CN113717236B - 一种透明质酸的分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种透明质酸的分离纯化方法，所述分离纯化方法包括如下步骤：1)将透明质酸粗品冻干粉进行溶解，得到透明质酸溶液；2)将步骤1)得到的透明质酸溶液上样到装有UniGel介质的层析柱中进行层析，分别采用纯水和无机盐作为流动相进行上样和洗脱；3)分段收集经步骤2)层析、洗脱后的目的峰值的透明质酸溶液，对符合要求的组份液进行分析，得到纯化的二糖、四糖、六糖和八糖。本发明的透明质酸的分离纯化方法，仅需一步洗脱，通过填料的纯化能将透明质酸中的多种糖类分离开，且洗脱时未使用有机溶剂，纯化收率高而稳定，本发明的分离纯化方法可用于规模化生产，更加环保且耗材更简单，大大降低了生产成本。

Description

一种透明质酸的分离纯化方法
技术领域
本发明属于药物纯化技术领域，涉及一种透明质酸的分离纯化方法。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid，HA，即大分子透明质酸，又名玻尿酸)是一类由(1-3)-2-N-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖-(1-4)-O-β-D-葡萄糖醛酸的二糖重复排列而形成的一种酸性直链多聚粘多糖。1934年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节、调节血管壁的通透性、调节蛋白质、水电解质扩散及运转、促进创伤愈合等，因其具有很强的亲水性和非常好的保湿性能，透明质酸是目前自然界中发现的保湿性能最好的物质，被国际化妆品行业公认为最理想的天然保湿因子，同时，由于HA无任何免疫原性和毒性，被广泛应用于化妆品、食品和医药等行业。
透明质酸有两种生产方法，一种是利用天然原料，即选用动物组织，用丙酮、乙醇、氯仿等有机溶剂提取精制而得。该方法提取率仅为1％左右，因而不仅环境污染严重，而且生产成本较高；另一种是生物发酵法制备。生物发酵法不受原料资源限制等优点，目前已得到广泛应用，已取代从动物组织中分离提取透明质酸的方法。生物发酵法所得透明质酸，已经广泛应用于医药、化妆品、保健食品、食品等领域。
但是，上述两种生产方法都会使用大量的有机相，透明质酸分离纯化时也会采用大量的有机相作为萃取剂将多种糖类分离开，但是此类分离纯化方法存在使用有机相会造成的安全问题、环境污染、有机相难回收等问题。
CN112375160A公开了一种从微生物发酵液中分离纯化透明质酸的方法，包括以下步骤：(1)对所述微生物发酵液调节pH值至酸性或中性并加入盐，形成悬浮液；(2)将悬浮液固液分离后，使用微滤膜、超滤膜和纳滤膜进行浓缩，得到透明质酸浓缩液；(3)将所述透明质酸浓缩液通过离子交换树脂。该申请方法工艺简单，在有效除渣、除杂蛋白、杂多糖、脱色素的同时，完全不使用乙醇等有机溶剂参与，解决了透明质酸行业大量使用乙醇等有机溶剂的安全问题、回收问题和环境保护等问题。但是，该分离纯化方法中，透明质酸浓缩液依次经过阳离子交换树脂和阴离子交换树脂，相当于需要经过两步洗脱，采用树脂为填料纯化时间长，步骤繁琐，且收率和纯度也有待提高。
CN102812050A公开了一种透明质酸及/或其盐的提纯法，包括将含有高分子透明质酸及其盐和杂质的透明质酸溶液，经超滤膜进行透析处理的工序。通过该发明的方法，能够简便、高收率且工业规模地制造出去除了蛋白质、核酸、乳酸、金属等的高品质的透明质酸及/或其盐。该方法可以有效去除蛋白质、核酸、乳酸、金属等杂质，但是不能将透明质酸中的各类多糖分离开来。
因此，开发一种可以将透明质酸中的多糖分离开来，且纯度高、收率高的透明质酸的分离纯化方法很有必要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种透明质酸的分离纯化方法，简单方便，仅需一步洗脱，通过填料的纯化能将透明质酸中的多种糖类分离开，且洗脱时未使用有机溶剂，纯化收率高而稳定，可得到纯度和收率均在90％以上的二糖、四糖、六糖和八糖；本发明的分离纯化方法可用于规模化生产，更加环保且耗材更简单，大大降低了生产成本。
本发明的目的之一在于提供一种透明质酸的分离纯化方法，为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一种透明质酸的分离纯化方法，包括如下步骤：
1)将透明质酸粗品冻干粉进行溶解，得到透明质酸溶液；
2)将步骤1)得到的透明质酸溶液上样到装有UniGel介质的层析柱中进行层析，分别采用纯水和无机盐作为流动相进行上样和洗脱；
3)分段收集经步骤2)层析、洗脱后的目的峰值的透明质酸溶液，对符合要求的组份液进行分析，得到纯化的二糖、四糖、六糖和八糖。
本发明的透明质酸的分离纯化方法，简单方便，仅需一步洗脱，通过填料的纯化能将透明质酸中的多种糖类分离开，且洗脱时未使用有机溶剂，四糖、六糖均可以达到纯度95％以上、收率90％以上，纯化收率高而稳定，本发明的分离纯化方法可用于规模化生产，更加环保且耗材更简单，大大降低了生产成本。
