DK160317B - Fremgangsmaade til fremstilling af et injicerbart chondroitinpolysulfat - Google Patents

Description

i

DK 160317 B

Både fremstillingen af chondroitinpolysulfat, specielt sulfateringen af chondroitinsulfat, og forskellige måder til behandling af chondroitinsulfat -råprodukter med henblik på rensning er tidligere 5 beskrevet (S. Bergstrfim, Hoppe-Seyler's Z.f. physiol.

Chemie 238, 163; 1936 - Chargaff, F.W. Bancroft J.biol. Chem. 115, 149, 155; 1936 - Husemann et al. Z.

Ges. Exp. Med. 114, 722; 1945 - J. Piper Acta Pharm.

Toxicol. 2, 317; 1946 - P. Karrer, H. Koenig, E. Usteri, 10 Helv. chim. acta .26, 1296; 1943 - tysk patentskrift 870.094 - tysk patentskrift 935.843 - tysk patentskrift 968,752 - tysk offentliggørelsesskrift 1,618.857 -U.S.A. Patentskrift 3.454,560 og DDE. patentskrift 136.572), Imidlertid fører ingen af disse fremgangs-15 måder til et tilfredsstillende produkt,

Toxiciteten, som stadig er for høj på trods af tekniske fremskridt, og andre ulemper ved chon-dronitinpolysulfater, fremstillet ved hidtil kendte fremgangsmåder, hindrer risikofri terapeutisk anvendelse 20 af disse stoffer til injektion.

Ved opfindelsen er det derfor tilsigtet, på en økonomisk fordelagtig måde, at opnå meget ren chondroitinpolysulfat, ved hvilken ulemperne ved kendte chondroitinpolysulfater er reduceret til et 25 minimum. Et sådant chondroitinpolysulfat vil kunne anvendes i en hvilken som helst administrationsform ved terapi af sygdomme hos mennesker og dyr.

Det tilsigtede opnås ved en fremgangsmåde, af hvilken det væsentlige fremgår af følgende: 30 oxidativ depolymerisering af rå chondroitinpolysulfat ved kendte fremgangsmåder, om nødvendig blegning med pereddikesyre, isolering af en fraktion med gennemsnitlig molekylvægt på 5000 - 15000 ved udfældning med methanol og/eller ultrafiltrering, om nødvendigt 35 demineralisering med ionbyttere og om nødvendigt behandling med aktivt trækul.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til fremstilling af et injicerbart chondroitinpolysulfat,

DK 160317B

2 som er ejendommelig ved, at man (a) oxidativt depolymeriserer rå chondroitinpolysulfat, (b) om nødvendigt bleger den depolymeriserede condroi-tinpolysulfat med pereddikesyre, 5 (c) underkaster produktet opnået ifølge (a) eller (b), udfældning en eller to gange med methanol og/eller ultrafiltrering til fraktionering med hensyn til molekylvægt, (d) om nødvendigt demineraliserer produktet opnået 10 ifølge (c) med kationbyttere, og (e) om nødvendigt affarver produktet opnået ifølge (c) eller (d) med aktivt trækul.

Hidtil kendte fremgangsmåder, f.eks. de der er beskrevet i de ovennævnte litteraturhenvisninger, kan 15 anvendes til opnåelse af det rå chondroitinpolysulfat, der anvendes som udgangsmateriale. Uden at begrænse opfindelsen til denne fremgangsmåde eller til en af de ovennævnte fremgangsmåder til fremstilling af rå chondroitinpolysulfat, er det muligt som udgangsmate-20 riale at anvende et produkt, der er opnået ved sulfatering af chondroitinsulfat med pyridin og chlorsulfon-syre. Der kan anvendes chondroitinpolysulfater med meget varierende farver. Det er også muligt at anvende højmolekylære chondroitinpolysulfater stammende fra 25 trin (c) i fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Følgende reagenser kan anvendes til indstilling af pH-værdien ved den nedenfor beskrevne fremgangsmåde: syrer, såsom uorganiske syrer, f.eks. saltsyre, og lavere alifatiske carboxylsyrer eller persyrer deraf, f.eks.

30 eddikesyre eller pereddikesyre, og alkalier, såsom alkalimetalhydroxid-opløsninger, f.eks. natriumhydroxidopløsning eller kaliumhydroxidopløsning. Det foretrækkes at udføre de enkelte trin i fremgangsmåden under normalt tryk. Med mindre andet er anført, er procent-35 angivelserne i det følgende vægt/volumen-procent. Ved beskrivelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen er methanol angivet som udfældningsmiddel· for mellemprodukter og slutprodukt. Andre med vand blandbare orga-

DK 160317 B

3 niske væsker, såsom f.eks. ethanol, isopropanol, acetone, tetrahydrofuran og dioxan, er ligeledes anvendelige. Mellemprodukterne, som fremstilles ved de enkelte trin i fremgangsmåden, behøver ikke nødvendigvis at 5 isoleres som tørre stoffer. Det er også muligt at vide-rebehandle materialerne, som er fugtige af opløsningsmiddel, uden at tørre dem. Under udfældning af chon-droitinpolysulfat med opløsningsmidler, der er blandbare med vand, er det hensigtsmæssigt at tilsætte 10 salte i en koncentration på fra 0,1 til 10%, fortrinsvis 0,5 til 5%. Særligt egnede salte er natrium- eller kaliumchlorid og natrium- eller kaliumacetat.

