RU1748324C - Способ получения препарата стрептодеказы - Google Patents

Abstract

Использование: изобретение относится к медицине и медицинской промышленности, а именно к получению лекарственных препаратов для тромболитической терапии. Цель: повышение удельной активности по белку и увеличение выхода по активности целевого продукта. Сущность изобретения: способ осуществляется путем смешивания чистой стрептокиназы с глутаминатом натрия и полигелином по 1 мг на 30000 ед. активности, процесс связывания с окисленным периодатом калия декстраном ведут в 0,05 М содовом буферном растворе, pH 8,6-8,8, при температуре 18-24°С в течение 60-90 мин, а восстановление проводят боргидридом натрия при соотношении окисленный полиглюкин: боргидрид натрия 14,5:1, затем обессоливают, проводят стерилизующую фильтрацию и диофилизацию. Положительный эффект заключается в повышении удельной активности по белку и повышении выхода до 180-240% по активности. 1 з.п. ф-лы.

Description

Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности, а именно к получению лекарственных препаратов для тромболитической терапии.

Стрептодеказа представляет собой производное стрептокиназы и получается путем химической модификации этого белка декстраном - полиглюкином. Аналогично стрептокиназе она является активатором фибринолитической системы крови человека. Под действием стрептодеказы из неактивного предшественника - плазминогена - образуется фермент фибринолиза - плазмин.

Стрептодеказа обладает значительными преимуществами перед нативным активатором стрептокиназой. Модификация стрептокиназы полиглюкином позволила создавать препарат с повышенной стабильностью, снизить его токсические и аллергические реакции, добиться пролонгированного действия, отказаться от длительного капельного введения, вводя сразу всю терапевтическую дозу стрептодеказы одномоментно. Простота и удобство применения, избирательное воздействие на гемостаз, безопасность лечения, пролонгация эффекта активации фибринолитической системы крови без нарушения свертывающей системы - положительные качества препарата.

Известен способ получения стабилизированной стрептокиназы, выбранный за прототип, заключающийся в том, что белок стрептокиназы связывают с водорастворимым декстраном молекулярной массы 20-100 кДа, предварительно окисленным до степени окисления 5-35% с последующим восстановлением полученного продукта боргидридом натрия, обессоливанием, стерилизующей фильтрацией и лиофилизацией.

По этому способу декстран предварительно переводят в активированную форму окислением периодатом калия, отделяют от избытка ионов окислителя ионообменной хроматографией и выдерживают в растворе со стрептокиназой. По окончании связывания конъюгат белка с декстраном восстанавливают боргидридом натрия, обессоливают диализом против дистиллированой воды или на установке для диафильтрации ТСГ-10 "Амикон", концентрируют, стерильно фильтруют через мембраны "Миллипор" с диаметром пор 0,45 мкм и лиофильно высушивают. Выход препарата по активности составляет 30-50% от исходной активности белка.

Основным недостатком известного способа является низкий уровень активности получаемого лекарственного препарата, а именно 4300 и 1700 ед/мг, при общем уровне сохранения активности при модификации 30-50%. Терапевтическая доза препарата стрептокиназы на одного больного составляет 3 млн. фибринолитических единиц. Для введения такой дозы в кровь пациента необходимо ввести большое количество (0,7-1,8 г) препарата, являющегося чужеродным веществом для организма.

Кроме того, в известном способе в качестве исходной стрептокиназы используют лиофилизированный препарат стрептазы фирмы Берингверке (ФРГ) во флаконах. Каждый флакон содержит одинаковое количество наполнителей-стабилизаторов (глутамината натрия и полигелина) независимо от дозы активного вещества (в единицах активности, а следовательно, и в мг белка), т.е. соотношение наполнителей на единицу активного вещества не является величиной постоянной. При проведении реакции химической модификации соотношение компонентов в реакционной смеси играет существенную роль и должно быть строго регламентировано. Лекарственный препарат стрептодеказа это - химический конъюгат, образование которого происходит при определенных условиях, обуславливающих его состав и специфические свойства. Поэтому отсутствие изучения влияния концентрации наполнителей и связанный с ним выбор их оптимальных соотношений в реакционной среде приводит к получению целевого продукта с низкой фибринолитической активностью.

