DE3118588A1 - Verfahren zur herstellung eines injizierbaren chondroitinpolysulfates, hiernach erhaeltliches produkt und pharmazeutische zusammensetzung - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines injizierbaren chondroitinpolysulfates, hiernach erhaeltliches produkt und pharmazeutische zusammensetzung

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Description

LUia?POLB-WEEK, CHEMISCH-PHARMAZEUTISCHE FABRIK,
MÜNCHEN
Verfahren zur Herstellung eines injizierbaren Chondroitinpolysulfates, hiernach erhältliches Produkt und pharmazeutische Zusammensetzung.
Beschreibung
In dem Stand der Technik sind sowohl die Herstellung von Chondroitinpolysulfat, insbesondere die Sulfatierung von Chondroitinsulfat als auch verschiedene Behandlungsweisen von Chondroitinpolysulfat-Rohprodukten mit dem Ziel der Reinigung beschrieben worden (S. Bergström, Hoppe-Seyler1s Z. f. physiol. Chemie 238, 163; 1936 - Chargaff, P.W. Bancroft J-. biol. Chem. 115» 14-9, 155; 1936 - Husemann et al. Z. Ges. Exp. Med. 114, 722; 194-5 - J. Piper Acta Pharm. Toxicol. 2, 317; 1946 - P. Karrer, H. Koenig, E. Usteri, HeIv. chim. acta 26, 1296; 1943 - DE-PS 870 094 - DE-PS 935 843 DE-PS 968 752 - DE-OS 1 618 857 - US-PS 34 54 560 - DDR-PS 136 572). Keine dieser Arbeitsweisen führt jedoch zu einem befriedigenden Produkt.
Die trotz technischer Fortschritte immer noch zu hohe Toxicität und andere Nachteile der Chondroitjnpolysulfate nach dem Stand der Technik verbieten bis Jetzt den risikofreien therapeutischen Einsatz dieser Stoffe als Injektion.
Ziel der Erfindung ist es daher, in wirtschaftlich vorteilhafter Weise zu einem hochreinen Chondroitinpolysulfat zu gelangen, bei dem die Nachteile bekannter Chondroitinpolysulfate auf ein Mindestmaß reduziert sind. Ein derartiges Chondroitinpolysulfat soll in der Therapie von Erkrankungen bei Mensch und Tier in jeder Applikationsart eingesetzt werden können.
Das vorstehende Ziel wird durch ein Verfahren erreicht, dessen Wesen in der Art und Abfolge der nachstehenden Verfahrensschritte zu sehen ist:
Oxidative Depolymerisierung eines dem Stand der Technik entsprechenden rohen Chondroitinpolysulfates, gegebenenfalls Bleichen mit Peressigsäure, Gewinnung einer Fraktion mit mittlerem Molekulargewicht von 5000 - I5OOO durch Fällung mit Methanol und/ oder Ultrafiltration, gegebenenfalls Entsalzung mittels Ionenaustauscher und gegebenenfalls Behandlung mit Aktivkohle.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines injizierbaren Chondroitinpolysulfates, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
A rohes Chondroitinpolysulfat oxidativ depolymerisiert,
B das depolymerisierte Chondroitinpolysulfat gegebenenfalls mit Peressigsäure gebleicht,
C das nach A oder B erhaltene Produkt durch ein oder zwei Methanolfällungen und/oder TJltrafiltrationen im Molekulargewicht fraktioniert,
D das nach C erhaltene Produkt gegebenenfalls mit Kationenaustauschern entsalzt,
E das nach C oder D erhaltene Produkt gegebenenfalls mit Aktivkohle entfärbt wird.
Für die Gewinnung des als Ausgangsmaterial eingesetzten rohen Chondroitinpolysulfats kommen die aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, beispielsweise wie sie in
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den vorstehend genannten Literaturstellen beschrieben sind, in Frage. Man kann, ohne daß die Erfindung hierauf oder auf eines der vorstehend genannten Verfahren zur Herstellung des rohen Chondroitinpolysulfates beschränkt ist, von einem Produkt ausgehen, das durch Sulfatierung von Chondroitinsulfat mit Pyridin und Chlorsulfonsäure erhalten wird. Es können Chondroitinpolysulfate sehr verschiedener Färbung verwendet werden. Auch hochmolekulare, aus der Stufe C des vorliegenden Verfahrens stammende Chondroitinpolysulfate können eingesetzt werden.
J Bei dem im folgenden beschriebenen Verfahren kommen zur pH-Wert-Einstellung folgende Reagenzien in Betracht: Säuren wie anorganische Säuren, z. B. Salzsäure, und niederaliphatische Carbonsäuren bzw. deren Persäuren, z.B. Essigsäure oder Peressigsäure, und Laugen wie Alkalihydroxidlösungen, z. B. Natronlauge oder Kalilauge. Die einzelnen Arbeitsschritte des Verfahrens werden vorzugsweise bei Normaldruck ausgeführt. Sofern nicht anders angegeben, sind im folgenden die Prozentangaben "Gew./Vol."-Angaben. In dem vorliegenden Verfahren wird als Abscheidungsmittel für Zwischenprodukte und Endprodukt Methanol angegeben. Gleichermaßen eignen sich auch andere mit Wasser mischbare organische Flüssigkeiten wie z. B. Ethanol, Isopropanol, Aceton, Tetrahydrofuran, Dioxan. Die in den einzelnen Arbeitsschritten des Verfahrens erzeugten Zwischenprodukte müssen nicht unbedingt als Trockensubstanzen isoliert werden. Man kann auch die lösungsmittelfeuchten Massen ohne Trocknen weiterverarbeiten. Bei der Ausfällung der Chondroitinpolysulfatstoffe mit wassermischbaren Lösungsmitteln setzt man zweckmäßig Salze in einem Konzentrationsbereich von 0,1 - 10 %, bevorzugt 0,5 - 5 % zu. Als Salze eignen sich insbesondere Natrium- oder Kaliumchlorid und Natrium- oder Kaliumacetat.
