CH650788A5

CH650788A5 - Verfahren zur herstellung eines injizierbaren chondroitinpolysulfates, hiernach erhaeltliches produkt und dessen verwendung zur herstellung von pharmazeutischen zubereitungen.

Info

Publication number: CH650788A5
Application number: CH2919/82A
Authority: CH
Inventors: Karl Helmut Dr Rer Nat Wolf
Original assignee: Luitpold Werk Chem Pharm
Priority date: 1981-05-11
Filing date: 1982-05-11
Publication date: 1985-08-15
Also published as: JPS57192401A; DK211882A; FI70416B; FR2505185B1; US4524066A; NL186638C; FI821651L; DE3118588C2; IE53633B1; AT387225B; LU84143A1; FI821651A0; SE458118B; DE3118588A1; NO821551L; SE8202947L; AU8357382A; IL65743A; SE8202947D0; FI70416C

Description

Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein nach diesem Verfahren hergestelltes Chondroitinpolysulfat. Es zeichnet sich durch eine akute Toxizität entsprechend einer letalen Dosis bei intravenöser Verabreichung bei der NMRI Maus von > 3500 mg/kg und bei der Wistar Ratte von > 3000 mg/kg, bei Katze und Hund von > 1000 mg/kg aus. Ein bevorzugtes Produkt besitzt eine akute Toxizität entsprechend einer letalen Dosis bei intravenöser Verabreichung bei der NMRI Maus von > 4000 mg/kg und bei der Wistar Ratte von > 3500 mg/kg und bei der Katze von > 1500 mg/kg,

beim Hund von > 1000 mg/kg.

In der Literatur wurden bis jetzt Chondroitinpolysulfate mit einer LDso (Maus i.v.) von nur 1000 mg/kg beschrieben. Das erfindungsgemässe Verfahren erlaubt somit die Herstellung von Chondroitinpolysulfat mit einer wesentlich grösseren therapeutischen Breite.

Insbesondere weist das nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Chondroitinpolysulfat folgende Parameter auf:

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Stickstoff: 1,65 bis 2,00%

Schwefel: 12,5 bis 14,5%

Hexuronsäure: 0,98 bis l,22mMol/g Hexosamin: 0,96 bis 1,24 mMol/g

Schliesslich betrifft die Erfindung die Verwendung des erfin-dungsgemäss hergestellten Chondroitinpolysulfates als Wirkstoff zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen zur Verwendung in der Human- und Veterinärmedizin.

Versuche haben gezeigt, dass beim Menschen Einzeldosierungen zwischen 20 und 250 mg, besonders zwischen 30 und 150 mg pro Individuum in 0,2 bis 2,0 ml, insbesondere 0,2 bis 1,0 ml, therapeutische Wirkung haben und gut vertragen werden. Tägliche Gaben von bis zu 500 mg erweisen sich als therapeutisch vorteilhaft. Die Injektion kann intramuskulär, intraartikulär, subcutan oder intravenös durchgeführt werden, ohne den Arzt speziell nur auf diese Injektionsarten festzulegen. Die Abpackung von therapeutisch anwendbaren Lösungen des Wirkstoffes kann z.B. in Ampullen, Fertigspritzen, Durchstichflaschen, Phiolen für Spritzpistolen und anderen für die Injektion zweckmässigen Primärpackmitteln erfolgen. Weitere Applikationsarten sind die perorale, percu-tane, rectale, sublinguale oder buccale Verabreichung. Die bevorzugte Dosierung entspricht derjenigen bei der Verabreichung durch Injektion.

Das erfindungsgemäss hergestellte Chondroitinpolysulfat eignet sich auch zur Anwendung in der Tiermedizin, bei der die beschriebenen Wirkungen angezeigt sind. Beim Hund beträgt die Dosierung zwischen 0,1 und 5 mg/kg Körpergewicht und Tag, bevorzugt 0,5 bis 1,5 mg/kg, in 0,1 bis 10 ml Volumen, insbesondere in 0,5 bis 1,0 ml. Beim Pferd beispielsweise bewähren sich tägliche Einzelgaben von 100 bis 1000 mg, bevorzugt 150 bis 500 mg in 0,1 bis 20 ml, insbesondere 1 bis 5 ml. Das Chondroitinpolysulfat kann auf dieselbe Weise wie beim Menschen appliziert werden.

Zur Bestimmung des mittleren Molekulargewichts wurde die folgende Methode angewandt:

Man Chromatographien 20 mg Probe in 2 M Kochsalzlösung an einer Biogel PIO Säule (50 g; H = 100 cm, 0 2cm). In den gesammelten 10 ml Fraktionen detektiert man das Chondroitinpolysulfat durch Hexuronsäurebestimmung nach Z. Dische., J. Biol. Chem. 167 (1947), 189, modifiziert von J. D. Gregory, Arch. Biochem. Biophys. 89 (1960), 157. Man eicht mit Chondroitinpolysulfat-Fraktionen, deren Molekulargewicht durch Ultrazentrifugation bestimmt wurde. Das mittlere Molekulargewicht berechnet man aus dem Auslaufvolumen, bei dem 50% der insgesamt im Chro-matogramm gefundenen Hexuronsäure eluiert sind.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel la

(Stufe A, Depolymerisierung)

7,5 kg rohes Chondroitinpolysulfat (erhältlich nach DE-PS 870 094) löst man in 75 Liter heissem Wasser, versetzt mit 2,25 kg Natriumchlorid und 2 ml Octanol-1. Man gibt nun eine Lösung von 75 g Ethylendinitrilotetraessigsäure in 750 ml In Natronlauge zu. Man erhitzt die Mischung auf 95°C und rührt dann 7,5 Liter 30%ige Hydroperoxid-Lösung ein. Man hält die Temperatur 100 Minuten zwischen 90 und 95°C und kühlt dann schnell auf Raumtemperatur ab.