Betingelserne for trinene (a) til (e) af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som beskrives mere de-15 taljeret i det følgende, kan varieres indenfor vide grænser. Således er de nedenfor for de individuelle trin anførte parametre ikke obligatoriske, men kun anvendt i forbindelse med en hensigtsmæssig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen, således 20 at opfindelsen ikke er begrænset til disse parametre.

Chondroitinpolysulfat kan depolymeriseres med hydrogenperoxid i fravær af tungmetaller. Depolymeri-seringen kan udføres i vandig opløsning under følgende betingelser: koncentrationen af rå chondroitinpoly-25 sulfat kan være 2-35%, fortrinsvis 10-20%. Koncentrationen af hydrogenperoxid i reaktionsmediet kan være 0,3-15%, fortrinsvis 1-5%. Reaktionstemperaturen kan være 20-100°C, fortrinsvis 50-100°C. Reaktionstiden er fra 10 minutter til 24 timer, fortrinsvis fra 30 30 til 200 minutter. pH-Værdien kan holdes konstant på mellem 3 og 9 eller kan være ujusteret og er fortrinsvis mellem 4,5 og 7.

Tilstedeværende tungmetaller kan blokeres med kompleksdannere, såsom nitrilotrieddikesyre, ethylen-35 dinitrilotetraeddikesyre, 1,2-cyclohexylendinitrilo-tetraeddikesyre, diethylentriaminpentaeddikesyre, 3,6-dioxaoctamethylendinitrilotetraeddikesyre eller blandinger deraf eller alkalimetalsalte deraf. Koncen-

DK 160317 B

4 trationen af kompleksdanneren i reaktionsmediet holdes mellem 0,001 og 0,5%, fortrinsvis mellem 0,005 og 0,15%. Efter afslutning af reaktionen kan reaktionsproduktet udfældes med et overskud af methanol efter tilsætning 5 af et alkalimetalsalt med eller uden afkøling og isoleres.

Depolymeriseringen af chondroitinpolysulfat med hydrogenperoxid kan også udføres i nærvær af tungmetalsalte under specielt milde betingelser. Depolymerise-10 ringen udføres f.eks. på følgende måde: Koncentrationen af rå chondroitinpolysulfat kan være 2-35%, fortrinsvis 15-30%. Koncentrationen af hydrogenperoxid i reaktionsopløsningen kan være 0,5-15%, fortrinsvis 1-5%. Reaktionstemperaturen kan være fra -10°C til +80°c, for-15 trinsvis fra 0°C til 30°C. Reaktionstiden kan være fra 5 minutter til 24 timer, fortrinsvis fra 30 til 500 minutter.

pH-Værdien kan være mellem 3 og 8, fortrinsvis mellem 4,5 og 7,5. Tungmetalsalte, som har vist sig 20 egnede, er uorganiske og organiske salte af jern, cobolt, kobber, mangan og vanadin. De i disse salte indgående metaller er hensigtsmæssigt til stede i følgende valenser: jern og cobolt: di- og trivalent, kobber: mono- og di-valent, mangan: di-, tri-, tetra-, 25 hexa- og heptavalent, og vanadin: di- og pentavalent. Koncentrationen af metalsalt indstilles til mellem . 0,001 og 0,5%, fortrinsvis mellem 0,05 og 0,2%. Efter nedbrydningen indstilles pH-værdien til mellem 5 og 14, fortrinsvis mellem 6 og 10, og det depolymeriserede 30 produkt isoleres ved udfældning med methanol.

Den oxidative depolymerisering af chondroitinpolysulfat kan udføres ved oxidativ nedbrydning af chondroitinpolysulfat med pereddikesyre i nærværelse af visse tungmetalsalte med samme resultat som ved 35 de ovennævnte fremgangsmåder. Følgende betingelser har vist sig at være fordelagtige for udførelse af reaktionen: koncentrationen af rå chondroitinpolysulfat kan være 5-35%, fortrinsvis 10-25%. Koncentrationen

DK 160317 B

5 af pereddikesyre i reaktionsopløsningen kan være 0,1-7%, fortrinsvis 0,5-2%. Koncentrationen af et tungmetalsalt kan være fra 0,001-0,5%, fortrinsvis fra 0,005-0,2%. Reaktionstemperaturen kan være fra -10°C til 5 +90°C, fortrinsvis fra 0°C til 30°C. Reaktionstiden kan være fra 5 minutter til 24 timer, fortrinsvis fra 15 minutter til 500 minutter. pH-Værdien kan være 2-12, fortrinsvis 3-8.

