NL8201873A - Werkwijze voor het bereiden van een injecteerbare chondroitinepolysulfaat, produkt verkrijgbaar met deze werkwijze alsmede een farmaceutisch preparaat. - Google Patents

Description

* % i' - 1 -

Werkwijze voor het bereiden van een injecteerbaar chondroïtine-polysulfaat, produkt verkrijgbaar met deze werkwijze alsmede een farmaceutisch preparaat.

De bereiding van chondroïtine-polysulfaat, in het bijzonder de sulfatering van chondroïtine-sulfaat, en verschillende methoden om ruw chondroïtine-polysulfaat te zuiveren zijn beschreven door S. Bergstrom in Hoppe-Seyler’s Z.f. physiol.

5 Chemie 238, 163; Chargaff en F.W. Bancroft (1936) in J. Biol.

Chem. 115, 1fc9» 155» Husemann et al (1936) in Z. Ges. Exp. Med.

1lfr, 722; J. Piper (19^5) in Acta Pharm. Toxicol. 2, 317» P. Karrer, H. Koenig en E. üsteri (19^6) in Helv. chim. acta 26, 1296; en verder in de Duitse octrooischriften 968.752 en 935*843; het Duits 10 Offenlegungsschrift 1.618.857; het Amerikaans octrooischrift 3Λ5^.56θ en het DDR - octrooischrift 136.572 (al deze octrooi-publicaties zijn uit 19^3).

Geen van deze methoden leidt echter tot een bevredigend produkt. Een van de bezwaren is de toxiciteit, die 15 ondanks de toegepaste geavanceerde technieken nog steeds te hoog is. Deze en andere bezwaren staan risicoloze toepassing van de tot nog toe bekende chondroïtine-polysulfaten voor therapeutische toepassing als injecteerbaar preparaat in de weg.

Gevonden is, dat op doelmatige en doeltreffende 20 wijze de bezwaren van de tot nog toe bekende chondroïtine-polysulfaten tot een minimum kunnen worden teruggebracht en dat een zeer zuiver chondroïtine-polysulfaat kan worden verkregen,dat geschikt is voor therapeutische behandeling van mens en dier.

De uitvinding berust in hoofdzaak op de aard 25 en volgorde van de volgende stappen: oxydatieve depolymerisatie van een ruw chondroïtine-polysulfaat zoals een tot nog toe bekend chondroïtine-polysulfaat, indien nodig ontkleuren met perazijnzuur, isoleren van een fractie met een gemiddeld molecuulgewicht van 5000-15ΟΟΟ door precipiteren met methanol en/of ultrafiltreren, 30 indien nodig demineraliseren met ionenuitwisselaars en indien 8201873 i 1 - 2 - nodig behandelen met geactiveerde kool.

De uitvinding heeft derhalve betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een injecteerbaar chondroïtine-polysulfaat, met het kenmerk dat, 5 a) ruw chondroïtine-polysulfaat oxydatief wordt gedepolymeriseerd, b) indien nodig het gedepolymeriseerde chondroïtine-polysulfaat wordt ontkleurd met perazijnzuur, c) het na stap a) of b) verkregen produkt êên 10 of twee keer wordt geprecipiteerd met methanol en/of door ultrafiltratie voor fractioneren met betrekking tot het molecuulge-wicht, d) indien nodig het na stap c) verkregen produkt wordt gedemineraliseerd met een kationuitwisselaar, en 15 e) indien nodig het na stap c) of d) wordt ontkleurd met geactiveerde kool.

Het ruwe uitgangs chondroïtine-polysulfaat kan op elke bekende wijze zijn verkregen, bijvoorbeeld zoals beschreven in de bovengenoemde literatuur. Ook kan een produkt worden gebruikt 20 dat is verkregen door sulfatering van chondroïtine-sulfaat met chloorsulfonzuur/pyridine. Verder kunnen hoogmoleculaire chondroï-tine-polysulfaten afkomstig uit stap c) van de onderhavige werkwijze worden ingezet. De uitgangs chondroïtine-polysulfaten kunnen allerlei kleuren hebben.

25 Bij de hierna beschreven uitvoeringsvormen van de werkwijze volgens de uitvinding kan de pH worden ingesteld met anorganische zuren bijvoorbeeld chloorwaterstofzuur, lage alifa-tische carbonzuren of perzuren daarvan bijvoorbeeld azijnzuur of perazijnzuur, en basen zoals alkalimetaalhydroxyden bijvoorbeeld 30 oplossingen van natrium- of kaliumhydroxyde. De verschillende stappen worden bij voorkeur onder normale druk uitgevoerd. Tenzij anders aangegeven zijn de vermelde percentages in gewicht per volume. Behalve methanol om tussenprodukten en het eindprodukt te precipiteren kunnen ook andere met water mengbare organische 35 vloeistoffen worden gebruikt bijvoorbeeld ethanol, isopropanol, 8201873 ψ * - 3 - aceton, tetrahydrofuran en/of dioxan. Het is niet nodig om de in de afzonderlijke stappen gevormde tussenprodukten te drogen.

