ES2236799T3 - Procedimiento de replicacion de virus de influenza en un cultivo celular y virus de influenza obtenibles por el procedimiento. - Google Patents
Procedimiento de replicacion de virus de influenza en un cultivo celular y virus de influenza obtenibles por el procedimiento.Info
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Abstract
SE DESCRIBEN NUEVOS PROCESOS PARA LA REPLICACION EN CULTIVO CELULAR DE VIRUS DE LA GRIPE Y VACUNAS Y COMPOSICIONES DIAGNOSTICAS QUE CONTIENEN LOS VIRUS DE LA GRIPE QUE PUEDEN OBTENERSE A TRAVES DEL PROCESO O SUS CONSTITUYENTES.
Description
Procedimiento de replicación de virus de
influenza en un cultivo celular y virus de influenza obtenibles por
el procedimiento.
La presente invención se refiere a procedimientos
para la replicación de virus de influenza en cultivo de células a
temperaturas reducidas, y a los virus de influenza obtenibles por
el procedimiento descrito y a las vacunas que puedan contener virus
de este tipo o constituyentes de los mismos.
Todas las vacunas para la influenza que han sido
usadas desde los años 40 hasta el presente como vacunas permitidas
para el tratamiento de seres humanos y animales están constituidas
por una o más cepas del virus que han sido repicadas en huevos
embrionados de gallina. Éstos virus son aislados del fluido
alantoideo de los huevos de las gallinas infectadas y sus antígenos
son usados como vacuna, como partículas de virus intactas o como
partículas de virus desintegradas por detergentes y/o solventes
-así llamadas vacunas fraccionadas- o como proteínas definidas del
virus aisladas -así llamadas vacunas de subunidad. En todas las
vacunas permitidas, los virus son inactivados por procedimientos
conocidos por las personas expertas en la técnica. Aún la
replicación de virus vivos atenuados, los que son evaluados en
vacunas experimentales, se lleva a cabo en huevos embrionados de
gallina.
El uso de huevos embrionados de gallina, para la
producción de vacunas demanda mucho tiempo, trabajo resulta
costoso. Los huevos de gallineros de gallinas sanas, controladas
por veterinarios, deben ser incubados antes de la infección, los
huevos deben ser seleccionados en relación a los embriones vivos,
dado que sólo estos huevos son adecuados para la replicación del
virus. Tras la infección, los huevos son incubados nuevamente,
habitualmente durante 2 a 3 días. Los embriones aún vivos en este
momento, son matados con frío y se obtiene el fluido alantoideo de
cada huevo individualmente por aspiración. Mediante procedimientos
laboriosos de purificación se separan sustancias de los huevos de
las gallinas que llevan a efectos indeseados de las vacunas, de los
virus, y éstos son concentrados. Como los huevos no son estériles
(libres de patógenos), es necesario también remover y/o inactivar
pirógenos y todos los patógenos posiblemente presentes. Para
aumentar el rendimiento de virus, la replicación de los virus de
influenza en huevos de gallina, ésta es llevada a cabo por regla
general a temperaturas reducidas (alrededor de 34ºC). Aún los virus
que pueden provocar enfermedades respiratorias pueden ser
replicados en cultivo celular. También aquí, en algunos casos se
usan temperaturas reducidas (alrededor de 33ºC), las que sin
embargo no afectan la calidad de la vacuna obtenida, sólo favorecen
la replicación.
Los virus de otras vacunas, como por ejemplo el
virus de la rabia, paperas, sarampión y rubéola, polio y
meningoencefalitis (FSME) pueden ser replicados en cultivos
celulares. Como los cultivos celulares originados de bancos de
células evaluados están libres de patógenos, en contraste con los
huevos de gallina, son un sistema definido de replicación que
(teóricamente) está disponible en cantidades casi ilimitadas, hacen
posible la replicación de virus de manera económica bajo ciertas
circunstancias, aún en el caso de los virus de influenza. Es
posible conseguir una producción económica de vacunas además por el
hecho de que el aislamiento y purificación desde un medio estéril
de un cultivo celular definido parece ser más simple que el
realizado desde el fluido alantoideo, con su alto contenido
proteico.