Man löst in der Reaktionsmischung 1,5 kg Natriumchlorid, rührt 360 Liter Methanol ein, dekantiert nach 30 Minuten den klaren Überstand ab und saugt den Niederschlag auf einer Nutsche ab. Man wäscht mit Methanol und trocknet bei einer Temperatur unter 60°C. Man erhält etwa 7 kg depolymerisiertes Chondroitinpolysulfat.

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Beispiel lb (Stufe A, Depolymerisierung)

7,5 kg rohes Chondroitinpolysulfat löst man in 22,5 Liter Wasser, versetzt zuerst mit 1,5 kg Natriumchlorid, dann mit einer Lösung von 37,5 g Kupfer-II-sulfat-pentahydrat in 750 ml Wasser. Man setzt unter Kühlung 3 Liter 30%iges Hydroperoxid zu und hält 5 Stunden bei 25°C. Danach stellt man mit 30%iger Natronlauge auf pH 10,5 ein, fällt unter Rühren mit 132 Liter Methanol, dekantiert den Überstand und nutscht den Niederschlag ab. Man wäscht mit Methanol und trocknet bei einer Temperatur unter 60°C. Man erhält etwa 6,8 kg depolymerisiertes Chondroitinpolysulfat.

Beispiel lc (Stufe A, Depolymerisierung)

9 kg rohes Chondroitinpolysulfat löst man in 45 Liter Wasser, versetzt mit einer Lösung von 8,57 g Kobalt-II-chlorid-hexahydrat in 1 Liter Wasser und ergänzt mit Wasser auf 67 Liter. Unter ständigem Rühren bei Raumtemperatur fügt man innerhalb 2 Stunden 1,35 Liter 40%ige Peressigsäure zu. Anschliessend gibt man eine Lösung von 27 g Ethylendi-nitrilotetraessigsäuredinatriumsalzdihydrat in 1 Liter Wasser zu. Man stellt nun mit 30%iger Natronlauge auf pH 11 ein, setzt 2,2 kg Natriumchlorid zu und fällt unter Rühren mit 290 Liter Methanol. Nach einer Stunde dekantiert man, saugt den Niederschlag auf einer Nutsche ab, wäscht mit Methanol und trocknet bei einer Temperatur unter 60°C. Man erhält etwa 8,4 kg depolymerisiertes Chondroitinpolysulfat.

Beispiel 2

(Stufe B, Bleiche).

8,0 kg depolymerisiertes Chondroitinpolysulfat löst man in 74 Liter Wasser, vermischt mit 2 Liter 40%iger Peressigsäure, stellt den pH-Wert mit 30%iger Natronlauge auf 8 ein und lässt 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Man löst in der Mischung 0,4 kg Natriumchlorid und fällt mit 320 Liter Methanol. Der Niederschlag wird abgenutscht, mit Methanol gewaschen und getrocknet. Man erhält ca. 7,9 kg weisses Material.

Beispiel 3a (Stufe C, Fraktionierung)

6,3 kg depolymerisiertes Chondroitinpolysulfat löst man in 27,1 Liter heissem Wasser, setzt 3,15 Liter 40%ige Peressigsäure zu, vermischt und lässt 4 Stunden stehen. Danach gibt man 45,4 Liter Wasser zu, löst 2,1 kg Natriumchlorid und stellt den pH-Wert mit 30%iger Natronlauge auf 10,5 ein. Dann rührt man je Liter Lösung 0,5748 Liter Methanol ein, um in der Mischung eine Methanolkonzentration von 36,5 Vol.% zu erhalten, das sind z.B. 48,6 Liter Methanol. Man lässt die Fällung über Nacht stehen, dann dekantiert man und zentrifugiert den halbflüssigen Niederschlag ab. Den klaren Überstand, z.B. 128,5 Liter, verrührt man mit 2,175 Liter Methanol pro Liter Lösung, so dass eine Methanolendkonzentration von 80 Vol.% erreicht wird, das sind z.B. 279,5 Liter Methanol. Die Fällung lässt man 1 Stunde absetzen, dekantiert und nutscht die Restsuspension ab. Den Niederschlag wäscht man mit Methanol und trocknet bei einer Temperatur unter 60°C. Man erhält etwa 5,6 kg Zwischenprodukt.

Beispiel 3b (Stufe C, Fraktionierung)

2 kg depolymerisiertes Chondroitinpolysulfat löst man in 200 Liter Wasser, filtriert durch ein Sterilfilter und ultrafiltriert mit einem Druck von 2,8 bar bei 32°C unter Verwendung eines Platten-Ultrafiltrationsgerätes (Membranfläche 2,25 m2, angegebene Ausschlussgrenze der Celluloseacetat-Membran bei Molekulargewicht 15 000). Die Lösung pumpt man mit einer Durchflussrate von 6,5 mVStund um. Wenn ein Volumen von ca. 20 Liter Retentat erhalten wird, ultrafiltriert man dieses dreimal nach Vermischen mit je 50 Liter Wasser.

s Die gesammelten Permeate unterwirft man unter Verwendung einer Celluloseacetat-Membran mit der angegebenen Molekulargewichts-Ausschlussgrenze 6000, jedoch sonst gleichen Bedingungen wie oben bei der Ultrafiltration. Das Retentat engt man bis auf eine Konzentration von 10% ein, setzt Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 0,5% zu, stellt den pH-Wert auf 7,5 ein und fällt unter Rühren mit 4 Volumteilen Methanol. Nach Waschen des abgesaugten Niederschlags trocknet man. Das erhaltene Zwischenprodukt wiegt 1,78 kg.