Het verdient aanbeveling om tijdens het precipiteren met vloeistoffen die met water mengbaar zijn,zouten toe te voegen in een 5 concentratie van 0,1-10 % en bij voorkeur 0,5-5 %> Zeer geschikte zouten zijn natrium- of kaliumchloride en natrium- of kaliumacetaat «

De stappen a) - e) kunnen onder een groot aantal verschillende omstandigheden worden uitgevoerd. Het is 10 duidelijk, dat de uitvinding niet beperkt is tot de hierna aangegeven omstandigheden.

Chondroitine-polysulfaat kan worden gedepoly-meriseerd met waterstofperoxyde bij afwezigheid van zware metalen.

De depolymerisatie kan worden uitgevoerd in 15 een waterige oplossing onder de volgende omstandigheden: concentratie ruw chondroïtine-polysulfaat 2-35 % en bij voorkeur 10-20 %% concentratie waterstofperoxyde 0,3-15 % en bij voorkeur 1-5 %» reactietemperatuur 20-100° C en bij voorkeur 50-100° C; reactietijd 10 min. tot 2k uren en bij voorkeur 30-200 min,; pH zoals 20 die is of 3-9 en bij voorkeur U,5-7.

Aanwezige zware metalen kunnen worden gecomplexeerd met bijvoorbeeld nitrilotriazijnzuur, ethyleendinitrilotetra-azijnzuur, 1,2-cyclohexyleendinitrilotetraazijnzuur, diethyleen-triaminepentaanzuur en/of 3,6-dioxaoctamethyleendinitrilotetra-25 azijnzuur of alkalimetaalzouten daarvan. De concentratie complex-eermiddel bedraagt 0,001-0,5 % en bij voorkeur 0,005-0,15 %* Na afloop van de reactie kan het produkt met een overmaat methanol worden geprecipiteerd en na toevoegen van een alkalimetaalzout al dan niet onder koelen worden geïsoleerd.

30 De depolymerisatie van chondroitine-polysulfaat met waterstofperoxyde kan ook bij aanwezigheid van zware metaal-zouten worden uitgevoerd, onder bijzonder milde omstandigheden, bijvoorbeeld met een concentratie ruw chondroitine-polysulfaat van 2-35 % en bij voorkeur 15-30 %t een concentratie waterstof-35 peroxyde van 0,5-15 % en bij voorkeur 1-5 JS, bij een temperatuur 8201873 * * . _ tussen -10 en 80° G en bij voorkeur 0-30° C gedurende 5 min, tot 2¾ uren en bij voorkeur 30-500 min., en bij een pH van 3-8 en bij voorkeur ^,5-7,5. Geschikte zouten van zware metalen zijn anorganische en organische zouten van ijzer, kobalt, koper, mangaan en 5 vanadium, bij voorkeur ijzer(H) en (III).. kobalt(H en III), koper(l en II), mangaan(H, III, IV, VI en Vil) en vanadium(ll en V). De concentratie metaalzout wordt ingesteld op 0,001-0,5 % en bij voorkeur op 0,05-0,2 %» Na de depolymerisatie wordt de pH ingesteld op 5-1¾ en bij voorkeur op 6-10 waarna het gedepolymeri-10 seerde produkt wordt geïsoleerd door precipitatie met methanol.

De oxydatieve depolymerisatie van chondroïtine-polysulfaat kan ook worden uitgevoerd met perazijnzuur bij aanwezigheid van bepaalde zware metaalzouten met dezelfde resultaten als boven vermeld. De omstandigheden zijn geschikt als volgt: 15 concentratie ruw chondroïtine-polysulfaat 5-35 % en bij voorkeur 10-25 %, concentratie perazijnzuur 0,1-7 % en bij voorkeur 0,5-2 %t concentratie zwaar metaalzout 0,001-0,5 % en bij voorkeur 0,005-0,2 %t reactietemperatuur tussen -10 en 90° C en bij voorkeur 0-30° C, reactietijd 5 min. tot 2¾ uren en bij voorkeur 15-500 min., 20 en een pH 2-12 en bij voorkeur 3-8.

Met anorganische en organische zouten van ijzer, kobalt, koper, mangaan en vanadium, met bij voorkeur de boven aangegeven valenties, wordt een goede reactiesnelheid bereikt.

Het kan aanbeveling verdienen om de depolymerisatie te beëindigen 25 met eenchelateringsmiddel bijvoorbeeld ethyleendinitrilotetra- azijnzuur of andere metaal complexerende middelen, in het bijzonder in het geval van betrekkelijk korte reactietijden. Het gede-polymeriseerde chondroïtine-polysulfaat kan met methanol worden geprecipiteerd, indien nodig na toevoegen van een neutraal zout en 30 instellen van de pH op 3-1¾ en in het bijzonder op 6-10.

Zoals reeds vermeld kunnen ruwe uitgangs chondroïtine-polysulfaten van verschillende zuiverheid en met een groot aantal uiteenlopende kleuren worden gebruikt. Hoewel ten gevolge van de depolymerisatie de kleur aanmerkelijk lichter wordt, 35 kan het nodig zijn om een ontkleuring uit te voeren alvorens tot 8201873 ψ * - 5 - een volgende stap over te gaan. Zo'n ontkleuring kan worden uitgevoerd met perazijnzuur. De omstandigheden waaronder zijn geschikt als volgt: concentratie ruw chondroïtine-polysulfaat 2-UO % en hij voorkeur 5-25 #> concentratie perazijnzuur 0,1-10 # en hij 5 voorkeur 1-5 #, reactietemperatuur 0-100° C en hij voorkeur 15-70° C, reactietijd 1 min. tot 96 uren en hij voorkeur 1-2U uren, en een pH 2,5-1^ en hij voorkeur 3-11.