El aislamiento y replicación de virus de
influenza en huevos lleva a una selección de ciertos fenotipos, la
mayoría de los cuales difieren del aislamiento clínico. En
contraste con esto, en el aislamiento y replicación de virus en
cultivos celulares no ocurre ninguna selección dependiente de las
etapas (Oxford, J.S. y col., J. Gen. Virology 72 (1.991),
185-189; Robertson, J.S. y col., J. Gen. Virology
74 (1.993) 2.047-2.051). Por lo tanto, la
replicación de virus en cultivos celulares es también de preferencia
frente a aquella en huevos en relación a este aspecto, para obtener
vacunas efectivas. Es sabido que los virus de influenza pueden ser
replicados en cultivos celulares. Frente a las células embrionadas
de gallina y células de hámster (BHK21-F y HKCC),
se ha descrito que las células MDBK, y en particular MDCK son
apropiadas para la replicación in vitro de virus de la
influenza (Kilbourne, E. D., en: Influenza, páginas
89-110, Plenum Medical Book Company - New York and
London, 1.987). Un requisito previo para una infección exitosa es
el agregado de proteasas al medio de infección, de preferencia
tripsina o serino proteasas similares, ya que estas proteasas
fraccionan extracelularmente al precursor de hemaglutinina
[HA_{0}] dando lugar a hemaglutinina activa [HA_{1} y
HA_{2}]. Solamente la hemaglutinina fraccionada lleva a la
adsorción de los virus de influenza en las células con la
subsecuente asimilación del virus dentro de la célula (Tobita, K. y
col., Med. Microbiol. Immunol., 162 (1.975), 9-14;
Lazarowitz, S.G. & Choppin, P.W., Virology, 68 (1.975)
426-439) y de este modo a un posterior ciclo de
replicación del virus en el cultivo celular.
La patente US 4.500.513 describe la replicación
de virus de influenza en cultivos celulares de células de
crecimiento adherente. Después de la proliferación celular, el
medio nutritivo es eliminado y se añade medio nutritivo fresco a
las células, y la infección de las células con virus de influenza
tiene lugar simultáneamente o apenas después. A un tiempo
determinado después de la infección se agrega proteasa (por ejemplo
tripsina) con el objeto de obtener una replicación viral óptima.
Los virus son recolectados, purificados y procesados para obtener
vacunas inactivadas o atenuadas. La replicación de manera económica
del virus de la influenza como un requisito previo para la
producción de vacunas no puede ser cumplida, de cualquier manera,
usando la metodología descrita en la mencionada patente, como el
cambio de medio, la infección subsecuente, así como la adición de
tripsina, la que es llevada a cabo más tarde, requiere que los
recipientes de cultivo celular sean abiertos en varias
oportunidades lo que resulta una tarea muy laboriosa. Además, el
peligro de contaminación del cultivo celular por microorganismos y
virus indeseables aumenta con cada manipulación de los recipientes
de cultivo. Una alternativa más productiva en relación al costo es
la proliferación celular en sistemas fermentadores conocidos por
las personas expertas en la técnica, las células de crecimiento
adherente en microportadores. El suero necesario para el crecimiento
de las células en los microportadores (usualmente suero fetal de
bovino), de cualquier manera, contiene inhibidores de tripsina, de
manera tal que aún con este método de producción es necesario un
cambio del medio por medio libre de suero para lograr el
fraccionamiento de la hemaglutinina de influenza por la tripsina y
de esta manera una replicación de virus adecuadamente alta. De este
modo esta metodología también requiere la apertura de los
recipientes de cultivo varias veces y así trae consigo el peligro
aumentado de contaminación. En la patente US 4.500.513, la
replicación viral se lleva a cabo a 34-37ºC. De
manera similar, Mancini & Yano [Rev. Farm. Bioquím. Univ.
S.Paulo (1.993) 29: 89-95] describen un
procedimiento de cultivo celular para influenza en el que el virus
es replicado a 35ºC. Estos autores usaron células MDCK cultivadas en
un medio Eagle suplementado con suero fetal de bovino y neomicina.
La tripsina fue agregada a las células cultivadas después de la
infección con el virus de influenza.