Beispiel 4a

(Stufe D, Entsalzung)

5,4 g kg Zwischenprodukt aus Arbeitsschritt 3 löst man in 20 54 Liter Wasser und rührt 21,6 Liter stark sauren Kationenaustauscher (z.B. «Lewatit» S 100) in der protonierten Form ein und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Man nutscht ab, wäscht zweimal mit je 8,1 Liter Wasser nach und vereinigt die Filtrate. Das Filtrat versetzt man mit 2,19 kg Natriumchlorid 2s und fällt unter Rühren mit 292 Liter Methanol. Den Fällungsansatz lässt man über Nacht stehen, dann dekantiert man, nutscht die verbleibende Suspension ab und wäscht mit Methanol gut aus. Den Niederschlag löst man in 43,2 Liter Wasser, stellt den pH-Wert mit 30%iger Natronlauge auf 7,5 30 ein, gibt 700 g Natriumchlorid zu und fällt unter Rühren mit 139,2 Liter Methanol. Den klaren Überstand hebert man ab, die Restsuspension saugt man durch eine Nutsche und wäscht mit Methanol. Nach dem Trocknen erhält man 3,6 kg entsalztes Chondroitinpolysulfat.

Beispiel 4b

(Stufe D, Entsalzung)

9 kg des nach Arbeitsschritt 3 anfallenden Zwischenpro-40 duktes oder auch den noch methanolfeuchten Niederschlag aus diesem Arbeitsschritt löst man in so viel Wasser, dass man 90 Liter Lösung erhält. Diese Lösung lässt man durch eine Ionenaustauschersäule laufen, die mit 36 Liter Kationenaustauscher «Amberlite» IR 120 in der H+-Form gefüllt 4s ist. Das Verhältnis Höhe der Säulenfüllung zu Durchmesser liegt z.B. bei ca. 2,5. Wenn die Substanzlösung durchgelaufen ist, spült man mit 33,3 Liter Wasser nach. Die vereinigten substanzhaltigen Filtrate versetzt man mit 3,7 kg Natriumchlorid und bringt durch Zusatz von 492 Liter Methanol zur so Ausfällung. Man saugt ab, wäscht mit Methanol und löst den noch lösungsmittelfeuchten Niederschlag mit pyrogenfreiem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 72 Liter. Man gibt 1,15 kg Natriumchlorid zu, stellt den pH-Wert mit 30%iger Natronlauge auf 7,5 ein und fällt mit 219 Liter Methanol aus. 55 Man nutscht ab, wäscht mit Methanol und trocknet. Es werden etwa 6 kg entsalztes Chondroitinpolysulfat gewonnen.

60 Beispiel 4

(Stufe E, Entfärbung)

20 kg entsalztes Chondroitinpolysulfat löst man in 190 Liter pyrogenfreiem Wasser. Die Lösung erhitzt man auf 90°C und gibt 40 kg Aktivkohle zu (Riedel de Haen Nr.

65 18 003). Man hält die Temperatur 60 Minuten auf 90°C, filtriert dann heiss mit einem Druckfilter. Den Kohlerückstand wäscht man zweimal mit je 40 Liter pyrogenfreiem Wasser und vereinigt die Filtrate. Man versetzt mit 3 kg Natrium10

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chlorid und 660 g Ethylendinitrilotetraessigsäure-dinatrium-salzdihydrat. Der pH-Wert wird auf 7,5 eingestellt. Dann filtriert man durch ein vorgewaschenes Membranfilter (Porenweite 0,2 um). Die ganz klare Lösung fällt man unter Rühren mit 720 Liter Methanol. Der Niederschlag wird mit der Nutsche abgesaugt, mit Methanol gewaschen und bei einer Temperatur unter 50°C getrocknet. Man erhält etwa 18 kg weisses, feinkörniges, reines, injizierbares Chondroitinpolysulfat. Die chemisch-analytische Untersuchung ergibt folgende Stoffwerte:

N 1,77%

S 12,96%

Hexuronsäure: 1,08 mMol/g Hexosamin: l,12mMol/g

Beispiel A

s (Herstellung einer Injektionslösung)

3,25 kg auf wasserfreie Substanz berechnetes reines Chondroitinpolysulfat und 0,325 kg Natriumchlorid löst man unter Rühren in etwa 50 Liter aqua pro iniectabilia und ergänzt auf 65 Liter. Nach Einstellen des pH-Wertes auf 8,4 io mit In Natronlauge und Sterilfiltration durch Membranfilter ampulliert man unter sterilen Kautelen in bekannter Weise. Die verschlossenen Ampullen werden 60 Minuten einer Hitzebehandlung im siedenden Wasserbad ausgesetzt.