Het fraetioneren van een produkt met een mole-cuulgewicht van ongeveer 5000-15000 na de depolymerisatie en even- f 10 tuele ontkleuring, wordt uitgevoerd met methanol van verschillende concentraties. Daarbij wordt het produkt in waterige oplossing behandeld met methanol hij aanwezigheid van een neutraal zout (eerste precipitatie) onder de volgende omstandigheden: concentratie gedepolymeriseerd en eventueel ontkleur chondroïtine-poly-15 sulfaat in de waterige oplossing 5-30 f en hij voorkeur 5-20 #,* concentratie neutraal zout (bij voorkeur natriumchloride) 0,5-10 # en hij voorkeur 1-5 #, hoeveelheid methanol 25-^5 vol.# en hij voorkeur 30-Uo vol.# berekend op het totale medium, temperatuur 0-50° C en hij voorkeur 15-30° C, en pH 2-10 en hij voorkeur 20 3,0-7,5. Hoog-moleculaire en hoog-gesulfat eerde chondroïtine- polysulfaten worden geprecipiteerd, samen met verontreinigingen, en kunnen door filtreren of centrifugeren worden verwijderd.

De methanolconcentratie van de resterende oplossing wordt met methanol op 60-85 vol.# en bij voorkeur 75-θΟ 25 vol.# gebracht (tweede precipitatie), waarbij een chondroïtine- polysulfaat precipitaat waaruit de zeer laag-moleculaire en laag-gesulfateerde componenten zijn verwijderd, samen met verontreinigingen, wordt verkregen. Voornoemde componenten worden niet geprecipiteerd.

30 De fractionering met methanol kan geheel of gedeeltelijk worden vervangen door ultrafiltreren. Zo is het mogelijk om bijvoorbeeld door ultrafiltreren van waterige oplossingen van gedepolymeriseerd chondroïtine-polysulfaat met membranen met een doorlaatbaarheidsgrens van 6000 en hoger (bijvoor-35 beeld celluloseacetaat-, polyamide- of polysulfonmembranen) de- 8201873 4 » - 6 - zelfde eerste fractie als boven aangegeven in het achtergebleven materiaal tegen te houden. Oe concentratie chondroïtine-polysul-faat in de oplossing bedraagt 1-10 % en bij voorkeur 1-5 %t en de pH van de oplossing 2-1¾ en bij voorkeur 5-10. Het doorgelaten 5 materiaal kan van laag-moleculaire chondroïtine-polysulfaat componenten worden bevrijd door precipitatie met methanol zoals boven beschreven.

Dit resultaat kan ook worden bereikt door een tweede daaropvolgende ultrafiltratie met membranen met een door-10 laatbaarheidsgrens van 8000 en lager. De concentratie chondroïtine-polysulfaat in de oplossing bedraagt dan weer 1-10 % en bij voorkeur 1-5 en de pH van de oplossing weer 2-1¾ en bij voorkeur 5-10.

Omdat de doorlaatbaarheidsgrens voor een stof 15 met een bepaald moleculair.gewicht zoals opgegeven door de fabrikant van ultrafiltratiemembranen vaak niet van toepassing is op chondroïtine-polysulfaten, moet proefondervinderlijk worden vastgesteld welk membraan geschikt is.

Voor zover nodig wordt het verwijderen van 20 zouten, zware metaalionen en verontreinigingen uitgevoerd door behandelen met een kationuitwisselaar. De metaalionen worden door de uitwisselaar gebonden in de geprotoneerde vorm^terwijl het vrije mucopolysaccharide-polyzwavelzuur naar het filtraat of eluaat gaat. De behandeling wordt uitgevoerd bij een temperatuur van 25 0-50° C en bij voorkeur bij omgevingstemperatuur (kamertemperatuur).

De behandeling kan ladingsgewijs worden uitgevoerd waarbij de kationuitwisselaar wordt omgeroerd, of volgens de continue- of discontinue kolomtechniek. Geschikte ionenuitwisselaars zijn sterk zure uitwisselaars bijvoorbeeld Lewatit S 100, Dowex X 50 of 30 Amberlite IR 120 in de geprotoneerde vorm.

De ladingsgewijze behandeling wordt uitgevoerd in een waterige oplossing met een concentratie chondroïtine-poly-sulfaat van 2-20 % en bij voorkeur 5-15 De hoeveelheid ionenuitwisselaar bedraagt 2-10 vol.dln. en bij voorkeur 3-8 vol.dln.

35 per gew.dl. droog chondroïtine-polysulfaat.

8201873 0 * \ - 7 -

Zouten kunnen onder dezelfde omstandigheden worden verwijderd onder gebruikmaking van met ionenuitwisselaar gevulde kolommen.