El objetivo de la presente invención es crear
procedimientos disponibles que hagan posible la replicación del
virus de influenza en cultivo celular simple y económica y que
permita obtener vacunas altamente eficaces.
Este objetivo se logra con la provisión de las
formas de realización indicadas en las reivindicaciones de
patente.
La invención de esta manera, se refiere a un
procedimiento para la replicación de virus de influenza en cultivo
celular, cuyas células, las que pueden ser infectadas por el virus
de influenza son cultivadas en cultivo celular, las células son
infectadas con virus de influenza y luego de la infección cultivadas
a temperatura en el intervalo de 30 a 36ºC para la replicación
viral. Antes o durante la infección con el virus de influenza, se
agrega una proteasa al cultivo celular. Mayores detalles del
tratamiento con proteasa se exponen a continuación.
En una forma de realización de preferencia del
procedimiento de acuerdo a la invención, el cultivo de las células
infectadas para replicación viral se lleva a cabo de 32 a 34ºC y
particularmente de preferencia a 33ºC.
Se ha encontrado sorprendentemente que replicando
los virus de influenza en células infectadas a temperaturas
reducidas, los virus obtenidos tienen una eficacia apreciablemente
mayor como vacuna que aquellos virus que se obtienen por
replicación a 37ºC. La replicación a 37ºC, la temperatura
clásicamente usada para replicación de influenza en cultivo
celular, lleva a rendimientos de virus comparativamente altos en un
tiempo corto. De cualquier manera, los virus producidos de este
modo tienen una eficacia baja como vacuna en comparación con los
virus preparados por el procedimiento de acuerdo a la invención.
Las células que son usadas en el procedimiento de
acuerdo con la invención para la replicación de virus de influenza
pueden en principio ser de cualquier tipo celular deseado que pueda
ser cultivado en cultivo celular y que pueda ser infectado por
virus de influenza. Pueden ser tanto células de crecimiento
adherente o células de crecimiento en suspensión.
En una forma de realización de preferencia, las
células son células de vertebrado, en particular, células de ave y
en este contexto de preferencia células de gallina, por ejemplo,
células embrionadas de gallina (células CEF).
En una posterior forma de realización de
preferencia, las células son células de mamífero, por ejemplo,
hámster, ganado vacuno, mono o células de perro. Se usan de
preferencia células de riñón o líneas celulares derivadas de éstas.
Ejemplos de células de hámster apropiadas son las líneas celulares
con los nombres BHK21-F o HKCC. Las células de mono
posibles son, por ejemplo, células VERO, y las células de ganado
vacuno posibles son las de línea celular MDBK. Un ejemplo de una
línea celular de riñón adecuada es la línea celular MDCK (ATCC CCL34
MDCK (NBL-2)) de riñones de perro. En el contexto
de la presente invención se estableció una línea celular de la
línea celular MDCK de riñón mencionada anteriormente, la que está
adaptada al crecimiento en suspensión en un medio libre de suero y
por ello hace posible un cultivo y una replicación viral
particularmente simples y eficientes. Esta línea celular, MDCK
33016, es usada particularmente de preferencia en el procedimiento
de acuerdo con la invención. Fue depositada bajo el número de
depósito DSM ACC 2219 el 7 de junio de 1.995 de acuerdo a los
requerimientos de la convención de Budapest de reconocimiento de
depósito de microorganismos para los propósitos de patentamiento en
la colección alemana de microorganismos (DSM) en Brunswick
(República Federal Alemana), la que es reconocida como un sitio de
depósito internacional.
Para cultivar las células en el procedimiento con
la invención, pueden ser usados para el cultivo celular los métodos
habituales conocidos por las personas expertas en el tema, en
particular aquellos que ya son conocidos para la replicación de
virus de influenza en cultivos celulares. El llevar a cabo los
procedimientos de acuerdo con la invención usando células que crecen
en suspensión, en particular aquellas que pueden ser cultivadas en
medios libres de suero, hace posible una replicación de virus
particularmente simple y eficiente. El cultivo de células en
suspensión puede ser llevado a cabo en este caso en un
procedimiento en lote o en un sistema de perfusión, por ejemplo en
un recipiente fermentador agitado, usando los sistemas de retención
celular conocidos por la persona experta en la técnica, como por
ejemplo centrifugación, filtración, filtros spin y similares.