Учитывая клиническое применение, нужно отметить, что в известном способе не конкретизируется такое важное свойство модифицирующей матрицы - декстрана, как возможность применения в качестве плазмозаменителя. Использование окисленных декстранов больших степеней окисления (25-35%) не оправдано по следующим причинам: наблюдается сильная инактивация стрептокиназы в процессе модификации; окисленный периодатом калия декстран значительно отличается от исходного, так как каждое 3-4 звено окислено, что может вызвать изменение его свойств как плазмозаменителя; при увеличении степени окисления наблюдается сильная декструкция декстрана.

Использование для получения лекарственного средства перпарата стрептодеказы в лиофилизированном состоянии во флаконах является экономически нецелесообразным.

Целью изобретения является повышение удельной активности по белку и увеличение выхода по активности целевого продукта - препарата стрептодеказы.

В способе получения препарата стрептодеказы путем связывания стрептокиназы с окисленным периодатом калия декстраном с последующим его восстановлением боргидридом натрия, обессоливанием, стерилизующей фильтрацией и лиофилизацией, в качестве исходной стрептокиназы используют раствор чистой стрептокиназы, смешивают ее с глутаминатом натрия и полигелином по 1 мг на 30000 ед. активности, процесс связывания ведут в 0,05 М содовом буферном растворе, рН 8,6-8,8, при температуре 18-24^оС в течение 60-90 мин, а восстановление осуществляют боргидридом натрия при соотношении окисленный полиглюкин: боргидрид натрия 14,5:1. Отличиями заявляемого способа от прототипа являются следующие.

Регламентировано соотношение между чистым белком стрептокиназой и наполнителями, представляющими собой биологические амины, позволяющие перевести стрептокиназу в полностью связанное состояние и при этом обеспечить высокий уровень сохранения активности. Важность соблюдения данного параметра объясняется тем, что образование химической связи происходит в результате взаимодействия активированных групп декстрана и аминогрупп биологически активных веществ, а константы скорости этой реакции не зависят от природы биологических аминов. Увеличение доли наполнителей при постоянстве всех остальных условий реакции не обеспечивает полного связывания стрептокиназы с полисахаридной матрицей, уменьшение же приводит к инактивации целевого продукта, так как увеличивает степень модификации самой стрептокиназы (долю связанных аминогрупп).

Связывание проводят в 0,05 М содовом буферном растворе, а не в 0,1 М. Этот результат получен на основании изучения зависимости сохранения фибринолитической активности стрептокиназы после модификации полиглюкином от молярности буферного раствора, которая, как неожиданно оказалось, имеет экстремальный характер с максимальным значением при 0,05 М. Проведение модификации стрептокиназы в буферном растворе большей или меньшей молярности приводит к понижению активности.

Восстановление полученного продукта боргидридом натрия проводят при массовом соотношении декстран-полиглюкин:боргидрид натрия, равном 14,5:1, т. е. количество боргидрида натрия снижено по отношению к прототипу более чем в 3 раза. Это позволяет значительно уменьшить пенообразование при проведении восстановления, что является положительным фактом, так как известно, что сильное пенообразование может вызывать значительную инактивацию ферментов (белков). Снижение количества пены ускоряет проведение ультрафильтрации и увеличивает ее эффективность.

Кроме того, условия взаимодействия (химической модификации) стрептокиназы с декстраном-полиглюкином характеризуются достаточно узкими интервалами параметров реакции модификации. Это обусловлено тем, что при значениях рН меньше 8,6 и всех остальных выбранных соотношениях реагирующих компонентов происходит неполное связывание белка стрептокиназы с декстраном-полиглюкином; при рН больше 8,8 может происходить глубокое связывание ("зашивка") стрептокиназы, вызывающее уменьшение выхода по активности, а также возможна нежелательная декструкция декстрана-полиглюкина, приводящая к снижению эффекта защиты белковой глобулы. Изменения условий окисления декстрана (ниже 0,36 и выше 0,46 г периодата калия на 1 л полиглюкина) сказываются на концентрации активных групп декстрана, образующихся при окислении и взаимодействующих с аминогруппами белка стрептокиназы. Это вызывает изменение степени модификации стрептокиназы, а следовательно, состава целевого продукта, которое отражается на медико-биологических характеристиках препарата стрептодеказы. Интервал времени 60-90 мин является необходимым и достаточным для полного прохождения реакции модификации при температуре 18-24^оС.