Het uit de demineralisatiestap afkomstige 5 sterk zure filtraat of eluaat wordt geprecipiteerd met 2,5-6 vol.

dln. en bij voorkeur 3-¾ vol.dln. methanol bij aanwezigheid van 0,5-5 % neutraal zout, en bij voorkeur 0,5-3 % natriumchloride. Tijdens de precipitatie vanuit een zuur medium blijven vrij zwavelzuur en laag-moleculaire chondroltine-polysulfaatcomponenten als 10 ook verontreinigingen in oplossing achter. Nadat het chondroïtine-polyzwavelzuur precipitaat is afgescheiden kan het opnieuw vanuit neutrale oplossing worden geprecipiteerd of meteen en nog nat van methanol in de volgende stap worden ingezet.

De demineralisatiestap kan achterwege worden 15 gelaten wanneer de ultrafiltratie is uitgevoerd onder toepassing van een ultrafiltratiemembraan met een lage doorlaatbaarheids-grens (tweede ultrafiltratie) in welk geval het achtergebleven materiaal verder wordt verwerkt.

Om de kleur nog meer op te helderen en een 20 zeer goede kleurechtheid tijdens hitte-sterilisatie van het zuivere chondroïtine-polysulfaat te bereiken, kan na de demineralisatiestap nog een zuiveringsstap worden uitgevoerd.

Door chondroïtine-polysulfaatoplossingen te behandelen met geactiveerde houtskool en het adsorbaat volledig 25 te verwijderen, wordt een chondroxtine-polysulfaatoplossing verkregen van waaruit, na instellen van de pH, het produkt wordt geprecipiteerd met methanol bij aanwezigheid van een neutraal zout onder de volgende omstandigheden: concentratie chondroïtine-polysulfaat in de waterige oplossing 5-25 % en bij voorkeur 10-20 30 %, hoeveelheid geactiveerde houtskool 0,1-3 gew.dln. per gew.dl.

chondroïtine-polysulfaat, temperatuur 20-100° C, behandelingsduur 10-180 min., en pH 4-10 en bij voorkeur 5-8.

Het verdient aanbeveling om na afscheiding van de geactiveerde houtskool een fijne filtratie door een membraan-35 filter uit te voeren om de houtskool zo volledig mogelijk te 8201873 0 v - 8 - verwijderen. Na instellen van de pH op 6-10 en bij voorkeur op 7-8 wordt het eindprodukt geprecipiteerd met methanol bij aanwezigheid van een neutraal zout, bijvoorbeeld natriumchloride in een concentratie van 0,5-5 # en bij voorkeur 1-2 #. De eindconcen-5 tratie methanol wordt op 60-85 vol.# en bij voorkeur 75-60 vol.# gebracht. Voorbeelden van geschikt geactiveerd houtskool zijn Brilonit normaal (Lurgi), zuivere geactiveerde houtskool Cat. No. 2183 (Merck), en zuivere geactiveerde houtskoolpoeder Cat. No.

I8OO3 (Riedel de Haen), Of de ontkleuring met geactiveerde houts-10 kool wordt uitgevoerd hangt af van de toestand van het uitgangs chondroxtine-polysulfaat.

Het kan voordelig zijn, in het bijzonder in het geval van het eindprodukt, om de precipitatie van het gezuiverde chondroxtine-polysulfaat uit te voeren met methanol bij aanwezig-15 heid van een complexeermiddel en/of natriumpyrosulfiet, Daardoor worden chondroxtine-polysulfaat bevattende injectieoplossingen tijdens bewaren niet troebel. Voorbeelden van geschikte complexeer-middelen zijn nitrilotriazijnzuur, ethyleendinitrilotetraazijnzuur, 1,2-cyclohexyleendinitrilotetraazijnzuur, diethyleentriaminepen-20 taanzuur en 3,6-dioxaoctamethyleendinitrilotetraazijnzuur, in concentraties van 0,01-0,5 # en bij voorkeur 0,05-0,35 #. De concentratie natriumpyrosulfiet die tijdens de precipitatie met methanol kan worden toegepast, bedraagt 0,01-0,5 #·

Het met de werkwijze volgens de uitvinding 25 verkregen chondroxtine-polysulfaat bezit anticoagulemisehe, thrombolytische, thromboprofylactische (in het bijzonder op diep veneuze thrombosen), anti-atherosclerotische,antilipemische, anti-inflammatoire, anti-exudatieve, anti-arthrotische en virustatische werking, en is geschikt voor het behandelen van mens en dier. De 30 toxiciteit is verrassend laag. Voor een produkt dat met de werkwijze volgens de uitvinding in zijn algemeenheid is verkregen, bedraagt de acute toxiciteit: 35 8201873 - 9 -

, TABEL A

Dier___^go/Td ^ν·___

Muizen (nmRI) >3,500 mg/kg

Ratten (wistar) >3,000 mg/kg ** Katten >1,000 mg/kg

Honden >1,000 mg/kg

TABEL B

10 Acute toxiciteit van een voorkeursprodukt Dier_________W50/Jd itYt______ NMRI muizen *11,000

Wistar ratten >3,500

Katten >1,500

Honden ........ >1,000._ri ___

Voor een produkt dat volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding is verkregen, bedraagt de acute toxiciteit: zie tabel B.

