 6 참조)으로 시작하여, EGFP ORF의 정지 코돈과 5'-근위 miRNA 표적 서열의 제1 뉴클레오타이드 사이에 15-뉴클레오타이드 스페이서를 삽입했다. 초기 유전자에 대한 폭스바이러스 전사 종결 서열은 miRNA 표적 서열의 하류에 삽입했다. 초기 전사 종결 서열(TTS)만이 miR블록을 함유하지 않는 기준 재조합 MVA-EGFP("EGFP 발현 기준")에서 EGFP 유전자의 3'-UTR에 삽입되었다. MVA-BAC로부터 감염성 바이러스를 재활성화하기 위해, FuGENE® HD 형질감염 시약(Promega)을 사용하여 106개의 BHK-21 세포를 3μg의 BAC DNA로 형질감염시키고 60분 후에 Shope 섬유종 바이러스로 감염시켜 필요한 헬퍼 기능을 제공했다. CEF 세포에서 추가 계대배양을 통해 재활성화된 바이러스를 단리했고, 헬퍼 바이러스는 이전에 설명된 바와 같이 제거했다(35).
miR블록-17 및 -18(PrS 프로모터의 제어 하에)을 함유하는 재조합 MVA 및 Pr13.5long 즉시 초기 프로모터의 제어 하에 EGFP-miR블록-2 및 EGFP-scrbl2를 발현하는 재조합체는 전술한 BAC-유래 재조합 MVA에서와 같이 IGR MVA044L/MVA045L 내로 전이유전자를 표적화하는 측면 상동성 영역을 갖는 전달 플라스미드를 사용하여 CEF 세포에서 표준 상동성 재조합에 의해 생성하였다. 생성된 재조합체는 CEF 세포에 대한 3회의 플라크 정제 라운드로 정제했다.
모든 재조합 MVA 바이러스 스톡은 DF-1 세포에서 생산했고, 설명된 바와 같이 TCID50 방법을 사용하여 CEF 세포에서 적정했다(3). 마우스 실험을 위한 재조합 MVA는 CEF 세포에서 전파시켰고, 2회의 연속 수크로스 쿠션 원심분리 단계를 통해 정제했고, TCID50 적정 방법을 사용하여 CEF 세포에서 적정했다.
1.3 miRNA 표적화된 EGFP 발현 분석을 위한 플라스미드 설계 및 클로닝
EGFP의 3'-UTR에 삽입될 다양한 miRNA 표적 서열 또는 miR블록은 정방향 프라이머와 함께 EGFP 유전자 증폭을 위한 역방향 PCR 프라이머로서 역할을 하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머로서 주문했다. ORF의 3'-말단에 miRNA 표적 서열 및 양쪽 말단에 클로닝을 위한 제한 부위를 함유하는 완전한 EGFP ORF를 갖는 DNA 단편을 PCR로 증폭시키고 다양한 EGFP 유전자가 모든 포유동물 세포뿐만 아니라 조류 세포에서 활성인 인간 CMV 프로모터의 제어하에 발현되는 포유동물 발현 벡터 pEGFP-C1 내로 클로닝했다. 다양한 miR블록에서 테스트된 miRNA 표적 서열은 표 1과 2에 나열되어 있다.
1.4 형질감염 검정
VP-SFM 배지에 갓 제조된 CEF 세포(4x104 세포/웰) 및 DMEM/10% FCS 중 DF-1 세포(3x104 세포/웰)를 0일째에 96웰 플레이트에 파종했다. 1일째에 세포는 인간 CMV 프로모터에 의해 유도되는 EGFP 또는 BFP를 발현하는 플라스미드의 1:2 비율을 갖는 0.1 ug 플라스미드 DNA 및 0.3 ul 형질감염 시약을 함유하는 형질감염 혼합물 5 ul를 96웰마다 사용하여 제조업체의 지침에 따라 FuGENE® HD Transfection Reagent(Promega)로 3중 반복으로 형질감염시켰다. miR블록을 함유하지 않는 EGFP를 암호화하는 플라스미드를 사용한 형질감염은 EGFP 발현 기준으로서 역할을 했고, 스크램블된 miR블록-2를 포함하는 EGFP를 암호화하는 플라스미드는 대조군으로서 역할을 했다. 이어서, 세포는 표시된 시간 기간 동안 37℃에서 인큐베이션했다. 형질감염 후 1일째에, 세포를 트립신처리하고, 세척하고, PBS-FACS-FORM(1% FCS, 0.1% NaN3, 1% PFA)에 재현탁한 후, 유세포분석법으로 EGFP 및 BFP의 발현에 대해 분석했다.
1.5 형광 마커 발현 분석을 위한 유세포분석법
세포 배양물 단층은 PBS로 세척하고 트립신 처리로 수확하여 단일 세포 현탁액을 제조했다. EGFP, 적색 형광 단백질(RFP) 및 청색 형광 단백질(BFP) 발현의 분석을 위해, 세포를 PBS-FACS(2% FCS, 0.1% NaN3)에 재현탁하고 LSR II 유세포분석기(BD Biosciences) 및 FlowJo 소프트웨어(Tree Star Inc.)를 사용하여 유세포분석법으로 직접 분석했다.
1.6 바이러스 복제 분석
다중주기 바이러스 복제 분석을 위해, 6웰 세포 배양 플레이트의 융합성 단층을 FCS가 없는 500μl의 DMEM 중 표시된 감염 다중도(MOI)의 초음파 처리된 바이러스 희석액으로 감염시켰다. 37℃ 및 5% CO2에서 60분 동안 흡착 후, 접종물을 흡인하고, 세포를 DMEM으로 1회 세척한 후 DMEM/2% FCS에서 37℃ 및 5% CO2 하에 추가로 인큐베이션했다. 세포 및 상청액은 표시된 시점마다 수확하고 3회 동결-해동한 후 적정 전에 초음파 처리했다. MVA 수율은 기술된 바와 같이(3) TCID50 적정 방법을 사용하여 CEF 세포에서 결정되었다.
1.7 재조합 MVA에 의한 RSV 단백질 발현의 면역블롯 분석
감염 전날에 세포를 12웰 조직 배양 플레이트에 파종했다. 감염은 이전에 설명된 바와 같이 수행했다(37). 감염 후 표시된 시간에 세포를 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하고 200μl 1X Laemmli 로딩 완충액(65mM Tris-HCl [pH 6.8], 10% 글리세롤, 2% SDS, 0.1% 브로모페놀 블루, 베타-머캅토에탄올(35μl/ml])에서 실온 하에 5분간 용해시킨 후, 3분간 초음파 처리하고, 이어서 95℃에서 5분간 가열했다. 용해물을 18,000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 세포 잔해를 제거했다. 세포 용해물 내 가용성 단백질은 사전주조된 SDS-폴리아크릴아미드 겔(MiniProtean TGX, 10%, Bio-Rad)에서 분리하고 Trans-Blot Turbo 블로팅 시스템(Bio-Rad) 및 Trans-Blot Turbo 전달 팩(Bio-Rad)을 사용하여 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막으로 전달했다. 0.1% Tween-20 및 0.1% NaN3을 함유하는 Tris 완충 식염수(TBS; 50mM Tris, 150mM NaCl, pH 7.5) 중의 5% 소 혈청 알부민(BSA, Carl Roth)을 사용하여 막을 차단하고, 아래에 나열된 1차 항체(차단 완충액으로 희석)와 4℃에서 진탕시키면서 밤새 인큐베이션했다. 막은 단계 사이에 0.1% Tween-20을 함유하는 TBS로 4회(총 20-40분) 세척하고 양고추냉이 퍼옥시다제에 커플링하고 뮤린 또는 토끼 IgG에 대해 유도된 2차 항체와 함께 실온에서 진탕하면서 1시간 동안 인큐베이션했다. 2차 항체는 5% 탈지분유가 함유된 TBS(VWR International)에 희석했다. 밴드는 고 감도로의 검출을 위해 1:10 희석된 Amersham ECL Select Western Blotting Protection Reagent(GE Healthcare Life Sciences), 및 표준 시약으로서 SuperSignal West Pico(Thermo Fisher Scientific)인 2가지 상이한 기질 시약을 사용하여 강화된 화학발광(ECL)으로 가시화했다. 이미지 분석 및 정량화를 위해 ChemiDoc Touch System 및 Image Lab™ 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 신호를 기록했다.