Die Bedingungen für die im folgenden (S. 8 bis S. 14, Abs.2) eingehender beschriebenen Stufen A bis E des erfindungsgemäßen Verfahrens sind über einen größeren Bereich variierbar. Dementspre-
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chend sind die nachstehenden Parameter für die einzelnen Stufen nicht als obligatorisch, sondern nur als zweckmäßige Ausgestaltung der Erfindung zu verstehen, sodaß die Erfindung nicht auf diese beschränkt ist.
Chondroitinpolysulfat läßt sich unter Ausschluß von Schwermetallen mit Hydroperoxid depolymerisieren. Der Depolymerislerschritt kann in wässriger Lösung unter folgenden Bedingungen ausgeführt werden: Die Konzentration des rohen Chondroitinpolysulfates kann ·2-35& vorzugsweise 10-20$ betragen. Die Konzentration von Hydroperoxid im Reaktionsmedium kann 0,3 - 15, vorzugsweise 1 - 5 % "betragen. Die Reaktionstemperatur kann 20 - 1000C, vorzugsweise 50 - 1000C, betragen. Die Reaktionsdauer liegt im Bereich von 10 Minuten - 24 Stunden, vorzugsweise 30 - 200 Minuten. Der pH-Wert kann zwischen 3 und 9 konstant gehalten oder auch uneingestellt bleiben, "bevorzugt arbeitet man zwischen pH 4,5 und'7.
Anwesende Schwermetalle lassen sich durch Komplexmittel wie Nitrilotriessigsäure, Ethylendinitrilotetraessigsäure, 1*,2-Cyclohexylendinitrilotetraessigsäure, DieNthylentriaminpentaessigsäure, 3lö-Dioxaoctamethylendinitrilotetraessigsäure oder deren Gemische bzw. deren Alkalisalze maskieren. Die . Konzentration des Komplexmittels im Reaktionsmedium hält man zwischen 0,001 und 0,5 %, bevorzugt zwischen 0,005 und 0,15 %. Nach Abschluß der Reaktion kann man das Reaktionsprodukt entweder ohne oder nach Abkühlung nach Zusatz eines Alkalisalzes mit einem Überschuß von Methanol ausfällen und gewinnen.
Die Depolymerisierung von Chondroitinpolysulfat mit Hydroperoxid kann auch in Gegenwart von Schwermetallsalzen unter besonders schonenden Bedingungen durchgeführt werden. Man · arbeitet z. B. wie folgt: Die Konzentration des rohen Chondroitinpolysulfats kann 2 -35 %, vorzugsweise 15 - 30 % betragen. Die Konzentration von Hydroperoxid in der Reaktionslösung kann 0,5 - 15 %·> vorzugsweise 1 - 5 %·> betragen. Die Reaktionstemperatur kann im Bereich von -10 C bis +80 C, vorzugsweise O0C bis 3O0C, liegen. Die Reaktionsdauer kann im Bereich von 5 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 30· - 500 Minuten, liegen. · .
Der pH-Wert kann zwischen 3 und 8 liegen, "bevorzugt zwischen 4,5 und 7,5. Als Schwermet all sal ze "bewähren sich anorganische und organische Salze von Eisen, Kobalt, Kupfer, Mangan, Vanadium. Die Metalle dieser Salze liegen vorzugsweise in folgenden Wertigkeitsstufen vor:
Eisen und Cobalt: zwei- und dreiwertig, Kupfer: ein- und zweiwertig,
Mangan:zwei-, drei-, vier-, sechs- und siebenwertig, Vanadin: zwei- und fünfwertig
Die Konzentration an Metallsalz wird zwischen 0,001 und 0,5 %, bevorzugt zwischen 0,05 und 0,2 % eingestellt. Nach dem ,Ao-DaU stellt man den pH-Wert in den Bereich 5 - 14» bevorzugt"-i6v-10, und gewinnt das Depolymerisat durch Methanolfällung.
Mit dem gleichen Ergebnis wie die vorstehenden Methoden zur oxidativen Depolymerisierung von Chondroitinpolysulfat ist der Arbeitsschritt durch oxidativen Abbau von Chondroitinpolysulfat durch Peressigsäure in Gegenwart von gewissen Schwermetallsalzen auszuführen. Es wurden folgende Bedingungen gefunden, bei denen die Reaktion vorteilhaft realisiert werden kann: Die Konzentration des rohen Chondroitinpolysulfats kann 5 - 35 %·> vorzugsweise 10 - 25 %, betragen. Die Konzentration der Peressigsäure in der Re akt ions lösung kann 0,1 - 7 %■> vorzugsweise 0,5 - 2 % betragen. Die Schwermetallsalzkonzentration kann, in dem Bereich von 0,001 - 0,5 %, vorzugsweise 0,005 0,2 %, liegen. Die Reaktionstemperatur kann -100C bis +900C, vorzugsweise O0C - 300C, betragen. Die Reaktionsdauer kann im Bereich von 5 Minuten - 24- Stunden, vorzugsweise 15 Minuten 500 Minuten, liegen. Der pH-Wert kann 2 - 12, vorzugsweise 3-8, betragen.