Reaktionen forløber hurtigt med f.eks. uorganiske 10 eller organiske salte af følgende tungmetaller: jern, cobolt, kobber, mangan og vanadin. Angående valensen af metallerne i disse metalsalte gælder det samme som anført ovenfor for depolymerisering med hydrogenper-oxid. Det kan være hensigtsmæssigt at standse depoly-15 meriseringen ved hjælp af et chelatdannende middel, såsom f.eks. ethylendinitrilotetraeddikesyre eller andre metalblokerende midler, specielt i tilfælde af forholdsvis korte reaktionstider.Det depolymeriserede chondroitinpolysulfat kan udfældes med methanol, om 20 nødvendigt efter tilsætning af et neutralt salt og indstilling af pH-værdien til mellem 3 og 14, fortrinsvis mellem 6 og 10.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes rå chondroitinpolysulfater, som varierer meget med 25 hensyn til renhed og farve. Til trods for depolymeri-seringen, ved hvilken farven bliver meget lysere, kan det være nødvendigt at udføre en affarvning eller blegning før viderebehandling. Blegning udføres med pereddikesyre. Følgende betingelser har vist sig at 30 være fordelagtige: pH-værdien kan være fra 2,5 til 14, fortrinsvis fra 3 til 11. Koncentrationen af pereddikesyre kan være 0,1-10%, fortrinsvis 1-5%. Koncentrationen af rå chondroitinpolysulfat kan være 2-40%, fortrinsvis 5-25%. Reaktionen udføres ved en temperatur 35 fra 0 til 100°C, fortrinsvis fra 15 til 70°C. Reaktionstiden kan være fra 1 minut til 96 timer, fortrinsvis fra 1 time til 24 timer.

Ifølge en foretrukken udførelsesform for frem-

DK 160317 B

e gangsmåden ifølge opfindelsen kan behandlingen med pereddikesyre indarbejdes i den følgende fraktionering efter molekylvægt. Som allerede nævnt kan behandlingen med pereddikesyre også fuldstændig udelades.

5 Materialet med molekylvægt fra ca. 5000 til 15000 skilles fra produktet opnået efter blegningseller depolymeriseringstrinet ved udfældning med methanol i forskellige koncentrationer.

I dette trin kan dopolymeriseret og om nødven-10 digt bleget chondroitinpolysulfat behandles i vandig opløsning med methanol i nærværelse af et neutralt salt på følgende måde (første udfældning med methanol): koncentrationen af depolymeriseret chondroitinpolysulfat i den vandige opløsning kan være 5-30%, fortrins-15 vis 5-20%. pH-Værdien kan være fra 2 til 10, fortrinsvis fra 3,0 til 7,5. indholdet af neutralt salt kan være 0,5-10%, fortrinsvis 1-5%. Som neutralt salt foretrækkes natriumchlorid. Temperaturen kan være fra 0 til 50°C, fortrinsvis fra 15 til 30°C. Mængden af 20 methanol kan være 25-45 volumen%, fortrinsvis 30-40 volumen% i forhold til hele det medium, der anvendes ved behandlingen.Sannen med urenheder udfældes højmolekylært og i høj grad sulfateret chondroitinpolysulfat, som kan fjernes ved filtrering eller centrifugering.

25 Den tilbageværende methanolholdige opløsning bringes til en methanoIkoncentration på 60-85 volumen%, fortrinsvis 75-80 volumen% i forhold til hele mediet, der anvendes til behandling, ved yderligere tilsætning af methanol (anden udfældning med methanol), og der 30 opnås et bundfald af urenheder og chondroitinpolysulfat, hvorfra de meget lavmolekylære og i ringe grad sulfaterede bestanddele er fjernet, idet disse ikke udfældes.

Hele fraktioneringen med methanol eller en del 35 af denne kan erstattes med ultrafiltrering. F.eks. kan vandige opløsninger af depolymeriseret chondroitinpolysulfat ultrafiltreres med membraner med en udelukkelsesgrænse fra 6000 og derover (f.eks. membraner af

DK 160317 B

7 celluloseacetat, polyamid eller polysulfon), og det er herved muligt at tilbageholde samme første fraktion som beskrevet ovenfor. Koncentrationen af chondroitinpoly-sulfat-opløsningen kan være 1-10%, fortrinsvis 1-5%.

5 pH-Værdien af opløsningen kan være fra 2 til 14, fortrinsvis fra 5 til 10. Fra permeatet kan lavmolekylært chondroitinpolysulfat fjernes ved udfældning med methanol som beskrevet ovenfor.

Dette kan også opnås ved en anden efterfølgende 10 ultrafiltrering med membraner med en udelukkelsesgrænse for højst 8000. Koncentrationen af chondroitin- polysulfat-opløsningen kan være 1-10%, fortrinsvis 1-5%. pH-Værdien af opløsningen kan være fra 2 til 14, fortrinsvis fra 5 til 10.