20 De tot nog toe beschreven chondroïtine-poly- sulfaten bezitten een LD^q (i.v.) voor muizen van slechts 1000 mg/kg.

De met de werkwijze volgens de uitvinding verkrijgbare chondroxtine-polysulfaten worden gekenmerkt door de 25 volgende parameters:

Stikstof 1,65-2,00 %

Zwavel 12,5—1^*5 %

Hexuronzuur 0,98-1,22 maol/g

Hexosamine 0,96-1,2¾ mmol/g 30 De uitvinding heeft verder betrekking op farma ceutische preparaten, die als werkzaam bestanddeel een chondrox-tine-polysulfaat bereid of verkrijgbaar met de werkwijze volgens de uitvinding bevatten.

De preparaten kunnen in voor intramusculaire, 35 intra-articulaire, subcutane, intraveneuze, per orale, rectale, 8201873 - 10 - sublinguale of buccale toediening geschikte vorm verkeren, bijvoorbeeld ampulles, gerede injectiespuiten, penetreerbare flesjes of inj eetiepatronen.

Mensen kunnen met enkelvoudige doses van 20-250 5 mg en bij voorkeur 30-150 mg chondroïtine-polysulfaat opgelost in 0,2-2,0 ml en bij voorkeur 0,2-1,0 ml water worden geïnjecteerd tot een dagelijkse dosis van tot 500 mg. De dagelijkse dosis voor honden bedraagt 0,1-5 mg/kg lichaamsgewicht en bij voorkeur 0,5- 1,5 mg/kg lichaamsgewicht chondroïtine-polysulfaat opgelost in 10 0,1-10 ml en bij voorkeur 0,5-1,0 ml water. Paarden kunnen worden geïnjecteerd met een dagelijkse dosis van 100-1000 mg en bij voorkeur 150-500 mg chondroïtine-polysulfaat opgelost in 0,1-20 ml en bij voorkeur 1-5 ml water.

Het gemiddelde molecuulgewicht van het chondroï-15 tine-polysulfaat verkrijgbaar met de werkwijze volgens de uitvinding kan als volgt worden bepaald. Een hoeveelheid van 20 mg wordt in 2 M natriumchloride-oplossing gechromatografeerd over een Biogel P 10 kolom (50 g; hoogte 100 cm, diameter 2 cm). Het eluaat wordt opgevangen in fracties van 10 ml. Hexuronzuur wordt bepaald 20 volgens de methode van Z. Dische: J. Biol. Chem. 167« 189 (19^7) gemodificeerd volgens J.D. Gregory: Arch. Biochem. Biophys. 89« 157 (i960). Als standaard worden chondroïtine-polysulfaat fracties gebruikt waaraan het molecuulgewicht is bepaald door ultracentri-fuge. Het gemiddeld molecuulgewicht wordt berekend uit het volume 25 eluaat waarin 50 % van de totale hoeveelheid in het chromatogram aangetoonde hexuronzuur is geëlueerd.

Voorbeeld Ia (stapa))

Een hoeveelheid van 7,5 hg ruw chondroïtine-polysulfaat (verkrijgbaar volgens het Duits octrooischrift 870.09*0 30 wordt opgelost in 75 1 heet water. Aan de oplossing worden 2,25 hg natriumchloride, 2 ml octan-1-ol en een oplossing van 75 g ethy-leendinitrilotetraazijnzuur in 750 ml 1 N natriumhydroxyde-oplos-sing toegevoegd. Het mengsel wordt verwarmd tot 95° C waarna 7,5 1 30 #-ig waterstofperoxyde onder roeren wordt toegevoegd. De 35 temperatuur wordt 100 min. op 90-95° C gehouden waarna het mengsel 8201873 - 11 - snel tot kamertemperatuur wordt afgekoeld. In het mengsel wordt 1,5 kg natriumchloride opgelost waarna 360 1 methanol onder roeren wordt toegevoegd. Na 30 min. staan wordt de heldere bovenstaande vloeistof afgedecanteerd en het precipitaat door filtreren op een 5 afzuigfilter verzameld. Het materiaal op het filter wordt gewassen met methanol en gedroogd bij een temperatuur beneden 60° C. Aldus wordt ongeveer 7 hg gedepolymeriseerd chondroïtine-polysul-faat verkregen.

Voorbeeld Ib^(stag a)|_ 10 Een hoeveelheid van 7*5 kg ruw chondroxtine- polysulfaat wordt opgelost in 22,5 1 water. Aan de oplossing wordt eerst 1,5 kg natriumchloride en daarna een oplossing van 37*5 g koper(H)sulfaatpentahydraat in 750 ml water toegevoegd. Vervolgens wordt 3 1 30 Jï-ig wat er s t o fperoxy de toegevoegd onder koelen waarna 15 het mengsel 5 uren op 25° C wordt gehouden. Na instellen van de . pH op 10,5 met een 30 #-ige natriumhydroxyde-oplossing wordt 132 1 methanol onder roeren toegevoegd onder vorming van een neerslag. De bovenstaande vloeistof wordt afgedecanteerd en het neerslag wordt op een afzuigfilter verzameld. Het produkt wordt 20 op het filter gewassen met methanol en gedroogd bij een temperatuur beneden 60° C. Aldus wordt ongeveer 6,8 kg gedepolymeriseerd ehondroïtine-polysulfaat verkregen.

