Verfahren zur Herstellung eines adrenocorticotropen Präparates Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines adrenoeorti- eotropen Präparates, das sich für intramusku- hire oder subkutane Injektionen eignet und eine gesteigerte adrenocorticotrope Wirkung zehn.
Das adrenoeorticotrope Hormon (ACTH) ist eine Substanz, die vom Hy pophysenvorder- lappen abgesondert wird und wahrscheinlich d reli die Blutbahn im tierischen Organismus zur Neberniiere gebracht wird, wo sie einen Einfluss auf die Entwicklung, das Wachstum rind die Wirksamkeit der Nebennierenrinde ausübt.
In den letzten Jahren haben sieh das adrenocorticotrope Hormon enthaltende Ex trakte, die aus den IIypophy sen von Tieren, wie Sehweinen, Schafen und Rindern, gewon nen wurden, bei parenteraler Injektion als äusserst wirksam für die Besserung bestimm ter pathologischer Zustände beim Menschen erwiesen, und es kam zu einer gesteigerten Nachfrage nach für die Injizierung in den menschlichen Körper geeignetem Hormon.
Im Hinblick auf die verhältnismässig knappe Belieferung mit tierischen Hypophy sen, aus denen das adrenoeortieotrope Hor nion gewonnen wird, und im Hinblick auf die äusserst geringe Grösse und Gehalt der Hypo physen selbst, ist. es wichtig, Verfahren zu entwickeln, die nicht nur eine hohe Ausbeute an aktiver Substanz aus den verfügbaren Drü sen erleben, sondern auch die Wirksamkeit der aktiven Substanz bis zum grösstmöglichen Ausmass steigern.
Das obige Problem wird in der USA-Pa- tentsehrift Nr. 2669537 von Robert E. Thomp- son beschrieben. Danach wurde gefunden, dass das adrenocortieotrope Hormon bei Anwen dung von Gelatine als Träger bedeutend wirk samer ist als bei Injektion in üblicher wäss riger Lösung. Wie in der genannten Patent schrift gezeigt wird, führt die Verwendung von Gelatine zu einer Verdoppelung und Ver- dreifacbung der adrenoeortieotropen Wirk samkeit.
Es scheint, dass die Verabreichung eines solchen Präparates zu einer plötzlichen, kräftigen Erhöhung der hormonalen Tätigkeit führt, wobei jedoch die Art der Reaktion im wesentlichen die gleiche ist, wie sie durch eine wässrige Lösung des Hormons ausgelöst wird, mit der Ausnahme, dass eine viel geringere Dosis erforderlich ist, um den Patienten in dem betreffenden Zustand zu halten als im Falle der Anwendung wässriger ACTH-Lösun- gen. In Verbindung mit den andern Trägern oder Lösungsmitteln, die üblicherweise für injizierbare Pharmazeutika verwendet wer den, hat sieh diese einzigartige Wirkung,
wie sie die Gelatine auf ACTH hat, nicht gezeigt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist nun ein Verfahren zur Herst.ellinmg eines adrenocorticotropen Präparates, das eine so gar noch grössere Wirksamkeit besitzt als das oben genannte Präparat. Das erfindungs gemäss hergestellte Präparat eignet sich für intramuskuläre und subkutane Injektion.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist da durch gekennzeichnet, dass man adrenocortico- tropes Hormon mit. Oxypolygelatine umsetzt.. Das erfindungsgemäss erhaltene Präparat ist wesentlich wirksamer als analoge, unter Ver wendung anderer Gelatinearten hergestellte Präparate und natürlich noch wirksamer als das Hormon als solches in einer üblichen wäss- rigen Lösung.
Die gesteigerte Wirksamkeit., die von der Umsetzung mit der Oxypolygela- tine herrührte, zeigt sich in einer Verdoppe lung und Verdreifachung der ACTH-Wir- kung gegenüber der mit andern (-T'elatinearten erzielten.
Die oben beschriebene Wirkungssteigerung beruht auf einer Potenzierung, im Gegensatz zu einer nur verzögernden Wirkung, die manchmal durch die Viskosität des Trägers hervorgerufen werden kann. Dies wird durch die Tatsache erhellt, dass das Oxypolygelatine- Adrenocorticotropin - Präparat unmittelbar nach der Injektion eine plötzliche starke Re aktion verursacht, die weit über die Reaktion, die durch eine gleiche Dosis derselben Sub stanz in einer wässrigen Lösung, der keine Oxypolygelatine zugegeben wurde, hinaus geht.
Es zeigt sich, dass während der ersten 24 Stunden nach der Injektion die Re aktion bei einer bestimmten Dosis Oxypoly- gelatine-Adrenocorticotropin ähnlich der bei einer gleichen Dosis Salz-Adrenocorticotro- pin ist, mit Ausnahme davon, da.ss die Reaktion des Oxy7polygelatine-Adrenocortico- tropins zu jedem einzelnen Zeitpunkt immer stärker ist-.
