AT398899B - Unter verwendung von eigenblut hergestellte aufbereitung für die diagnose und/oder gewinnung von vakzinen für eine immuntherapie - Google Patents

Description

AT 398 899 B

Die Erfindung betrifft eine unter Verwendung von Eigenblut hergestellte Aufbereitung für die Diagnose und/oder Gewinnung von Vakzinen für eine Immuntherapie, aus der Aufbereitung hergestellte Vakzine selbst, ein Verfahren zur Herstellung spezieller Vakzine und schließlich die Verwendung dieser Vakzine als Immunogen. 5 Es ist bekannt, daß sich aus der Untersuchung von Blutproben und gegebenenfalls unter verschiedener Aufbereitung der Blutproben viele Rückschlüsse auf das Allgemeinbefinden und den Verlauf von Erkrankungen von Patienten ziehen lassen. Ferner ist es bekannt, Eigenblut unmittelbar oder nach verschiedenen, meist nach homöopathischen Grundsätzen erfolgenden Aufbereitungen in der Therapie spezifischer Erkrankungen einzusetzen. io Für eine Immuntherapie bei der Nachbehandlung von Tumorerkrankungen, sind Vakzine bekannt, die in einem flüssigen Träger aus menschlichen Tumorzellen gewonnene, insbesondere wenigstens zum Teil einer Behandlung mit Neuraminidase unterzogene Zeilpräparate enthalten. Für diese Zellpräparate werden von beliebigen Fremdspendern stammende Tumorgewebsarten verwendet, die bestimmte Antigene tragen, wobei Zellkulturen angelegt, aufgearbeitet und mit einem Zytostatikum inaktiviert sowie schließlich lyophili-15 siert werden, um auf diese Weise Zellwandpräparate zu erhalten, die Antigene tragen.

Bei der Anlegung von Kulturen von Krankheitserregern und Mikroparasiten, die von einem bestimmten Patienten stammen, werden bisher im wesentlichen ausschließlich von fremden Quellen stammende Nährlösungen verwendet, wobei, unter anderem, aseptisch gewonnene, embrionale Proteinextrakte z. B. zellfreie, aus Gehirn, Herz, Lunge, Muskel, Leber, Haut von Tierembryos gewonnene Proteinextrakte 20 eingesetzt werden. Solche Kulturen erleichtern die Diagnose. Es wurde auch schon vorgeschlagen, ähnliche Kulturen, die ebenfalls artfremde Proteinextrakte als Nährlösung enthalten, für die Züchtung spezifischer Krankheitserreger zu verwenden und dann die Krankheitserreger nach bekannten Verfahren z. B. durch Erhitzung zu inaktivieren, um sie als Immunogen verwenden zu können. Eine Vielzahl bekannter Impfverfahren, insbesondere gegen Viruserkrankungen, beruht auf der Herstellung entsprechender Vorkulturen. Nach-25 teilig ist hier immer, daß das art- bzw. individuenfremde Eiweiß bei der Verwendung als Impfvakzine zu unerwünschten Allergiereaktionen seitens des Patienten führen kann.

Bei der mikroskopischen Untersuchung von Nativblut fallen, insbesondere bei bestimmten Erkrankungen, und praktisch immer bei Präkanzeröse und Kanzerose lebhaft bewegliche Formen auf, die normalerweise hämatologisch nicht beachtet werden. Es handelt sich hier um annähernd kugelige, stark bewegliche 30 Gebilde, welche bei der Phasenkonstrastuntersuchung optisch als im Zentrum aufgehellte Ringe erscheinen. Für die Betrachtung von Kleinstformen dieser Gebilde eignet sich besonders die Dunkelfeld-Blutunter-suchung. Die Größe dieser Gebilde reicht von der Grenze des Sichtbaren bis zu etwa 1/3 jener von Erythrocyten. Übliche Blutfärbemethoden reihen diese Formen als große Randkömchen der Erythrocyten oder als freie Howell-Jolly-Körperchen (rundliche Reste des verschwindenden Zellkernes im Protoplasma 35 der Erythrocyten) ein. Das obligate Auftreten dieser Formen in Tumorpräparaten wird durch das Procedere der Färbung (Fixierung und Abpülen) verhindert. Diese Formen können wachsen, sprossen, sich vermehren und sind bei geeigneter Präparation auch innerhalb der Erythrocyten zu sehen, wo sie solitär, paarig und in Gruppen auftreten und angenommen werden kann, daß sie das Zytoplasma der Erythrocyten fermentativ verbrauchen, wodurch dieses vakuolisiert wird. Auch unter Heranziehung dieser Beobachtungen kann 40 angenommen werden, daß das gesunde, insbesondere jedoch das vom kranken Patienten stammende Blut symbiontische bzw. parasitäre Mikroorganismen mit wahrscheinlich mykotischer Natur enthält. Bereits Enderlein hat auf die Phänomene des obligaten Blutparasitismus hingewiesen. Mit steigender Alkalität des Blutes und sinkender Abwehr des Organismus ist immer eine zunehmende Virulenz sowie ein Überwiegen des zellulären Befalles gegenüber dem Serum festzustellen. Die beschriebenen Mikroorganismen werden 45 auch innerhalb der weißen Blutkörperchen, vor allem auch innerhalb der Makrophagen, gesehen. Da diese Mikroorganismen auch innerhalb der Zellorganellen vital bleiben, scheint es, daß sie sich von der körpereigenen Abwehr verborgen vermehren können. Von den einzelnen Wissenschaftlern werden die erwähnten Mikroorganismen verschieden bezeichnet. So spricht Enderlein von Endobionten, v. Bremer von Syphonosporen, Gerlach von Mikromyceten, Scheller von Viromyceten, Körnchen und Ringen usw. Die so Beobachtung, daß Leukämie der Mäuse durch zellfreie Übertragung übertragbar sind, hat schon Versuche ausgelöst im Blut oder Knochenmark zytopathogene Organismen nachzuweisen.

