FI70416C - Foerfarande foer framstaellning av en injektabel chondroitin polysulfat - Google Patents

Description

7041 6 MENETELMÄ injektoitavan kondroitiinipolysulfaatin

VALMISTAMISEKSI - FÖRFARANDE FÖR FRAMSTÄLLNING AV

EN INJEKTABEL CHONDROITIN POLYSULFAT

Kondroitiinipolysulfaatin valmistusta ja varsinkin kondroitiinisulfaatin sulfatointia sekä erilaisia epäpuhtaan kondroitiinipolysulfaatin puhdistusmenetelmiä on kuvattu useissa julkaisuissa (S. Bergström, Hoppe-Seyler's Z. f. physiol. Chemie 238, 163, (1936);

Chargaff, F.W. Bancroft, J. Biol. Chem. 115, 149, 155 (1936); Husemann et ai., Z. Ges. Exp. Med. 114, 722 (1945); J. Piper, Acta Pharm. Toxicol. 2, 317 (1946); P. Karrer, H. Koenig, E. Usteri, Helv. Chim. Acta 26, 1296 (1943); saksalainen patenttijulkaisu 870 094; saksalainen patenttijulaksu 935 843; saksalainen patenttijulkaisu 968 752; Saksan Offenlegunsschrift 1 618 857; U.S.A:n patenttijulkaisu 3 454 560 ja DDR:n patenttijulkaisu 136 572). Kuitenkaan näistä menetelmistä millään ei saavuteta tyydyttävää tuotetta.

Toksisuus, joka teknisistä edistysaskeleista huolimatta on liian korkea, ja muut tähänastisilla menetelmillä valmistettujen kondroitiinipolysulfaattien haitat estävät vielä näiden aineiden riskittömän käytön ruiskeiden muodossa.

Näin ollen tämän keksinnön tarkoituksena on saada taloudellisesti edullisella tavalla aikaan erittäin puhdas kondroitiinipolysulfaatti, jossa tunnettuihin kondroi-tiinipolysulfaatteihin liittyvät haitat on saatu mahdollisimman pieniksi. Tällaista kondroitiinipolysulfaattia pitäisi voida käyttää ihmisten ja eläinten sairauksien hoidossa missä tahansa antomuodossa.

Mainittu tarkoitus on saavutettu menetelmällä, jossa ennestään tunnetulla tavalla saatu epäpuhdas kondroitiinipolysulfaatti depolymeroidaan hapettamalla, tarvittaessa suoritetaan valkaisu peretikkahapolla, erotetaan jae, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 5 000 - 15 000, saostamalla metanolilla ja/tai ultrasuo- 2 70416 dattamalla, tarvittaessa suoritetaan demineralisointi ioninvaihtimen avulla ja tarvittaessa käsitellään aktiivihiilellä.

Näin ollen keksintö koskee injektoitavan kondroitiinipolysulfaatin valmistusmenetelmää, jolle on tunnusomaista se, että A) epäpuhdas, kondroitiinipolysulfaatti depolymeroidaan hapettamalla, B) tarvittaessa depolymeroitu kondroitiinipolysulfaatti valkaistaan pertikka-hapolla, C) vaiheesta A tai B saadusta tuotteesta eristetään molekyylipanoltaan määrätty fraktio poistamalla suuremman molekyylipainon omaava aines raetanolisa-ostuksella käyttäen 25-45 % metanolia seoksen koko tilavuudesta tai ultra-suodatuksella käyttäen suodatuskalvoa, jonka jakoraja on vähintään 6000, ja erottamalla fraktioon kuuluva aines pienemmän molekyylipainon omaavasta aineksesta toisella metanolisaostuksella käyttäen 60-85 Z metanolia seoksen koko tilavuudesta tai toisella ultrasuodatuksella käyttäen suodatuskalvoa, jonka jakoraja on korkeintaan 8000, D) vaiheessa C saatu tuote demineralisoidaan tarvittaessa kationivaihtimien avulla ja E) vaiheessa C tai D saadusta tuotteesta poistetaan tarvittaessa väri aktiivihiilen avulla.

Ennestään tunnettuja menetelmiä, kuten edellämainituissa kirjallisuusviitteissä kuvattuja, voidaan käyttää lähtöaineena käytettävän epäpuhtaan kondroitiinipolysulfaatin valmistukseen. Epäpuhtaan kondroitiinipolysulfaatin valmistusta ei kuitenkaan haluta rajoittaa tähän menetelmään tai johonkin edellä mainittuun menetelmään, vaan on mahdollista lähteä tuotteesta, joka saadaan sulfatoimalla kondroitiinisulfaatti pyridiinillä ja kloorisulfonihapol-la. Voidaan käyttää hyvin erivärisiä kondroitiinipolysulfaatteja. On myös mahdollista käyttää suurimolekyylisiä kondroitiinipolysulfaatteja, jotka ovat peräisin tämän menetelmän vaiheesta C.