면역블롯 분석에는 다음과 같은 1차 항체를 사용했다: 항-RSV G(acris BM1268), 항-RSF F(abcam ab43812), RSV N(abcam ab94806) 또는 항-D8 VACV(클론 AB12IT-012-001M1)(모두 마우스, 1:1000).
1.8 마우스 면역화
10마리의 암컷 BALB/c 마우스 그룹(Janvier SAS, 프랑스 셍-베흑뜨방 Cedex)은 108 TCID50의 각각의 MVA 재조합체를 함유하는 총 100μl(각 뒷다리에 50μl)의 접종물로 0일(프라임) 및 21일(부스트)째에 근육내(i.m.) 경로를 통해 면역화했다. TBS 처리된 마우스(n=5)는 대조군으로 포함시켰다. 분석을 위해 표시된 시점에 꼬리 정맥을 통해 혈액을 채취하고 2% FCS, 0.1% 아지드화나트륨 및 2.5 U/ml 헤파린을 함유하는 PBS에 수집하고 이하에 기술된 바와 같이 처리했다. 면역화 후 34일째에 마우스를 안락사시키고 T 세포의 세포내 사이토카인 염색(ICCS)을 위해 비장세포를 준비했다. 모든 동물 실험은 어퍼 바이에른 정부(Regierung von Oberbayern)의 승인을 받았다.
1.9 T 세포 검정: RSV-M2-1 및 MVA-E3-특이적 CD8 T 세포에 대한 덱스트라머 염색
RSV- 및 MVA-특이적 CD8+ T 세포 반응의 분석을 위해, 혈액은 7일, 28일 및 34일에 마우스로부터 수집하고, 적혈구 용해 완충액(Sigma-Aldrich)으로 제조업체의 지시에 따라 적혈구를 용해시켜 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 제조했다. PBMC는 BALB/c 배경에서 RSV M2-1 또는 MVA E3(대조군)의 면역우성 에피토프뿐만 아니라 표면 마커 CD4, CD8 및 CD44의 발현에 대해 특이적인 MHC 클래스 I 덱스트라머(Immudex)로 염색했다.
1.10 세포내 사이토카인 염색 및 ELISpot 분석
부스트 후 13일(34일)째에 마우스를 죽이고 비장을 수집하여 70μm 세포 스트레이너(strainer)를 통해 조직을 기계적으로 파괴하면서 콜라게나제/DNase 분해한 후 적혈구 용해(Sigma-Aldrich)하여 단일 세포 현탁액을 제조했다. 세포내 사이토카인 염색(ICCS)을 위해, 비장세포는 표시된 바와 같이 펩타이드 또는 대조군으로 6시간 동안 재자극한 후, IC Fixation & Permeabilization Staining 키트(eBioscience)를 사용하여 고정하고 세포 표면 마커 및 세포내 사이토카인 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2의 발현에 대해 염색했다. ELISpot 분석을 위해, 5x105 비장세포/웰은 H-2d 일배체형에서 표시된 RSV 단백질 및 MVA E3에 대한 면역우성 펩타이드를 이용하여 이중 반복으로 재자극하고, 반응을 제조업체의 프로토콜(BD™ ELISPOT)에 따라 검정했다.
1.11 RSV 및 MVA 특이적 항체를 위한 ELISA
RSV- 및 MVA-특이적 IgG 항체 역가의 분석을 위해, 면역화 1일 전(-1일), 프라임 후 20일 및 34일(= 부스트 후 13일)에 혈청을 수집했다. 혈청 내 RSV- 및 MVA-특이적 IgG 수준은 직접 ELISA로 측정했다. 96웰 ELISA 플레이트를 RSV 항원(Meridian)을 이용하거나 또는 MVA-BN으로 감염된 세포의 조 추출물을 이용하여 밤새 코팅했다. 혈청에 대해 1:100부터 시작하는 연속 희석액을 사용하여 샘플을 적정했다. 양 항-마우스 IgG-HRP(AbD Serotec) 또는 염소 항-마우스 IgG-HRP(Abcam)를 검출 항체로 사용했다. 항체 역가는 4-매개변수 적중도(Magellan Software)로 계산했고, 0.24의 광학 밀도를 초래하는 혈청 희석으로서 정의했다. 기하 평균 역가(GMT) 및 평균의 표준 오차(SEM)는 Excel(Microsoft Office 365)을 사용하여 계산했다. 검정 컷오프(OD < 0.24) 미만의 항체 역가는 계산 목적을 위해 임의의 값 "1"로 지정했다.
1.12 RSV 중화 항체를 위한 PRNT
RSV 플라크 감소 중화 역가의 분석을 위해, 면역화 1일 전(-1일), 프라임 후 20일 및 34일(= 부스트 후 13일)째에 혈청을 수집했다. RSV 특이적 중화 역가는 플라크 감소 중화 테스트(PRNT)로 측정했다. 혈청 샘플의 2배 연속 희석액을 정의된 수의 RSV-A2 플라크 형성 단위(pfu)와 함께 30분 동안 인큐베이션하여 바이러스를 중화시켰다. 그 다음, 혼합물을 70분 동안 Vero 세포에 흡착시켰다. 오버레이 배지를 첨가하고 플레이트를 5일 동안 인큐베이션했다. 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후, PRNT 역가를 결정하고 신경망 플라크 계수 패키지를 사용하여 플라크 수에 기초하여 계산했다. 중화 역가는 성숙한 바이러스의 50%를 중화할 수 있는 혈청 희석으로 표시된다.
실시예 2: miRNA 표적 서열 및 miR블록의 설계
우선, CEF 세포에서 가장 풍부한 것으로 보고된 miRNA를 과학문헌에서 발췌했다(28-34). 추가적으로, 감염되지 않은 CEF 세포 뿐만 아니라 비재조합 MVA로 감염된 CEF 세포의 miRNA를 RNA 시퀀싱으로 결정하였다.
miRNA 표적 서열의 경우, 본 발명자들은 각 miRNA의 뉴클레오타이드 서열과 정확히 일치하는 뉴클레오타이드 서열을 사용했다. 일반적으로, 4개의 miRNA 표적 서열을 소위 "miR블록"(때때로 본원에서는 "miRb"로 약칭됨)에 연속적으로 배열시켰다. 일부 경우에는 miRNA 표적 서열 4개 대신 3개(또는 예외적인 경우 8개)를 miR블록에 조합시켰다. 개별 miRNA 표적 서열에 관한 miR블록의 조성은 이종-올리고머 또는 동종-올리고머였다.
선택된 miRNA, 그에 상응하는 표적 서열 및 각각 조립된 miR블록은 이하 표 5 및 6에 나열되어 있다. miR블록-13 내지 -20은 문헌(25-31)의 닭 miRNA 풍부도 및 특이성 데이터를 기반으로 miRNA 표적 서열로부터 작제했다. 몇몇 경우("miR-9999", "miR-10000")에, miRNA는 miR뷰어 데이터베이스로부터 선택했다. miR블록-25 내지 36은 자신의 miRNA 시퀀싱 데이터를 기반으로 식별된 miRNA 표적 서열로부터 작제했다. miR블록-37 내지 -47은 이전에 miR블록-13 내지 -36에 사용되었던 miRNA 표적 서열로 구성했다.
실시예 3: 플라스미드 내 miRNA 표적 서열
3.1 miRNA 표적 서열을 함유하는 플라스미드 작제
닭 세포에서 전이유전자 발현의 하향조절을 매개하는 miRNA 표적 서열의 잠재성을 평가하기 위한 목적으로 플라스미드를 작제했다. 이러한 플라스미드 작제물의 삽입체는 도 1에 예시되어 있다.