Die Reaktion verläuft z. B. mit anorganischen oder organischen Salzen der Schwermetalle in guter Geschwindigkeit: Eisen, Kobalt, Kupfer, Mangan, Vanadium. Was die Wertigkeit der Metalle dieser Metallsalze anbelangt, ß1 It das diel ehe wie vorstehend
• ν ·
- ίο -
für die Depolymerisierung mit Hydroperoxid.Besonders bei kürzeren Reaktionszeiten kann das Abstoppen des Depolymerisiervorganges durch einen Chelatbildner wie z. B. Ethylendinitrilotetraessigsäure oder andere Metallmaskierungsmittel angezeigt sein. Das depolymerisierte Chondroitinpolysulfat kann gegebenenfalls nach Zusatz eines Neutralsalzes und Einstellen des pH-Wertes in den Bereich 5-14·» besonders 6-10, mit Methanol abgeschieden werden.
Für den Einsatz in dem vorliegenden Verfahren eignen sich rohe Chondroitinpolysulfate sehr verschiedener Reinheit und Färbung. Es kann nötig sein, daß trotz des die Farbe stark aufhellenden Depolymerisiervorganges vor der Weiterverarbeitung ein Entfärbungsschritt "bzw. eine Bleiche eingefügt werden muß. Die Bleiche wird mit Peressigsäure durchgeführt. Es wurden folgende vorteilhafte Bedingungen gefunden: Der· pH-Bereich kann 2,5 - 14, vorzugsweise 5 - H? betragen. Die Peressigsäurekonzentration kann 0,1 - 10 %, bevorzugt 1 - 5 %·> betragen. Die Konzentration des rohen Chondroitinpolysulfats kann 2 - 40 %, bevorzugt 5 - 25 %, betragen. Die Reaktion wird in dem Temperaturbereich von 0 - 1000C, bevorzugt 15 - ?0°C, durchgeführt. Die Reaktionsdauer kann zwischen 1 Minute und 96 Stunden, insbesondere zwischen 1 und 24 Stunden betragen.
Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform kann die Peressigsäurebehandlung in das nachfolgende Molekülfraktionierungsverfahren einbezogen werden. Wie bereits vorstehend zum Ausdruck gebracht wurde, kann die Peressigsäurebehandlung auch ganz unterbleiben.
Aus dem nach der Bleiche bzw. Depolymerisierung erhaltenen Produkt fraktioniert man durch Methanolfällung bei verschiedenen Konzentrationen den Molekulargewichtsbereich von etwa 5000 I5OOO aus.
Hierzu kann man das depolymerisierte und ggf. gebleichte Chondroitinpolysulfat in wässriger Lösung wie folgt mit Methanol in Gegenwart von Neutralsalz behandeln (1. Methanolfällung) : Die Konzentration des depolymerisierten Chondroitinpolysulf at es in der wässrigen Lösung kann 5 - 30 %, vorzugsweise 5 - 20 %, betragen. Der pH-Wert kann im Bereich von 2 - 10, vorzugsweise 3>0 - 7i5i liegen. Der Neutralsalzgehalt kann 0,5 - 10 %, bevorzugt 1 - 5 %, betragen. Ein bevorzugtes Neutralsalz ist Natriumchlorid. Die Temperatur kann im Bereich von 0 - 500C, vorzugsweise 15 - 30 C, liegen. Die Methanolmenge kann 25 - 45 Vol.-%, bevorzugt 30 - 40 Vol.-%, bezogen auf das gesamte Behandlungsmedium, betragen. Hochmolekulare und hochsulfatierte Chondroitinpolysulfat-Individuen fallen zusammen mit Verunreinigungen aus und können durch Filtration oder Zentrifugieren entfernt werden.
Die verbleibende methanolhaltige Lösung bringt man durch weiteren Methanolzusatz auf eine Methanolkonzentration von 60 - 85 Vol.-%, bevorzugt 75 - 80 Vol.-%, bezogen auf das gesamte Behandlungsmedium (2. Methanolfällung), und gewinnt so eine Chondroitinpolysulfat-Fällung, bei der die sehr niedermolekularen und niedersulfatierten Anteile zusammen mit Verunreinigungen entfernt sind; diese werden nicht ausgefällt.
Das Fraktionierungsverfahren mit Methanol kann teilweise oder ganz durch Ultrafiltration ersetzt werden. Z. B. kann man durch Ultrafiltration von wässrigen Lösungen depolymerisierten Chondroitinpolysulf ats mit Membranen der Ausschlußgrenze von 6000 und darüber (z. B. aus Celluloseacetat, Polyamid oder PoIysulfon) dieselbe Vorfraktion wie oben beschrieben im Retentat zurückhalten. Hierbei kann die Konzentration der Chondroitinpolysulf at lösung 1 - 10 %, bevorzugt 1 - 5 %·, betragen. Der pH-Wert der Lösung kann 2 - 14, bevorzugt 5-10, betragen. Das Permeat kann wie oben erläutert durch Methanolfällung von niedermolekularen Chondroitinpolysulfat-Anteilen befreit werden.