Il 3 7041 6

Seuraavia reagensseja voidaan käyttää jäljempänä kuvatun prosessin pH:n säädössä: hapot, kuten epäorgaa niset hapot, joista esimerkinä suolahappo, ja alemmat alifaattiset karboksyylihapot tai niiden perhapot, joista esimerkkeinä etikkahappo tai peretikkahappo, ja alkalit, kuten alkalimetallihydroksidiliuokset, joista esimerkkeinä natriumhydroksidiliuos tai kaliumhydroksi-diliuos. Yksittäiset prosessivaiheet on edullista suorittaa normaalipaineessa. Ellei toisin ole mainittu, seuraavassa tekstissä ilmoitetut prosenttiluvut perustuvat suhteeseen "paino/tilavuus". Tässä prosessissa on metanoli ilmoitettu välituotteiden ja lopputuotteen saostusaineeksi. Muut veteensekoittuvat orgaaniset liuottimet, kuten etanoli, isopropanoli, asetoni, tetra-hydrofuraani ja dioksaani, sopivat yhtä hyvin. Eri prosessivaiheissa saatuja välituotteita ei välttämättä tarvitse eristää kuivassa muodossa. On mahdollista käyttää liuottimesta kosteata massaa seuraavassa prosessi- . vaiheessa ilman kuivausta. Kun kondroitiinipolysulfaatteja saostetaan veteensekoittuvilla liuottimilla, on edullista lisätä suoloja niin, että niiden väkevyydeksi tulee 0,1 - 10 %, mielellään 0,5 - 5 %. Erittäin sopivia suoloja ovat natrium- tai kaliumkloridi ja natrium-tai kaliumasetaatti.

Keksinnönmukaisen menetelmän vaiheiden A - E olosuhteita kuvataan tarkemmin seuraavassa ( sivu 3, kappale 3 - sivu 9 , kappale 3 ), mutta olosuhteita voidaan muunnella laajasti. Näin ollen yksittäisille vaiheille annettuja parametrejä ei pidä ymmärtää pakollisiksi vaan ainoastaan edullisiksi tämän keksinnön toteutuksen kannalta niin, ettei keksintöä rajoiteta näihin parametreihin.

Kondroitiinipolysulfaatti voidaan depolymeroida vetyperoksidilla, kun raskaita metalleja ei ole läsnä. De-polymerointivaihe voidaan suorittaa vesiliuoksessa, 4 70416 jonka epäpuhtaan kondroitiinipolysulfaatin pitoisuus on 2 - 35 %, mielellään 10 - 20 %. Reaktioseoksen vetyperoksidi väkevyys voi olla 0,3 - 15 %, mielellään 1 - 5 %. Reaktiolämpötila voi olla 20 - 100 °C, mielellään 50 - 100 °C. Reaktioaika on 10 minuutin ja 24 tunnin välillä, mielellään 30 - 200 minuuttia. pH-arvo voidaan pitää vakiona välillä 3-9 tai se voidaan jättää säätämättä, mutta mielellään se on välillä 4,5 - 7.

Läsnäolevat raskasmetallit voidaan tehdä tehottomiksi kompleksinmuodostusaineilla, kuten nitrilotrietikka-hapolla, etyleenidinitrilotetraetikkahapolla, 1,2-sykloheksyleenidinitrilotetraetikkahapolla, dietyleeni-triamiinipentaetikkahapolla, 3,6-dioksaoktametyleenidi-nitrilotetraetikkahapolla tai Häiden seoksilla tai näiden alkalimetallisuoloilla. Kompleksinmuodostusaineen väkevyys reaktioseoksessa pidetään välillä 0,001 - 0,5 %, mielellään välillä 0,005 - 0,15 %. Reaktion loputtua reaktiotuote voidaan saostaa ylimäärällä metanolia, kun on ensin lisätty alkalimetallisuolaa ja mahdollisesti jäähdytetty, ja sen jälkeen tuote eristetään.

Kondroitiinipolysulfaatti voidaan myös depolymeroi-da vetyperoksidilla raskasmetallien läsnäollessa, kun käytetään erittäin mietoja olosuhteita. Depolymerointi voidaan suorittaa esimerkiksi kondroitiinipolysulfaatin väkevyyden ollessa 2 - 35 %, mielellään T5 - 30 %. Vetyperoksidin väkevyys reaktioliuoksessa voi olla 0,5 - 15 %, mielellään 1 - 5 %. Reaktiolämpötila voi olla välillä - 10 °C - + 80 °C, mielellään 0 - 30 °C. Reaktioaika voi olla 5 minuutin ja 24 tunnin välillä, mielelllään 30 -500 minuuttia.

pH-arvo voi olla välillä 3-8, mielellään välillä 4,5 - 7,5. Sopiviksi osoittautuneita raskasmetallisuo-loja ovat raudan, koboltin, kuparin, mangaanin ja vanadiinin epäorgaaniset ja orgaaniset suolat. Näiden suolojen metallit voivat mielellään olla seuraavilla valens-sitasoilla: rauta ja koboltti kaksi- tai kolmivalenssi- s 7041 6 siä, kupari yksi-tai kaksivalenssisena, mangaani kaksi-, kolme-, neljä-, kuusi- ja seitsemänvalenssisena ja vanadiini kaksi- ja viisivalenssisena. Metallisuo-lan väkevyys säädetään välille 0,001 - 0,5 %, mielellään välille 0,05 - 0,2 %. Hajoamisen jälkeen pH-arvo säädetään välille 5 - 14, mielellään välille 6 - 10, jadepolymeroitunut tuote eristetään metanolilla saosta-malla.