모델 전이유전자로서 본 발명자들은 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)의 유전자를 사용했다. EGFP 리포터 유전자의 발현은 표준 거대세포바이러스 IE 프로모터(pCMV)로 유도했(도 1).
miR블록-1 및 -2의 miRNA 표적 서열(각각 도 1b 및 1c; "EGFP-miRb-1", "EGFP-miRb-2"; 또한, 표 3 참조)은 CEF 세포에서 가장 풍부한 miRNA에 상응했기 때문에 선택했다(25, 27, 30). miR블록-1 및 2 내 4개의 개별 miRNA 표적 서열은 4-뉴클레오타이드(nt) 스페이서로 서로 분리했다. (각각 도 1b 및 1c). miR블록의 5'-말단에 있는 miRNA 표적 서열의 제1 뉴클레오타이드는 EGFP 개방 판독 프레임(ORF)의 정지 코돈에 직접 결합시켰다. 이 개념은 miR블록-3 내지 -10에도 적용했다. 다른 모든 경우에는 EGFP 정지 코돈과 제1 miRNA 표적 서열 사이에 15-nt 스페이서를 삽입시켰다.
대조군으로서, 본 발명자들은 3'-UTR에 추가로 삽입된 임의의 서열 없이 EGFP ORF를 함유하는 EGFP 발현 플라스미드를 사용했다("EGFP 발현 기준")(도 1a, "miRb 없는 EGFP"). 3'-UTR에 "스크램블된-2"(또는 "scrbl2")로 명칭된 miR블록과 함께 EGFP ORF를 함유하는 플라스미드는 추가 대조군으로서 역할을 했다(도 1d, "scrbl2"). miR블록-scrbl2는 miR블록-2의 4개 miRNA 표적 서열 각각의 뉴클레오타이드를 스크램블하고 스크램블된 miRNA 표적 서열을 4-nt 스페이서를 사용하여 다시 결합시킴으로써 설계했다(표 3). 스크램블링에는 GeneScript®에서 제공하는 도구를 사용했다.
3.2 EGFP 발현의 하향조절
miR블록-1 내지 -10의 EGFP 하향조절 활성을 테스트했다.
이 목적을 위해 본 발명자들은 CMV 프로모터 하에서 청색 형광 단백질(BFP)을 발현하는 제2 플라스미드와 함께 각각의 miR블록을 함유하는 플라스미드로 CEF 세포를 공동 형질감염시켰다. 이 BFP 발현 플라스미드는 3'-UTR 암호화 영역에 추가로 삽입된 임의의 서열을 함유하지 않았으며, BFP 양성 세포에서 EGFP 발현 수준을 결정하기 위한 형질감염 대조군 및 내부 기준으로서 역할을 했다.
도 2(상단)에서 나타나는 바와 같이, miR블록-1은 대조군("miRb 없음")의 약 25%로 EGFP 발현의 하향조절을 매개했으며, miR블록-2는 심지어 대조군의 약 9%로 EGFP 발현의 하향조절을 매개했다. 이러한 효과는 공동 형질감염된 대조 플라스미드에 의한 BFP 발현에서는 관찰되지 않았다(도 2 하단).
miR블록-1 및 -2와 비교하여 miR블록-3은 중간 정도의 EGFP 하향조절을 매개하는 반면, miR블록-5 내지 -10은 EGFP 발현에 유의미한 효과를 나타내지 않았다(도 2 상단).
3.3 EGFP 하향조절에 대한 온도 효과
실시예 3.2에 기술된 결과를 기반으로 miR블록-1 및 -2는 추가 특성화를 위해 선택했다.
본 발명자들은 30℃ 또는 37℃에서 miR블록-1 및 -2에 의해 매개되는 EGFP 발현의 하향조절을 테스트했다. CEF 세포의 EGFP 하향조절도 동일한 작제물 및 온도를 사용하여 닭 섬유아세포주 DF-1의 하향조절과 비교했다.
도 3(상단)에서 나타나는 바와 같이, EGFP 발현 기준("miRb 없음") 및 miR블록 대조군("scrbl2")은 두 세포 유형 모두에서 주어진 온도 하에 비슷한 수준의 EGFP 발현을 산출했다(형질감염 후 24시간). 이 발견은 EGFP의 3'-UTR 암호화 영역에 miR블록, 즉 약 90-100개 뉴클레오타이드의 서열 스트레치를 삽입해도 전이유전자의 발현 수준 자체를 변화시키지는 않았으며, miR블록-scrbl2도 적합한 대조군이었음을 입증했다.
추가로 나타나는 바와 같이, miR블록-1 및 -2는 CEF 및 DF-1 세포에서 EGFP 발현의 하향조절을 매개했다(도 3 상단). 두 세포 유형 및 두 온도 모두에서 miR블록-2에 의해 생성된 효과는 miR블록-1에 의해 생성된 효과보다 더 두드러졌다.
더욱이, miR블록-1 및 -2는 모두 30℃에 비해 37℃에서 EGFP 발현의 하향조절을 더 효과적으로 매개했다. 이 온도 효과는 DF-1 세포에서 더욱 두드러졌다(도 3 상단).
공동-감염된 대조군 플라스미드에 의한 BFP 발현은 다시 EGFP 하향조절과 무관했다(도 3 하단).
실시예 4: 재조합 MVA의 miRNA 표적 서열
4.1 miRNA 표적 서열을 함유하는 재조합 MVA의 작제
다음으로 miRNA 표적 서열을 사용하여 MVA 감염의 정황에서도 EGFP 하향조절이 달성될 수 있는지 여부를 조사했다.
이를 위해, 본 발명자들은 miR블록-1 또는 miR블록-2에 연결된 EGFP 유전자를 유전자간 영역(IGR) 44/45에 삽입한 2가지 MVA 재조합체를 작제했다(도 4, "EGFP-miRb-1, "EGFP-miRb-2"). 각 miR블록 뒤에는 초기 전사체의 길이를 약 50개 뉴클레오타이드로 제한하는 역할을 하는 폭스바이러스 초기 전사 종결 신호(TTS)가 뒤따른다. TTS는 폭스바이러스 벡터용 유전자 발현 카세트의 표준 요소이다. 단량체성 적색 형광 단백질(RFP)은 모든 MVA 재조합체에 의해 공동 발현되었다(도 4). RFP 유전자는 miRNA 표적 서열의 삽입에 의해 변형되지 않았으므로, 감염된 세포의 miRNA 기구에 의해 조절되지 않아야 한다. 이는 상이한 MVA 작제물에 의해 생성된 감염 수준을 모니터링하고 비교하는 마커로서 역할을 하기 위해 삽입했다. EGFP와 RFP는 모두 재조합 MVA 작제물에서 초기/후기 PrS 프로모터의 제어하에 두었다(도 4).
대조군으로서, 본 발명자들은 miRNA 표적 서열 없이 EGFP ORF를 함유하는 재조합 MVA(도 4, "EGFP"), 즉 EGFP 발현 기준, 및 EGFP의 3'-UTR에 miR블록-scrbl2를 갖는 재조합 MVA(도 4, "EGFP-scrbl2")를 작제했다.
4.2 EGFP 발현의 하향조절 및 온도 효과
본 발명자들은 다음으로 각각의 MVA 재조합체에 감염되고 30℃ 또는 37℃에서 배양된 세포에서 miR블록-1 및 -2의 EGFP 하향조절 매개 활성을 분석했다.
도 5(상단)에서 나타나는 바와 같이, 재조합 MVA에 의한 EGFP 발현은 CEF 및 DF-1 세포 모두에서 miR블록-1 및 -2에 의해 하향조절되었다. 플라스미드를 사용한 관찰과 유사하게, miR블록-2는 특히 DF-1 세포에서 더 효과적이었다.
또한, EGFP 하향조절은 두 온도 모두에서 검출 가능했지만 두 세포 유형 모두에서 30℃보다 37℃에서 더 두드러졌고, 이 온도 효과는 DF-1 세포에서 더 두드러졌다(도 5 상단).