Voorbeeld Ic (stap a))

Een hoeveelheid van 9 kg ruw chondroïtine-25 polysulfaat wordt opgelost in H5 1 water. Aan de oplossing wordt een oplossing van 8,57 g kobalt(13) chloridehexahydraat in 1 1 water toegevoegd waarna het volume met water op 67 1 wordt gebracht. Vervolgens wordt 1,35 1 40 %-ig perazijnzuur in 2 uren onder voortdurend roeren bij kamertemperatuur toegevoegd en daarna 30 een oplossing van 27 g dinatriumethyleendinitrilotetraacetaat-dihydraat in 1 1 water. Na instellen van de pH op 11 met een 30 l-ige natriumhydroxyde-oplossing wordt 2,2 kg natriumchloride toegevoegd en wordt precipitatie bewerkstelligd met 290 1 methanol onder roeren. Na 1 uur staan wordt de bovenstaande vloeistof 35 af gedecanteerd en wordt het precipitaat op een afzuigfilter 8201873 - 12 - verzameld. Het produkt wordt op het filter gewassen met methanol en gedroogd bij een temperatuur beneden 6o° C. Aldus wordt ongeveer 8,U kg gedepolymeriseerd chondroïtine-polysulfaat verkregen. Voorbeeld II (stap b)) 5 Een hoeveelheid van 8,0 kg gedepolymeriseerd chondroïtine-polysulfaat wordt opgelost in 7^* 1 water. De oplossing wordt gemengd met 2 1 1*0 %-ig perazijnzuur. Na instellen van de pH op 8 met een 30 ?-ige natriumhydroxyde-oploss ing wordt het mengsel 2l* uren bij kamertemperatuur weggezet. Vervolgens wordt 10 0,1* kg natriumchloride in het mengsel opgelost en wordt 320 1 methanol toegevoegd onder vorming van een neerslag. Het neerslag wordt afgefiltreerd, gewassen met methanol en gedroogd. Aldus wordt ongeveer 7*9 kg van een wit produkt verkregen,

Voorbeeld lila (stap c)) 15 Een hoeveelheid van 6,3 kg gedepolymeriseerd chondroïtine-polysulfaat wordt opgelost in 27,1 1 heet water.

Aan de oplossing wordt 3,15 1 1*0 %-ig perazijnzuur onder roeren toegevoegd. Na 1* uren staan worden 1*5Λ 1 water en 2,1 kg natriumchloride in het mengsel opgelost. De pH wordt met een 30 %-ige 20 natriumhydroxyde-oplossing op 10,5 ingesteld. Om de methanol- concentratie op 36,5 vol.Si te brengen wordt 1*8,6 1 methanol (0,57l* g liter methanol per liter oplossing) onder roeren toegevoegd.

Na een nacht overstaan wordt de bovenstaande vloeistof afgedecanteerd waarna het half-vloeibare precipitant wordt afgecentrifugeerd. 25 De heldere bovenstaande vloeistof (128,5 l) wordt met 279*5 1 methanol (2,175 1 methanol per liter oplossing) geroerd zodat de eindconcentratie methanol 80 vol.Si bedraagt. Nadat men het neerslag gedurende 1 uur heeft laten bezinken, wordt de bovenstaande vloeistof afgedecanteerd waarna de resterende suspensie op een 30 afzuigfilter wordt gefiltreerd. Het neerslag wordt gewassen met methanol en gedroogd bij een temperatuur beneden 60° C. Aldus wordt ongeveer 5*6 kg tussenprodukt verkregen.

Voorbeeld Illb (stap c))

Een hoeveelheid van 2 kg gedepolymeriseerd 35 chondroïtine-polysulfaat wordt opgelost in 200 1 water. De 8201873 r - 13 - oplossing wordt op een steriel filter gefiltreerd en daarna onderworpen aan ultrafiltratie onder een druk van 280 kPa (2,8 bar) bij 32° C onder gebruikmaking van een plaat ultrafiltratie appa-raat (celluloseacetaatmembraan met een oppervlak van 2,25 m en 5 een doorlaatbaarheidsgrens tot een moleculair gewicht van 15.000).

O

De oplossing wordt rondgepompt met een snelheid van 6,5 nr/uur. Nadat het volume van het achtergebleven materiaal ongeveer 20 1 is geworden, wordt dit materiaal drie keer onderworpen aan ultrafiltratie, steeds na mengen met 50 1 water. De gecombineerde 10 permeaten worden onderworpen aan ultrafiltratie onder de boven aangegeven omstandigheden maar met een celluloseacetaatmembraan met een doorlaatbaarheidsgrens tot een molecuulgewicht van 6000. Het achtergebleven materiaal wordt geconcentreerd tot een concentratie van 10 waarna natriumchloride wordt toegevoegd tot een ‘ 15 concentratie van 0,5 %· Na instellen van de pH op 7»5 wordt pre- cipitatie bewerkstelligd met k vol.dln. methanol onder roeren.

Het precipitaat wordt op een afzuigfilter verzameld, gewassen en gedroogd. Aldus wordt 1,78 kg tussenprodükt verkregen.