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Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von injizierbarem Chondroitinpolysulfat, dadurch gekennzeichnet, dass man rohes Chondroitinpolysulfat oxidativ depolymerisiert und das depolymerisierte Chondroitinpolysulfat durch Methanolfällung und/oder Ultrafiltration fraktioniert.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das depolymerisierte Chondroitinpolysulfat vor dem Fraktionierungsschritt oder während des Fraktionierungsschrittes mit Peressigsäure bleicht.
3. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man das fraktionierte Produkt mit Hilfe von Kationenaustauschern entsalzt und/oder mit Hilfe von Aktivkohle entfärbt.
4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die oxidative Depolymerisierung mit Hilfe von Hydroperoxid in Abwesenheit von Schwermetallen durchführt.
5. Verfahren nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man in Gegenwart eines Komplexierungsmit-tels arbeitet.
6. Verfahren nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als Komplexierungsmittel Nitrilotriessig-säure, Ethylendinitrilotetraessigsäure, 1,2-Cyclohexylen-dinitrilotetraessigsäure, Diethylentriaminpentaessigsäure, 3,6-Dioxaoctamethylendinitrilotetraessigsäure, deren Alkalisalze oder ein Gemisch dieser Verbindungen verwendet.
7. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die oxidative Depolymerisierung mit Hilfe von Hydroperoxid in Gegenwart von Schwermetallionen durchführt.
8. Verfahren nach Patentanspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als Schwermetallionenquelle Eisen-, Kobalt-, Kupfer-, Mangan- und/oder Vanadiumsalze verwendet, wobei die Konzentration dieser Salze im Reaktionsmedium im Bereich von 0,001 bis 0,5 Gew./Vol.% gehalten wird.
9. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die oxidative Depolymerisierung mit Hilfe von Peressigsäure in Gegenwart von Schwermetallionen durchführt.
10. Verfahren nach Patentanspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man als Schwermetallionenquelle Eisen-, Kobalt- und/oder Mangansalze verwendet, wobei die Konzentration dieser Salze im Reaktionsmedium im Bereich von 0,001 bis 0,5 Gew./Vol.% gehalten wird.
11. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Fraktionierung des depolyme-risierten Chondroitinpolysulfats zwei Methanolfällungen durchführt, wobei die erste Methanolfällung bei einer Konzentration von 25 bis 45 Vol.% Methanol und/oder die zweite bei einer Konzentration von 60 bis 85 Vol.% Methanol vorgenommen wird.
12. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Fraktionierung des depolyme-risierten Chondroitinpolysulfats in der Weise durchführt, dass man eine Methanolfällung und eine Ultrafiltration durchführt.
13. Verfahren nach Patentanspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass man zunächst eine Ultrafiltration mit einer Membran der Ausschlussgruppe von mindestens 6000 vornimmt und anschliessend das erhaltene Produkt einer Methanolfällung unterwirft.
14. Verfahren nach Patentanspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass man zunächst eine Methanolfällung durchführt und das erhaltene Produkt einer Ultrafiltration mit einer Membran der Ausschlussgruppe von höchstens 8000 vornimmt.
15. Verfahren nach Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Entsalzung des bei der Fraktionierung erhaltenen Produktes entweder durch portionsweises Einrühren eines Kationenaustauschers oder mit Hilfe einer kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Kolonnenarbeitsweise vornimmt.
16. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das bei der Fraktionierung erhaltene, gegebenenfalls entsalzte und/oder entfärbte reine Chondroitinpolysulfat mit Hilfe von Methanol in Gegenwart von 0,01 bis 0,5 Gew./Vol.% eines Komplexierungsmittels abscheidet.
17. Verfahren nach Patentanspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass man als Komplexierungsmittel Nitrilotriessig-säure, Ethylendinitrilotetraessigsäure, 1,2-CycIohexylendini-trilotetraessigsäure, Diethylentriaminpentaessigsäure, 3,6-Dioxaoctamethylendinitrilotetraessigsäure oder ein Gemisch dieser Verbindungen verwendet.
18. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das bei der Fraktionierung erhaltene, gegebenenfalls entsalzte und/oder entfärbte reine Chondroitinpolysulfat mit Hilfe von Methanol in Gegenwart von 0,01 bis 0,5 Gew./Vol.% Natriumpyrosulfit abscheidet.
19. Injizierbares Chondroitinpolysulfat, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1.
20. Injizierbares Chondroitinpolysulfat nach Patentanspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass es eine akute Toxizität (LD50) bei intravenöser Verabreichung bei der NMRI Maus von > 3500 mg/kg, bei der Wistar Ratte von

> 3000 mg/kg, bei der Katze von > 1000 mg/kg und beim Hund von > 1000 mg/kg aufweist.
21. Verwendung des injizierbaren Chondroitinpolysul-fates nach Patentanspruch 19 als Wirkstoff zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen für die Human- und V eterinärmedizin.
22. Verwendung nach Patentanspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass man ein injizierbares Chondroitinpolysulfat gemäss Patentanspruch 20 verwendet.

In zum Stand der Technik gehörenden Veröffentlichungen sind sowohl die Herstellung von Chondroitinpolysulfat, insbesondere die Suifatierung von Chondroitinpolysulfat, als auch verschiedene Behandlungsweisen von Chondroitinpolysulfat-Rohprodukten mit dem Ziel der Reinigung beschrieben worden (S. Bergström, Hoppe-Seyler's Z. f. phy-siol. Chemie 238 [1936] 163; Chargaff, F. W. Bancroft, J. biol. Chem. 115 [1936] 149, 155; Husemann et al., Z. Ges. Exp. Med. 114 [1945] 722; J. Piper, Acta Pharm. Toxicol. 2 [1946] 317; P. Karrer, H. Koenig, E. Usteri, Helv. chim. acta 26 [1943] 1296; DE-PS 870 094; DE-PS 935 843; DE-PS 968 752; DE-OS 1 618 857; US-PS 3 454 560; DDR-PS 136 572). Keine dieser Arbeitsweisen führt jedoch zu einem befriedigenden Produkt.