RFP의 공동발현은 EGFP 하향조절과 무관했다 (도 5 하단). 이는 MVA 전이유전자(여기서: EGFP 유전자)의 발현이 동일한 재조합 MVA에 존재하는 다른 전이유전자(여기서: RFP 유전자)에 동시에 영향을 미침이 없이 miRNA 표적 서열에 의해 선택적으로 조정될 수 있음을 입증했다.
4.3 EGFP 하향조절에 대한 MOI의 효과
MOI(다중 감염도)가 miR블록-1 또는 -2에 의한 EGFP 하향조절에 영향을 미치는지 여부를 테스트하기 위해 세포를 각 MVA 재조합체로 MOI 5, 1 또는 0.2로 감염시켰다.
도 6(상단)에서 나타나는 바와 같이, miR블록-1 및 -2에 의해 매개되는 EGFP 발현의 하향조절은 테스트된 모든 MOI에서 p.i. 6시간째에 검출 가능했다. 특히, EGFP 발현이 대조군(즉, EGFP 발현 기준, "miRb 없음")의 %로 묘사되는 경우(도 6 하단), miR블록-1 및 -2의 하향조절 효과는 사용된 MOI와 무관하다는 것이 명백해진다. 따라서, 더 높은 MOI로 인한 감염된 세포 배양물 내 더 높은 EGFP 발현 수준은 EGFP 발현의 하향조절에 영향을 미치지 않았다.
4.4 EGFP 하향조절에 대한 다중 주기 MVA 복제의 효과
전이유전자 하향조절은 바이러스 스톡 또는 백신 로트를 생산하기 위한 바이러스 전파 동안 일반적으로 적용되는 것과 유사한 환경에서 추가로 조사되었다. 이를 위해, CEF 세포를 0.1의 낮은 MOI에서 miR블록-1 또는 -2를 함유하는 재조합 MVA로 감염시키고 3일의 장기간 인큐베이션 기간에 걸쳐 배양했다.
도 7(상단, 왼쪽)에서 나타나는 바와 같이, EGFP 발현 수준은 시간이 지남에 따라(적어도 p.i. 6시간 내지 48시간째) 증가했다. 그러나, miR블록-1 또는 -2를 함유하는 재조합 MVA에 의한 감염 후 EGFP 발현의 증가는 EGFP 발현 기준("miRb 없음") 및 miR블록 대조군("scrbl2")에 대해 관찰된 것에 비해 유의미하게 감소했다.
EGFP 발현이 대조군("miRb 없음")의 %로 묘사되는 경우(도 7 하단, 왼쪽), miR블록-1 및 -2에 의한 EGFP 하향조절은 72시간의 전체 관찰 기간 동안 대체로 일정하게 유지되는 것으로 판명되었다. p.i.miR블록-2는 miR블록-1보다 EGFP 발현의 하향조절을 매개하는 데 있어서 더 효과적이었다.
재조합 MVA에 의해 공동 발현된 RFP 수준도 시간이 지남에 따라 증가했지만(p.i. 72시간까지)(도 7 상단, 왼쪽), EGFP에서와 같은 하향조절은 관찰되지 않았고(도 7 상단, 오른쪽 및 하단, 오른쪽), 이는 세포 배양물을 통한 비슷한 감염 효율 및 바이러스 확산을 나타낸다.
따라서, miR블록-1 및 -2에 의해 매개되는 EGFP 하향조절의 효율은 다중 주기 MVA 복제 과정에 걸쳐 안정적으로 유지되었다.
4.5 폭스바이러스 프로모터의 효과
전이유전자 발현을 유도하는 데 사용되는 폭스바이러스 프로모터는 바이러스 감염의 초기뿐만 아니라 후기에서 발현을 개시하는 조합된 프로모터 클래스로부터 종종 선택되었다. 강력한 전이유전자 발현을 유도하도록 설계된 합성 PrS 프로모터(23)가 이의 전형적인 예이며 널리 사용된다.
PrS 프로모터에서 최적화된 초기 프로모터 모티프의 존재에도 불구하고, 이 프로모터의 제어 하에 전이유전자 발현은 주로 후기에 발생한다. 그러나 전이유전자 생성물에 대한 T 세포 반응의 가능한 최고의 유도를 위해서는 전이유전자의 초기 및 심지어 즉시 조기 발현이 유리하다.
따라서, 본 발명자들은 지금까지 사용된 PrS 프로모터(예를 들어, 도 4 참조)를 즉시 초기 Pr13.5long 프로모터(24)(WO 2014/063832)로 대체하는 실험을 수행하였다. PrS 또는 Pr13.5long 프로모터의 제어 하에 EGFP 발현은 EGFP의 3'-UTR 암호화 영역에 miR블록-2를 함유하는 재조합 MVA에서 비교했다(도 8). miR블록-scrbl2 및 PrS 또는 Pr13.5long 프로모터를 갖는 재조합 MVA는 대조군으로서 사용했다(도 8).
도 9에서 나타나는 바와 같이, PrS 및 Pr13.5 프로모터 모두에 의해 유도된 EGFP 발현은 p.i. 6시간 및 18시간째에 CEF 및 DF-1 세포에서 miR블록-2에 의해 하향조절되었다. 그러나 특히 Pr13.5long 유도 EGFP 발현의 하향조절은 PrS 유도 EGFP 발현에 비해, 즉 두 세포 유형 및 두 시점 모두에서의 발현에서 훨씬 더 효과적이었다(도 9).
실시예 5: 동종-올리고머 및 이종-올리고머 miR블록을 사용한 miRNA 표적 서열의 평가
5.1 플라스미드 내 개별 miRNA 표적 서열에 의한 EGFP 하향조절
이종-올리고머 miR블록에 의해 매개되는 EGFP 하향조절에 대한 개별 miRNA 표적 서열의 기여를 결정하기 위해, 본 발명자들은 이전에 이종-올리고머 miR블록에 배열된 개별 miRNA 표적 서열의 동종-올리고머 반복체를 갖는 플라스미드 발현 작제물을 생성했다.
본 발명자들은 먼저 miR블록-1 및 -2의 8개의 상이한 표적 서열을 조사했다. miR블록-1에 함유된 각 miRNA 표적 서열은 동종-올리고머 miR블록 내 3개의 동일한 카피(3중 반복)로 배열했다(표 6, miR블록-13 내지 -16 참조). miR블록-2에 함유된 각 miRNA 표적 서열은 4개의 카피(4중 반복)로 배열했다(표 6, miR블록-17 내지 -20 참조). 한 예로서, miR-125b-5p(miR블록-1에 함유됨)에 대한 표적 서열을 사용하여, 본 발명자들은 EGFP 하향조절이 동종-올리고머 miR블록에 배열된 3개 또는 4개의 카피에 의해 크게 상이하지 않다는 것을 관찰했다. 동종-올리고머 miR블록 내에서 개별 miRNA 표적 서열은 이종-올리고머 miR블록에 대해 전술한 바와 같은 4-nt 스페이서로 분리되었다(실시예 3.1 참조).
도 10(상단)에서 나타나는 바와 같이, miR블록-13, -17 및 -18(각각 miR-17-5p, miR-20a-5p 및 miR-21-5p에 대한 표적 서열로 구성됨)이 EGFP 발현을 하향조절하는 데 있어 동종-올리고머 miR블록-13 내지 -20 중에서 가장 효율적이었다. 대조군("miRb 없음")의 %로서 miR블록-13, -17 및 -18에 의해 매개되는 EGFP 하향조절의 정도는 이종-올리고머 miR블록-1 및 -2 매개 효과의 범위 내였다(도 10 상단).
miR블록-15, -16 및 -20(각각 miR-125b-5p, miR-222a 및 miR-221-3p에 대한 표적 서열)은 중간 수준으로 EGFP 하향조절을 매개한 반면, mR블록-14 및 -19(각각 miRNA 103-3p 및 148a-3p에 대한 표적 서열)는 미미한 효과만 나타냈다(도 10 상단).