Kondroitiinipolysulfaatin depolymerointi hapettamalla voidaan myös suorittaa hajottamalla kondroitiinipoly-sulfaatti peretikkahapolla tiettyjen raskasmetallisuolo-jen läsnäollessa, jolloin saadaan sama tulos kuin edel-läkuvatuissa menetelmissä. Reaktiossa on edullista käyttää epäpuhtaan kondroitiinipolysulfaatin väkevyyttä 5 - 35 %, mielellään 10 - 25 %. Peretikkahappoväkevyys reaktioliuoksessa voi olla 0,1 - 7 %, mielellään 0,5 -2 %. Raskasmetallisuolaväkevyys voi olla 0,001 - 0,5 %, mielellään 0,005 - 0,2 %. Reaktiolämpötila voi olla - 10 °C - + 90 °C, mielellään 0 - 30 °C. Reaktioaika voi olla 5 minuutin ja 24 tunnin välillä, mielellään 15 - 500 minuuttia. pH-arvo voi olla 2 - 12 , mielellään 3-8.

Reaktio etenee hyvällä nopeudella, kun käytetään esim. sellaisten raskasmetallien kuin rauta, koboltti, kupari, mangaani ja vanadiini epäorgaanisia tai orgaanisia suoloja. Näiden metallien valenssien suhteen pätee sama kuin edellä vetyperoksidilla suoritetun depo-lymeroinnin kohdalla. Saattaa olla hyvä lopettaa depolymerointi käyttämällä kelaatinmuodostusreagenssia, kuten etyleenidinitrilotetraetikkahappoa,tai muita aineita, jotka tekevät metallit tehottomiksi, varsinkin, jos reaktioajat ovat lyhyitä. Depolymeroitunut kondroi-tiinipolysulfaatti voidaan saostaa metanolilla, kun tarvittaessa on ensin lisätty neutraalisuolaa ja säädetty pH alueelle 3-14, varsinkin välille 6 - 10.

6 70416 Tässä menetelmässä voidaan käyttää puhtausasteeltaan ja väriltään erilaisia epäpuhtaita kondroitiinipo-lysulfaatteja. Huolimatta depolymerointioperaatiosta, joka vaalentaa väriä suuresti, voi olla tarpeen suorittaa värinpoisto tai valkaisu ennen jatkokäsittelyä. Valkaisu suoritetaan peretikkahapolla. On havaittu olevan edullista, jos pH on alueella 2,5 - 14, mielellään välillä 3-11. Peretikkahappoväkevyys voi olla 0,1 - 10 %, mielellään 1 - 5 %. Epäpuhtaan kondroitii-nisulfaatin väkevyys voi olla 2 - 40 %, mielellään 5 - 25 %. Reaktio suoritetaan lämpötila-alueella 0 - 100 °C, mielellään välillä 15 - 70 °C. Reaktioaika voi olla 1 minuutin ja 96 tunnin välillä, varsinkin 1-24 tuntia.

Edullisen toteutustavan mukaan peretikkahappokäsit-tely voidaan sisällyttää seuraavaan molekyylifraktiointi-prosessiin. Kuten jo edellä on mainittu, peretikkahap-pokäsittely voidaan jättää kokonaan pois.

Osa, jonka molekyylipaino on alueella 5 000 -15 000, fraktioidaan valkaisu- tai depolymerointivaiheen tuotteesta saostamalla metanolilla eri väkevyyksinä.

Tässä vaiheessa depolymeroitu ja tarvittaessa myös valkaistu kondroitiini voidaan käsitellä vesiliuoksessa metanolilla neutraalisuolan läsnäollessa (1. metanoli-saostus) siten, että depolymeroidun kondroitiinipolysul-faatin väkevyys vesiliuoksessa voi olla 5 - 30 %, mielellään 5 - 20 %. pH-arvo voi olla alueella 2-10, mielellään 3,0 - 7,5. Neutraalisuolapitoisuus voi olla 0,5 - 10 %, mielellään 1 - 5 %. Edullinen neutraalisuo-la on natriumkloridi. Lämpötila voi olla 0 - 50 °C, mielellään 15 - 30 °C. Me tanolimäärä voi olla 25 -45 tilavuus-%, mielellään 30 - 40 tilavuus-% käsittelyn alla olevasta koko seoksesta laskettuna. Tällöin saostuu suurimolekyylinen ja voimakkaasti sulfatoitunut kondroitiinipolysulfaatti sekä epäpuhtaudet, jotka voi- 7 70416 daan poistaa suodattamalla tai sentrifugoimalla.

Jäljellejääneen metanoliliuoksen metanolipitoisuus nostetaan 60 - 85 tilavuus-%:iin, mielellään 75 - 80 tilavuus-%:iin käsittelyn alla olevasta koko seoksesta laskettuna lisäämällä metanolia (2. metanolisaostus) ja näin saadaan kondroitiinipoly-sulfaattisakka, josta saostumattomat pienimolekyyliset ja heikosti sulfatoituneet komponentit sekä epäpuhtaudet on erotettu.

Koko metanolisaostusprosessi tai osa siitä voidaan korvata ultrasuodatuksella. Esimerkiksi ultrasuodattamalla depolymeroidun kondroitiinin vesiliuokset kalvoilla, joiden jakokyky on 6 000 tai suurempi (esim. selluloosa-asetaatti-, polyairtidi- tai polysulfo-nikalvot), on mahdollista pidättää sama ensimmäinen jae kuin edellä. Kondroitiinipolysulfaattiliuoksen väkevyys voi olla 1 - 10 %, mielellään 1 - 5 %. Liuoksen pH-arvo voi olla 2 - 14, mielellään 5 - 10. Permeaat-ti voidaan vapauttaa pienimolekyylisestä kondroitiinipo-lysulfaatista metanolisaostuksella, kuten edellä on kuvattu .