Die trotz technischer Fortschritte immer noch zu hohe Toxizität und andere Nachteile der Chondroitinpolysulfate nach dem Stand der Technik verbieten bis jetzt den risikofreien therapeutischen Einsatz dieser Stoffe als Injektion.

Ziel der Erfindung ist es daher, in wirtschaftlich vorteilhafter Weise zu einem hochreinen Chondroitinpolysulfat zu gelangen, bei dem die Nachteile bekannter Chondroitinpolysulfate auf ein Mindestmass reduziert sind. Ein derartiges Chondroitinpolysulfat soll in der Therapie von Erkrankungen bei Mensch und Tier in jeder Applikationsart eingesetzt werden können.

Dieses Ziel wird mit Hilfe des in Patentanspruch 1 defi5

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nierten Verfahrens, dessen bevorzugte Ausführungsformen in den Patentansprüchen 2 bis 18 aufgeführt sind, erreicht.

Das nach diesem Verfahren hergestellte Chondroitinpolysulfat ist injizierbar und zeichnet sich durch eine ausserordentlich geringe Toxizität aus. Es kann in der Therapie bei Mensch und Tier eingesetzt werden und ist anticoagulämisch, thrombolytisch, thromboprophylaktisch (speziell auch auf die tiefen Venenthrombosen einwirkend), antiatherosklero-tisch, antilipämisch, antiinflammatorisch, antiexsudativ, antiarthrotisch und virustatisch wirksam.

Als Ausgangsmaterial zu verwendendes rohes Chondroitinpolysulfat kann nach den zum Stand der Technik gehörenden Verfahren, beispielsweise den in den vorstehend genannten Literaturstellen beschriebenen, gewonnen werden. So kann man beispielsweise von einem Produkt ausgehen, das durch Suifatierung von Chondroitinpolysulfat mit Pyridin und Chlorsulfonsäure erhalten wird. Als Ausgangsmaterial können rohe Chondroitinpolysulfate sehr verschiedener Färbung eingesetzt werden. Je nach Wahl des Ausgangsmaterials kann es sich deshalb als notwendig erweisen, das in der ersten Verfahrensstufe gewonnene depolymerisierte Chondroitinpolysulfat vor oder während der Fraktionierung mit Peressigsäure zu bleichen. Ausserdem können als Ausgangsmaterial höhermolekulare Chondroitinpolysulfate, wie sie in der Fraktionierungsstufe des erfindungsgemässen Verfahrens als Nebenprodukte anfallen, verwendet werden.

Bei dem im folgenden beschriebenen Verfahren kommen zur pH-Wert-Einstellung folgende Reagenzien in Betracht: Säuren, wie anorganische Säuren, z.B. Salzsäure, und nieder-aliphatische Carbonsäuren bzw. deren Persäuren, z.B. Essigsäure oder Peressigsäure, und Laugen, wie Alkalihydroxidlösungen, z.B. Natronlauge oder Kalilauge. Die einzelnen Arbeitsschritte des Verfahrens werden vorzugsweise bei Normaldruck ausgeführt. Sofern nicht anders angegeben, sind im folgenden die Prozentangaben «Gew./Vol.%»-Angaben. In dem vorliegenden Verfahren wird als Abscheidungsmittel für Zwischenprodukte und Endprodukt Methanol angegeben. Gleichermassen eignen sich auch andere mit Wasser mischbare organische Flüssigkeiten, wie z.B. Ethanol, Isopro-panol, Aceton, Tetrahydrofuran, Dioxan. Die in den einzelnen Arbeitsschritten des Verfahrens erzeugten Zwischenprodukte müssen nicht unbedingt als Trockensubstanzen isoliert werden. Man kann auch die lösungsmittelfeuchten Massen ohne Trocknen weiterverarbeiten. Bei der Ausfällung der Chondroitinpolysulfatstoffe mit wassermischbaren Lösungsmitteln setzt man zweckmässig Salze in einem Konzentrationsbereich von 0,1 bis 10%, bevorzugt 0,5 bis 5%, zu. Als Salze eignen sich insbesondere Natrium- oder Kaliumchlorid und Natrium- oder Kaliumacetat.

Die in den einzelnen Verfahrensstufen anzuwendenden Bedingungen sind über einen grösseren Bereich variierbar und für einen Fachmann im Einzelfall ohne Schwierigkeiten zu ermitteln. Bei den in der nachfolgenden Beschreibung des Verfahrens angegebenen Parametern handelt es sich dementsprechend nicht um obligatorische, sondern um besonders vorteilhafte Werte.

Chondroitinpolysulfat lässt sich unter Ausschluss von Schwermetallen mit Hydroperoxid depolymerisieren. Der Depolymerisierungsschritt kann in wässriger Lösung unter folgenden Bedingungen ausgeführt werden: Die Konzentration des rohen Chondroitinpolysulfats kann 2 bis 35%, vorzugsweise 10 bis 20%, betragen. Die Konzentration von Hydroperoxid im Reaktionsmedium kann 0,3 bis 15, vorzugsweise 1 bis 5%, betragen. Die Reaktionstemperatur kann 20 bis 100°C, vorzugsweise 50 bis 100°C, betragen. Die Reaktionsdauer liegt im Bereich von 10 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 30 bis 200 Minuten. Der pH-Wert kann zwischen 3 und 9 konstant gehalten oder auch uneingestellt bleiben; bevorzugt arbeitet man zwischen pH 4,5 und 7.