El cultivo de las células se lleva a cabo por
regla general a un pH regulado de preferencia en el intervalo desde
pH 6,6 hasta pH 7,8, en particular en el intervalo de pH 6,8 a pH
7,3.
Además, el valor de pO_{2} puede ventajosamente
ser regulado y es luego por regla general entre 25% y 95%, en
particular entre 35% y 60% (basado en la saturación del aire).
La infección de las células cultivadas en
suspensión es llevada a cabo, de preferencia, cuando las células en
el procedimiento de lote han alcanzado una densidad celular de
alrededor de 8 a 25 x 10^{5} células/ml o alrededor de 5 a 20 x
10^{6} células/ml en el sistema de perfusión. Si se usan células
de crecimiento adherente, la densidad celular óptima para la
infección depende de la línea celular en particular.
La infección de las células con virus de
influenza es llevada a cabo de preferencia a m.d.i. (multiplicidad
de infección) de alrededor de 0,0001 a 10, de preferencia de 0,002
a 0,5.
El agregado de una proteasa para lograr dar el
fraccionamiento de la proteína precursora de hemaglutinina
[HA_{0}] y de esta manera permitir la adsorsión de los virus a
las células, puede ser llevado a cabo de acuerdo a la invención
apenas antes o simultáneamente con la infección de las células con
los virus de influenza. Si ese agregado es llevado a cabo
simultáneamente con la infección, la proteasa puede ser agregada
bien directamente al cultivo celular a infectar o, por ejemplo,
como un concentrado junto con el inóculo de virus. Si se usa un
medio conteniendo suero para el cultivo, éste debe ser extraído
antes del agregado de la proteasa. La proteasa es de preferencia
una serino proteasa, y particularmente de preferencia tripsina.
Si se usa tripsina, la concentración final
agregada en el medio de cultivo es ventajosamente 1 a 200
\mug/ml, de preferencia 5 a 50 \mug/ml y particularmente de
preferencia 5 a 30 \mug/ml.
Tras la infección, el cultivo celular infectado
es cultivado para la replicación de los virus, en particular hasta
que puede ser detectada una cantidad máxima o un efecto citopático
máximo de antígeno viral.
En una forma de realización de preferencia del
procedimiento, la recolección y el aislamiento de los virus de
influenza replicados se lleva a cabo 2 a 10 días, de preferencia 3
a 7 días después de la infección. Para hacer esto, por ejemplo, las
células o residuos celulares son separados del medio de cultivo por
métodos conocidos por la persona experta en la técnica, por
ejemplo, con separadores o filtros. Siguiendo a esto se lleva a
cabo la concentración de los virus de influenza presentes en el
medio de cultivo por métodos conocidos por la persona experta en la
técnica, tales como, por ejemplo centrifugación en gradiente,
filtración, precipitación y similares.
La invención además se refiere a virus de
influenza que son obtenibles por un procedimiento con la invención.
Éstos pueden ser formulados por técnicas conocidas para dar una
vacuna para administración a seres humanos o animales. Como ya se
ha explicado con anterioridad, los virus de influenza de éste tipo
tienen una eficacia mayor como vacuna que los virus de influenza
obtenidos por replicación en cultivo celular a 37ºC.
La inmunogenicidad o eficacia de los virus de
influenza obtenidos como vacuna puede ser determinada por métodos
conocidos por personas expertas en la técnica, por ejemplo, por
medio de la protección impartida en el experimento de exposición o
como títulos de anticuerpo de anticuerpos neutralizantes del
virus.
La determinación de la cantidad de virus o
antígenos producido puede llevarse a cabo, por ejemplo, por la
determinación de la cantidad de hemaglutinina por métodos conocidos
por las personas expertas en el tema. Es sabido, por ejemplo, que
la hemaglutinina fraccionada se une a los eritrocitos de varias
especies, por ejemplo a los eritrocitos de gallina. Esto permite
una cuantificación rápida y simple de los virus producidos o de los
anticuerpos formados por métodos apropiados de detección.