Pekar spricht in diesem Zusammenhang von "Onko-Mykoplasmen", welche bei induzierender Milieuänderung, z. B.seelischer oder körperlicher Überbelastung starke äußere Reize, insbesondere Strahlung usw. aus Symbionten entstehend, zusammen mit chronischen Reizen, an der Bildung von Tumoren mitbeteiligt 55 sein könnten.

Luc Montagnier berichtete auf dem 8. Virologiekongress in Berlin 1990, daß die üblicherweise auf der Zelloberfläche parasitierenden Mykoplasmen in die Zelle eindringen können, wenn eine systemische Mykopiasmose besteht. 2

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Ausgehend von den zuletzt angeführten Überlegungen ist es die Hauptaufgabe der Erfindung eine unter Verwendung von Eigenblut hergestellte Aufbereitung anzugeben, die für die Diagnose und/oder Gewinnung von Vakzinen für eine Immuntherapie geeignet ist.

Die gestellte Aufgabe wird prinzipiell dadurch gelöst, daß die wie an sich bekannt aus einer Kultur von Mikroorganismen in einem Nährmedium bestehende als ein homologes Nährmedium aus dem Eigenblut des Patienten gewonnenes Serum enthält, das mit vom jeweiligen Patienten stammenden, körpereigenen, polymorphen Mikroorganismen versetzt ist, welche durch Aufbereitung von Eigenbiut oder von vom Patienten stammenden Gewebepräparaten in einem flüssigen Medium und z. B. durch nachfolgende Filtrierung frei von vollständigen Körperzeilen gewonnen wurden.

Eine Grundüberlegung der Erfindung besteht darin, daß eine auf dem Vergleich und der Untersuchung verschiedener Kulturen beruhende Diagnose nur dann eine ausreichend genaue Aussagekraft hat, wenn nicht nur die verschiedenen Aufbereitungen unter gleichen Bedingungen hergestellt und untersucht werden, sondern grundsätzlich auch verhindert wird, daß fremde Mikroorganismen in die Kulturen eingeschleppt werden. Gerade bei den möglichen Kleinstformen der beschriebenen Gebilde ist nicht auszuschiießen bzw. besteht sogar eine relativ große Wahrscheinlichkeit, daß bei Verwendung von Nährlösungen aus fremden, z.B. von Embryos gewonnenen Proteinextrakten Mikroparasiten mit diesen Extrakten in die Kultur eingeschleppt werden und daß auch die vom jeweiligen Patienten gewonnenen Mikroparasiten in der teilweise artfremden Nährlösung eine unspezifische Entwicklung nehmen. Diese Möglichkeiten werden durch Verwendung des aus dem Eigenblut gewonnenen Serums als Nährlösung ausgeschaltet. Bei der Weiterverarbeitung der Aufbereitung zu Vakzinen für eine Immuntherapie sind, eben wegen der Verwendung einer körpereigenen Nährlösung, keine Aliergiereaktionen zu erwarten.