Anwesende Schwermetalle lassen sich durch Komplexierungsmittel, wie Nitrilotriessigsäure, Ethylendinitrilotetraes-sigsäure, 1,2-Cyclohexylendinitrilotetraessigsäure, Diethy-lentriaminpentaessigsäure, 3,6-Dioxaoctamethylendinitrilo-tetraessigsäure, deren Alkalisalze oder Gemische dieser Verbindungen maskieren. Die Konzentration des Komplexie-rungsmittels sollte im Bereich von 0,001 bis 0,5%, bevorzugt zwischen 0,005 und 0,15%, gehalten werden. Nach Abschluss der Reaktion kann man das Reaktionsprodukt entweder ohne oder nach Abkühlung mit einem Überschuss Methanol unter Zusatz eines Alkalisalzes ausfällen und gewinnen.

Die Depolymerisierung von Chondroitinpolysulfat mit Hydroperoxid kann auch in Gegenwart von Schwermetallsalzen unter besonders schonenden Bedingungen durchgeführt werden. Man arbeitet z.B. wie folgt: Die Konzentration des rohen Chondroitinpolysulfates kann 2 bis 35%, vorzugsweise 15 bis 30%, betragen. Die Konzentration von Hydroperoxid in der Reaktionslösung kann 0,5 bis 15%, vorzugsweise 1 bis 5%, betragen. Die Reaktionstemperatur kann im Bereich von — 10°C bis +80°C, vorzugsweise 0°C bis 30°C, liegen. Die Reaktionsdauer kann im Bereich von 5 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 30 bis 500 Minuten, liegen.

Der pH-Wert kann zwischen 3 und 8 liegen, wobei der Bereich von 4,5 bis 7,5 bevorzugt ist. Als Schwermetallsalze bewähren sich anorganische und organische Salze von Eisen, Kobalt, Kupfer, Mangan, Vanadium. Die Metalle dieser Salze liegen vorzugsweise in folgenden Wertigkeitsstufen vor:

Eisen und Cobalt: zwei- und dreiwertig,

Kupfer: ein- und zweiwertig,

Mangan: zwei-, drei-, vier-, sechs- und siebenwertig, Vanadium: zwei- und fünfwertig.

Die Konzentration an Metallsalz wird zweckmässigerweise auf 0,001 bis 0,5% eingestellt, wobei der Bereich von 0,05 bis 0,2% bevorzugt ist. Nach Beendigung der Depolymerisations-reaktion wird der pH-Wert zweckmässigerweise auf 5 bis 14, vorzugsweise 6 bis 10, eingestellt und das Depolymerisations-produkt durch Methanolfällung gewonnen.

Mit dem gleichen Ergebnis wie die vorstehenden Methoden zur oxidativen Depolymerisierung von Chondroitinpolysulfat ist der Arbeitsschritt durch oxidativen Abbau von Chondroitinpolysulfat durch Peressigsäure in Gegenwart von gewissen Schwermetallsalzen auszuführen. Es wurden folgende Bedingungen gefunden, bei denen die Reaktion vorteilhaft realisiert werden kann: Die Konzentration des rohen Chondroitinpolysulfats kann 5 bis 35%, vorzugsweise 10 bis 25%, betragen. Die Konzentration der Peressigsäure in der Reaktionslösung kann 0,1 bis 7%, vorzugsweise 0,5 bis 2%, betragen. Die Schwermetallsalzkonzentration kann in dem Bereich von 0,001 bis 0,5%, vorzugsweise 0,005 bis 0,2%, liegen. Die Reaktionstemperatur kann - 10°C bis +90°C, vorzugsweise 0°C bis 30°C, betragen. Die Reaktionsdauer kann im Bereich von 5 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 15 Minuten bis 500 Minuten, liegen. Der pH-Wert kann 2 bis 12, vorzugsweise 3 bis 8, betragen.

Geeignete Schwermetallsalze, bei deren Anwesenheit die Reaktion mit guter Geschwindigkeit abläuft, sind anorganische oder organische Salze von Eisen, Kobalt, Kupfer, Mangan und Vanadium. Hinsichtlich der Wertigkeit der Metalle dieser Metallsalze gilt das Gleiche wie vorstehend für die Depolymerisierung mit Hydroperoxid. Besonders bei kürzeren Reaktionszeiten kann das Abstoppen des Depo-lymerisiervorganges durch einen Chelatbildner, z.B. Ethylen-dinitrilotetraessigsäure oder andere Metallmaskierungsmittel, angezeigt sein. Das depolymerisierte Chondroitinpolysulfat kann, gegebenenfalls nach Zusatz eines Neutral5

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salzes und Einstellen des pH-Wertes in den Bereich von 3 bis 14, insbesondere 6 bis 10, mit Methanol abgeschieden werden.

Für den Einsatz in dem vorliegenden Verfahren eignen sich rohe Chondroitinpolysulfate sehr verschiedener Reinheit und Färbung. Es kann nötig sein, dass trotz des die Farbe stark aufhellenden Depolymerisiervorganges vor der Weiterverarbeitung ein Entfärbungsschritt bzw. eine Bleiche eingefügt werden muss. Die Bleiche wird allgemein mit Peressigsäure durchgeführt. Es wurden folgende vorteilhafte Bedingungen gefunden: Der pH-Bereich kann 2,5 bis 14, vorzugsweise 3 bis 11, betragen. Die Peressigsäurekonzentration kann 0,1 bis 10%, bevorzugt 1 bis 5%, betragen. Die Konzentration des rohen Chondroitinpolysulfats kann 2 bis 40%, bevorzugt 5 bis 25%, betragen. Die Reaktion wird in dem Temperaturbereich von 0 bis 100CC, bevorzugt 15 bis 70°C, durchgeführt. Die Reaktionsdauer kann zwischen 1 Minute und 96 Stunden, insbesondere zwischen 1 und 24 Stunden, betragen.

Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform kann die Peressigsäurebehandlung in das nachfolgende Molekül-fraktionierungsverfahren einbezogen werden. Wie bereits vorstehend zum Ausdruck gebracht wurde, kann die Peressigsäurebehandlung auch ganz unterbleiben.

Aus dem nach der Bleiche bzw. Depolymerisierung erhaltenen Produkt fraktioniert man durch Methanolfällung bei verschiedenen Konzentrationen den Molekulargewichtsbereich von etwa 5000 bis 15 000 aus.

Hierzu kann man das depolymerisierte und gegebenenfalls gebleichte Chondroitinpolysulfat in wässriger Lösung wie folgt mit Methanol in Gegenwart von Neutralsalz behandeln (1. Methanolfällung): Die Konzentration des depolymeri-sierten Chondroitinpolysulfates in der wässrigen Lösung kann 5 bis 30%, vorzugsweise 5 bis 20%, betragen. Der pH-Wert kann im Bereich von 2 bis 10, vorzugsweise 3,0 bis 7,5, liegen. Der Neutralsalzgehalt kann 0,5 bis 10%, bevorzugt 1 bis 1,5%, betragen. Ein bevorzugtes Neutralsalz ist Natriumchlorid. Die Temperatur kann im Bereich von 0 bis 50°C, vorzugsweise 15 bis 30°C, liegen. Die Methanolmenge kann 25 bis 45 Vol.%, bevorzugt 30 bis 40 Vol.%, bezogen auf das gesamte Behandlungsmedium, betragen. Hochmolekulare und hochsulfatierte Chondroitinpolysulfat-Individuen fallen zusammen mit Verunreinigungen aus und können durch Filtration oder Zentrifugieren entfernt werden.

Die verbleibende methanolhaltige Lösung bringt man zweckmässigerweise durch weiteren Methanolzusatz auf eine Methanolkonzentration von 60 bis 85 Vol.%, bevorzugt 75 bis 80 Vol.%, bezogen auf das gesamte Behandlungsmedium (2. Methanolfällung), und gewinnt so eine Chondroitinpoly-sulfat-Fällung, bei der die sehr niedermolekularen und niedersulfatierten Anteile zusammen mit Verunreinigungen entfernt sind; diese werden nicht ausgefällt.

Das Fraktionierungsverfahren mit Methanol kann teilweise oder ganz durch Ultrafiltration ersetzt werden. So kann man beispielsweise durch Ultrafiltration von wässrigen Lösungen depolymerisierten Chondroitinpolysulfats mit Membranen der Ausschlussgrenze von 6000 und darüber (z.B. aus Celluloseacetat, Polyamid oder Polysulfon) dieselbe Vorfraktion wie oben beschrieben im Retentat zurückhalten. Hierbei kann die Konzentration der Chondroitinpolysulfat-lösung 1 bis 10%, bevorzugt 1 bis 5%, betragen. Der pH-Wert der Lösung kann 2 bis 14, bevorzugt 5 bis 10, betragen. Das Permeat kann wie oben erläutert durch Methanolfällung von niedermolekularen Chondroitinpolysulfat-Anteilen befreit werden.

Dieser Effekt kann auch durch eine zweite nachgeschaltete Ultrafiltration mit Membranen der Ausschlussgrenze von 8000 und darunter erreicht werden. Hierbei kann die Konzentration der Chondroitinpolysulfatlösung 1 bis 10%, vorzugsweise 1 bis 5%, betragen. Der pH-Wert der Lösung kann 2 bis 14, vorzugsweise 5 bis 10, betragen.

Die von den Herstellern von Ultrafiltrationsmembranen angegebene Ausschlussgrenze für Substanzen eines bestimmten Molekulargewichts ist für Chondroitinpolysulfate meistens nicht gültig. Die geeignete Membrane muss deshalb im Einzelfall durch Versuch ermittelt werden, findet sich aber erfahrungsgemäss in den angegebenen Bereichen.

Die Entfernung von Salzen, gegebenenfalls Schwermetallionen und Verunreinigungen kann durch eine Kationenaustauscherbehandlung erreicht werden. Die Metallionen werden von Austauscherharzen in der protonierten Form gebunden, die freie Mucopolysaccharidpolyschwefelsäure geht ins Filtrat bzw. Eluat. Die Behandlung kann bei einer Temperatur von 0 bis 50°C, zweckmässigerweise bei Raumtemperatur, erfolgen. Sie kann durch portionsweises Einrühren des Kationenaustauschers im Batchverfahren oder in kontinuierlicher oder diskontinuierlicher Säulentechnik vorgenommen werden. Als Ionenaustauscherharze eignen sich stark saure Qualitäten, wie z.B. «Lewatit» S 100, «Dowex» X 50, «Amberlite» IR 120 in der protonierten Form.

Bei Anwendung des Batchverfahrens arbeitet man zweckmässigerweise mit Chondroitinpolysulfatkonzentrationen von 2 bis 20%, insbesondere von 5 bis 15%. Die Menge des lonenaustauscherharzes kann 2 bis 10 Volumenteile, vorzugsweise 3 bis 8 Volumenteile, bezogen auf 1 Gewichtsteil Trockensubstanz von Chondroitinpolysulfat, betragen.