15 Udelukkelsesgrænsen for stoffer af en vis mole kylvægt angivet af fabrikanterne af ultrafiltreringsmembraner gælder i de fleste tilfælde ikke chondroitin-polysulfater. Den egnede membran må derfor i det enkelte tilfælde findes ved forsøg, men erfaringen viser, 20 at den er indenfor det anførte område.

Fjernelsen af salte, om nødvendigt tungmetalioner, og urenheder opnås ved behandling med en kation-bytter. Metalionerne bindes af ionbytterharpikserne i protoneret form, og den frie mucopolysaccharid-poly-25 svovlsyre passerer til filtratet eller eluatet. Behandlingen kan udføres ved en temperatur fra 0 til 50°C, hensigtsmæssigt ved stuetemperatur. Den kan udføres chargevis ved omrøring i kationbytteren, eller ved kontinuerlig eller diskontinuerlig søjleteknik. Egnede 30 ionbytterharpikser er stærkt sure produkter, såsom f.eks. Lewatit S 100, Dowev X 50 eller Amberiite IR 120 i protoneret form.

Den chargevise fremgangsmåde udføres i vandig opløsning med en chondroitinpolysulfat-koncentration på 35 2-20%, fortrinsvis 5-15%. Mængden af ionbytterharpiks kan være 2-10 volumendele, fortrinsvis 3-8 volumendele, i forhold til 1 vægtdel chondroitinpolysulfat-tørstof. Fjernelsen af salte kan også udføres under samme betin-

DK 160317 B

8 gelser ved anvendelse af ionbyttere i søjleform.

Det stærkt sure filtrat eller eluat fra deminera-liseringstrinet underkastes udfældning med 2,5-6 volumendele, fortrinsvis 3-4 volumendele, methanol i nær-5 værelse af 0,5-5% af et neutralt salt, fortrinsvis 0,5-3% natriumchlorid. Ved udfældningen fra surt medium forbliver fri svovlsyre og lavmolekylær chondroitin-polysulfat samt urenheder i opløsning. Når chondroitin-polysvovlsyrebundfaldet er fraskilt, kan det enten 10 genfældes fra neutral opløsning eller anvendes direkte til det næste trin i fremgangsmåden ifølge opfindelsen, medens det endnu er fugtigt af methanol.

Demineraliseringen kan udelades, hvis der er udført ultrafiltrering med anvendelse af en ultrafil-15 treringsmembran med en lav udelukkelsesgrænse (anden ultrafiltrering), i hvilket tilfælde det tilbageholdte materiale viderebehandles.

For at få en lysere farve og for at opnå en specielt god farvestabilitet under varmesterilisationen 20 af det rene chondroitinpolysulfat kan demineraliseringen efterfølges af et yderligere rensningstrin.

Behandling af chondroitinpolysulfat-opløsninger med aktivt trækul og fuldstændig fjernelse af adsorbate t fører til en chondroitinpolysulfat-opløsning, 25 fra hvilken produktet, efter at pH-værdien er indstillet, udfældes med methanol i nærværelse af et neutralt salt. Koncentrationen af den vandige chondroitinpoly-sulfat-opløsning, som skal behandles, er 5-25%, fortrinsvis 10-20%. Dens pH-værdi er fra 4 til 10, for-30 trinsvis fra 5 til 8. Der anvendes 0,1 til 3 vægtdele aktivt trækul (i forhold til 1 vægtdel chondroitinpolysulfat) . Temperaturen kan være f£a 20 til 100°C. Behandlingstiden er fra 10 til 180 minutter.

Det aktive trækul fraskilles. Derefter er fin-35 filtrering gennem et membranfilter tilrådelig til opnåelse af en opløsning, der er fuldstændig fri for trækul. pH-Værdien indstilles til fra 6 til 10, fortrinsvis fra 7 til 8, og slutproduktet udfældes med

DK 160317 B

9 methanol i nærværelse af et neutralt salt, f.eks. na-triumchlorid i en koncentration på 0,5-5%, fortrinsvis 1-2%. Slutkoncentrationen af methanol indstilles til 60-85 volumen%, fortrinsvis 75-80 volumen%. Eksempler 5 på egnet aktivt trækul er Brilonit normal (Lurgi), active charcoal pure, Cat. No. 2183 (Merck), active charcoal pure, powder, Cat. No. 18003 (Riedel de Haen).

Om der udføres affarvning med aktivt trækul afhænger af det chondroitinpolysulfat, der anvendes som udgangs-10 materiale.

Det kan være hensigtsmæssigt at udføre udfældningen af det rensede chondroitinpolysulfat med methanol i nærværelse af en kompleksdanner og/eller natrium-pyrosulfit. Denne foranstaltning er specielt velegnet 15 for såvidt angår slutproduktet. Herved opnås injektionsopløsninger indeholdende chondroitinpolysulfat, som når de lagres er fri for uklarheder og ikke mørkner i væsentlig grad. Eksempler på egnede kompleks-dannere er nitrilotrieddikesyre, ethylendinitrilo-20 tetraeddikesyre, 1,2-cyclohexylendinitrilotetraeddike-syre, diethylentriaminpentaeddikesyre og 3,6-dioxa-octamethylendinitrilotetraeddikesyre i koncentrationer på 0,01-0,5%, fortrinsvis 0,05-0,35%. Koncentrationen af natriumpyrosulfit, som kan anvendes under udfæld-25 ningen med methanol, kan være 0,01-0,5%.