Tämä voidaan saavuttaa myös toisella ultrasuodatuk-i sella, jonka jakokyky on 8 000 tai pienempi. Kondroitii-nipolysulfaattiliuoksen väkevyys voi olla 1 - 10 %, mielellään 1 - 5 %. Liuoksen pH-arvo voi olla 2-14, mielellään 5 - 10.

Useimmissa tapauksissa kondroitiinipolysulfaatteihin eivät päde ne jakorajat, jotka ultrasuodatuskalvojen valmistajat ovat antaneet tietyille molekyylipainoille.

Näin ollen sopiva membraani pitää kussakin tapauksessa valita kokeellisesti, mutta kokemus on osoittanut, että se on mainituissa rajoissa.

Suolat, tarvittaessa raskasmetalli-ionit, ja epäpuhtaudet poistetaan kationinvaihtimen avulla. Metalli-ionit sitoutuvat protonoidussa muodossa oleviin vaihto- 8 7041 6 hartseihin ja vapaa mukopolysakkaridipolyrikkihappo siirtyy suodokseen tai eluaattiin. Käsittely voidaan suorittaa alueella 0 - 50 °C olevassa lämpötilassa, mielellään huoneenlämpötilassa. Se voidaan suorittaa panos-menetelmällä sekoittamalla kationinvaihtimen kanssa tai jatkuvalla tai epäjatkuvalla pylvästekniikalla. Sopivia ioninvaihtohartseja ovat voimakkaasti happamat tuotteet, kuten Lewatit S 100, Dowex X 50 tai Amberlite IR 120 protonoidussa muodossa.

Panosmenetelmä toteutetaan vesiliuoksessa, jonka kondroitiinipolysulfaattipitoisuus on 2 - 20 %, mielellään 5 - 15 %. Ioninvaihtohartsia voidaan käyttää 2-10 tilavuusosaa, varsinkin 3-8 tilavuusosaa, per 1 paino-osa kuivaa kondroitiinipolysulfaattia. Suolo-jenpoisto voidaan myös suorittaa samoissa olosuhteissa käyttämällä pylväsiin kaadettuja vaihtohartseja.

Demineralisointivaiheesta saatu voimakkaasti hapan suodos tai eluaatti saostetaan 2,5-6 tilavuusosalla, mielellään 3-4 tilavuusosalla metanolia, kun läsnä on 0,5 - 5 % neutraalisuolaa, varsinkin 0,5 - 3 % natriumklo-ridia. Suoritettaessa saostus happamasta väliaineesta, vapaa rikkihappo ja pienimolekyylinen kondroitiinipolysul-faattikomponentti sekä epäpuhtaudet pysyvät liuoksessa.

Kun kondroitiinipolyrikkihapposakka on erotettu, se voidaan joko saostaa uudelleen neutraalista liuoksesta tai käyttää metanolista kosteana suoraan seuraavassa prosessivaiheessa.

Demineralisointi voidaan jättää pois, jos ultrasuo-datus on suoritettu käyttämällä ultrasuodatuskalvoa, jolla on matala jakoraja (2. ultrasuodatus), jolloin pidättynyt materiaali jatkokäsitellään.

Jotta väri saataisiin vielä vaaleammaksi ja puhtaan kondroitiinipolysulfaatin väristabiilisuus olisi erittäin hyvä lämpösteriloinnin aikana, voi deminerali-sointia seurata vielä toinen puhdistusvaihe.

Kun kondroitiinipolysulfaattiliuokset käsitellään aktiivihiilellä ja adsorbaatti poistetaan kokonaan, saa- 11 9 7041 6 daan kondroitiinipolysulfaattiliuos, josta tuote pH:n säädön jälkeen saostetaan metanolilla neutraalisuolan läsnäollessa. Käsiteltävän kondroitiinipolysulfaatti-vesiliuoksen väkevyys on 5 - 25 %, mielellään 10 - 20 %. Sen pH on 4 - 10, varsinkin 5-8. Aktiivihiiltä käytetään 0,1 - 3 paino-osaa (suhteessa kondroitiinipolysulf aatin painoon). Lämpötila voi olla 20 - 100 °C. Käsittelyaika on 10 - 180 minuuttia.

Aktiivihiili erotetaan. Tässä on hyvä käyttää hie-nosuodatusta kalvosuotimen läpi, jotta saadaan täysin hiiletön liuos. pH säädetään välille 6 - 10, varsinkin välille 7 - 8, ja lopputuote saostetaan metanolilla neutraalisuolan, esim. natriumkloridin läsnäollessa, jonka väkevyys on 0,5 - 5 %, varsinkin 1 - 2 %. Metanolin loppuväkevyys säädetään 60 - 85 tilavuus-%:ksi, mielellään 75 - 80 tilavuus-%:ksi. Sopivia aktiivihiiliä ovat esim. "Brilonit normal" (Lurgi)f puhdas aktiivihiili, jonka luettelonumero on 2183 (Merck), puhdas aktiivihiili-jauhe, jonka luettelonumero on 18003 (Riedel de Haen). Aktiivihiilellä tapahtuvan värinpoiston tarve riippuu lähtöaineena käytetystä kondroitiinipolysulfaatista.