BFP 발현은 모든 형질감염된 CEF 배양물에서 매우 비슷하여 플라스미드 작제물의 비슷한 형질감염 효율을 확인시켜 주었다(도 10 하단).
miR-222a 및 miR-221a-3p(각각 miR블록-16 및 -20)가 CEF 세포에서 가장 풍부한 miRNA로 기술된 바 있는 한, 수득된 결과는 흥미로운 것이었다(28). 그러나 본 발명자들의 실험에서, 이들의 상응하는 표적 서열은 EGFP 발현의 하향조절의 중간 정도로만 매개했다(도 10 상단). 반면, miR-17-5p 및 miR-20a-5p(각각 miR블록-13 및 -17)의 풍부도는 miR-222a 및 miR-221-3p의 약 10%에 불과한 것으로 보고되었는데(28), 하지만 본 발명자들의 실험에서는 그들의 상응하는 표적 서열이 훨씬 더 효과적인 것으로 판명되었다(도 10 상단).
5.2 재조합 MVA에서 선택된 miRNA 표적 서열에 의한 EGFP 하향조절
상기 실시예 5.1에 기술되고 도 10에서 나타나는 바와 같이, 동종-올리고머 miR블록-13, -17 및 -18은 플라스미드 형질감염에 의한 EGFP 발현의 하향조절을 매개하는데 특히 효과적이었다.
miR블록-17 및 -18에 의한 EGFP 하향조절의 효율은 다음으로 MVA 감염의 정황에서 결정되었다. PrS 프로모터 하에서 EGFP를 발현하고 EGFP의 3' UTR 암호화 영역에 miR블록-17 또는 miR블록-18을 함유하는 2개의 재조합 MVA가 작제되었다(도 11, 각각 "EGFP-miRb-17" 및 "EGFP-miRb-18"). 비교를 위해 miR블록-2를 함유하는 재조합 MVA를 사용했다(도 11, "EGFP-miRb-2"). miR블록-17 및 -18에 구성된 miRNA 표적 서열은 이종-올리고머 miR블록-2에도 함유되었다.
도 12(왼쪽)에서 나타나는 바와 같이, CEF 세포에서의 EGFP 발현은 miR블록-2에 의해 대조군("miRb 없음")의 약 29%로 하향조절되었다. miR블록-17 또는 -18을 함유하는 MVA 재조합체의 경우, EGFP 발현은 각각 약 62% 및 66%로만 감소되었다(도 12 왼쪽).
상이한 MVA 재조합체에 의한 RFP의 발현은 매우 유사했으며(도 12 오른쪽), 이는 비슷한 수준의 MVA 감염을 나타낸다.
miR블록-17 및 -18이 EGFP 발현의 하향조절 정도를 miR블록-2에 의해 생성된 것의 단지 약 절반으로 달성했다는 것은 주목할 만하다(도 12 왼쪽). 이 결과는 플라스미드에 의해 수득된 결과와 상이했다. 위에서 입증된 바와 같이(실시예 5.1, 도 10 참조), 플라스미드에서 발현될 때 miR블록-17 및 -18에 의한 EGFP 하향조절은 miR블록-2에 의해 생성된 것과 매우 비슷했다. 따라서, 이종-올리고머 miR블록 내 miRNA 표적 서열의 배열은 MVA 재조합체에 적용되는 경우에 특히 유리할 수 있는 것으로 보인다.
5.3 플라스미드에서 추가로 잠재적인 miRNA 표적 서열의 스크리닝
본 발명자들은 CEF 세포에 함유된 작은 RNA에 대한 자체 RNA 시퀀싱 분석을 수행했다. 이 분석으로부터 초래되는 miRNA에 의한 EGFP 하향조절이 테스트되었다.
선택된 miRNA에 대한 표적 서열은 4-nt 스페이서에 의해 분리된 4중 반복체로 동종-올리고머 miR블록 내에 배열되었다(표 6, miR블록-25 내지 -36 참조). miR블록은 EGFP ORF의 서열 스트레치에 배치했고, EGFP는 플라스미드 형질감염에 의해 발현되었다.
도 13(상단)에서 나타나는 바와 같이, miR블록-26 및 -31(각각 miR-19a-3p 및 miR-199-3p에 대한 표적 서열)은 CEF 및 DF-1 세포에서 EGFP 발현을 하향조절하는 데 있어서 miR블록-25 내지 -36 중에서 가장 효율적이었다.
miR블록-25 및 -32(각각 miR-18a-5p 및 miR-33-5p에 대한 표적 서열)는 EGFP 하향조절을 중간 수준으로 매개했다. 적어도 CEF 세포에서는 miR블록-33(miR-218b-5p의 표적 서열)에도 유사하게 적용되었다. 대조적으로, 나머지 miR블록-27 내지 -30 및 miR블록-33 내지 -36은 하향조절 활성이 미미하거나 전혀 나타나지 않거나, 심지어 EGFP 발현에 대한 강화 효과도 관찰되었다(도 13 상단).
CEF 및 DF-1 세포에서 비슷한 수준의 RFP 발현은 동일한 형질감염 효율을 확인시켜 주었다(이하 도 13).
5.4 재조합 MVA에 의한 EGFP 발현의 하향조절에 가장 적합한 miRNA 정의
상이한 miRNA 표적 서열의 EGFP 하향조절 활성에 대해 얻은 지식(실시예 5.1, 5.2 및 5.3 참조)은 재조합 MVA에 사용하기 위한 이종-올리고머 miR블록의 설계를 최적화하기 위한 기초로서 역할을 했다. 이 효과를 위해 선택된 miRNA는 이하 표 7에 나열되어 있다.
뉴클레오타이드 서열의 반복체는 일반적으로 MVA 복제 동안 상동성 재조합의 위험을 안고 있다. 따라서 miR블록 내 miRNA 표적 서열의 부분적 또는 완전한 동종-올리고머 반복체는 새로 생성된 재조합 MVA 게놈에서 원치 않는 결실 또는 재배열을 초래할 수 있을 것이다. 그러한 이벤트의 확률은 아마도 동일한 서열 또는 유사성이 높은 서열 스트레치가 직렬 배열되어 서로 밀접하게 또는 직접 인접해 있을 때 가장 높다.
따라서, 본 발명자들은 miRNA가 뉴클레오타이드 서열에 있어서 최대로 상이한 이종-올리고머 miR블록을 설계하는 것을 목표로 했다. 결과적으로, 이종-올리고머 miR블록-37 내지 -47이 생성되었다(표 5). miR블록-43 및 -44는 각각 miR블록-39 및 -41과 동일한 miRNA 표적 서열을 함유했지만 순서는 달랐다.
EGFP 하향조절은 이미 전술한 바와 같이 EGFP 암호화 서열에 결합된 miR블록-37 내지 -47 중 하나를 함유하는 플라스미드에서 분석했다.
도 14(상단, 왼쪽)에서 나타나는 바와 같이, miR블록-37, -38 및 -39는 CEF 세포에서 miR블록-37 내지 -47 중에서 가장 효과적으로 EGFP 하향조절을 매개했다. EGFP 발현의 하향조절 정도(대조군, "miRb 없음"의 %)는 miR블록-2에 의해 생성된 것보다 훨씬 우수했다. DF-1 세포(도 14 상단, 오른쪽)에서 적어도 miR블록-37 및 -38에 의한 EGFP 하향조절은 miR블록-2에 의해 유도된 범위 내에 있었다. 나머지 miR블록-40 내지 -47은 덜 효율적으로 EGFP 발현의 하향조절을 매개했다(도 14 상단).
상이한 MVA 재조합체에 의한 RFP의 발현은 다시 매우 유사했다(이하 도 14).
8개의 상이한 miRNA 표적 서열을 갖는 이종-올리고머 miR블록(표 4의 miR블록-45)을 함유하는 재조합 MVA도 테스트했지만 EGFP 하향조절에는 거의 활성을 나타내지 않았다.