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Dieser Effekt kann auch durch eine zweite nachgeschaltete Ultrafiltration mit Membranen der Ausschlußgrenze von 8000 und darunter erreicht werden. Hierbei kann die Konzentration der Chondroitinpolysulfatlosung 1 bis 10 %, vorzugsweise 1 bis 5 %■) betragen. Der pH-Wert der Lösung kann 2 bis vorzugsweise 5 bis 10, betragen.
Die von den Herstellern von Ultrafiltrationsmembranen angegebene Ausschlußgrenze für Substanzen eines bestimmten Molekulargewichtes ist für Chondroitinpolysulfate meistens nicht gültig. Die geeignete Membran muß deshalb im Einzelfall durch Versuch ermittelt werden, findet sich aber erfahrungsgemäß in den angegebenen Bereichen.
Die Entfernung von Salzen, gegebenenfalls Schwermetallionen yyft Verunreinigungen wird durch eine Kationenaustauscherbehandlung erreicht. Die Metallionen werden von Austauscherharzen in der protonierten Form gebunden, die freie Mucopolysaccharidpolyschwefelsäure geht ins Filtrat bzw. Eluat. Die Behandlung kann bei einer Temperatur von O - 50°C, zweckmäßig bei Raumtemperatur erfolgen. Sie kann durch Einrühren des KatIonenaustauschers im Batchverfahren oder in kontinuierlicher oder diskontinuierlicher Säulentechnik vorgenommen werden. Als Ionenaustauscherharze eignen sich stark saure Qualitäten wie z. B. Lewatit S 100, Dowex X 50, Amberlite IR 120 in der protonierten Form.
Man arbeitet in wässriger Lösung im Batchverfahren mit Chondroitinpolysulfatkonzentrationen von 2 - 20 %, besonders 5 - 15 %· Die Menge des Ionenaustauscherharzes kann 2-10 Volumteile, besonders 3-8 Volumteile, bezogen auf 1 Gewichtsteil Trockensubstanz von Chondroitinpolysulfat, betragen. Unter denselben Bedingungen läßt sich auch mit in Kolonnen geschütteten Austauschern arbeiten.
Das stark sauer reagierende Filtrat bzw. Eluat aus dem Entsalzungsschritt fällt, man in Gegenwart von 0,5 5 % Neutralsalz, besonders 0,5 - 3 % Natriumchlorid, mit 2,5 - 6 Volumenteilen, "bevorzugt 3-4· Volumenteilen, Methanol. Bei der Fällung aus saurem Milieu "bleiben freie Schwefelsaure und niedermolekulare Anteile von Chondroitinpolysulfat und Verunreinigungen in Lösung. Nach Abtrennung der Chondroitinpolyschwefelsäure-Fällung kann man diese entweder aus neutraler Lösung umfallen oder direkt noch methanolfeucht für den folgenden Prozeßschritt weiterverwenden.
Die Entsalzung kann entfallen, wenn eine Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit niedriger Ausschlußgrenze (2. Ultrafiltration) vorgenommen wurde, bei der das Retentat weiterverarbeitet wird.
Zur weiteren Aufhellung der Farbe und zum Erreichen einer besonders guten Farbstabilität beim Hitzesterilisieren des reinen Chondroitinpolysulfates kann ein weiterer Reinigungsschritt nachgeschaltet werden.
Durch Behandlung von Chondroitinpolysulfatlösungen mit Aktivkohle und vollständige Abtrennung des Adsorbates erhält man eine Chondroitinpolysulfatlösung, aus der das Produkt'nach pH-Einstellung in Gegenwart eines Neutralsalzes mit Methanol ausgefällt wird. Die Konzentration der zu behandelnden wässrigen Chondroitinpolysulfatlösung beträgt 5 - 25 %, insbesondere 10 - 20 %. Ihr pH-Wert beträgt 4-10, insbesondere 5-8. Es werden 0,1 - 3 Gewichtsteile Aktivkohle (bezogen auf ein Gewichtsteil Chondroitinpolysulfat) eingesetzt. Die Temperatur kann 20 - 100 C betragen. Die Behandlungsdauer beträgt 10 180 Minuten.
Die Aktivkohle trennt man ab. Anschließend empfiehlt sich eine Peinfiltration durch Membranfilter, um die Lösung völlig kohlefrei zu erhalten. Man stellt den pH-Wert auf 6-10, besonders 7-8 und fällt das Endprodukt in Gegenwart von Neutralsalz, z. B. Natriumchlorid in 0,5 - 5 %·> • 'insbesondere 1 - 2 % Konzentration mit Methanol aus. Die Endkonzentration von Methanol wird auf 60 - 85 Vol.-%, bevorzugt 75 - 80 Vol.-% eingestellt. Geeignete Aktivkohlen sind zum Beispiel Brilonit normal (Lurgi), Aktivkohle rein, Art.Nr. 2183 (Merck), Aktivkohle rein, Pulver, Art.Nr. 18003 (Riedel de Haen). Ob mit Aktivkohle entfärbt wird, hängt von dem als Ausgangsmaterial verwendeten Chondroitinpolysulfat ab.