Saattaa olla edullista suorittaa puhdistetun kondroi-tiinipolysulfaatin saostus metanolilla kompleksinmuodos-tusaineen ja/tai natr.iumpyrosulfiitin läsnäollessa. Tämä on erittäin sopivaa lopputuotteen ollessa kyseessä. Näin ollen saadaan pysyviä injektioliuoksia, jotka sisältävät kondroitiinipolysulfaattia, ja jotka säilytettäessä eivät samene ja tummuvat vain sellaisessa määrin, ettei sitä voi havaita. Sopivia kompleksinmuodostaja-aineita ovat nitrilötrietikkahappDjetyleenidinitrilotetraetikkahap-po, 1,2-sykloheksyleenidinitrilotetraetikkahappo, diety-leenitriamiinipentaetikkahappo ja 3,6-dioksaoktametyleeni-dinitrilotetraetikkahappo, joiden väkevyys voi olla 0,01 - 0,5 %. Edulliset väkevyydet ovat 0,05 - 0,35 %.

Jos metanolisaostuksessa käytetään natriumpyrosulfiittia, 10 7041 6 sen väkevyys voi olla 0,01 - 0,5 %.

Kuvatulla kondroitiinipolysulfaatilla on terapeuttista merkitystä eläimille ja ihmisille. Yhdisteellä on koaguloitumista hillitsevä, trombolyyttinen, trombo-profylaktinen (varsinkin syvissä laskimotukoksissa), antiarteroskleroottinen, rasvaverisyyttä hillitsevä, tulehduksia hillitsevä, tulehdusnesteisyyttä hillitsevä, nivelten jäykistymistä hillitsevä ja virustaattinen vaikutus .

Juuri tämän keksinnön mukaiseen menetelmään kuuluvilla toimenpiteillä ja käsittelyillä saadaan uusi aine, jolle on ominaista yllättävän matala toksisuus.

TAULUKKO 1 Akuutti toksisuus --1-1-----,

Eläinlaji Antotapa j LD5Qy7 vrk --j--— - 1 NMRI-hiiret ' laskimonsisäisesti j > 3,500 mg/kg ! Wistar-rotat | -"- >3,000 mg/kg j Kissat j >1,000 mg/kg { Koirat >1,000 mg/kg , . __________ . ......... .4 — ----- .1.,,--

Keksinnön mukaisesti voidaan täten valmistaa kondroitii-nipolysulfaattia, jonka letaalista annosta vastaava akuutti toksisuus laskimonsisäisesti annettuna on > 3 5qq mr/kg NMRI-hiirillä, > 3 000 mg/kg Wistar-rotilla ja > i q0q mg/kg kissoilla ja koirilla. Edullisen keksinnön mukaisesti valmistetun tuotteen akuutisti toksinen letaalinen annos laskimonsisäisesti annettuna on / 4 000 mg/kg NMRI-hiirillä, > 3 500 mg/kg Wistar-rotilla, y χ 5000 mg/kg kissoilla ja J 1 000 mg/kg koirilla.

Tähän mennessä on kirjallisuudessa kuvattu vain sellaisia kondroitiinipolysulfaatteja, joiden LD^ (hiiret,

II

11 7041 6 laskimonsisäisesti) on vain 1 000 mg/kg. Näin ollen tämän keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan valmistaa sellaista kondroitiinipolysulfaattia, jolla on huomattavasti laajempi terapeuttinen käyttöalue.

Tarkemmin sanottuna tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetulla kondroitiinipolysulfaatilla on seuraava koostumus: typpeä 1,65 - 2,00 % rikkiä 12,50 - 14,5 % heksuronihappoa 0,98 - 1,22 mmol/g heksosamiinia 0,96 - 1,24 mmol/g

Kondroitiinipolysulfaattia, joka on valmistettu keksinnön mukaisella menetelmällä, voidaan käyttää farmaseuttisten seosten aineosana.

Kokeet ovat osoittaneet, että yksikköannoksilla, joiden suuruus on 20 - 250 mg, varsinkin 30 - 150 mg, yksilöä kohti 0,2 - 2,0 ml:ssa, varsinkin 0,2 - 1,0 mlrssa, on terapeuttinen vaikutus ihmisiin ja niitä siedetään hyvin. Vuorokausiannokset, jotka ovat korkeintaan 500 mg, ovat osoittautuneet terapeuttisesti edullisiksi. Ruiskeet voidaan antaa lihaksensisäisesti, nivelensisäisesti, ihonalaisesti tai laskimonsisäisesti, mutta tämäntyyppisiin ruiskeisiin ei välttämättä pidä rajoittua. Terapeuttisesti käytettävät vaikuttavan aineen liuokset voidaan pakata esim. ampulleihin, käyttövalmiisiin ruiskuihin, puhkaistaviin pulloihin, "injektiopyssyjen" pikkupulloihin tai muihin sopiviin pakkauksiin. Anto voi tapahtua myös suun kautta, ihon kautta, peräsuolen kautta, kielenalaisesti tai posken kautta. Edullinen annos vastaa ruiskeena annettua annosta.

