DD144359A1 - Verfahren zur herstellung von immunpraeparaten gegen geschwulstkrankheiten - Google Patents

Abstract

Das Verfahren zur Herstellung von Immunpräparaten gegen Geschwulstki'ankheiten ist anwendbar auf dem Gebiet der- Humanund Veterinärmedizin und ist dadurch gekennzeichnet, daß ein i-n Enten persistierendes Retrovirus in Entenembryozellkulturen vermehrt, anschließend angereichert und gereinigt wird und daß die wirksamen, aber unschädlichen bzvz. inaktivierten Virtisbesfcandteile als Prophylaktikum, Therapeutikum und Diagnostikern-bei durch Retroviren bedingten Infektionen (Geschwülste) vornehmlich bei Papillomatosen einsetzbar sind.

Description

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Verfahren sur Herstellung vonImmunpräparaten gegen Geschwulst-

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Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung "betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Immunpräparaten für die Behandlung und Diagnose von Geschwulstkrankheiten in der Human- und Veterinärmedizin, die durch Retroviren hervorgerufen werden? vorzugsweise von Papillomatosen»

Charakteristik der "bekannten technischen Lösungen

Die durch, die DDR-Patente WPA 61 K/179 066 und WPA 61 K/190 065 gesühütsten Yöifalix-en zur Herstellung von Impfstoffen gegen humane Larynyjpapillornatose sowie gegen Papillomatosen anderer Lokalisation bei Mensch und Tier beruhen auf der in—vitro-Züch~ tung des Erregers, bei dem es sich vermutlich um einen Vertreter der Familie der Papovaviren handelt« Das Virus wird aus Geschwulstgewebe isoliert und in Zellkulturen vermehrt«, Nach Anreicherung und Reinigung erfolgt die Herstellung von Vakzinen aus dem Viruskonzentrat_e Die parenterale Verabfolgung des Impfstoffes führt zum Verschwinden der papillomatosen Wucherungen»' Nach der Behandlung tritt Rezidivfreiheit ein«,

Ziel der Erfindung

Bei weiterführenden elektronenmikroskopischen .Untersuchungen zur Virusätiologie menschlicher Tumoren wurde gefundene daß in Papillomen beispielsweise des Kehlkopfes und der Blase und ebenfalls in Prostatakarsinomen auch andere Viren enthalten sind| die der Familie der Retroviren angehören· Die ursprünglich als Papovavireii identifizierten Strukturen entsprechen wahrscheinlich den Innenkörpern

der Retroviren« Es wurde ferner gefunden, daß in klinisch gesunden Entenpopulationen ein Retrovirus zirkuliert, das vertikal auf den Entenembryo übertragen wird, in normalen Entenembryozellen entfalten ist und mit diesen ohne erkennbare Veränderungen im Sinne einer persistierenden Virusinfektion kultiviert werden kann· Das persistierende JSntenretroYirus verursacht keine Entwicklungsstörungen bei den wachsenden Entenembryonen«. Es ist für Enten- und Hühnerküken sowie Säuglingsmäuse, Meerschweinchen, Kaninchen und Kälber apathogen» Onkogene Eigenschaften konnten nicht nachgewie-S6SQ werden. Serologisch bestehen Verwandtschaftsbeziehungen zu den in menschliches Papillomgewebe enthaltenen Retroviren»

Ziel der! Erfindung ist die Anwendung des apathogenen in normalen Entenembryozellen persistierenden Retrovirus für die Immuntherapie von GescirwüTsten,. die durch Retroyiren hervorgerufen werden· Erfindungsgemäß wird das persistierende Retrovirus direkt aus primären Entenzellkulturen gewonnen. Die exfindungsgemäße Lösung bietet den Vorteil, daß die schwierige und zeitaufwendige Isolierung des Erregers der geweblichen Wucherungen aus Geschwixistge\vebe und seine Züchtung in vor— . kultivierten Zellen, die dem durch die DDR-Patente V/PA 61 K/ 179 066 und WPA 61 K/ 190 065 geschützten Verfahren entspricht, vermieden werden kann«

¥/esen der Erfindung .