Bei aufgetretenen Tumorerkrankungen ist es möglich, vom Patienten stammende, spezifische Tumor-Gewebepräparate für die Versetzung des Serums zur Züchtung der polymorphen Mikroorganismen zu verwenden. In den meisten Fällen wird man jedoch vorsehen, daß die körpereigenen Mikroparasiten aus einem Eigenbluthämolysat gewonnen werden, wobei nicht nur wegen der einfacheren Herstellung, sondern auch aus grundsätzlichen Überlegungen vorzugsweise Serum und Hämolysat von ein und derselben Blutprobe gewonnen werden.

In der Diagnose können spezifische Erkenntnisse über ein Krankheitsbild oder einen Krankheitsverlauf bzw. das Allgemeinbefinden des Patienten dadurch gewonnen werden, daß Proben der in ihren Grundsätzen beschriebenen Aufbereitung nach vorgegebenen Inkubationszeiten der Kultur serologischen, gentechnologischen und/oder elektronenmikroskoplschen Untersuchungen unterzogen werden, wobei vorzugsweise auch verschiedene Entwicklungsphasen der Kultur Berücksichtigung finden.

Eine aus einer Aufbereitung der obigen Art hergestellte Vakzine enthält die aus der Kultur gewonnenen körpereigenen Mikroparasiten in inaktivierter Form.

Unter Heranziehung der oben dargelegten grundsätzlichen Überlegungen und Bedingungen können verschiedene, an sich wenigstens zum Teil bekannte Verfahren für die Herstellung der Aufbereitung und der Vakzine eingesetzt werden. Ein einfaches, erfindungsgemäßes Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß von einer entnommenen Blutprobe ein Teil mit Aqua ad injectionem gemischt, z. B. durch Schütteln zu einem Hämolysat aufbereitet, das Hämolysat im Brutschrank (z. B. bei 37· C) inkubiert, nach einer vorgegebenen Inkubationszeit (z. B. nach drei Tagen) zentrifugiert, filtriert und in aus dem Rest der Blutprobe gewonnenes Serum eingebracht und weiter inkubiert wird, daß nach einer neuerlich vorgegebenen Inkubationszeit der Überstand der Kultur verworfen, der Bodensatz mit physiologischer Kochsalzlösung aufgefüllt und die Suspension zur Inaktivierung der in ihr enthaltenen Mikroorganismen z. B. auf 70* C erhitzt wird, wonach diese Suspension in entsprechender Verdünnung zu Vakzinen zur Verabreichung an den Patienten weiter verarbeitet wird.

Damit möglichst alle Formen der vorhandenen Mikroparasiten weiter gezüchtet werden, kann man vorsehen, daß ein Teil der Hämolysat-Serum-Mischung unter aeroben und ein weiterer Teil der Mischung, z. B. durch Überschichten mit Paraffinöl unter anaeroben Bedingungen inkubiert wird und daß anschließend diese beiden Teiimischungen zusammengeführt und gemeinsam weiter verarbeitet werden.

Aus der Suspension können Vakzine in entsprechender Verdünnung sowohl für die enterale als auch parenterale Applikation hergestellt werden.

Eine bevorzugte Verwendung finden die Vakzine in parenteraler und/oder enteraler wiederholter Applikation als Immunogen, insbesondere zur Unterstützung der Therapie bei Tumorerkrankungen und Auto-Aggressionskrankheiten.

Weitere Einzelheiten und Vorteile des Erfindungsgegenstandes entnimmt man der nachfolgenden Beschreibung eines Ausführungsbeispieles:

Von einem nüchternen Patienten wurden 10 cm3 Blut aus der Vene abgenommen. 2 cm3 davon werden mit 4 cm3 Aqua ad injectionem gemischt und gut geschüttelt, so daß Hämolyse (Platzen der Blutzellen) auftritt. 3

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Das so gewonnene Hämolysat wird drei Tage bei 37* C im Brutschrank inkubiert.

Die restlichen 8 cm3 Blut werden zur Gewinnung von Serum verwendet. 2 ml dieses Serums wird in Fläschchen abgefüllt und ebenfalls inkubiert.

Nach drei Tagen wird das Hämolysat zentrifugiert, durch ein Filter mit der Porengröße <0,3 Nanometer 5 steril filtriert und nach mikroskopischer Kontrolle, um das Vorhandensein von Zellen sicher ausschließen zu können, werden 2 ml des filtrierten Hämolysates in das Serum als homologes Nährmedium eingebracht.

Das Hämolysat erscheint bei der mikroskopischen Nachkontrolle im Phasenkontrastverfahren zellfrei, zeigt aber bei der Betrachtung mittels Dunkelfeld-Technik ein ganz anderes Bild. Es zeigen sich in großer Anzahl virusähnliche Kleinstformen an der Grenze der mikroskopischen Sichtbarkeit. Dabei handelt es sich 70 offensichtlich um Vorstufen von sich später in der Kultur entwickelnden mykoplasmaähnlichen Wuchsformen.