Tämän keksinnön mukaisesti saatu kondroitiinipolysul-faatti sopii myös eläinten lääkityksessä käytettäväksi, jolloin sillä on kuvatut vaikutukset. Koirien annos on 12 7 041 6 0,1 - 5 mg painokiloa kohti, mielellään 0,5 - 1,5 mg/kg, 0,1 - 10 ml:ssa, varsinkin 0,5 - 1,0 ml:ssa. Esimerkiksi hevosten ollessa kyseessä on osoittautunut sopivaksi, jos annetaan yksi vuorokausiannos, jonka suuruus on 100 - 1 000 mg, mielellään 150 - 500 mg, 0,1 - 20 ml:ssa, varsinkin 1-5 ml:ssa. Kondroitiinipolysulfaatti voidaan antaa samoin kuin ihmisille.

Keskimääräinen molekyylipaino määritettiin seuraa-valla menetelmällä: 20 mg:n näyte kromatografoidaan 2 M natriumkloridi-liuokseen "Biogel P 10"-pylväässä (50 g, korkeus 100 cm, 0=2 cm). Kondroitiinipolysulfaatti ilmaistaan kerätyistä 10 ml:n jakeista määrittämällä heksuronihappo menetelmällä Z. Dische, J. Biol. Chem. 167, 189 (1947) , joka on muunnettu menetelmäksi J. D. Gregory, Arch. Biochem. Biophys. £5S), 157 (1960). Standardeina käytetään sellaisia kondroitiinipolysulfaattijakeita, joiden molekyyli- , paino on määritetty ultrasentrifugoinnilla. Keskimääräinen molekyylipaino lasketaan siitä eluaattimäärästä, johon 50 % kromatogrammista löytyneestä koko heksuroni-happomäärästä on eluoitunut.

Keksintöä valaistaan seuraavilla esimerkeillä.

Esimerkki 1a (Vaihe A) 7,5 kg epäpuhdasta kondroitiinipolysulfaattia (valmistettavissa saksalaisen patenttijulkaisun n:o 870 094 mukaan) liuotetaan 75 litraan kuumaa vettä ja lisätään 2,25 kg natriumkloridia ja 2 ml oktan-1-olia. Sitten lisätään liuos, jossa on 75 g etyleenidinitrilo-tetraetikkahappoa 750 ml:ssa 1 N natriumhydroksidiliuosta. Seos kuumennetaan 95 °C:een ja mukaan sekoitetaan 7,5 litraa 30 % vetyperoksidiliuosta. Lämpötila pidetään 100 minuuttia välillä 90 - 95 °C ja sen jälkeen se jäähdytetään nopeasti huoneenlämpötilaan.

i« 13 7041 6

Reaktioseokseen liuotetaan 1,5 kg natriumkloridia, sitten sekoitetaan mukaan 360 litraa metanolia ja 30 minuutin kuluttua emäliuos dekantoidaan pois ja sakka suodatetaan erilleen imusuodattimella. Suodattimen päällä oleva materiaali pestään metanolilla ja kuivataan alle 60 °C:ssa. Näin saadaan noin 7 kg depolymeroitunutta kondroitiinipolysulfaattia.

Esimerkki 1b (Vaihe A) 7,5 kg epäpuhdasta kondroitiinipolysulfaattia liuotetaan 22,5 litraan vettä ja ensin lisätään 1,5 kg natriumkloridia ja sitten liuos, jossa on 37,5 g kupari(2)-sulfaattipentahydraattia 750 ml:ssa vettä. Jäähdytyksen alaisena lisätään 3 litraa 30 % vetyperoksidia ja seosta pidetään 25 °C:ssa 5 tuntia. Sitten seoksen PH säädetään arvoon 10,5 30% natriumhydroksidiliuoksella, saostus suoritetaan sekoittamalla mukaan 132 litraa metanolia, emäliuos dekantoidaan pois ja sakka imusuo-datetaan. Suodattimen päällä oleva materiaali pestään metanolilla ja kuivataan alle 60 °C:ssa. Näin saadaan noin 6,8 kg depolymeroitunutta kondroitiinipolysulfaattia.

Esimerkki 1c (Vaihe A) 9 kg epäpuhdasta kondroitiinipolysulfaattia liuotetaan 45 litraan vettä, lisätään liuos, jossa on 8,57 g koboltti(2)kloridiheksahydraattia 1 litrassa vettä, ja näin saadun seoksen tilavuus täytetään vedellä 67 litraan. 1,35 litraa 40 % peretikkahappoliuosta lisätään huoneenlämpötilassa 2 tunnin aikana jatkuvasti sekoittaen. Sitten lisätään liuos, jossa on 27 g dinat-riumetyleenidinitrilotetra-asetaattidihydraattia 1 litrassa vettä. Tämän jälkeen pH säädetään 30 % natriumhydroksidiliuoksella arvoon 11, lisätään 2,2 kg natriumkloridia ja suoritetaan saostus sekoittamalla mukaan 14 7041 6 290 litraa metanolia. Tunnin kuluttua emäliuos dekan-toidaan pois, sakka suodatetaan erilleen imusuodatti-mella ja suodattimen päällä oleva materiaali pestään metanolilla ja kuivataan alle 60 °C:ssa. Näin saadaan noin 8,4 kg depolymeroitunutta kondroitiinipolysulfaat-tia.