Dieser Effekt. kann nicht einfach auf Grund von Absorptionsverzögerung er klärt werden, sondern man muss annehmen, dass er auf einer besonderen Eigenschaft der Oxypolygelatine beruht, die sich in Verbin dung mit adrenocorticotropem Hormon, nicht. aber bei Anwendung mit einer andern biolo gisch aktiven Substanz entfaltet.
Oxypolygelatine ist eine wohlbekante Sub stanz, die in der Literatur ausführlich be schrieben wurde und auf dem Markt leicht, zu erhalten ist [siehe z. B. Campbell u. a. The Preparation and Properties of a Dlodified iJelatin (Oxypolygelatin)
an Oneotic Substi- tute for Serum Albumin Texas Reports an Biology and Medicine, Bd. 9, Nr. 2, S. 235 bis 280, Sommer 1951]. Im allgemeinen wird Oxy polt' geladne wie folgt hergestellt:
Gela tinemoleküle werden mit einem Kondensa tionsmittel oder einem Kupplungsagens zu grösseren Komplexen verknüpft, und dieses Gelatinepolymer mit hohem Molekulargewicht wird der Oxydation bis zu einem bestimmten Grad unterworfen, wobei das Molekül bis zur genriinsehten Grösse und Konfiguration ab- Creba.ut wird. Eine bevorzugte Methode zur Herstellung von Oxypolygelatine umfasst die Kondensation von Gelatine mit Glyoxal und darauffolgende Oxydation mit Wasserstoff superoxyd.
Man nimmt an, da.ss sieh die Form der Oxy polygelatinemoleküle von der spin- delähnliehen Form der ursprünglichen Gela- tinemoleküle zu einer mehr kug_elähnliehen Form ändert.
Oxypolygelatine ist entwickelt und zuerst verwendet worden zur Vergrösserung des Plasmavolumens, und ihre einzigartige Wir kung bei der Umsetzung mit dem adrenocor- ticotr open Hormon war bis jetzt noch nicht bekannt. Sie wirkt nicht toxisch und erzeugt weder Antigene noch ruft sie Fieber hervor Es wird vorzugsweise eine 35--10 faige wäss- rige Oxypolygelatine verwendet.
Im allgemei nen ist es wünschenswert., dass die Konzentra tion an Oxy Polygelatine in einem Bereich zwi schen 5 und 50 Gewichtsprozent der Injek tionslösung liegt, aber die Wirkung der Oxy- polygelatine auf die. Erhöhung der adreno- cort.icotropen Wirksamkeit hat sich bis zu einem gewissen Grad selbst bei Oxypoly gela- tine-Konzentrationen oben- und unterhalb die ser Grenzen gezeigt.
Das adrenoeortieotrope Hormon ist bis jetzt. noch nicht isoliert. worden, und seine Molekü lstruktur ist. noch nicht endgültig auf geklärt. Man nimmt an, dass es ein Eiweiss ist, und teilweise wird angenommen, dass be stimmte Herstellungsverfahren zu einem Poly- peptid-3folekül führen. Vorzugsweise wird eine ziemlich reine Substanz verwendet.
Man kann das adrenoeorticotrope Hormon in jeder beliebigen Form verwenden, also zum Beispiel in der sogenannten Ganzprotein -Form ( whole protein ) oder der Polypeptidform . Die erhöhte Wirksamkeit, verursacht durch die Umsetzung mit Oxypolygelatine, beruht höchstwahrscheinlich auf einer Verbindungs bildung, deren Eintreten auf Grund der ehe mischen Natur der Komponenten angenommen werden muss.
Durch die Oxydation, der die Gelatine bei der Heisstellung der Oxypolygelatine unter zogen wird, wird das Molekül mit einer grö sseren Anzahl saurer Carboxygruppen ver sehen, die verursachen, dass die Oxypolygela- tine sich mit dem basischen Adrenoeorticotro- pin, vermutlich unter Bildung von amidarti- gen Bindungen, zu einem chemischen Kom plex mit. erhöhter adrenocorticotroper Wirk samkeit verbindet.
Sowohl Untersuehungen der Wirksamkeit wie klinische Versuche an Patienten, die sich eine ACTH-Behandlung unterzogen, zeigen, rlass die Anwendung von Polyoxygelatine eine wesentlich stärkere Reaktion pro Dosis Hor mon hervorruft, als dies bei Anwendung von Salz oder andern Gelatinearten als Träger der Fall ist.
Beispiel <I>1</I> Eine bestimmte Menge Adrenocorticotro- pin wird durch Extraktion mit Eisessig bei 70 C aus mit Aceton entwässerten Hy pophy- senvorderlappen von Schweinen erhalten. Durch Zusatz des halben Volumens Aeeton und einer kleinen Menge NaCl zu der Lösung werden unerwünschte Bestandteile ausgefällt; durch Versetzen der Lösung mit einer gleich lgrossen Menge Äthyläther fällt man ein rohes Adrenoeorticotropin aus.