Voorbeeld IVa (stap d)) 20 Een hoeveelheid van 5,¾ kg van het tussen prodükt uit stap c) wordt opgelost in 5¾ 1 water. Een hoeveelheid van 21,6 1 sterk zure kationuitwisselaar (Lewatit S 100) in de geprotoneerde vorm wordt onder roeren toegevoegd waarna het roeren 1 uur bij kamertemperatuur wordt voortgezet. Na afloop wordt de 25 kationuitwisselaar afgefiltreerd op een afzuigfilter en twee keer met steeds 8,1 1 water gespoeld. Aan de verzamelde filtraten wordt 2,19 kg natriumchloride toegevoegd waarna precipitatie wordt bewerkstelligd met 292 1 methanol onder roeren. Na een nacht overstaan wordt de bovenstaande vloeistof afgedecanteerd waarna de 30 resterende suspensie op een afzuigfilter wordt gefiltreerd. Het produkt wordt op het filter gewassen met methanol en daarna opgelost in U3,2 1 water. Na instellen van de pH op 7,5 met een 30 %-ige natriumhydroxyde-oplossing wordt 700 g natriumchloride toegevoegd en wordt precipitatie bewerkstelligd met 139,2 1 methanol 35 onder roeren. De heldere bovenstaande vloeistof wordt afgedecan- 8201873 - 11* - teerd waarna de resterende suspensie op een afzuigfilter wordt gefiltreerd. Het produkt wordt op het filter gewassen met methanol. Aldus wordt na drogen 3,6 kg gedemineraliseerd chondroïtine-poly-sulfaat verkregen.

5 Voorbeeld IVb (stap d|)

Een hoeveelheid van 9 kg van het tussenprodukt uit stap c) of anders het nog van methanol natte precipitaat uit deze stap, wordt opgelost in een zodanige hoeveelheid water dat 90 1 oplossing wordt verkregen. Deze oplossing wordt door een 10 ionenuitwisselaarkolom gevoerd die gevuld is met 36 1 kationuit-wisselaar Amberlite IR 120 in de geprotoneerde vorm (verhouding hoogte en diameter van de kolom ongeveer 2,5:1). De kolom wordt nagespoeld met 3,3 1 water. Aan de gecombineerde filtraten wordt 3,7 kg natriumchloride toegevoegd waarna precipitatie wordt bewerk-15 stelligd met 1*92 1 methanol onder roeren. Het neerslag wordt op een afzuigfilter verzameld en gewassen met methanol waarna het zonder te drogen wordt opgelost in zo veel zuurstofvrij water dat het totale volume van de oplossing 72 1 bedraagt. Aan de oplossing wordt 1,15 kg natriumchloride toegevoegd. Na instellen van de pH 20 op 7,5 met een 30 $-ige natriumhydroxyde-oplossing wordt precipitatie bewerkstelligd met 219 1 methanol onder roeren. Het neerslag wordt op een afzuigfilter verzameld, gewassen met methanol en gedroogd. Aldus wordt ongeveer 6 kg gedemineraliseerd chondroïtine-polysulfaat verkregen.

25 Voorbeeld V (stap e))

Een hoeveelheid van 20 kg gedemineraliseerd chondroxtine-polysulfaat wordt opgelost in 190 1 zuurstof-vrij water. De oplossing wordt verwarmd tot 90° C waarna 1*0 g geactiveerde houtskool (Riedel de Haen No. 1Ö003) wordt toegevoegd. De 30 temperatuur wordt 60 min. op 90° C gehouden waarna het nog warme mengsel wordt gefiltreerd op een drukfilter. Het houtskoolresidu wordt twee keer met steeds 1*0 1 zuurs tof-vrij water gewassen. Aan de gecombineerde filtraten worden 3 kg natriumchloride en 660 g dinatriumethyleendinitrilotetraacetaatdihydraat toegevoegd. Na 35 instellen van de pH op 7,5 wordt het mengsel gefiltreerd op een 8201873 - 15 - tevoren gewassen membraanfliter (poriën-diameter 0,2 jua). Aan de totale heldere oplossing wordt 720 1 methanol onder roeren toegevoegd. Het precipitaat wordt op een afzuigfilter verzameld, gewassen met methanol en gedroogd bij een temperatuur beneden 50° C.

5 Aldus wordt ongeveer 18 kg wit, fijnverdeeld, zuiver, injecteer-baar chondroïtine-polysulfaat verkregen.

Analyse: N: 1,77 % S: 12,96 % 10 Hexuronzuur: 1,08 mmol/g

Hexosamine: 1,12 mmol/g

Voorbeeld VI (Bereiding van een injectie-oplossing).

Een hoeveelheid van 3,25 kg praktisch watervrij en zuiver chondroïtine-polysulfaat en 0,325 kg natriumchloride 15 worden onder roeren opgelost in ongeveer 50 1 water voor injectie. Nadat het volume op 65 1 is gebracht en de pH met 1 N natrium-hydroxyde-oplossing op 8,k is ingesteld wordt de oplossing steriel gefiltreerd door een membraanfilter. Ampulles worden steriel met het filtraat afgevuld en na sluiten 60 min. behandeld met kokend 20 water.