Esimerkki 2 (Vaihe B) 8,0 kg depolymeroitunutta kondroitiinipolysulfaat-tia liuotetaan 74 litraan vettä, liuokseen sekoitetaan 2 litraa 40 % peretikkahappoa, pH säädetään 30 % natrium-hydroksidiliuoksella arvoon 8 ja näin saatu seos jätetään seisomaan huoneenlämpötilaan 24 tunniksi. 0,4 kg natriumkloridia liuotetaan ja suoritetaan saostus 320 litralla metanolia. Sakka suodatetaan pois, pestään metanolilla ja kuivataan. Näin saadaan 7,9 kg valkoista materiaalia.

Esimerkki 3a (Vaihe C) 6,3 kg depolymeroitunutta kondroitiinipolysulfaat-tia liuotetaan 27,1 litraan kuumaa vettä, lisätään 3,15 litraa 40 % peretikkahappoa, sekoitetaan ja seos jätetään seisomaan 4 tunniksi. Sitten lisätään 45,4 litraa vettä, seokseen liuotetaan 2,1 kg natriumkloridia ja pH säädetään 30 % natriumhydroksidiliuoksella arvoon 10,5. Jotta metanoliväkevyydeksi saataisiin 36,5 tilavuus-% seoksesta, mukaan sekoitetaan 0,5748 litraa metanolia per litra liuosta, so. esim. 48,6 litraa. Saostettava seos jätetään seisomaan yön ajaksi ja sitten emäliuos dekantoidaan pois ja puolinestemäinen sakka sentrifugoidaan erilleen. Kirkkaaseen emäliuokseen, jonka tilavuus on esim. 128,5 litraa, sekoitetaan 2,175 litraa metanolia per litra liuosta, so. esim.

279,5 litraa metanolia, niin, että lopullinen metanoli-väkevyys on 80 tilavuus-%. Sakan annetaan laskeutua 1 tunnin ajan, emäliuos dekantoidaan pois ja jäljelle

II

15 7041 6 jäänyt suspensio imusuodatetaan. Sakka pestään meta-nolilla ja kuivataan alle 60 °C:ssa. Näin saadaan noin 5,6 kg välituotetta.

Esimerkki 3b (Vaihe C) 2 kg depolymeroitunutta kondroitiinipolysulfaattia liuotetaan 200 litraan vettä ja liuos suodatetaan steriili- suodattimen läpi ja suoritetaan ultrasuodatus 280 kPa paineessa 32 °C:ssa käyttämällä levyultrasuodatuslait- 2 teistoa ( kalvon ala 2,25 m , selluloosa-asetaattikal-volle ilmoitettu jakoraja on molekyylipaino 15 000).

3

Liuosta pumpataan virtausnopeudella 6,5 m /h. Kun pidättyneen materiaalin tilavuus on noin 20 litraa, se ultrasuodatetaan 3 kertaa sekoittamalla joka kerta ensin 50 litran kanssa vettä.

Yhdistetyt permeaatit ultrasuodatetaan selluloosa-asetaattikalvolla, jonka ilmoitettu jakoraja on 6 000, mutta olosuhteet ovat muuten samat kuin yllä. Pidättynyt materiaali väkevöidään 10 % pitoisuuteen, natrium-kloridia lisätään väkevyyteen 0,5 %, pH säädetään arvoon 7,5 ja saostus suoritetaan 4 tilavuusosalla meta-nolia samalla sekoittaen. Sakka imusuodatetaan, pestään ja kuivataan. Näin saadun välituotteen paino on 1,78 kg.

Esimerkki 4a (Vaihe D) 5,4 kg vaiheessa 3 saatua välituotetta liuotetaan 54 litraan vettä, mukaan sekoitetaan 21,6 litraa proto-noidussa muodossa olevaa voimakkaasti hapanta kationin-vaihdinta (esim. "Lewatit S 100") ja seosta sekoitetaan huoneenlämpötilassa 1 tunti. Kationinvaihtaja suodatetaan pois imun avulla ja huuhdotaan kahdesti 8,1 litralla vettä ja suodokset yhdistetään. Suodokseen lisätään 2,19 kg natriumkloridia ja saostus suoritetaan sekoittamalla mukaan 292 litraa metanolia. Saostuserä 16 7041 6 jätetään seisomaan yön ajaksi, emäliuos dekantoidaan pois, jäljellejäänyt suspensio imusuodatetaan ja suodattimen päälle jäänyt materiaali pestään perusteellisesti metanolilla. Sakka liuotetaan 43,2 litraan vettä, pH säädetään 30 % natriumhydroksidiliuoksella arvoon 30 %, lisätään 700 g natriumkloridia ja suoritetaan saostus sekoittamalla mukaan 139,2 litraa meta-nolia. Kirkas emäliuos dekantoidaan pois, jäljellejäänyt suspensio imusuodatetaan ja suodattimen päällä oleva materiaali pestään metanolilla. Kuivataan ja saadaan 3,6 kg demineralisoitua kondroitiinipolysulfaattia .