Det omhandlede chondroitinpolysulfat har terapeutisk anvendelighed til mennesker og dyr. Stoffet har en antikoagulerende, thrombolytisk, thrombopro-phylaktisk (specielt mod thrombose i dybe vener), 30 antiatherosclerotisk, antilipemisk, antiinflammatorisk, antiexudativ, antiarthrotisk og virustatisk virkning.

Et typisk hidtil ukendt stof, som er ejendommeligt ved en overraskende lav toxicitet, opnås ved det specielle forløb og arten af behandlingerne ved frem-35 gangsmåden ifølge opfindelsen.

10

DK 160317 B

Tabel 1

Akut toxicitet

Dyreart Administration LD50/7d 5 NMRI mus \ i.v. >3500 mg/kg

Wistar rotter i.v. >3000 mg/kg

Katte i.v. >1000 mg/kg

Hunde i.v. >1000 mg/kg 10

Et chondroitinpolysulfat med en akut toxicitet svarende til en letal dosis efter intravenøs administration på >3500 mg/kg til NMRI mus, på >3000 mg/kg til Wistar rotter og på >1000 mg/kg til katte og hunde. Et foretrukket produkt har en akut toxicitet svarende til en letal dosis efter intravenøs administrering på >4000 mg/kg til NMRI mus, på >3500 mg/kg til Wistar rotter, på >1500 mg/kg til katte og på >1000 mg/kg til hunde.

20 Chondroitinpolysulfater med LD,-q (mus, i.v.) på kun 1000 mg/kg er tidligere beskrevet i litteraturen. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan således fremstilles chondroitinpolysulfater med et væsentlig større terapeutisk anvendelsesområde.

25 Specielt har chondroitinpolysulfatet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen følgende sammensætning: nitrogen: 1,65 - 2% svovl: 12,5 - 14,5% 30 hexuronsyre: 0,98 - 1,22 mmol/g hexosamin: 0,96 - 1,24 mmol/g

Forsøg har vist, at enkeltdoser på mellem 20 og 250 mg, fortrinsvis mellem 30 og 150 mg, pr. individ i 0,2-2,0 ml, fortrinsvis 0,2-1,0 ml, har en terapeutisk 35 virkning hos mennesker og tåles godt. Daglige doser på op til 500 mg har vist sig at være terapeutisk hensigtsmæssige. Injektionen kan være intramuskulær, intraartikulær, subkutan eller intravenøs, uden at 11

DK 160317 B

lægen er bundet specielt til kun disse typer for injektion. Terapeutisk anvendelige opløsninger af den aktive forbindelse kan f.eks. pakkes i ampuller, brugsklare sprøjter, gennemstikkelige flasker, flasker til injek-5 tionsapparater og andre sædvanlige pakninger til injektionsformål. Andre administrationsmåder er peroral, perkutan, rektal, sublingal eller buccal administration. Den foretrukne dosis svarer til den, der er angivet for administrering ved injektion.

10 Det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnåede chondroitinpolysulfat er også egnet til anvendelse indenfor veterinærmedicinen, hvor det udviser de beskrevne virkninger. Dosis til hunde er mellem 0,1 og 5 mg/kg legemsvægt pr. dag, fortrinsvis 0,5 til 1,5 mg/kg, 15 i et volumen på 0,1-10 ml, fortrinsvis 0,5-1,0 ml. I tilfælde af f.eks. heste har daglige enkeltdoser på 100-1000 mg, fortrinsvis 150-500 mg, i 0,1-20 ml, fortrinsvis 1-5 ml, vist sig egnede. Chondroitinpolysul-fatet kan administreres på samme måde som til mennesker.

20 Følgende fremgangsmåde blev anvendt til bestem melse af den gennemsnitlige molekylvægt:

En prøve på 20 mg chromatograferes i 2 M natrium-chlorid-opløsning på en Biogel P 10-søjle (50 g; højde= 100 cm, diameter = 2 cm). Chondroitinpolysulfatet på-25 vistes i de opsamlede 10 ml fraktioner, ved bestemmelse af hexuronsyre ved fremgangsmåden ifølge Z. Dische: J.Biol. Chem. 167, 189 (1947) modificeret af J.D.

Gregory: Arch. Biochem. Biophys. 8j), 157 (1960) . Chon-droitinpolysulfat-fraktioner, i hvilke molekylvægten 30 er bestemt ved ultracentrifugering, anvendes som standarder. Den gennemsnitlige molekylvægt beregnes udfra volumenet af eluat, hvori 50% af den totale mængde påvist hexuronsyre i chromatogrammet elueres.

Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de 35 følgende eksempler, hvor eksemplerne 1-5 belyser de forskellige trin i fremgangsmåden ifølge opfindelsen, og eksempel 6 belyser anvendelsen af det ved fremgangsmåden 12

DK 160317 B

fremstillede produkt.

Eksempel la (trin (a)) 7.5 kg rå chondroitinpolysulfat (som kan opnås 5 ved fremgangsmåden ifølge tysk patentskrift 870.094) opløses i 75 liter varmt vand, og der tilsættes 2,25 kg natriumchlorid og 2 ml octan-l-ol. Derefter tilsættes en opløsning af 75 g ethylendinitrilotetraeddikesy-re i 750 ml 1 N natriumhydroxid-opløsning. Blandingen 10 opvarmes til 95°C, og der irøres 7,5 liter 30%'s hydro-genperoxid-opløsning. Temperaturen holdes mellem 90 og 95°C i 100 minutter, hvorefter blandingen hurtigt afkøles til stuetemperatur.

1.5 kg natriumchlorid opløses i reaktionsblan-15 dingen, 360 liter methanol irøres, og efter 30 minutters forløb fradekanteres den klare overstående væske, og bundfaldet frafiltreres på et sugefilter. Materialet på filteret vaskes med methanol og tørres ved en temperatur under 60°C. Herved opnås ca. 7 kg depolymeriseret 20 chondroitinpolysulfat.

Eksempel lb (trin (a)) 7.5 kg rå chondroitinplolysulfat opløses i 22,5 liter vand, og der tilsættes først 1,5 kg natriumchlo- 25 rid og derefter en opløsning af 37,5 g cuprisulfat, pentahydrat i 750 ml vand. Der tilsættes under afkøling 3 liter 30%’s hydrogenperoxid, og blandingen holdes ved 25°C i 5 timer. Derefter indstilles pH-værdien til 10,5 med 30%'s natriumhydroxid-opløsning, der ud-30 fældes med 132 liter methanol under omrøring, den overstående væske fradekanteres, og bundfaldet frafiltreres ved sugning. Materialet på filteret vaskes med methanol og tørres ved en temperatur under 60°C. Der opnås ca.

6,8 kg depolymeriseret chondroitinpolysulfat.

Eksempel lc (trin (a)) 9 kg rå chondroitinpolysulfat opløses i 45 liter vand, der tilsættes en opløsning af 8,57 g cobolt(II)- 35

DK 160317 B

13 chlorid-hexahydrat i 1 liter vand, og blandingen fortyndes til 67 liter med vand. Derefter tilsættes 1,35 liter 40%'s pereddikesyre ved stuetemperatur i løbet af 2 timer under kontinuerlig omrøring. Der 5 tilsættes en opløsning af 27 g dinatriumethylendinitri-lotetraacetat,dihydrat i 1 liter vand. pH-Værdien indstilles derpå til 11 med 30%'s natriumhydroxid-opløsning, der tilsættes 2,2 kg natriumchlorid og udfældes med 290 liter methanol under omrøring. Efter 1 times 10 forløb fradekanteres den overstående væske, bundfaldet frafilteres på et sugefilter, og materialet på filteret vaskes ved methanol og tørres ved en temperatur under 60°C. Der opnås ca. 8,4 kg depolymeriseret chondroitinpolysulfat.

15 Eksempel 2 (trin (b)) 8,0 kg depolymeriseret chondroitinpolysulfat opløses i 74 liter vand, opløsningen blandes med 2 liter 40%'s pereddikesyre, pH-værdien indstilles til 8 med 30%'s natriumhydroxidopløsning, og blandingen 20 henstilles ved stuetemperatur i 24 timer. 0,4 kg natriumchlorid opløses i blandingen, og der udfældes med 320 liter methanol. Bundfaldet frafiltreres, vaskes med methanol og tørres. Der opnås ca. 7,9 kg hvidt stof.

25 Eksempel 3a (trin (c)) 6,3 kg depolymeriseret chondroitinpolysulfat opløses i 27,1 liter varmt vand, der tilsættes 3,15 liter 40%'s pereddikesyre, bestanddelene blandes, og blandingen henstilles i 4 timer. Derefter tilsættes 30 45,4 liter vand, 2,1 kg natriumchlorid opløses i blan dingen, og pH-værdien indstilles til 10,5 med 30%'s natriumhydroxidopløsning. Til opnåelse af en methanol-koncentration på 36,5 volumen% i blandingen irøres 0,5748 liter methanol pr. liter opløsning, dvs. f.eks.

35 48,6 liter methanol. Blandingen henstilles natten over, og den overstående væske fradekanteres derefter, og

DK 160317 B

14 det halvflydende bundfald fracentrifugeres. Den klare overstående væske, f.eks. 128,5 liter, omrøres med 2,175 liter methanol pr. liter opløsning, dvs. f.eks.