Совокупность всех условий химической модификации позволяет получить препарат стрептокиназу высокой активности, а при не соблюдении хотя бы одного из указанных параметров поставленная цель не может быть достигнута.

Выбор условий получения модифицированной стрептокиназы высокой активности был осуществлен на основании анализа экспериментальных данных. Взаимодействие стрептокиназы с окисленным периодатом калия декстраном в присутствии наполнителей изучали в интервале температур 8-40^оС, рН 4,5-10,6 и концентрации наполнителей 0,5-1,5 мг на 30000 ед. активности.

После проведения связывания продукт восстанавливали борогидридом натрия или калия, обессоливали, концентрировали и стерилизовали на мембранных фильтрах.

Раствор модифицированной стрептокиназы высокой активности лиофильно высушивали во флаконах для получения готового продукта.

П р и м е р 1. 55 г полиглюкина (ПГ) по ФС 42-2023-83 растворяют в 1 л воды или инъекций и добавляют 20,0 г периодата калия. Это соответствует соотношению декстран: периодат калия 1:0,36. Окисление проводят при 25^оС и постоянном перемешивании в течение 90 мин. Полученный раствор окисленного ПГ со степенью окисления 16% пропускают через хроматографическую колонку, заполненную 170 г анионита АРА в ацетатной форме, отбрасывают 200 мл элюата ("мертвый" объем колонки с первыми фракциями очищенного ПГ), а остальной раствор с концентрацией по декстрану 55 мг/мл собирают отдельно.

К 75 мл раствора чистой стрептокиназы, содержащих 250 млн. ед. активности, приливают 85 мл 10% -ного раствора полигелина и добавляют 8,5 г глутамината натрия. После полного перемешивания к полученному раствору стрептокиназы с наполнителями приливают 85 мл 0,5 М содового буферного раствора, рН 9,2, и 655 мл раствора очищенного окисленного ПГ до конечной концентрации последнего в реакционной смеси 40 мг/мл, а молярности раствора 0,05 М.

Реакционную смесь в объеме 900 мл выдерживают при рН 8,7 и температуре 21^оС в течение 70 мин, затем охлаждают до 10^оС и порциями добавляют 100 мл охлажденного 2,5%-ного раствора боргидрида натрия на 0,05 М содовом буферном растворе, рН 9,2 (из расчета на 14,5 г окисленного периодата калия декстраном 1,0 г боргидрида натрия).

Раствор восстановленной модифицированной стрептокиназы фильтруют от механических примесей через мембрану "Миллипор" или "Владипор" с диаметром пор 0,45 мкм или 0,8 мкм, доводят объем раствора до 1,5 л водой для инъекций и проводят ультрафильтрацию на установке "Пелликон" через кассеты мембранных фильтров, отсекающих вещества по молекулярной массе 10000 Да. По достижении значения рNA в ультрафильтрате более 2,8 начинают концентрирование раствора модифицированной стрептокиназы до объема 0,5 л. Концентрированный раствор стрептодеказы пропускают через стерилизующие пластины "Миллипор" и "Владипор" с диаметром пор 0,22 мкм, разливают во флаконы и высушивают лиофильно. Полученный продукт имеет фибринолитическую активность 19000 ед/мг препарата (удельную 290000 ед/мг белка) с общей активностью 725 млн. ед. , что составляет 290% от исходной активности. Препарат стерилен, апирогенен, нетоксичен.

П р и м е р 2. 22 г полиглюкина по ФС 42-2023-83 растворяют в 400 мл воды для инъекций и добавляют 10,0 г периодата калия. Это соответствует соотношению декстран:периодат калия 1:0,46. Окисление проводят при 18^оС и постоянном перемешивании в течение 75 мин.