최고의 EGFP 하향조절 활성을 나타내는 miR블록에서 다음 고려 사항을 기반으로 선도적인 후보 miR블록을 선택했다: 첫째, 인간 혈액, 백혈구 또는 골격근에서 발현이 높거나 매우 높은 miRNA 표적 서열은 피했다. 이면의 이유는 본 발명자들이 근육내 또는 피하 적용을 가장 일반적인 백신접종 경로라고 생각했기 때문이다. 인간 혈액, 백혈구 및 골격근에서 miRNA 발현에 대한 데이터는 miRgeneDB 데이터베이스(http://mirgenedb.org/)에서 가져왔다. miRNA-21-5p는 인간 백혈구에서 고도로 발현되기 때문에 상응하는 표적 서열을 포함하는 miR블록, 즉 miR블록-37 및 -38은 추가 고려 사항에서 제외했다. 둘째, miR-17-5p 및 miR 20a-5p 모두에 대한 표적 서열을 함유하는 miR블록, 즉 miR블록-37, -46 및 -47은 이들 두 표적 서열의 높은 서열 유사성으로 인해 더 이상 고려하지 않았다.
마지막으로, miRNA 표적 서열 배제 기준을 충족하고 miR블록-37 및 -38에 가장 가까운 EGFP 하향조절 활성을 갖는 miR블록-39 및 -41은 재조합 MVA에 적용하기에 가장 적합한 것으로서 식별되었다.
실시예 6: 재조합 MVA-BN-RSV 내 miRNA 표적 서열
6.1 miRNA 표적 서열에 의해 변형된 MVA-BN-RSV의 작제
본 발명자들은 MVA-BN®-RSV("MVA-BN-RSV"로 지칭됨)(WO 2014/019718)에 존재하는 전이유전자의 발현에 미치는 miRNA 표적 서열의 효과를 조사했다.
MVA-BN-RSV는 인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 5가지 단백질을 암호화한다(도 15). 순환성 RSV 항원 아형 A와 B 둘 모두로부터의 당단백질(G)의 2개의 ORF는 각각 초기/후기 프로모터 Pr7.5(G(A)) 및 PrS(G(B))의 제어 하에 발현된다. 융합 당단백질(F) 유전자는 PrH5m 초기/후기 프로모터의 제어하에 발현된다. 주로 항바이러스 CD8 T 세포 반응의 표적으로 작용하는 핵단백질(N) 및 M2-1 단백질은 융합 단백질 N/M2-1로서 암호화되며, 각각의 ORF는 즉시 초기 프로모터 PrLE1((35), PrLE1은 상기 참고문헌에서 pHyb로 지칭됨)의 제어 하에 발현된다(도 15).
miR블록-1 및 -2를 함유하는 변형된 MVA-BN-RSV의 제1 버전(도 15의 "MVA-BN-RSV-miRb1/2")은 RSV 당단백질 G(A), G(B) 및 F의 발현을 하향조절하는 것을 목표로 하여 생성되었다. miR블록-1은 G(B) 유전자 및 F 유전자의 3'-UTR 영역에 삽입되었고, 반면 miR블록-2는 G(A) 유전자의 3'-UTR 영역에 삽입되었다(도 15).
변형된 MVA-BN-RSV의 제2 버전(도 15의 "MVA-BN-RSV-miRb39/41")에서, 모든 RSV 유래 전이유전자는 miRNA 표적 서열에 연결했다. MVA-BN-RSV-miRb39/41은 재조합 MVA에서 전이유전자 하향조절에 가장 적합한 것으로 식별된 miR블록, 즉 miR블록-39 및 -41을 사용하여 설계 및 생성되었다(실시예 5.4 참조).
6.2 변형된 MVA-BN-RSV에서의 전이유전자 하향조절
MVA-BN-RSV-miRb1/2 또는 MVA-BN-RSV-miRb39/41로 감염된 CEF 세포에서 RSV G, F 및 N/M2-1 단백질의 발현은 면역블롯으로 분석하고 MVA-BN-RSV에서의 각각의 단백질 발현과 비교했다.
12시간 또는 18시간 동안 MVA-BN-RSV, MVA-BN-RSV-miRb1/2 또는 MVA-BN-RSV-miRb39/41로 감염된 CEF 세포의 용해물에서, RSV G는 분자량이 약 90 kDa인 이의 완전히 글리코실화된 성숙 형태로 주로 검출되었다(도 16). 이러한 점에서 RSV G 검출에 사용된 항체는 RSV G 단백질의 2가지 항원 아형인 A와 B를 구별하지 못했음을 유의해야 한다. 따라서, 도 16의 면역블롯에서 볼 수 있는 RSV G-특이적 신호는 RSV G(A) 및 G(B)에 대한 중첩된 신호로 구성될 가능성이 높다. MVA-BN-RSV 대조군으로 감염된 세포와 비교하여, 성숙 및 미성숙 RSV G의 발현 수준은 MVA-BN-RSV-miRb1/2 또는 MVA-BN-RSV-miRb39/41로 감염된 세포에서 더 낮았다(도 16). 따라서 miR블록-1 및 -2(각각 MVA-BN-RSV-miRb1/2의 RSV G(B) 및 (G)A에 연결됨) 뿐만 아니라 miR블록-39 및 -41(각각 MVA-BN-RSV-miRb39/41의 RSV G(B) 및 G(A)에 연결됨)은 RSV G(A)/(B) 단백질 발현의 하향조절을 매개했다.
RSV F 단백질은 전구체 단백질 F0 및 큰 F1 서브유닛(세포 푸린 프로테아제에 의한 F0의 단백질분해 절단에 의해 생성됨)으로서 검출 가능했다(도 16). MVA-BN-RSV-miRb1/2에 의한 RSV F0/F1의 발현은 MVA-BN-RSV 대조군에 비해 단지 중간 정도로 감소되었지만, MVA-BN-RSV-miRb39/41의 경우에는 분명하게 감소되었다(도 16). 따라서, miR블록-39는 miR블록-1보다 RSV F0/F1 발현을 하향조절하는데 있어서 더 효과적이었다.
MVA-BN-RSV-miRb39/41 감염된 세포에서 RSV N/M2-1 융합 단백질(약 62kDa)의 발현은 MVA-BN-RSV 대조군 또는 MVA-BN-RSV-miRb1/2로 감염된 세포와 비교하여 분명하게 감소되었다(도 16). 이와 관련하여 MVA-BN-RSV-miRb1/2는 RSV N/M2-1 ORF에서 어떠한 miRNA 표적 서열도 함유하지 않았다는 점에 유의해야 한다(도 15 참조).
내인성 발현 대조군으로 사용된 백시니아 바이러스 D8 단백질의 발현은 MVA-BN-RSV-miRb1/2 또는 MVA-BN-RSV-miRb39/41로 감염된 세포에서 비슷했다(도 16). 흥미롭게도, D8 신호는 3가지 재조합체에 비해 야생형, 즉 비재조합 MVA-BN(도 16)에 의해 감염된 세포로부터의 용해물에서 약간 더 강했다. 이 결과는 임의의 miRNA 매개 하향조절 없이 동시에 발현된 RSV 유래 전이유전자의 세포독성 효과가 D8과 같은 자가 MVA 유전자의 발현에 영향을 미치는 반면, RSV 전이유전자의 miRNA 표적화는 정상적인 D8 발현을 완전히 회복시키지 못했음을 나타낼 수 있다.
종합하면, RSV G(A)/(B) 및 RSV F0/F1의 발현은 MVA-BN-RSV-miRb1/2 및 MVA-BN-RSV-miRb39/41에서 하향조절된다. 그러나 RSV F0/F1 발현의 하향조절은 MVA-BN-RSV-miRb39/41에서 더욱 두드러진다. N/M2-1의 발현은 초기 프로모터에 의해 발현이 유도되기 때문에 예상한 바와 같이 특히 잘 하향조절된다.