Bei Infektionen mit Retroviren ist der menschliche und tierische Organismus im allgemeinen nicht in der Lage, das JLuftreten klinischer Manifestationen, die sich u.a. in fortschreitendem Gescüwulstwachstura äußern, mit Hilfe seiner Ab-Yzehrsysteme su beherrschen. Um den Organismus zu befähigen, eine spezifische zellvermittelte Immunität zur Vernichtung der Retroviren und der durch sie induzierten Geschwülste aufzubauen, müssen dem Immunsystem zusätzliche Informationen vermittelt werden* Bei den durch die DDR-Patente WPA E/179 086 und WPA 61 K/190 065 geschützten Erfindungen geschieht dies im Falle der menschlichen Larynxpapillomatose

durch wiederholte Impfungen mit dem aus Geschwulstmaterial 6i? isolierten und in heterolcgen Zellkulturen gezüchteten spezieshomologen Erreger»

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren findet zur Inimuntherapie papiilomatö'ser Geschwülste ein heterologes Retrovirus Verwendung, das in normalen Entenzellen persistiert· Es besitzt keine pathogenen Eigenschaften,» Im Gegensatz zu den aus Geschwuistgewebe isolierten Erregern wirkt es nicht onkogen_c Durch die Virusgewinnung aus normalen, unbeimpften Entenemb.Tyozellkulturen wird der zweiphasige Prozeß der bisherigen Verfahren, der auf der Zellkulturherstellung mit

nachfolgender Virusbeimpfung beruht, auf einen Schritt_? die Zellkulturherstellung, reduziert«

Die Zellkulturen werden mit großer Zelleinsaat aus jungen Entenem'bryonen hergestellt. Die Zelldichte wird so gewählt? daß innerhalb τοη 24 h ein konfluierendes Zellwachstum vor~ liegte Nach 2-*2 d Inkubation werden die Zellen aus den KuI-turgefäßen entfernt _s in einem serumfreien Medium minde~ stens 1Ofach im Verhältnis zum Zellzüchtungsmedium konisentriert und zur Freisetzung des intrazellulären Virus desintegrierte Das durch Zentrifugieren zur Beseitigung τοη Zeil- bestandteilen roi'gereinigte Virus wird sodann mit Lipidlösungsmitteln behandelt und mit der Ultrazentrifuge oder mit anderen geeigneten Verfahren weiter gereinigt und konzentriert« Nach Inaktivierung mit Formalin oder anderen geeigneten In= aktiTierungsmitteln kann das Virus mit oder ohne Zusatz von Adjuvantien als Impfstoff Verwendung finden* Bei wiederholter Anwendung der aus konzentriertem Entenretrovirus hergestellten Vakzine wird das Geschvmlstwaclistum bei akuten und chronisch-rezidivierenden Papillomatosen zum Stillstand gebracht und EezidiTfreiheit erzielte Das bisher üb-» liehe chirurgische Vorgehen kann durch das erfindungsgemäße Verfahren unterstützt, in vielen Fällen auch ersetzt werden»

1. Entenembryozellkuliuren werden in bekannter Weise aus 11 (10-12) d alten Vollembryonen hergestellt und bei 38⁰C in einer Rollereinrichtung bebrütet. Die ZeIldiclite wird auf 3x10 Zellen eingestellt, so daß innerhalb 24h eine konfluierende Zellschicht resultiert. Nach weiteren 2 Bebrütungstagen werden die Zellen durch ein Chelapex (0,1$) - Trypsingend sch (0,2$) aus den Kulturgefäßen abgelöst, durch Zentrifugieren ( 1500 U/min für 5min) sedimentiert und in mindestens 10 fächer Konzentration im Verhältnis zum Zeilzüchtungsmedium mit serumfreier Hanks — Lösung aufgenommen. Zur Freisetzung des intrazellulären Virus werden die Zellen durch klimatische Beugung in CO₂- Trockeneis-Alkohol - Gemisch oder mit anderen geeigneten Verfahren aufgeschlossen» Der Zelldetritus wird durch Zentrifugation bei 2000 U/min für 30 min aus der Virus enthaltenden Flüssigkeit entfernt· Die Virusflüssigkeit wird von dezs Sedimenten abgetrennt, mit 50$ Diäthyläther versetzt und 5 min lang gründlich geschüttelt. Nach erneuter Zentrifugation bei 2000 U/min für 30 min setzt sich die Äthorphase über einen schmalen Präzipitationsschiciit von der das Virus enthaltenden wäßrigen Phase ab« Die Virusflüssigkeit wird unter der Präaipitationsschiciit vorsichtig abgesaugt und anschließend durch Ultrazentrifugation im 80 ml Rotor einsr VAC 602"2h lang mit 25000 U/min bei O⁰C zentrifugiert (ca. 100000 g). Die Sedimente werden in Trispufferlösung aufgenommen. Nach Zentrifugation bei 5000 U/min für 20 rain in einer %hlzentrifuge bei 4⁰C wird das im Verhältnis zum Ausgangsmaterial 100 fach angereicherte "Virus mit Formalin in einer Endkonzentration von 1 : 4 000 inaktiviert. Zur Verwendung als Impfstoff v/ird die inaktivierte Virusflüssigkeit mit oder ohne Zusats von Adjuvantien in Mengen von 5ml in-Ampuulen abgefüllt 3 die anschließend ir;it eier Flamme verschmolzen