279,5 liter methanol, således at der opnås en endelig 5 methanolkoncentration på 80 volumen%. Det udfældede får lov at bundfældes i 1 time, den overstående væske afdekanteres, og den tilbageværende suspension filtreres ved sugning. Bundfaldet vaskes med methanol og tørres ved en temperatur under 60°C. Der opnås ca.

10 5,6 kg mellemprodukt.

Eksempel 3b (trin (c)) 2 kg depolymeriseret chondroitinpolysulfat opløses i 200 liter vand, og opløsningen filtreres gennem et sterilt filter og underkastes ultrafiltrering 15 under et tryk på 2,8 bar ved 32°C ved anvendelse af ~ 2 et plade-ultrafiltreringsapparat (membranareal: 2,25 m, angivet udelukkelsesgrænse for celluloseacetatmembranen: molekylvægt på 15000). Opløsningen pumpes rundt med en strømningshastighed på 6,5 m /time. Når volumenet 20 af tilbageholdt materiale er ca. 20 liter, underkastes dette materiale ultrafiltrering 3 gange, hver gang efter at være fortyndet med 50 liter vand.

De kombinerede permeater ultrafiltreres ved anvendelse af en celluloseacetat-membran med en angivet 25 molekylvægt-udelukkelsesgrænse på 6000, men i øvrigt under samme betingelser som anført ovenfor. Det tilbageholdte materiale nedkoncentreres til en koncentration på 10%, der tilsættes natriumchlorid til en koncentration på 0,5%, pH-værdien indstilles til 7,5, 30 og der udfældes med 4 volumendele methanol under omrøring. Efter vask af bundfaldet, som er frafiltreret med sugning, tørres det. Det resulterende mellemprodukt vejer 1,78 kg.

Eksempel 4a (trin (d)) 35 5,4 kg af mellemproduktet fra trin (c) opløses i 54 liter vand, 21,6 .liter stærkt sur'

DK 160317 B

15 kationbytter (f.eks. Lewatit S 100) i protoneret form irøres, og blandingen omrøres ved stuetemperatur i 1 time. Kationbytteren frafiltreres med sugning og skylles to gange, hver gang med 8,1 liter vand, hvor-5 efter filtraterne sammenføres. 2,19 kg natriumchlorid sættes til filtratet, og der udfældes med 292 liter methanol under omrøring. Blandingen henstilles natten over, hvorefter den overstående væske afdekanteres, den tilbageværende suspension filtreres med sugning, 10 og stoffet på filteret udvaskes grundigt med methanol. Bundfaldet opløses i 43,2 liter vand, pH-værdien indstilles til 7,5 med 30%'s natriumhydroxidopløsning, der tilsættes 700 g natriumchlorid og udfældes med 139,2 liter methanol under omrøring. Den klare over-15 stående væske fradekanteres, den tilbageværende suspension filtreres gennem et sugefilter, og stoffet på filteret vaskes med methanol. Efter tørring opnås 3,6 kg demineraliseret chondroitinpolysulfat.

Eksempel 4b (trin d)) 20 9 kg mellemprodukt fra procestrin (c) eller bund fald, som stadig er fugtigt af methanol fra dette procestrin opløses i så meget vand, at der fås 90 liter opløsning. Denne opløsning ledes gennem en ionbytter-søjle fyldt med 36 liter af ionbytteren Amberiite IR 25 120 i protoneret form. Forholdet mellem højden, hvor til kolonnen er fyldtfog diameteren er f.eks. ca. 2,5:1.

Når opløsningen af stoffet er løbet igennem, skylles søjlen med 33,3 liter vand. 3,7 kg natriumchlorid sættes til de sammenbragte filtrater indeholdende stof-30 fet, og der udfældes ved tilsætning af 492 liter methanol. Bundfaldet frafiltreres med sugning og vaskes med methanol, og bundfaldet, som stadig er fugtigt af methanol, opløses i pyrogenfrit vand til et volumen på 72 liter. Der tilsættes 1,15 kg natriumchlorid, 35 pH-værdien indstilles til 7,5 med 30%'s natriumhydroxidopløsning, og der udfældes med 219 liter methanol.

Bundfaldet frafiltreres med sugning, vaskes med metha-

DK 160317 B

16 nol og tørres. Der opnås ca. 6 kg demineraliseret chondroitinpolysulfat.

Eksempel 5 (trin (e)) 20 kg demineraliseret chondroitinpolysulfat op-5 løses i 190 liter pyrogenfrit vand. Opløsningen opvarmes til 90°C, og der tilsættes 40 kg aktivt trækul (Riede! de Haen No. 18003). Temperaturen holdes ved 90°C i 60 minutter, hvorefter blandingen filtreres, medens den stadig er varm,ved anvendelse af trykfilter.

10 Resten af trækul vaskes to gange, hver gang med 40 liter pyrogenfrit vand, og filtraterne sammenføres.

Der tilsættes 3 kg natriumchlorid og 660 g dinatrium-ethylendinitrilotetraacetat-dihydrat. pH-Værdien indstilles til 7,5. Derefter filtreres blandingen gennem 15 et forvasket membranfilter (porediameter: 0,2 ym). Til den fuldstændigt klare opløsning sættes 720 liter methanol til udfældning under omrøring.