6.3 변형된 MVA-BN-RSV 재조합체의 수율
MVA-BN-RSV, MVA-BN-RSV-miRb1/2 및 MVA-BN-RSV-miRb39/41로 감염된 CEF 세포로부터의 재조합 MVA 수율은 p.i. 3일 및 4일째에 2가지 상이한 MOI, 즉 0.1 및 0.01에서 결정했다.
도 17에서 나타나는 바와 같이, MVA-BN-RSV는 p.i. 3일 및 4일째에 0.1 및 0.01의 MOI 모두에서 야생형 MVA-BN에 비해 수율을 상당히 감소시켰다(약 4.2배 내지 21.5배 저하, 도 17의 표에서 "MVA-BN 대 -RSV" 참조). 그러나 MVA-BN-RSV와 비교하여 MVA-BN-RSV-miRb1/2의 수율은 약 1.2배 내지 4.2배 증가했다("MVA-RSV-miRb1/2 대 MVA-RSV"). MVA-BN-RSV-miRb39/41의 수율은 MVA-BN-RSV-miRb1/2(p.i. 3일 및 4일째에 적어도 MOI 0.1, 및 p.i. 4일째 MOI 0.01에서)에 비해 1.2배 내지 2.6배 더 증가했다("MVA-RSV-miRb39/41 대 -miRb1/2"). MVA-BN-RSV에 비해 최고의 증가는 p.i. 3일 및 4일째에 MOI 0.1에서 MVA-BN-RSV-miRb39/41에 의해 관찰되었다(각각 약 3.2배 및 6.8배)("MVA-RSV-miRb39/41 대 MVA-RSV").
그럼에도 불구하고, MVA-BN-RSV-miRb39/41은 MVA-BN의 복제 거동을 완전히 회복하지 못했다(도 17의 표에서, "MVA-BN 대 RSV-miRb39/41 참조): MVA-BN-RSV-miRb39/41의 수율은 여전히 MVA-BN에 비해 약 3.2배(MOI 0.1) 및 2.6배(MOI 0.01) 감소되었다.
결론적으로, 생산 수율과 관련하여 miRNA 표적 서열에 의해 생성된 최고의 효과는 MOI 0.1 및 p.i. 4일째에 MVA-BN-RSV-miRb39/41에 의해 수득되었다.
6.4 변형된 MVA-BN-RSV로부터의 RSV 단백질의 면역원성
6.4.1 T 세포 검정
MVA-BN-RSV-miRb39/41 및 MVA-BN-RSV-miRb1/2로부터의 RSV 전이유전자 생성물의 면역원성을 조사하기 위해, 마우스 면역화 실험을 수행했다.
마우스의 BALB/c 계통에서 생성되는 경우, M2-1 단백질은 강력하고 면역우성의 CD8 T 세포 에피토프를 보유한다. 따라서, 이 에피토프의 분석은 RSV M2-1 특이적 CD8 T 세포 반응을 결정하기 위한 넓은 동적 범위를 갖는 민감한 검정을 제공했다.
RSV M2-1 또는 MVA E3(벡터 대조군으로 사용됨)에 특이적인 BALB/마우스의 CD8 T 세포 반응은 Dextramer 염색으로 분석했다. 마우스 PBMC를 수집하고 프라임 후 7일째에, 뿐만 아니라 21일째 부스트 후 7일 및 13일째(즉, 1차 면역화 후 28일째와 34일째)에 염색했다.
도 18(왼쪽 패널)에서 나타나는 바와 같이, MVA-BN-RSV, MVA-BN-RSV-miRb1/2 및 MVA-BN-RSV-miRb39/41은 분석된 모든 시기에 RSV M2-1에 특이적인 CD8+ T 세포의 유사한 빈도를 유도했다. 따라서, RSV N/M2-1의 면역원성은 변형된 MVA-BN-RSV 재조합체에 존재하는 miRNA 표적 서열에 의해 생체 내에서 영향을 받지 않았다.
더욱이, MVA-BN-RSV, MVA-BN-RSV-miRb1/2 및 MVA-BN-RSV-miRb39/41은 E3-특이적 CD8+ T 세포의 유사한 빈도를 유도했으며(도 18 오른쪽 패널), 이는 MVA 벡터 백본에 대한 T 세포 반응이 비슷했고, 상이한 재조합체를 사용한 면역화가 일반적으로 유사하게 효과적이었음을 입증한다. 추가적으로, 특정 세포 표면 마커(CD4, CD8, CD44, CD62L, CD127, CD29, CX3CR1)의 발현 패턴에 기초한 기억 T 세포 표현형 하위세트의 빈도 분석에서는 3개의 MVA-BN-RSV 재조합체 사이의 차이가 드러나지 않았다.
6.4.2 세포내 사이토카인 염색 및 ELISpot 분석
사이토카인 생산 측면에서 CD8+ T 세포의 기능적 반응을 추가로 평가하고 RSV F 및 G 단백질에 대한 CD8 T 세포 반응을 정량적으로 비교하기 위해, 부스트 후 13일째에 마우스 비장세포를 수집하고 RSV G, F 또는 M2-1로부터 또는 MVA E3(벡터 대조군)으로부터 유래된 펩타이드로 즉시 자극했다. 반응은 세포내 사이토카인 염색(ICCS) 및 ELISpot 분석으로 분석했다.
MVA-BN-RSV, MVA-BN-RSV-miRb1/2 또는 MVA-BN-RSV-miRb39/41로 면역화된 마우스에서, 각 RSV G, F 및 N/M2-1 단백질 또는 MVA E3에 특이적인 CD44+ IFN-γ+ CD8+ T 세포의 전체 빈도는 3가지 MVA-BN-RSV 재조합체 중 하나로 면역화된 마우스 그룹 간에 매우 유사했다(도 19a). RSV F 유래 펩타이드에 의한 자극 후, IFN-γ+ CD8+ T 세포의 전체 빈도는 테스트한 항원 중에서 가장 낮았고(< 2%), 반면 RSV N/M2-1 유래 펩타이드에 의해 수득된 빈도는 가장 높았다(도 19a). 게다가, 표면 마커 CD62L, CD127 및 CX3CR1의 패턴은 모든 마우스 그룹 간에 매우 유사했다.
CD4 및 CD8 T 세포 분석을 포괄한 ELISPOT 검정을 사용하여 면역화된 마우스의 T 세포 반응도 분석했다. 결과는 도 19b에 나타냈다. RSV M2-1 유래 펩타이드로 비장세포를 자극한 후 ELISpot 분석은 계수하기에 너무 많은 IFN-γ+ 반점 형성 콜로니를 초래했다(따라서 도 19b에 나타내지 않음). 이 결과는 RSV N/M2-1 단백질이 강력한 CD8 T 세포 반응을 유도했음을 확인시켜 주었고, 이는 RSV M2-1이 H-2d 마우스에서 면역우성 에피토프를 함유한다는 다른 사람들의 보고와 일치하는 것이다(36, 37).
RSV G 및 F, 뿐만 아니라 MVA E3로부터 유래된 펩타이드에 의한 자극 후 비장세포의 ELISpot 분석은 RSV G 펩타이드에 대한 반응이 RSV F 펩타이드에 대한 반응보다 더 강력하다는 것을 확인시켜 주었다(도 19b). ICCS(도 19a 및 위에서 논의됨)와 마찬가지로, 3가지 MVA-BN-RSV 재조합체 중 하나에 의해 면역화된 마우스 그룹 간에 RSV G 및 F 단백질과 MVA E3 각각에 특이적인 T 세포의 빈도 차이는 관찰되지 않았다(도 19b).
6.4.3 ELISA 및 PRNT 분석
암호화된 RSV 단백질에 대한 체액 반응은 항원으로서 전체 RSV에 대한 면역글로불린 G(IgG) 항체 결합에 대해 ELISA하고 시험관내에서 감염성 RSV를 중화시키는 항체의 역가를 결정함으로써 분석했다. RSV- 및 MVA-특이적 IgG 역가는 프라임 전 1일(-1일), 프라임 후 20일 및 프라임 후 34일(즉, 부스트 후 13일)째에 분석했다.