Esimerkki 4b (Vaihe D) 9 kg prosessivaiheen jälkeen saatua välituotetta tai tästä vaiheesta saatua vielä metanolista kosteata sakkaa liuotetaan sellaiseen vesimäärään, että saadaan 90 litraa liuosta. Tämän liuoksen annetaan valua ionin-vaihtopylvään läpi, joka on täytetty 36 litralla katio-ninvaihtajaa ("Amberlite IR 120” H+-muodossa). Täytetyn kolonnin pituuden suhde halkaisijaan on esim. noin 2,5 ; 1. Kun liuos on virrannut läpi, pylväs pestään 33,3 litralla vettä. 3,7 kg natriumkloridia lisätään tuotteen sisältäviin yhdistettyihin suodoksiin ja suoritetaan saostus lisäämällä 492 litraa metanolia. Sakka imusuodatetaan, pestään metanolilla ja liuottimesta kostea sakka liuotetaan pyrogeenittömään veteen, niin, että kokonaistilavuudeksi tulee 72 litraa. 1,15 kg natriumkloridia lisätään, pH säädetään 30 % natriumhydroksidiliuoksella arvoon 7,5 ja suoritetaan saostus 219 litralla metanolia. Sakka imusuodatetaan, pestään metanolilla ja kuivataan. Näin saadaan noin 6 kg demineralisoitua kondroitiinipolysulfaattia.

M

17 7041 6

Esimerkki 5 (Vaihe E) 20 kg demineralisoitua kondroitiinipolysulfaattia liuotetaan 190 litraan pyrogeenitöntä vettä. Liuos kuumennetaan 90 °C:een ja lisätään 40 kg aktiivihiiltä (Riedel de Haen No. 18003). Seosta pidetään 60 minuuttia 90 °C:ssa ja sen jälkeen se suodatetaan paine-suotimella vielä kuumana. Hiilijäännös pestään kahdesti 40 litralla pyrogeenitöntä vettä ja suodokset yhdistetään. Lisätään 3 kg natriumkloridia ja 660 g dinatriumetyleeni-dinitrilotetra-asetaattidihydraattia. pH säädetään arvoon 7,5. Sitten seos suodatetaan esipestyn kalvosuoti-men läpi (huokoshalkaisija 0,2 m) . Täysin kirkas liuos saostetaan lisäämällä 720 litraa metanolia ja sekoittamalla. Sakka imusuodatetaan, pestään metanolil-la ja kuivataan alle 50 °C:ssa. Näin saadaan noin 18 kg valkoista, hienojakoista, puhdasta ja injektointikelpois-ta kondroitiinipolysulfaattia. Aineen kemiallinen analyysi antaa seuraavan tuloksen: N: 1,77% S: 12,96 % heksuronihappo: 1,08 mmol/g heksosamiini: 1,12 mmol/g

Esimerkki 6 (Injektioliuoksen valmistus) 3,25 kg, vedettömänä aineena laskettuna, puhdasta kondroitiinipolysulfaattia ja 0,325 kg natriumkloridia liuotetaan 50 litraan injektiokelpoista vettä (aqua pro iniectabilia) samalla sekoittaen ja tilavuus täytetään 65 litraksi. Sitten pH säädetään N natrium-hydroksidiliuoksella arvoon 8,4 , suodatetaan steriiliksi kalvosuodattimen läpi ja ampullit täytetään liuoksella sterilitekniikkaa noudattaen tunnetulla tavalla. Tiiviisti suljettuja ampulleja lämpökäsitellään kiehuvalla vedellä vesihauteella 60 minuuttia.

Claims (9)

18 7041 6

1. Menetelmä injektoitavan kondroitiinipolysulfaatin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että A) epäpuhdas kondroitiinipolysulfaatti depolymeroidaan hapettamalla, B) tarvittaessa depolymeroitu kondroitiinipolysulfaatti valkaistaan peretik-kahapolla, C) vaiheesta A tai B saadusta tuotteesta eristetään molekyylipainoltaan määrätty fraktio poistamalla suuremman molekyylipainon omaava aines metanolisa-ostuksella käyttäen 25-45 % metanolia seoksen koko tilavuudesta tai ultra-suodatuksella käyttäen suodatuskalvoa, jonka jakoraja on vähintään 6000, ja erottamalla fraktioon kuuluva aines pienemmän molekyylipainon omaavasta aineksesta toisella metanolisaostuksella käyttäen 60-85 % metanolia seoksen koko tilavuudesta tai toisella ultrasuodatuksella käyttäen suodatuskalvoa, jonka jakoraja on korkeintaan 8000, D) vaiheessa C saatu tuote demineralisoidaan tarvittaessa kationivaihtimen avulla ja E) vaiheessa C tai D saadusta tuotteesta poistetaan tarvittaessa väri aktiivihiilen avulla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheen A hapettamalla tapahtuva depolymerointi suoritetaan ilman raskasmetallien läsnäoloa.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se suoritetaan kompleksinmuodostusaineen läsnäollessa.

4. Patenttivaatimuksen I mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa A hapettamalla tapahtuva depolymerointi suoritetaan vetyperoksidilla raudan, koboltin, kuparin, mangaanin ja/tai vanadiinin suolojen läsnäollessa.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa A hapettamalla tapahtuva depolymerointi suoritetaan peretikkaha-polla raudan, koboltin ja/tai mangaanin suolojen läsnäollessa. 7041 6

6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktioseoksen raskasmetalliväkevyys pidetään välillä 0,001-0,5 % (paino/ tilavuus).

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peretikkahappokäsittely B sisällytetään molekyylipainon mukaan tapahtuvaan fraktiointiprosessiin C.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puhdas kondroitiinipolysulfaatti seostetaan metanolilla siten, että läsnä on 0,01-0,5 % kompleksinmuodostaja-ainetta.

9. Patenttivaatimuksen 1 tai 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puhdistettu kondroitiinipolysulfaatti saostetaan metanolilla siten, että läsnä on 0,01-0,5 % natriumpyrosulfiittia. 7041 6 20