Es kann zweckmäßig sein, die Abscheidung der gereinigten Chondroitinpolysulfate mit Methanol in Gegenwart eines Komplexmittels und/oder Natriumpyrosulfit vorzunehmen. Insbesondere bei dem Endprodukt ist diese Maßnahme angezeigt. Dadurch bleiben Injektionslösungen, die Chondroitinpolysulfat enthalten, beim Lagern frei von Trübungen und dunkeln nur" unmerklich nach. Als Komplexmittel werden beispielsweise Nitrilotriessigsäure, Ethylendiamintetraessigsäure, 1,2-Cyclohexylendinitrilotetraessigsäure, Diethylentriaminpentaessigsäure, 356-Dioxaoctamethylendinitrilotetraessigsäure in Konzentrationen von 0,01 - 0,5 % eingesetzt. Bevorzugt arbeitet man bei Konzentrationen von 0,05 - 0,35 %· Die Konzentration des bei der Methanolfällung gegebenenfalls verwendeten Natriumpyrosulfits kann 0,01 - 0,5 % betragen.
Das beschriebene Chondroitinpolysulfat hat bei Mensch und Tier therapeutische Bedeutung. Die Substanz ist anticoagulämisch, thrombolytisch, thromboprophylaktisch (speziell auch auf die tiefen Venenthrombosen einwirkend), antiatherosklerotisch, antilipämisch, antiinflammatorisch, antiexsudativ, antiarthrotisch und virustatisch wirksam.
Durch den "besonderen Ablauf und die Art der Behandlungen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine charakteristische neuartige Substanz gewonnen, die sich durch die überraschend .geringe Toxicität auszeichnet.
Tabelle 1
Akute Toxicität
Tierart Applikation LD5O/7d
HHRI Mäuse
Wistar Ratten
Katze
Hund		 i.v.
i.v.
i.v.
i.v.		 >35OO mg/kg
>3000 mg/kg
>1000 mg/kg
>1000 mg/kg
Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Chondroitinpolysulfat mit einer akuten Toxicität entsprechend einer letalen Dosis bei intravenöser Verabreichung bei der MRI Maus von >35OO mg/kg und bei der Wistar Ratte von 73000 mg/kg, bei Katze und Hund von >1000 mg/kg. Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Produkt besitzt eine akute Toxicität entsprechend einer letalen Dosis bei intravenöser Verabreichung bei der MIRI Maus von > 4000 mg/kg und bei der Wistar Ratte von >35OO mg/kg und bei der Katze von ^1^00 mg/kg, beim Hund von >1000 mg/kg.
In der Literatur wurden bis jetzt Chondroitinpolysulfate mit einer LDc0 (Maus, i.v.) von nur 1000 mg/kg beschrieben. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt somit die Herstellung von Chondroitinpolysulfat mit einer wesentlich größeren therapeutischen Breite.
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Insbesondere weist das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Chondroitinpolysulfat folgende Parameter auf:
Stickstoff: · 1,65 - 2,00 %
Schwefel: 12,5 - 14,5 %
Hexuronsäure: 0,98 - 1,22 mHol/g
Hexosamin: 0,96 - 1,24 mMol/g,
Schließlich betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die gekennzeichnet ist durch den Gehalt an einem nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren Chondroitinpolysulfat oder einem Chondroitinpolysulfat wie es vorstehend definiert wurde.
Versuche haben gezeigt, daß beim Menschen Einzeldosierungen zwischen 20 und 250 mg, besonders zwischen 30 und 150 mg pro Individuum in 0,2 - 2,0 ml, besonders 0,2 - 1,0 ml therapeutische Wirkung haben und" gut vertragen werden. Tägliche Ga--r ben von bis zu 500 mg erweisen sich als therapeutisch vorteilhaft. Die Injektion kann i.m., intraartikulär, s.c. oder i.v. durchgeführt werden, ohne den Arzt speziell nur auf diese Injektionsarten festzulegen. Die Abpackung von therapeutisch anwendbaren Lösungen des Wirkstoffes kann z.B. in Ampullen, Fertigspritzen, Durchstichflaschen, Phiolen für Spritzpistolen und anderen für die Injektion zweckmäßigen Primärpackmitteln erfolgen. Weitere Applikationsarten sind die perorale, percutane, rectale, sublinguale oder buccale Verabreichung. Die bevorzugte Dosierung entspricht derjenigen bei der Verabreichung durch Injektion.
Das erfindungsgemäß gewonnene Chondroitinpolysulfat eignet sich auch zur Anwendung in der Tiermedizin, bei der die beschriebenen Wirkungen angezeigt sind. Beim Hund beträgt die Dosierung zwischen 0,1 und 5 mg/kg Körpergewicht und Tag, bevorzugt 0,5 bis 1,5 mg/kg, in 0,1 - 10 ml Volumen, insbesondere in 0,5 1,0 ml. Beim Pferd beispielsweise bewahren sich tägliche Einzelgaben von 100 - 1000 mg, bevorzugt I50 - 5OO mg in 0,1 - 20 ml, besonders 1-5 ml· Das Chondroitinpolysulfat kann auf dieselbe
- 17 -
Weise wie beim Menschen appliziert werden.
Zur Bestimmung des mittleren Molekulargewichts wurde die folgende Methode angewandt:
Man chromatographiert 20 mg Probe in 2 M Kochsalzlösung an einer Biogel P 10 Säule (50 g; H « 100 cm, 0 2 cm). In den gesammelten 10 ml Fraktionen detektiert man das Chondroitinpolysulfat durch HexuronsäurebeStimmung nach Z. Dische: J. Biol. Ohem. <1§2, 189 (1W), modifiziert von J. D. Gregory: Arch. Biochem. Biophys. 89, 157 (1960). Man eicht mit Chondroitinpolysulfat-Fraktionen, deren Molekulargewicht durch Ultrazentrifugation bestimmt wurde. Das mittlere Molekulargewicht berechnet man aus dem Auslauf volumen, bei dem 50 % der insgesamt im Chromatogramm gefundenen Hexuronsäure eluiert sind.