Unter denselben Bedingungen lässt sich auch mit in Kolonnen geschütteten Austauschern arbeiten.

Das stark sauer reagierende Filtrat bzw. Eluat aus dem Entsalzungsschritt fällt man allgemein in Gegenwart von 0,5 bis 5% Neutralsalz, insbesondere 0,5 bis 3% Natriumchlorid, mit 2,5 bis 6 Volumenteilen, bevorzugt 3 bis 4 Volumenteilen, Methanol. Bei der Fällung aus saurem Milieu bleiben freie Schwefelsäure und niedermolekulare Anteile von Chondroitinpolysulfat und Verunreinigungen in Lösung. Nach Abtrennung der Chondroitinpolyschwefelsäure-Fällung kann man diese entweder aus neutraler Lösung umfällen oder direkt noch methanolfeucht für den folgenden Prozessschritt weiterverwenden.

Die Entsalzung kann entfallen, wenn eine Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit niedriger Ausschlussgrenze (2. Ultrafiltration) vorgenommen wurde, bei der das Retentat weiterverarbeitet wird.

Zur weiteren Aufhellung der Farbe und zum Erreichen einer besonders guten Farbstabilität beim Hitzesterilisieren des reinen Chondroitinpolysulfates kann ein weiterer Reinigungsschritt nachgeschaltet werden. Hierfür empfiehlt sich eine Behandlung mit Aktivkohle.

Durch Behandlung von Chondroitinpolysulfatlösungen mit Aktivkohle und vollständige Abtrennung des Adsorbates erhält man eine Chondroitinpolysulfatlösung, aus der das Produkt nach pH-Einstellung in Gegenwart eines Neutralsalzes mit Methanol ausgefällt werden kann. Die Konzentration der zu behandelnden wässrigen Chondroitinpolysulfatlösung beträgt zweckmässigerweise 5 bis 25%, insbesondere 10 bis 20%, ihr pH-Wert 4 bis 10, insbesondere 5 bis 8. Es werden zweckmässigerweise ,0,1 bis 3 Gewichtsteile Aktivkohle (bezogen auf ein Gewichtsteil Chondroitinpolysulfat) eingesetzt. Die Temperatur kann 20 bis 100°C betragen. Die Behandlungsdauer beträgt allgemein 10 bis 180 Minuten. Danach wird die Aktivkohle zweckmässigerweise zunächst abgetrennt. Anschliessend empfiehlt sich eine Feinfiltration durch Membranfilter, um die Lösung völlig kohlefrei zu erhalten. Geeignete Aktivkohlen sind zum Beispiel Brilonit normal (Lurgi), Aktivkohle rein, Art. Nr. 2183 (Merck), Aktivkohle rein, Pulver, Art. Nr. 18003 (Riedel de Haen). Ob

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mit Aktivkohle entfärbt wird, hängt von dem als Ausgangsmaterial verwendeten Chondroitinpolysulfat ab.

Zur Gewinnung des Verfahrensproduktes geht man zweckmässigerweise so vor, dass man den pH-Wert auf 6 bis 10, insbesondere 7 bis 8, einstellt und das Endprodukt in Gegenwart von Neutralsalz, insbesondere Natriumchlorid, in einer Konzentration von 0,5 bis 5%, insbesondere 1 bis 2%, mit Methanol ausfällt. Die Konzentration des Methanols sollte auf einen Endwert von 60 bis 85 Vol.%, vorzugsweise 75 bis 80 Vol.%, eingestellt werden.

Es kann zweckmässig sein, die Abscheidung der gereinigten Chondroitinpolysulfate mit Methanol in Gegenwart eines Komplexierungsmittels und/oder Natriumpyrosulfit vorzunehmen. Insbesondere bei dem Endprodukt ist diese Massnahme angezeigt. Dadurch bleiben Injektionslösungen, die Chondroitinpolysulfat enthalten, beim Lagern frei von Trübungen und dunkeln nur unmerklich nach. Als Komplexierungsmittel werden beispielsweise Nitrilotriessigsäure, Ethylendinitrilotetraessigsäure, 1,2-Cyclohexylendinitrilote-traessigsäure, Diethylentriaminpentaessigsäure, 3,6-Dioxa-octamethylendinitrilotetraessigsäure in Konzentrationen von 0,01 bis 0,5% eingesetzt. Bevorzugt arbeitet man bei Konzentrationen von 0,05 bis 0,35%. Die Konzentration des bei der Methanolfällung gegebenenfalls verwendeten Natriumpyro-sulfits kann 0,01 bis 0,5% betragen.

Das beschriebene Chondroitinpolysulfat hat bei Mensch und Tier therapeutische Bedeutung. Die Substanz ist, wie bereits erwähnt, anticoagulämisch, thrombolytisch, throm-boprophylaktisch (speziell auch auf die tiefen Venenthrombosen einwirkend), antiatherosklerotisch, antilipämisch, antiinflammatorisch, antiexsudativ, antiarthrotisch und viru-statisch wirksam.

Durch den besonderen Ablauf und die Art der Behandlungen des erfindungsgemässen Verfahrens wird eine charakteristische neuartige Substanz gewonnen, die sich durch die überraschend geringe Toxizität auszeichnet.

Tabelle 1

Akute Toxizität

Tierart

Applikation

LD50/7d

NMRI Mäuse i.V.

> 3500 mg/kg

Wistar Ratten i.V.

> 3000 mg/kg

Katze

I.V.

> 1000 mg/kg

Hund

I.V.

> 1000 mg/kg