Die erwähnte Mischung aus 2 cm3 Serum und 2 cm3 Hämolysat bleibt für drei Tage im Brutschrank, wobei ein Teil dieser Kultur mit sterilem Paraffinöl überschichtet wird, um auch Formen zu züchten, die nur im anaeroben Milieu gedeihen. Schon nach wenigen Stunden wachsen jene schon besprochenen Mikroor-15 ganismen, die im Phasenkontrastverfahren als mykoplasmaähnliche Körper, also eindeutig als Erreger zu erkennen sind, die aus der Blutaufbereitung entstanden sind.

Gewöhnlich befindet sich die Kultur nach Ablauf von drei Tagen auf dem Höhepunkt der Entwicklung. Es werden dann die aerobe und die anaerobe Kultur zusammengeführt, der Oberstand verworfen und der Bodensatz mit 5 cm3 physiologischer Kochsalzlösung aufgefüllt. Es ist auch möglich, die beschriebene 20 Kultur durch Überimpfen des Bodensatzes in frische wieder aus dem Serum erzeugte Nährlösung ein- oder mehrmals zu wiederholen, wobei auch hier aerobe und anaerobe Bedingungen eingehalten werden. Die schließlich erhaltene Suspension des Bodensatzes in physiologischer Kochsalzlösung wird für die Verwendung als spezifisches Immunogen (hinsichtlich der mykoplasmaähnlichen Körper) und als unspezifisches Immunogen (hinsichtlich der veränderten Zytoplasmafraktion) zwei Stunden lang bei 70° C inaktiviert. 25 Schließlich werden aus dieser Suspension sechs Verdünnungsstufen für die parenterale Applikation und nach den Regeln der Homöopathie sieben Potenzierungen für die enterale Verabreichung hergestellt.

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2. 2. Aufbereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die körpereigenen Mikroparasiten aus einem Eigenbluthämolysat gewonnen werden.
3. 3. Aufbereitung nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Serum und Hämolysat von ein und derselben Blutprobe gewonnen werden.
4. 4. Verwendung einer Aufbereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für die Diagnose, wobei die Kultur nach vorgegebenen Inkubationszeiten serologischen Untersuchungen unterzogen wird.
5. 5. Verwendung einer Aufbereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für die Diagnose, wobei die Kultur nach vorgegebenen Inkubationszeiten gentechnologischen Untersuchungen unterzogen wird.
6. 6. Verwendung einer Aufbereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für die Diagnose, wobei die Kultur nach vorgegebenen Inkubationszeiten elektronenmikroskopischen Untersuchungen unterzogen wird.
7. 7. Aus einer Aufbereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 hergestellte Vakzine, dadurch gekennzeichnet, daß sie die aus der Kultur gewonnenen körpereigenen Mikroparasiten in inaktivierter Form enthält.
8. 8. Verfahren zur Herstellung einer Aufbereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und einer Vakzine nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß von einer entnommenen Blutprobe ein Teil mit Aqua ad injectionem gemischt, z. B. durch Schütteln zu einem Hämolysat aufbereitet, das Hämolysat im Brutschrank (z. B. bei 37· C) inkubiert, nach einer vorgegebenen Inkubationszeit (z. B. nach drei Tagen) zentrifugiert, filtriert und in aus dem Rest der Blutprobe gewonnenes Serum eingebracht und weiter inkubiert wird, daß nach einer neuerlich vorgegebenen Inkubationszeit der Überstand der Kultur verworfen, der Bodensatz mit physiologischer Kochsalzlösung aufgefüllt und die Suspension zur Inaktivierung der in ihr enthaltenen Mikroorganismen z. B. auf 70' C erhitzt wird, wonach diese Suspension in entsprechender Verdünnung zu Vakzinen zur Verabreichung an den Patienten weiter verarbeitet wird.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil der Hämolysat-Serum-Mischung unter aeroben und ein weiterer Teil der Mischung z. B. unter Überschichtung mit Paraffinöl unter anaeroben Bedingungen inkubiert wird und daß anschließend diese beiden Teilmischungen zusammengeführt und gemeinsam weiter verarbeitet werden.
10. 10. Verfahren nach den Ansprüchen 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß aus der Suspension Vakzinen in entsprechender Verdünnung sowohl für die enteraie als auch parenterale Applikation hergestellt werden. 5