»5 I I
- 18 Die·folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 a (Stufe A)
7,5 kg rohes Chondroitinpolysulfat (erhältlich nach OE-PS 870 097I-) löst man in 75 Liter heißem. Wasser, versetzt mit 2,25 kg Natriumchlorid und 2 ml Octanol-1. Man gibt nun eine Lösung von 75 g Ethylendinitrilotetraessigsäure in 750 ml 1 N Natronlauge zu. Man erhitzt die Mischung auf 95°C und rührt dann 7i5 Liter 30 %ige Hydroperoxid-Lösung ein. Man hält die Temperatur 100 Minuten zwischen 90 und 95°C und kühlt dann schnell auf Raumtemperatur ab.
Man löst in der Eeaktionsmischung 1,5 kg Natriumchlorid, rührt 360 Liter Methanol ein, dekantiert nach 30 Minuten den klaren Überstand ab und saugt den Niederschlag auf einer Nutsche ab. Man wäscht mit Methanol und trocknet bei einer Temperatur unter 6O0C Man erhält etwa 7 kg depolymerisiertes Chondroitinpolysulfat.
Beispiel 1 b (Stufe A)
7,5 kg rohes Chondroitinpolysulfat löst man in 22,5 Liter Wasser, versetzt zuerst mit 1,5 kg Natriumchlorid, dann mit einer Lösung von 37,5 g Kupfer II-sulfat-pentahydrat in 75Ο ml Wasser. Man setzt unter Kühlung 3 Liter 30 %iges Hydroperoxid zu und hält 5 Stunden bei 25°C. Danach stellt man mit 30 %iger Natronlauge auf pH 10,5 ein, fallt'unter Rühren mit 132 Liter Methanol, dekantiert den Überstand und nutseht den Niederschlag ab. Man wäscht mit Methanol und trocknet bei einer Temperatur unter 60 C. Man erhält etwa 6,8 kg depolymerisiertes Chondroitinpolysulfat.
Beispiel 1 c (Stufe Λ)
9 kg rohes Chondroitinpolysulfat löst man In ^5 Liter Wasser, versetzt mit einer Lösung von 8,57 g Kobalt Il-chloridhexahydrat in 1 Liter Wasser und ergänzt mit Wasser auf 67 Liter. Unter ständigem Rühren bei Raumtemperatur fügt man innerhalb 2 Stunden 1*35 Liter 40 %ige Peressigsäure zu. Anschließend gibt man eine Lösung von 27 g Ethylendinitrilotetraessigsäuredinatriumsalzdihydrat in 1 Liter Wasser zu. Man stellt nun mit 30 %iger Natronlauge auf pH 11, setzt 2,2 kg Natriumchlorid zu und fällt unter Rühren mit-290 Liter Methanol. Nach einer Stunde dekantiert man, saugt den Niederschlag auf einer Nutsche ab, wäscht mit Methanol und trocknet bei einer Temperatur unter 60 C. Man erhält etwa 8,4 kg depolymerisiertes Chondroitinpolysulfat.
Beispiel 2 (Stufe B)
8,0 kg depolymerisiertes Chondroitinpolysulfat löst man in 74 Liter Wasser, vermischt mit 2 Liter 40 % Peressigsäure, stellt den pH-Wert mit 30 % Natronlauge auf 8 und läßt 24' Stunden bei Raumtemperatur stehen. Man löst in der Mischung 0,4 kg Natriumchlorid und fällt mit 320 Liter Methanol. Der Niederschlag wird abgenutscht, mit Methanol gewaschen und getrocknet. Man erhält ca. 7*9.kg weisses Material.
3.11 «588
- 20 -
Beispiel 3 a (Stufe C)
6,3 kg depolymerisiertes Chondroitinpolysulfat löst man in 27,1 Liter heißem Wasser, setzt 3,^5 Liter 40 %ige Peressigsäure zu, vermischt und läßt 4 Stunden stehen. Danach gibt man 45,4 Liter Wasser zu, löst 2,1 kg Natriumchlorid und stellt den pH-Wert mit 30 %iger Natronlauge auf 10,5· Dann rührt man je Liter Lösung 0,5748 Liter Methanol ein, um in der Mischung eine Methanolkonzentration von 36,5 Vol. % zu erhalten, das sind z. B. 48,6 Liter Methanol. Man läßt die Fällung über Nacht stehen, dann dekantiert man und zentrifugiert den halbflüssigen Niederschlag ab. Den klaren Überstand, z. B. 128,5 Liter, verrührt man mit 2,175 Liter Methanol pro Liter Lösung, so daß eine Methanolendkonzentration von 80 Vol. % erreicht wird, das sind z. B. 279,5 Liter Methanol. Die Fällung läßt man 1 Stunde absetzen, dekantiert und nutscht die Restsuspension ab. Den Niederschlag wäscht man mit Methanol und trocknet bei einer Temperatur unter 6O0C. Man erhält etwa 5,6 kg Zwischenprodukt.