Mediante la comparación de experimentos en
modelos animales, se ha demostrado que los virus de influenza de
acuerdo con la invención producen un título de anticuerpos
neutralizantes apreciablemente mayor que los virus replicados a 37ºC
y por ello imparten una protección apreciablemente mejor contra la
infección del virus de influenza. En experimentos con ratones como
un modelo animal, el título de anticuerpos neutralizantes fue, por
ejemplo, mayor por al menos un factor de 42 semanas después de la
vacunación que el título de anticuerpos neutralizantes después de
la inoculación con virus de influenza que habían sido replicados a
37ºC. Cuatro semanas después de la inoculación, el título de
anticuerpos neutralizantes fue mayor por al menos un factor de 17 y
en algunos casos hasta 27 veces mayor. Si se llevaba a cabo una re
vacunación, el título de anticuerpos neutralizantes podía ser mayor
por un factor de más de 60 cuando se usaba virus de influenza de
acuerdo con la invención en comparación con los virus de influenza
que habían sido replicados a 37ºC. En consecuencia, la tasa de
supervivencia de animales en un experimento de exposición usando una
administración de 1.000 DL_{50} (dosis letal 50%) puede
incrementarse de 1/10 a hasta al menos 8/10, de preferencia de 9/10
y particularmente de preferencia a 10/10 (100%).
La invención se refiere además a vacunas que
contienen virus de influenza obtenible por el procedimiento de
acuerdo con la invención. Las vacunas de este tipo pueden contener
opcionalmente los aditivos usuales para vacunas, en particular
sustancias que incrementan la respuesta inmune, por ejemplo, los
llamados adyuvantes, por ej. hidróxidos de varios metales,
constituyentes de paredes celulares bacterianas, aceites o
saponinas, y además los excipientes farmacéuticamente tolerables
usuales.
Los virus pueden estar presentes en las vacunas
como partículas virales intactas, en particular como virus vivo
atenuado. Para este propósito, los concentrados virales son
ajustados al título deseado y liofilizados o estabilizados en forma
líquida.
En otra forma de realización de preferencia, las
vacunas de acuerdo con la invención pueden contener virus
desintegrados, es decir inactivados, o virus intactos pero
inactivados. Para este propósito, la infectividad del virus es
destruida por medio de métodos químicos o físicos (por ej. con
detergentes o formaldehído). La vacuna es luego ajustada a la
cantidad deseada de antígeno y después de la posible mezcla con
adyuvantes o después de la formulación de la vacuna, dispensada,
por ej. como liposomas, microesferas o formulaciones de liberación
lenta.
En otra forma de realización de preferencia, las
vacunas de acuerdo con la invención pueden finalmente presentarse
como vacunas de subunidad, por ej. puede contener constituyentes
virales definidos, aislados, de preferencia proteínas aisladas del
virus de influenza. Estos constituyentes pueden ser aislados de los
virus de influenza por métodos conocidos por la persona experta en
la técnica.
La diferencia en la mayor antigenicidad de los
virus de influenza preparados de acuerdo con la invención, los que
son preparados a temperaturas más bajas, puede ser usada para fines
diagnósticos. Por ello la presente invención también se refiere a
composiciones para diagnóstico que contienen virus de influenza de
acuerdo con la invención o constituyentes de tales virus, si es
apropiado, en combinación con aditivos usuales en este campo y
apropiados agentes para la detección.
Los ejemplos ilustran la invención
Se replicaron células MDCK (ATCC CCL 34) en
botellas de cultivo (Eagle's MEM [EMEM] usando FCS 2%, incubación a
37ºC durante 4 días). La monocapa celular resultante fue extraída
de la pared del recipiente usando una solución de tripsina, las
células fueron aisladas y el concentrado celular resuspendido en un
medio conteniendo suero. Las células fueron inoculadas en botellas
rotatorias de 200 ml (botellas roller) a una densidad celular de 5
x 10^{5} células/ml e incubadas a 37ºC a 4 rpm. Luego de 2 días,
las células fueron infectadas con virus de influenza. Para hacer
esto, se descartó el medio sobrenadante de monocapa celular y se lo
reemplazó por EMEM libre de suero. Se agregó al medio el virus de
influenza A/PR/8/34 con una m.d.i. (multiplicidad de infección) de
0,1 y tripsina en una concentración final de 25 \mug/ml. Se
incubaron en cada caso dos botellas roller, a 37ºC o a 33ºC. La
replicación viral fue determinada como cantidad de antígeno (medido
como unidades de hemaglutinina) y como infectividad (medida con la
prueba CC DI_{50}) y es mostrada en la Tabla 1.