und bei 4⁰C aufbewahrt werden. In der Regel werden 5 Injektionen im Abstand von 3 d intramuskulär verabreicht, an die sich in 4 - wöchigen Abständen weitere Injektionsserien anschließen können.

Die Impfstoffprüfung auf Virusgehalt und Reinheit wird elektronenmikroskopisch nach Negativkontrastierung mit Phosphorwolframsäure vorgenommen» Die serologische' Identität wird mit spezifischen Hyperimmunseren sowie mit Patientenseren unter Verwendung der einfachen Irarnundiffusion nach MNCINI (EANCINI, G., CARBONARAy A.O., u, HEREMANS, J«F_e: Immunochem. 2 (1965), 235), der

145. Laurell - Elektrophorese oder der Überwanderungselektrophorese (Methoden entnommen aus FRIEMEL, EU : Immunologische Arbeitsmethoden, VEB Gustav Fischer Verlag Jena, 1976) durchgeführt. Die Unschädlichkeit wird im Tierversuch an Säuglingsmäusen, Meerschweinchen und Kaninchen bei verschiedenen Applikationsverfahren geprüft« Mit Antilymphozytenseren behandelte Mäuse dienen zum Abschluß· einer onkogenen Aktivität»

2. Für den Nachweis serologischer Verwandtschaftsbeziehung und zeilvermittelter immunologischer Reaktionen wird das entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene Enten - Retrovirus in 1000 fach konzentierter Form verwendet* Als Antiserum zur Testung der humoralen Immunität dienen Patientenseren in verschiedenen Verdünnungen in gepufferte Lösung. Für Kontrollversuche werden spezi~ fische Hyperimmunseren von Kaninchen eingesetzt. Die Ermittlung der immunologischen Gemeinsamkeiten bzw. einer Interspezieverwandtschaft zwischen dem aus Entenseilen isolierten Virus, den humanen Retroviren insbesondere . von Papillomviren des Menschen sowie Diagnose eines ab— gelaufenen Antigenkontaktes bei den Probanden erfolgt mit der einfachen radialen Imarandiffussion nach IAANCINI (1965)» Die Überwandexungseleictrophorese, Laurell - Elektrophorese und Immunelektrophorese werden in Anlehnung an FRBlEL · (1976) durchgeführt,, '

Claims (2)

Erfindungsanspruoh

1, Verfahren zur Herstellung von Immunpräparaten gegen Geschwulstkrankheiten bei Menschen und Tieren, die durch Retroviren verursacht werden vornehmlich von Papillomat@sen_? gekennzeichnet durch die Isolierung , Konzentrierung und Reinigung von persis'tierenden Retroviren, die in den Zellen normaler Entenembryonen und in den daraus hergestellten Zellkulturen emthalten sind sowie durch ihre Inaktivierung für den Einsatz als Impfstoff zur parenteralen Applikation mit oder ohne Zusatzvon Adjuvantien·

2· Verfahren nach Punkt 1 dadurch gekennzeichnet, daß in normalen Geweben oder Frischzellkulturen von anderen Vertebraten persistierende Retroviren verwendet werden· 3. Verfahren nach Punkt 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß die persistierenden Retroviren in aktiver oder inaktiver Form zur immunologischer Diagnose, von durch Retroviren verursachten Infektionen* fo