Beispiel 3 b (Stufe C)
2 kg depolymerisiertes Chondroitinpolysulfat löst man in
200 Liter Wasser, filtriert durch ein Sterilfilter und ultrafiltriert mit einem Druck von 2,8 bar bei 32°C unter Verwendung eines Platten-Ultrafiltrationsgerätes (Membranfläche
2
2,25 m , angegebene Ausschlußgrenze der Celluloseacetat-Membran bei Molekulargewicht I5OOO). Die Lösung pumpt man mit einer Durchflußrate von 6,5 m /Stunde um. Wenn ein Volumen von ca. 20 Liter Retentat erhalten ist, ultrafiltriert man dieses
3 mal nach Vermischen mit je 50 Liter Wasser.
Die gesammelten Permeate unterwirft man unter Verwendung einer Celluloseacetat-Membran mit der angegebenen Molekulargewicht s-AusSchlußgrenze 6000, jedoch sonst gleichen Bedingungen wie oben der Ultrafiltration. Das Retentat engt man bis auf eine Konzentration von 10 % ein, setzt Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 0,5 % zu, stellt den pH-Wert auf 7,5 und fällt unter Rühren mit 4 Volumteilen Methanol. Nach Waschen des abgesaugten Niederschlags trocknet man. Das erhaltene Zwischenprodukt wiegt 1,78 kg.
Beispiel 4- a (Stufe D)
5,4- kg Zwischenprodukt aus Arbeitsschritt 3 löst man in 54· Liter Wasser und rührt 21,6 Liter stark sauren Kationenaustauscher (z. B. Lewatit S 100) in der protonierten Form ein und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Man nutseht ab, wäscht 2 mal mit je 8,1 Liter Wasser nach und vereinigt die Filtrate. Das Filtrat versetzt man mit 2,19 kg Natriumchlorid und fällt unter Rühren mit 292 Liter Methanol. Den Fällungsansatz läßt man über Nacht stehen, dann dekantiert man, nutscht die verbleibende Suspension ab und wäscht mit Methanol gut aus. Den Niederschlag löst man in 4-3,2 Liter Wasser, stellt den pH-Wert mit 30 %iger Natronlauge auf 7,5> gibt 700 g Natriumchlorid zu und fällt unter Rühren mit 139,2 Liter Methanol. Den klaren Überstand hebert man ab, die Re st suspension saugt man durch eine Nutsche und wäscht mit Methanol. Nach'dem Trocknen erhält man 3»6 kg entsalztes Chondroitinpolysulfat.
3.113588
- 22 -
Beispiel 4- b (Stufe D)
9 kg des nach Arbeitsschritt 3 anfallenden Zwischenproduktes oder auch den noch methanolfeuchten Niederschlag aus diesem Arbeitsschritt löst man in soviel Wasser, daß man 90 Liter Lösung erhält. Diese Lösung läßt man durch eine Ionenaustauschersäule laufen, die mit 36 Liter Kationenaustauscher Amberlite IE 120 in der H+-Form gefüllt ist. Das Verhältnis Höhe der Säulenfüllung zu Durchmesser liegt z. B. bei ca. 2,5- Wenn die Substanzlosung durchgelaufen ist, spült man mit 33»3 Liter Wasser nach. Die vereinigten substanzhaltigen Filtrate versetzt man mit 3,7 kg Natriumchlorid und bringt durch Zusatz von 4-92 Liter Methanol zur Ausfällung. Man saugt ab, wäscht mit Methanol und löst den noch lösungsmittelfeuchten Niederschlag mit pyrogenfreiem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 72 Liter. Man gibt 1,15 kg Natriumchlorid zu, stellt den pH-Wert mit 30 % Natronlauge auf 7i5 und fällt mit 219 Liter Methanol aus. Man nutscht ab, wäscht mit Methanol und trocknet. Es werden etwa 6*kg entsalztes Chondroitinpolysulfat gewonnen.
Beispiel 5 (Stufe E)
20 "kg entsalztes Chondroitinpolysulfat löst man in 190 Liter pyrogenfreiem Wasser. Die Lösung erhitzt man auf 900C und gibt 4-0 kg Aktivkohle zu (Riedel de Haen Nr. I8OO3). Man hält die Temperatur 60 Hinuten auf 90°C, filtriert dann noch heiß mit einem Druckfilter. Den Kohlerückstand wäscht man 2 mal mit je 40 Liter pyrogenfreiem Wasser und vereinigt die Filtrate. Man versetzt mit 3 kg Natriumchlorid und 660 g Ethylendinitrilotetraessigsäuredinatriumsalzdihydrat. Der pH-Wert wird auf 7*5 eingestellt. Dann filtriert man durch ein vorgewachenes Membranfilter (Porenweite 0,2/um). Die ganz klare Lösung fällt man unter Rühren mit 720 Liter Methanol. Der Niederschlag wird mit der Nutsche abgesaugt, mit Methanol gewaschen und "bei einer Temperatur unter 500C getrocknet. Man erhält etwa 18 kg weisses,'feinkörniges, reines, inöizierbares Chondroitinpolysulfat. Die chemisch - analytische Untersuchung ergibt folgende Stoffwerte: ■ ·
N 1,77 %
S 12,96 %
Hexuronsäure : 1,08 mMol/g
Hexosamin : 1,12 mMol/g
.Beispiel 6 (Herstellung einer Injektionslösung)
3,25 kg auf wasserfreie Substanz "berechnetes reines Chon-./ droitinpolysulfat und 0,325 kg Natriumchlorid löst man
unter Rühren in etwa 50 Liter aqua pro iniectabilia und ergänzt auf 65 Liter. Nach Einstellen des pH-Wertes auf ■ . 8,4 mit N Natronlauge und Sterilfiltration durch Membranfilter ampulliert man unter sterilen Kautelen in bekannter Weise. Die verschlossenen Ampullen werden 60 Minuten einer Hitzebehandlung im siedenden Wasserbad ausgesetzt.