프라임 또는 부스트 후, 3가지 MVA-BN-RSV 재조합체 중 하나로 면역화된 마우스의 혈청에서는 총 RSV 특이적 IgG 역가의 차이가 관찰되지 않았다(도 20a 왼쪽). MVA-특이적 IgG 역가에 대해서도 비슷한 결과가 수득되었다(도 20a 오른쪽).
RSV 특이적 중화 항체 역가는 면역화된 마우스의 혈청에서 프라임 후 34일째(즉, 부스트 후 13일째)에 플라크 감소 중화 테스트(PRNT)에 의해 결정했다.
3가지 상이한 MVA-BN-RSV 재조합체 중 하나로 마우스를 면역화한 후 유도된 중화 항체의 양의 차이는 전혀 검출할 수 없었다(도 20b). RSV 중화 항체와 관련하여 혈청전환 속도는 면역화된 마우스의 모든 그룹에서 100%였다(도 20b의 표 참조).
6.4.4 면역원성 연구의 결론
요약하면, RSV 특이적 CD8+ T 세포의 빈도와 기능성, 및 총 RSV 특이적 IgG 뿐만 아니라 중화 항체의 유도를 포함하는 T 세포 반응은 3가지 상이한 MVA-BN-RSV 재조합체 중 하나로 면역화된 마우스 그룹 간에 매우 비슷했다. 따라서, 전이유전자의 3'-UTR 내에 miRNA 표적 서열의 첨가는 변형되지 않은 MVA-BN-RSV 작제물에서 유래된 전이유전자 생성물의 면역원성과 비교하여 마우스 내 각 전이유전자 생성물의 면역원성에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 결과는 모두 miRNA 표적 서열에 의해 매개되는 세포독성 전이유전자 발현의 하향조절이 생체내에서 각각의 전이유전자 생성물의 면역원성에 검출가능하게 영향을 미치지 않으면서 CEF 세포로부터의 MVA 수율에 긍정적으로 영향을 미친다는 것을 보여주었다.
최종 논평: 본 명세서의 텍스트 전체에 걸쳐 여러 문서가 인용되었다. 본원에 인용된 각 문서(모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조업체의 설명서, 지침 등 포함)는 전체 내용이 참고로 포함된다. 참고로 포함된 자료가 본 명세서와 모순되거나 일치하지 않는 경우, 본 명세서는 이러한 임의의 자료를 대신한다. 본 문서의 어떠한 내용도 본 발명이 이전 발명으로 인해 그러한 개시내용에 앞설 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
[참고문헌]

Claims (16)

  1. 폭스바이러스 프로모터에 작동 가능하게 연결된 전이유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 변형 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)로서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 상기 전이유전자에 연결된 이종 miR블록에 배열된 일련의 miRNA 표적 서열을 추가로 포함하며, 여기서 각각의 miRNA 표적 서열은 진핵생물 MVA 생산자 세포의 miRNA에 상응하며, 상기 miR블록 내 miRNA 표적 서열 중 적어도 하나는 상기 진핵생물 MVA 생산자 세포에서 상기 전이유전자 발현의 하향조절을 매개할 수 있는, 재조합 변형 백시니아 바이러스 앙카라(MVA).
  2. 폭스바이러스 프로모터에 작동 가능하게 연결된 전이유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 전사 단위로서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 상기 전이유전자에 연결된 이종 miR블록에 배열된 일련의 miRNA 표적 서열을 추가로 포함하며, 여기서 각각의 miRNA 표적 서열은 진핵생물 MVA 생산자 세포의 miRNA 서열에 상응하며, 상기 miR블록 내 miRNA 표적 서열 중 적어도 하나는 진핵생물 MVA 생산자 세포에서 상기 전이유전자 발현의 하향조절을 매개할 수 있는, 전사 단위.
  3. 이종 miR블록(miRblock)에 배열된 일련의 miRNA 표적 서열로서, 각각의 miRNA 표적 서열은 진핵생물 MVA 생산자 세포의 miRNA에 상응하고, 상기 miR블록 내 miRNA 표적 서열 중 적어도 하나는 상기 진핵생물 MVA 생산자 세포에서 상기 miR블록에 연결된 전이유전자 발현의 하향조절을 매개할 수 있는, 일련의 miRNA 표적 서열.
  4. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 적어도 하나의 miRNA 표적 서열은 상기 miRNA 서열에 약 80 내지 100%, 바람직하게는 약 90 내지 100%, 더욱 바람직하게는 약 95 내지 100%, 가장 바람직하게는 약 100%의 뉴클레오타이드 서열 유사성으로 상응하는, 재조합 MVA, 전사 단위 또는 miR블록.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 miRNA 표적 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 및 서열번호 9에 묘사된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 MVA, 전사 단위, 또는 miR블록.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miR블록은 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 및 서열번호 55에 묘사된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지는 것인, 재조합 MVA, 전사 단위, 또는 miR블록.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이유전자는 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에서 유래된 단백질 또는 이의 항원성 부분, 바람직하게는 RSV G(A), G(B), F, N 및 M2-1 단백질, 및 N/M2-1 융합 단백질로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 암호화하는 것인, 재조합 MVA, 전사 단위 또는 miR블록.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진핵생물 MVA 생산자 세포는 1차 조류 세포, 바람직하게는 닭 배아 섬유아세포(CEF) 세포, 또는 영구 조류 세포주, 바람직하게는 DF-1 또는 메추라기 세포인, 재조합 MVA, 전사 단위 또는 miR블록.
  9. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 Pr13.5long, Pr1328, PrLE1(pHyb) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 즉시 초기 프로모터이고, 바람직하게는 Pr13.5long 프로모터인, 재조합 MVA 또는 전사 단위.
  10. 제1항, 및 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 MVA를 생산하는 방법으로서,
    (1) 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 miR블록에 배열된 일련의 miRNA 표적 서열을 제공하는 단계;
    (2) 단계 (1)에서 제공된 상기 miR블록을 사용하여 제2항, 및 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항의 전사 단위를 제조하는 단계;
    (3) 단계 (2)에서 제조된 상기 전사 단위를 MVA에 삽입하는 단계;
    (4) 단계 (3)에서 수득된 상기 MVA로 진핵생물 MVA 생산자 세포를 감염시키고 이를 전파시키는 단계; 및
    (5) 단계 (4)에서 전파된 재조합 MVA를 수확하는 단계
    를 포함하는 방법.
  11. 시험관 내에서 진핵생물 MVA 생산자 세포에서 MVA 암호화된 전이유전자의 발현을 하향조절하기 위한 miRNA 표적 서열의 용도로서, 상기 miRNA 표적 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 및 서열번호 9에 묘사된 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 용도.
  12. 시험관 내에서 진핵생물 MVA 생산자 세포에서 MVA 암호화된 전이유전자의 발현을 하향조절하기 위한 miR블록에 배열된 일련의 miRNA 표적 서열의 용도로서, 상기 miR블록은 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 및 서열번호 55에 묘사된 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지는, 용도.
  13. 제1항, 및 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 MVA를 포함하는 약제학적 조성물 또는 백신.
  14. 약제 또는 백신으로 사용하기 위한 제1항, 및 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 MVA.
  15. 감염성 질환 또는 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 바람직하게는 RSV 감염 예방에 사용하기 위한, 제1항, 및 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 MVA.
  16. 폭스바이러스 프로모터에 작동가능하게 연결된 전이유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 MVA로서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 상기 전이유전자에 연결된 miRNA 표적 서열을 추가로 포함하며, 상기 miRNA 표적 서열은 진핵생물 MVA 생산자 세포의 miRNA에 상응하고, miR블록 내 상기 miRNA 표적 서열은 상기 진핵생물 MVA 생산자 세포에서 상기 전이유전자의 발현의 하향조절을 매개할 수 있는, 재조합 MVA.
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