Bundfaldet frafiltreres med sugning, vaskes med methanol og tørres ved en temperatur under 50°C. Der opnås 20 ca. 18 kg hvidt, fintkornet, rent, injicerbart chondroitinpolysulfat. Ved kemisk analyse opnås følgende resultater: N: 1,77% S: 12,96% 25 hexuronsyre: 1,08 mmol/g hexosamin: 1,12 mmol/g

Eksempel 6 (fremstilling af en injektionsopløsning) 3,25 kg, beregnet som vandfrit stof, ren chondroitinpolysulfat og 0,325 kg natriumchlorid opløses 30 i ca. 50 liter aqua pro iniectabilia under omrøring, og opløsningen fortyndes til 65 liter. Efter at pH-vær-dien er indstillet til 8,4 med N natriumhydroxid-opløsning, og opløsningen har været underkastet steril filtrering gennem et membranfilter, fyldes opløsningen i 35 ampuller under sterile betingelser på kendt måde..

De lukkede ampuller underkastes varmebehandling i et

DK 160317 B

17 kogende vandbad i 60 minutter.

Claims (19)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et injicer-bart chondroitinpolysulfat, kendetegnet ved, at man (a) oxidativt depolymeriserer et råt chondroitinpoly- 5 sulfat, (b) om nødvendigt bleger det depolymeriserede chondroi- tinpolysulfat med pereddikesyre, (c) en eller to gange underkaster produktet opnået fra (a) eller (b) udfældning med methanol og/eller 10 ultrafiltrering til fraktionering med hensyn til molekylvægt, (d) om nødvendigt demineraliserer produktet opnået fra (c) med kationbytterer. og (e) om nødvendigt affarver produktet opnået fra (c) 15 eller (d) med aktivt trækul,

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den oxidative depolymerisering (a) udføres med hydrogenperoxid i fravær af tungmetaller.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendeteg-20 net ved, at den oxidative depolymerisering udføres i nærværelse af en kompleksdanner.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at der som kompleksdanner anvendes nitrilo-trieddikesyre, ethylendinitrilotetraeddikesyre, 1,2- 25 cyclohexylendinitrilotetraeddikesyre, diethylentriamin-pentaeddikesyre, 3,6-dioxaoctamethylendinitrilotetra-eddikesyre eller en blanding deraf.

5. Fremgangsmåde ifølge krav ^kendetegnet ved,at den oxidative depolymerisering (a) udføres 30 med hydrogenperoxid i nærværelse af tungmetalioner.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at den oxidative depolymerisering udføres i nærværelse af salte af jern, cobolt, kobber, mangan og/ eller vanadin.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, k e n d e t e g- n e t ved, at den oxidative depolymerisering (a) udføres med pereddikesyre i nærværelse af tungmetalioner. DK 160317 B

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den udføres i nærværelse af salte af jern, cobolt og/eller mangan.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 6 og 8, kende-5 tegnet ved, at koncentrationen af tungmetalsalte i reaktionsblandingen holdes mellem 0,001 og 0,5% (vægt/volumen).

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at behandlingen med pereddikesyre (b) ind- 10 arbejdes i den molekylære fraktionering (c).

11. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den første methanol-fraktionering i trin (c) udføres ved en koncentration på mellem 25 og 45 volumen% methanol.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at den anden methanol-fraktionering i trin (c) udføres ved en koncentration på mellem 60 og 85 volumen% methanol.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg- 20 net ved, at der i stedet for den første methanol- fraktionering i trin (c) udføres ultrafiltrering med en membran med en udelukkelsesgrænse på mindst 6000.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der-i stedet for den anden methanol-frak- 25 tionering i trin (c) udføres ultrafiltrering med en membran med en udelukkelsesgrænse på højst 8000.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kend.e tegnet ved, at demineraliseringen i trin (d) udføres enten chargevis ved omrøring i en kationbytter eller 30 ved kontinuerlig eller diskontinuerlig søjle-fremgangsmåde.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der i trin (e) anvendes aktivt trækul til affarvning.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 12, 14, 15 eller 16, kendetegnet ved, at det rene chondroi-tinpolysulfat udfældes med methanol i nærværelse af 0,01-0,5% kompleksdanner. DK 160.317 B

18. Fremgangsmåde ifølge krav 17, k ende-tegnet ved, at der som kompleksdanner anvendes nitrilotrieddikesyre, ethylendinitrilotetraeddikesyre, 1,2-cyclohexylendinitrilotetraeddikesyre, diethylen- 5 triaminpentaeddikesyre, 3,6-dioxaoctamethylendinitrilo-tetraeddikesyre eller en blanding deraf.

19. Fremgangsmåde ifølge krav 12, 14, 15, 16, 17 eller 18, kendetegnet ved, at det rensede chondroitinpolysulfat udfældes med methanol i nærværel- 10 se af 0,01-0,5% natriumpyrosulfit.