Claims (1)

  1. .: ·: ..: .-.J18588
    Dr. F. Zumstein sen. - Dr. E. Assmanp - pn ft. fcöerügstoerger Dipl.-lng. F. Klingseisen - Dr. F. ZÜmsteln jun.* *
    PATENTANWÄLTE
    ZUGELASSENE VERTRETER BEIM EUROPÄISCHEN PATENTAMT REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE
    Case CPS . * '
    Patentansprüche
    Verfahren zur Herstellung eines injizierbaren Chondroitinpolysulfates, dadurch gekennzeichnet, daß
    ' A rohes Chondroitinpolysulfat oxidativ depolymerisiert,
    B das depolymerisierte Chondroitinpolysulfat gegebenenfalls mit Peressigsäure gebleicht,
    C das nach A oder B erhaltene Produkt durch ein oder zwei Methanolfällungen und/oder Ultrafiltrationen im Molekulargewicht fraktioniert,
    D das nach 0 erhaltene Produkt gegebenenfalls mit Kationenaustauschern entsalzt,
    E das nach C oder D erhaltene Produkt gegebenenfalls mit Aktivkohle entfärbt wird. . ·
    2· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die oxidative TJepolymerisierung A durch Hydroperoxid in Abwesenheit von Schwermetallen durchgeführt wird.
    3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,· daß in Gegenwart eines Komplexmittels gearbeitet wird.
    4. Verfahren nach Anspruch J, dadurch Kekenm-.eich-
    net, daß man als Komplexmittel Nitrilotriessigsäure, Ethylendinitrilotetraessigsäure, 1^-Cyclohexylendinitrilotetraessigsäure, Diethylentriaminpentaessigsäure, 3,6-Dioxaoctamethylendinitrilotetraessigsäure oder Gemische hiervon verwendet.
    ,.31.185:89
    5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die oxidative Depolymerisierung A durch Hydroperoxid in Anwesenheit von Schwermetallionen durchgeführt wird.
    6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß man in Gegenwart von Eisen-, Kobalt-, Kupfer-, Mangan- und/oder Vanadiumsalzen arbeitet.
    7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die oxidative Depolymerisierung A durch Peressigsäure in Gegenwart von Schwermetallionen durchgeführt wird.
    8. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß man in Gegenwart von Eisen-, Kobalt- und/oder Mangan-Salzen arbeitet.
    9- Verfahren nach den Ansprüchen 6 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Schwermetallsalze im Reaktionsmedium zwischen 0,001 und 0,5 % (Gew./VoI) gehalten wird.
    10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
    die Peressigsäurebehandlung B in das Molekülfraktionierungsverfahren C einbezogen wird.
    11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Methanolfraktionierung der Stufe C bei einer Konzentration zwischen 25 und 45 Vol. % Methanol durchgeführt wird.
    12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Methanolfraktionierung der Stufe C bei einer Konzentration zwischen 60 und 85 Vol.-% Methanol durchgeführt wird.
    13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Stufe C anstelle der ersten Methanolfraktionierung eine Ultrafiltration mit einer Membran der Ausschlußgrenze von mindestens 6000 vornimmt.
    14·. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Stufe C anstelle der zweiten Methanolfraktionierung eine Ultrafiltration mit einer Membran der Ausschlußgrenze von höchstens 8000 vornimmt.
    15- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Stufe D entweder durch Einrühren eines Kationenaustauschers im Batchverfahren oder durch kontinuierliche oder diskontinuierliche Kolonnenarbeitsweise entsalzt.
    16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei Stufe E mit Aktivkohle entfärbt.
    17. Verfahren nach den Ansprüchen 12, 14-, I5 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß das reine Chondroitinpolysulfat durch Methanol in Gegenwart von 0,01 - 0,5 % eines Komplexmittels abgeschieden wird.
    18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man als Komplexmittel Nitrilotriessigsäure, Ethylendinitrilotetraessigsäure, 1,2-Cyclohexylendinitrilotetraessigsäure, Diethylentriaminpentaessigsäure, 3,6-Dioxaoctamethylendinitrilotetraessigsäure oder Gemische hiervon verwendet.
    3118580
    19. Verfahren nach den Ansprüchen 12, 14-, 15, 16, 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß das gereinigte Chondroitinpolysulfat durch Methanol in Gegenwart von 0,01 - 0,5 % Natriumpyrοsulfit abgeschieden wird1.
    20. .Chondroitinpolysulfat, herstellbar nach einem der Ansprüche 1 bis 19 . ■
    21. Chondroitinpolysulfat mit einer akuten Toxicität 0 bei intravenöser Verabreichung bei der NMRI Maus von 7 3500 mg/kg, bei der Wistar Ratte von >3000 mg/kg, bei der Katze von>1000 mg/kg und beim Hund von >1000 mg/kg.
    22. Pharmazeutische Zusammensetzung für die Human- und Veterinärmedizin, gekennzeichnet durch den Gehalt an einem gemäß den Ansprüchen 1 bis 19 herstellbaren Chondroitinpolysulfat oder einem Chondroitinpolysulfat gemäß Anspruch 21 als Wirkstoff.
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