Las razones indicadas significan que una dilución
1:X del virus obtenido aún tiene propiedades hemaglutinantes. Las
propiedades hemaglutinantes pueden ser determinadas, por ej., como
se describe en Mayer y col., Virologische Arbeitsmethoden, Volumen
1 (1.974), páginas 260-261 o en Grist, Diagnostic
Methods en Clinical Virology, páginas 72-75.
La determinación del valor de CC DI50 puede
llevarse a cabo, por ej., de acuerdo con el método que es descrito
en Paul, Zell- und Gewebekultur [Cultivo celular y tisular]
(1.980), pág. 395.
Se seleccionó una línea celular, la cual es
adecuada para el crecimiento en suspensión y que puede ser
infectada por virus de influenza, partiendo de células MDCK (ATCC
CCL34 MDCK NBL-2), las que han sido proliferadas por
medio de unos pocos pasajes o a través de varios meses en el
laboratorio. Esta selección se llevó a cabo por proliferación de
las células en botellas roller, las que fueron rotadas a 16 rpm (en
lugar de alrededor de 3 rpm como es habitual para botellas en las
que se cultivan células en crecimiento adherente). Luego de varios
pasajes de las células en suspensión en el medio, se obtuvieron las
cepas celulares de crecimiento en suspensión. Estas cepas celulares
fueron infectadas con virus de influenza y se seleccionaron las
cepas que produjeron un mayor rendimiento de virus. Se alcanzó un
incremento en la tasa de células de crecimiento en suspensión
durante los primeros pasajes a 16 rpm a través de 1 a 3 pasajes por
la adición de sistemas de selección conocidos por la persona
experta en la técnica, tales como hipoxantina, aminopterina y
timidina, o alanosina y adenina, individualmente o en combinación.
La selección de células de crecimiento en suspensión también es
posible en otros sistemas de cultivo celular con agitación
conocidos por la persona experta en la técnica, tal como frascos en
agitación. Un ejemplo de células que están adaptadas a crecimiento
en suspensión y pueden ser infectadas por virus de influenza es la
línea celular MDCK 33016 (DSM ACC2219).
La línea celular MDCK 33016 (DSM ACC2219) con
crecimiento en suspensión fue replicada a 37ºC en medio Iscove con
una tasa de división de 1:8 a 1:12 dos veces a la semana en una
botella rotatoria con rotación a 16 rpm 4 días después de la
transferencia, se obtuvo un recuento celular de aproximadamente 7,0
x 10^{5} células/ml. Simultáneamente con la infección del cultivo
celular, el cual ahora lleva 4 días de cultivo, con la cepa del
virus de influenza A/PR/8/34 (m.d.i. = 0,1), el cultivo celular fue
tratado con tripsina (concentración final 25 \mug/ml), incubado a
37ºC o a 33ºC y la replicación viral fue determinada a lo largo de
3 días (tabla II).
| Contenido de HA luego de los días después de la infección (ddi) | |||
| 1 ddi | 2 ddi | 3 ddi | |
| 37ºC | 1:64 | 1:512 | 1:1.024 |
| 33ºC | 1:16 | 1:128 | 1:1.024 |
La línea celular MDCK 33016 (DSM ACC2219) fue
proliferada a 33ºC en medio Iscove con una tasa de división de 1:8
a 1:12 dos veces a la semana en una botella rotatoria con rotación
a 16 rpm 4 días después de la transferencia, se obtuvo un recuento
celular de aproximadamente 7,0 x 10^{5} a 10 x 10^{5}
células/ml. Simultáneamente con la infección del cultivo celular.
Simultáneamente con la infección del cultivo celular, el cual ahora
lleva 4 días de cultivo, con varias cepas de influenza (m.d.i.