Полученный раствор окисленного ПГ со степенью окисления 20% очищают от ионов окислителя с помощью ультрафильтрации на установке ФМ-02 через мембраны УПМ-20 или УПМ-50 или на установке "Пелликон" через кассеты мембранных фильтров, отсекающих вещества по молекулярной массе 10000 Да, пропуская 3 порции воды для инъекций по 400 мл. Получают 340 мл раствора окисленного ПГ с концентрацией 55 мг/мл.

К 30 мл раствора чистой стрептокиназы, содержащим 100 млн.ед. активности, приливают 34 мл полигелина и добавляют 3,4 г глутамината натрия. После полного перемешивания к полученному раствору стрептокиназы с наполнителями приливают 34 мл 0,5 М содового буферного раствора, рН 9,2, и 262 мл раствора очищенного окисленного ПГ до конечной концентрации последнего 40 мг/мл, а молярности раствора 0,05 М.

Реакционную смесь в объеме 360 мл выдерживают при рН 8,8 и 24^оС в течение 90 мин, затем охлаждают до 10^оС и порциями добавляют 80,0 мл охлажденного 1,25%-ного раствора боргидрида натрия на 0,05 М содовом буферном растворе рН 9,2 (что соответствует соотношению окисленный декстран:боргидрид натрия 14,5:1).

Раствор восстановленной модифицированной стрептокиназы фильтруют от механических примесей через мембрану "Миллипор" или "Владипор" с диаметром пор 0,45 или 0,8 мкм, доводят объем раствора до 600 мл водой для инъекций и проводят ультрафильтрацию на установке "Пелликон" через кассеты мембранных фильтров, отсекающих вещества по мол.м. 10000 Да. По достижении значения pNA в ультрафильтрате более 2,8 начинают концентрирование раствора стрептокиназы до объема 200 мл. Концентрированный раствор стрептокиназы пропускают через стерилизующие пластины "Миллипор" или "Владипор" с диаметром пор 0,22 мкм, разливают во флаконы и высушивают лиофильно. Полученный продукт - стрептодеказа имеет фибринолитическую активность 16000 ед/мг препарата с общей активностью 180 млн.ед., что составляет 180% от исходной активности. Препарат стерилен, апирогенен, нетоксичен.

П р и м е р 3. Аналогично описанному в примере 1 получают раствор окисленного периодатом калия декстрана с концентрацией 55 мг/мл. Смешивают с раствором чистой стрептокиназы, полигелина и глутамината в тех же условиях, как в примере 1.

Полученную реакционную смесь в объеме 900 мл выдерживают при рН 8,6 и 18^оС в течение 60 мин, затем охлаждают до 12^оС и порциями добавляют 100 мл охлажденного 2,5%-ного раствора боргидрида натрия на 0,05 М содовом буферном растворе, рН которого 9,2 (при этом в реакционной смеси реализуется соотношение окисленный декстран:боргидрид натрия 14,5:1).

Дальше процесс ведут так, как описано в примере 1.

Полученный продукт имеет фибринолитическую активность 17500 ед/мг препарата с общей активностью 600 млн.ед., что составляет 240% от исходной активности.

Стрептодеказа, полученная известным способом (по прототипу), имеет активность от 1700 до 4300 ед/мг препарата с выходом до активности соответственно от 30 до 50%.

Claims (2)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА СТРЕПТОДЕКАЗЫ путем связывания стрептокиназы с окисленным периодатом калия декстраном с последующим его восстановлением боргидридом натрия, обессоливанием, стерилизующей фильтрацией и диофилизацией, отличающийся тем, что, с целью повышения удельной активности по белку и увеличения выхода по активности целевого продукта, в качестве стрептокиназы используют раствор чистой стрептокиназы, смешивают ее с глутаминатом натрия и полигелином по 1 мг на 30000 ед. активности, процесс связывания ведут в 0,5 М содовом буферном растворе, pH 8,6 - 8,8, при температуре 18 - 24^oС в течение 60 - 90 мин, а восстановление осуществляют боргидридом натрия при соотношении окисленный полиглюкин : боргидрид натрия 14,5 : 1.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что окисление полиглюкина проводят периодатом калия при соотношении декстран : периодат калия 1 : 0,36 - 0,46.