Der Niederschlag wird zur Reinigung an Oxycellulose adsorbiert und wieder davon eluiert. Das im Eluat be findliche Adrenocorticotropin wird durch ge eignete Behandlung in das Acetat überge führt.
Die so gebildete Lösung wird dann lyophilisiert, um ein trockenes Pulver zu er halten, das mit destilliertem Wasser, das frei von fiebererzeugenden Substanzen ist, wieder aufgelöst wird, steril filtriert, in Ampullen zu 40 USP-Einheiten pro Ampulle abgefüllt, abgekühlt und wieder lyophilisiert. Das Iyo- philisierte Produkt, das von dem Typ ist, der manchmal als Poly-peptidform des Adreno- cor ticotropins bezeichnet wird, wird mit.
einer Lösung, die 37 % Oxypolygelatine und 0,5% Phenol enthält, versetzt.
Die erhaltene Lösung, die Adrenocorticotropin, 37 % Oxypolygela- tine und 0,5 % Phenol enthält, wird der kli- nischen Standard-Prüfung unterzogen, und es zeigt sich, dass sie ungefähr zwei- bis drei mal so wirksam ist wie das urprüngliche Adrenocorticotropin,
das in gewöhnlicher Ge latine verabreicht worden ist.
Die obenerwähnte Oxypolygelatinelösung wurde aus einer Oxypolygelatine-Standard- losung, die auf dem Markt erhältlich ist, her gestellt. Die Standardlösung war durch Kon densation von G elatine mit Glyoxal und dar auffolgender Oxydation mit Wasserstoff- superoxyd hergestellt worden, als 5%ige Oxy- polygelatinelösung in normaler Salzlösung.
Diese wurde für die Verwendung in dem vor liegenden Beispiel so behandelt, dass der nor male Salzgehalt durch Dialyse entfernt, die Lösung durch Vakuumdestillation auf 37 % 0xypolygelatine angereichert, mit Phenol bis zu einer Konzentration von 0,
5% versetzt und steril filtriert wurde. <I>Beispiel 2</I> Lyophilisiertes Adrenocorticotropin, das nach Beispiel 1 hergestellt worden ist, wird mit 16%iger Gelatine versetzt, wobei sieh eine ACTH-Wirksamkeit von 16,5 Einheiten/0,5 ml ergibt.
Die obige Stammlösung wird in zwei gleich grosse Teile geteilt und zur Herstellung der Lösungen A und B wie folgt verwendet: Lösung A wird durch Verdünnen der Stamm lösung auf 0,40 Einheiten/0,5 ml mit 16pro- zentiger Gelatine, die 0,5 % Phenol enthält, hergestellt.
Lösung B wird durch Verdünnen der Stammlösung auf 0,40 Einheiten/0,5 ml mit 37%iger Oxypolygelatine, die 0,5 % Phe- nol enthält, hergestellt.
Lösungen A und B werden darauf nach der Standardmethode (Adrenalin-Ascorbin- säure-Ersclhöpfungstest an hypophysektomier- ten Ratten) untersucht., und es zeigt sieh, dass Lösung B (die Oxypolygelatine enthält) eine Wirksamkeit von etwa 150-200 % der Lösung A (die nur gewöhnliche Gelatine enthält) besitzt.
Lyophilisiertes Adrenocorticotropin, das nach Beispiel 1 hergestellt worden war, wird mit 16%iger Gelatine versetzt, wobei sich eine ACTH-Wirksamkeit von 16,5 Einheiten/0,5 ml ergibt.
Die obige Stammlösung wird in zwei gleieh grosse Teile geteilt und zur Herstellung der Lösung C und D wie folgt verwendet Lösung C wird dureb. Verdünnen der Stammlösung auf 0,120 Einheiten/0,5 ml mit 16%iger Gelatine, die 0,5% Phenol enthält, hergestellt.
Lösung D wird durch Verdünnen der Stammlösung auf 0,120 Einheiten/0,5 ml mit 37 % iger Oxypolygelatine, die 0,5% Phenol enthält, verdünnt.
Die Lösungen C und D werden nach der Standardmethode an hypophysektomierten Ratten), untersucht, und es zeigt sich, dass Lösung D (mit Oxypolygelatine) eine Wirk samkeit von etwa 150-200 0/a der Lösung C (mit nur gewöhnlicher Gelatine) besitzt.
Un- ter Einheit der ACTH-Wirksamkeit wird die Internationale Einheit verstanden. Eine Internationale Einheit ist definiert als Äquivalent zu der Wirksamkeit von 1 mg des Präparates LA-1.-A, untersueht nach der Methode von M. Say er s, U. Say ers und L.<B>A</B>. Woodbury [Errdocrinology, 42,379 (19.18)i.