\cong 0,1) el cultivo celular fue tratado con tripsina
(concentración final 25 \mug/ml), incubado a 33ºC, y la
replicación viral fue determinada en el 5º día después de la
infección (Tabla III).
| Contenido de HA 5 días | |
| después de la infección | |
| Cepa de Influenza | |
| A/Singapore | 1: 1.024 |
| A/Sichuan | 1: 256 |
| A/Shanghai | 1: 256 |
| A/Guizhou | 1: 128 |
| A/Beijing | 1: 512 |
| B/Beijing | 1: 256 |
| B/Yamagata | 1: 512 |
| Contenido de HA 5 días | |
| después de la infección | |
| Cepa de Influenza | |
| A/PR/8/34 | 1: 1.024 |
| A/Equi 1/Prague | 1: 512 |
| A/Equi 2/Miami | 1: 256 |
| A/Equi 2/Fontainebleau | 1: 128 |
| A/Swine/Ghent | 1: 512 |
| A/Swine/Iowa | 1: 1.024 |
| A/Swine/Arnsberg | 1: 512 |
Tras la inoculación en ratones, los virus de
influenza patogénicos para el ser humano usualmente no conducen a
procesos patológicos con su infección, de manera que los
experimentos de protección con ratones son muy difíciles de
construir experimentalmente. La cepa de virus de influenza
A/PR/8/34, de cualquier manera, está adaptada a ratones y luego de
la administración intranasal causa mortalidad dosis dependiente en
ratones.
Se preparó una vacuna experimental del virus de
influenza A/PR/8/34 del Ejemplo 3 (A/PR/8 replicado a 37ºC o 33ºC).
Los virus de influenza en medio de cultivo celular fueron separados
de las células y los fragmentos celulares por centrifugación a baja
velocidad (2.000 g, 20 minutos, 4ºC) y purificados con una
centrifugación en gradiente de sucrosa (10 a 50%) (peso/peso) de
gradiente de sucrosa lineal, 30.000 g, 2 hs, 4ºC). Se obtuvo la
capa que contiene al virus de influenza, se diluyó 1:10 con
solución tampón fosfato (PBS) a pH 7,2, y se sedimentó a 20.000
rpm, y el precipitado fue resuspendido en PBS (volumen: 50% del
medio de cultivo celular original). Los virus de influenza fueron
inactivados con formaldehído (se adicionó dos veces solución de
formaldehído al 0,025% de una solución al 35% en un intervalo de 24
hs, incubación a 20ºC con agitación).
Se inocularon 10 ratones NMRI, cada uno con un
peso entre 18 y 20 g, con 0,3 ml de cada una de las vacunas
experimentales inactivadas en el día 0 y el día 28 por inyección
subcutánea. Se extrajo sangre de los animales para determinar el
título de los anticuerpos neutralizantes contra A/PR/8/34 2 y 4
semanas después de la inoculación y también 1 y 2 semanas después
de la revacunación. Para determinar la tasa de protección, los
ratones fueron expuestos dos semanas después de la revacunación (6
semanas después del inicio del experimento) por administración
intranasal de 1.000 DL_{50} (dosis letal 50%). Los resultados del
experimento se muestran en la Tabla IV.
* Semanas después de la vacunación (s dvac) y
semanas después de la revacunación (s drevac).
Los experimentos confirman que los virus de
influenza que han sido replicados a 37ºC en cultivo celular con un
rendimiento de antígeno alto (título HA) sólo indujeron a bajos
títulos de anticuerpos neutralizantes en el ratón y apenas
proporcionaron protección, mientras que los virus de influenza que
han sido replicados a 33ºC en cultivo celular también con un
rendimiento alto de antígeno (título HA) indujeron muy altos
títulos de anticuerpos neutralizantes en el ratón y brindaron una
protección muy buena.