8201873

Claims (18)

1. Werkwijze voor het bereiden van een injec-teerbare chondroïtine-polysulfaat, met het kenmerk, dat a) ruw chondroïtine-polysulfaat oxydatief wordt 5 gedepolymeriseerd, b) het gedepolymeriseerde chondroïtine-poly-sulfaat desgewenst wordt ontkleurd, met perazijnzuur, c) het produkt uit stap a) of b) één of twee keer wordt geprecipiteerd met methanol en/of door ultrafiltratie, 10 d) het produkt uit stap c) desgewenst wordt gedemineraliseerd, met een kationuitwisselaar, en e) het produkt uit stap c) of d) desgewenst wordt ontkleurd, met geactiveerde kool.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken- 15 merk, dat de oxydatieve depolymerisatiestap 4 wordt uitgevoerd met waterstofperoxyde in afwezigheid van zware metalen.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de oxydatieve depolymerisatiestap a) wordt uitgevoerd bij aanwezigheid van een complexeermiddel. 20 k. Werkwijze volgens conclusie 3, met_het ken merk, dat als complexeermiddel nitrilotriazijnzuur, ethyleendi-nitrilotetraazijnzuur, 1,2-cyclohexyleendinitrilotetraazijnzuur, diethyleentriaminepentaazijnzuur, 3,6-dioxaoctamethyleendinitrilo-tetraazijnzuur of mengsels daarvan wordt gebruikt. 25 5· Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken merk, dat de oxydatieve depolymerisatiestap a) wordt uitgevoerd met waterstofperoxyde bij aanwezigheid van zware metaalionen.

6. Werkwijze volgens conclusie 5» met het kenmerk, dat de oxydatievHepolymerisatiestap a) wordt uitgevoerd 30 bij aanwezigheid van zouten van ijzer, kobalt, koper, mangaan en/of vanadium.

7. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken-merk, dat de oxydatieve depolymerisatiestap a) wordt uitgevoerd met perazijnzuur bij aanwezigheid van zware metaalionen. 35 8· Werkwijze volgens conclusie 7» met het ken- 8201873 -Γ> - 17 - merk, dat de oxydatieve depolymerisatiestap a) wordt uitgevoerd bij aanwezigheid van zouten van ijzer, kobalt en/of mangaan.

9· Werkwijze volgens conclusie 6 en 8, met het kenmerk, dat de concentratie zware metaalzouten op 0,001-0,5 gew./ 5 vol.? wordt gehouden.

10. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken-merk, dat de ontkleuring stap b) met perazijnzuur wordt gecombineerd met stap c).

11. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken- 10 merk, dat de eerste fraetionering met methanol in de precipitatie- stap c) wordt uitgevoerd bij een concentratie methanol van 25-^5 vol.?.

12. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken-merk, dat de tweede fraetionering met methanol in de precipitatie- 15 stap c) wordt uitgevoerd bij een concentratie methanol van 60-85 . vol,?.

13. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de eerste fraetionering door ultrafiltratie in de precipitatiestap c) wordt uitgevoerd onder gebruikmaking van een 20 membraan met een doorlaatbaarheidsgrens van tenminste 6000. 1¾. Werkwijze volgens conclusie 1, met_het kenmerk, dat de tweede fraetionering door ultrafiltratie in de precipitatiestap c) wordt uitgevoerd onder gebruikmaking van een membraan met een doorlaatbaarheidsgrens van tenhoogste 8000.

15. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken merk, dat de demineralisatiestap d) hetzij ladingsgewijs onder omroeren van een kationuitwisselaar hetzij continu of discontinu in een kolom wordt uitgevoerd.

16. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken- 30 merk, dat de ontkleuringsstap e) wordt uitgevoerd met geactiveerde houtskool.

17. Werkwijze volgens éên der conclusies 12, ih, 15 en 16, met het kenmerk, dat zuiver chondroxtine-polysulfaat wordt geprecipiteerd met methanol bij aanwezigheid van 0,01-0,5 ? 35 complexeermiddel. 8201873 - 18 -

18. Werkwijze volgens conclusie 17, mer het kenmerk, dat als coraplexeermiddel nitrilotriazijnzuur, ethyleendinitrilotetraazijnzuur, 1,2-cydohexyleendinitrilotetra-azijnzuur, diethyleentriaminepentaazij nzuur, 3,6-dioxaoctamethy- 5 leendinitrilotetraazijnzuur of een mengsel daarvan wordt gebruikt. 19* Werkwijze volgens één der conclusies 12, 14, 15, 16, 17 en 18, met het kenmerk, dat het gezuiverde chon-droïtine-polysulfaat wordt geprecipiteerd met methanol bij aanwezigheid van 0,01-0,5 % natriumpyrosulfiet.

20. Chondroïtine-polysulfaat bereid c.q. ver krijgbaar met de werkwijze volgens één der voorgaande conclusies.

21. Chondroïtine-polysulfaat, gekenmerkt door een acute toxiciteit LD^q i.v. van meer dan 3500 mg/kg voor NMRI muizen, meer dan 3000 mg/kg voor Wistar ratten, meer dan 1000 mg/kg 15 voor katten en meer dan 1000 mg/kg voor honden.

22. Farmaceutisch preparaat voor mens en dier, met het kenmerk, dat het preparaat als werkzaam bestanddeel een chondroïtine-polysulfaat bevat bereid c.q. verkrijgbaar met de werkwijze volgens één der conclusies 1-19 of chondroïtine-polysul- 20 faat volgens conclusie 21.

23. Produkten, werkwijzen en daarbij toepasbare en verkrijgbare produkten alsmede farmaceutische preparaten zoals beschreven in de beschrijving en voorbeelden. 25 8201873