La línea celular MDCK (ATCC CL34) fue replicada a
33ºC en botellas de cultivo celular en medio MEM de Eagle (EMEM)
con FCS 2% con una tasa de división de 1:8 a 1:12 dos veces a la
semana. El resultado 4 días después de la transformación fue una
densa capa celular. Luego de cambiar el medio por un EMEM libre de
suero, el cultivo celular fue infectado con influenza B/Beijing
(m.d.i. = 0,1), se agregó tripsina al medio en una concentración
final de 25 \mug/ml y las botellas con el cultivo celular
infectado fueron incubadas, bien a 37ºC o a 33ºC. El contenido de
HA, 4 días después de la infección, fue en ambos lotes
experimentales de 256 unidades HA. Después de una centrifugación a
baja velocidad para remover células/residuos celulares, los virus
en el sobrenadante fueron inactivados con formaldehído (se adicionó
dos veces solución de formaldehído al 0,025% de una solución al 35%
en un intervalo de 24 hs, incubación a 20ºC con agitación). En cada
sección experimental, el adyuvante agregado fue hidróxido de
aluminio (concentración final 10%, de una solución al 2% de
Al(OH)_{3}). Usando estas vacunas experimentales, en
cada caso por cada sección experimental, 3 cobayos fueron vacunados
por vía intraplantar con 0,2 ml y se los revacunó 4 semanas después
con la misma vacuna. Para investigar la eficacia de la vacuna, se
tomaron muestras de sangre 2, 4 y 6 semanas después de la
inoculación y se realizó la prueba de inhibición de hemaglutinación
y la prueba de neutralización de suero (cfr. Tabla V).
* s dvac = semanas después de la inoculación (6 s
dvac = 2 semanas después de la revacunación).
Claims (23)
1. Un procedimiento para la replicación de virus
de influenza en cultivo celular, en el que las células que puedan
ser infectadas por los virus de influenza son cultivadas en cultivo
celular, las células son infectadas con virus de influenza y luego
de la infección son cultivadas a una temperatura en el intervalo de
30ºC a 36ºC para la replicación viral, caracterizado porque
se agrega una proteasa a las células cultivadas antes o durante la
infección con los virus de influenza.
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en
el que las células son cultivadas con virus de influenza a una
temperatura en el intervalo de 32ºC a 34ºC después de la infección
para la replicación viral.
3. El procedimiento según la reivindicación 2, en
el que las células son cultivadas con virus de influenza a 33ºC
después de la infección para la replicación viral.
4. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que las células son células de
vertebrado.
5. El procedimiento según la reivindicación 4, en
el que las células de vertebrado son células de ave.
6. El procedimiento según la reivindicación 5, en
el que las células de ave son células embrionadas de gallina.
7. El procedimiento según la reivindicación 4, en
el que las células de vertebrado son células de mamífero.
8. El procedimiento según la reivindicación 7, en
el que las células de mamífero son células de hámster, bovino, mono
o perro.
9. El procedimiento según la reivindicación 8, en
el que las células de mamífero son células BHK21-F,
células HKCC, células VERO, o células MDCK.
10. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que las células que pueden ser
infectadas por virus de influenza crecen de manera adherente o en
suspensión.
11. El procedimiento según la reivindicación 10,
en el que las células son cultivadas en un medio libre de
suero.
12. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que la proteasa es una serino
proteasa.
13. El procedimiento según la reivindicación 12,
en el que la serino proteasa es tripsina.
14. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que la recolección y el aislamiento
de los virus de influenza tiene lugar 2 a 10 días después de la
infección.
15. El procedimiento según la reivindicación 14,
en el que la recolección y el aislamiento de los virus de influenza
tiene lugar 2 a 7 días después de la infección.
16. Un virus de influenza obtenible por un
procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
15.
17. Una vacuna que contiene virus de influenza
según la reivindicación 16.
18. Una vacuna según la reivindicación 17, en
combinación con sustancias que incrementen la respuesta inmune.
19. Una vacuna según la reivindicación 17 o la
reivindicación 18, en la que el virus de influenza esté presente
como partículas virales intactas, como virus atenuado o como
partículas virales desintegradas.
20. Una vacuna que contiene constituyentes de un
virus de influenza según la reivindicación 16.
21. Una vacuna según la reivindicación 20, en
combinación con sustancias que incrementen la respuesta inmune.
22. Una vacuna según la reivindicación 20 o la
reivindicación 21, que contiene proteínas aisladas del virus de
influenza.
23. Una composición diagnóstica, que contiene
virus de influenza según la reivindicación 16 o constituyentes de
dichos virus de influenza.
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