步骤1)中，所述透明质酸粗品冻干粉采用纯水进行溶解。
优选地，所述纯水为超纯水或去离子水。
优选地，所述透明质酸溶液的浓度为5-10mg/mL，例如为5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL或10mg/mL。
步骤2)中，所述UniGel介质的型号为UniGel80Q。
步骤2)中，所述无机盐的浓度为0.1-0.3mol/L，例如为0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.25mol/L或0.3mol/L等。
优选地，所述无机盐为氯化钠。
步骤2)中，所述流动相的pH为4.5-5.5，优选为4.9-5.1。
优选地，所述流动相采用酸进行调节；优选地，所述酸为磷酸、醋酸、柠檬酸或盐酸，优选为盐酸。
步骤2)中，所述层析柱的载量为15-25mg/mL，例如为15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、24mg/mL或25mg/mL等。
优选地，以层析柱中介质的体积为1个柱体积算，所述流动相的用量为25-35个柱体积，例如为25个柱体积、26个柱体积、27个柱体积、28个柱体积、29个柱体积、30个柱体积、31个柱体积、32个柱体积、33个柱体积、34个柱体积、35个柱体积。
优选地，所述纯水与所述无机盐的体积比为(5-8):(3-5)，优选为7:4。
步骤3)中，所述分析时所用的色谱柱为YMC色谱柱，优选为YMC-Pack PolyamineII色谱柱。
优选地，步骤3)中，所述分析时采用磷酸二氢铵溶液与乙腈的混合液为流动相。
所述磷酸二氢铵溶液与乙腈的体积比为(88-92):(8-12)，优选地，所述磷酸二氢铵溶液与乙腈的体积比为90:10，即乙腈的体积百分比优选为10％。
优选地，所述磷酸二氢铵溶液的浓度为0.1-0.15mol/L，例如为0.1mol/L、0.11mol/L、0.12mol/L、0.13mol/L、0.14mol/L或0.15mol/L等。
作为本发明的优选方案，所述透明质酸的分离纯化方法包括如下步骤：
1)将透明质酸粗品冻干粉采用纯水进行溶解，得到浓度为5-10mg/mL的透明质酸溶液；
2)将步骤1)得到的透明质酸溶液上样到装有UniGel80Q介质的层析柱中进行层析，分别采用纯水和无机盐作为流动相进行上样和洗脱，其中，所述无机盐的浓度为0.1-0.3mol/L，所述流动相的pH为4.5-5.5，所述层析柱的载量为15-25mg/mL，以层析柱中介质的体积为1个柱体积算，所述流动相的用量为25-35个柱体积；
3)分段收集经步骤2)层析、洗脱后的目的峰值的透明质酸溶液，对符合要求的组份液进行分析，分析时所用的色谱柱为YMC-Pack Polyamine II色谱柱，采用磷酸二氢铵溶液与乙腈的混合液为流动相，其中，具体用量百分比优选为90％0.1mol/L磷酸二氢铵溶液+10％乙腈，体积比9：1，得到纯化的二糖、四糖、六糖和八糖。
本发明的目的之二在于提供一种目的之一所述的分离纯化方法得到的二糖、四糖、六糖和八糖。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的透明质酸的分离纯化方法，简单方便，仅需一步洗脱，通过填料的纯化能将透明质酸中的多种糖类分离开，且洗脱时未使用有机溶剂，二糖、四糖、六糖和八糖均可以达到纯度90％以上、收率90％以上，纯化收率高而稳定，本发明的分离纯化方法可用于规模化生产，更加环保且耗材更简单，大大降低了生产成本。
附图说明
图1为本发明的所用的透明质酸粗品冻干粉的色谱图；
图2为本发明的实施例的空白峰；
图3为本发明的实施例的透明质酸经分离纯化后的色谱图；
图4为图3的1号峰的色谱图；
图5为图3的2号峰的色谱图；
图6为图3的3号峰的色谱图；
图7为图3的4号峰的色谱图；
图8为图3的5号峰的色谱图。
具体实施方式
下面结合附图1-8，并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
如无具体说明，本发明的各种原料均可市售购得，或根据本领域的常规方法制备得到。
首先，对透明质酸粗品冻干粉进行色谱分析，所用仪器及具体参数如下：
仪器：岛津LC2030液相色谱仪
色谱柱：YMC-Pack Polyamine II色谱柱(250×4.6mm，5μm)
流动相：0.1mol/L磷酸二氢铵溶液(10％乙腈)
流速：0.5mL/min
波长：210nm
柱温：30℃。
透明质酸粗品冻干粉的色谱图如图1，分析结果如表1所示。
表1
Figure BDA0003277711000000061
Figure BDA0003277711000000071
由图1和表1数据分析得知，粗品中，保留时间为8.558min处的峰为二糖(简称HA2)的色谱峰，保留时间为11.037min处的峰为四糖(简称HA4)的色谱峰，保留时间为14.92min处的峰为六糖(简称HA6)的色谱峰，保留时间为21.184min处的峰为八糖(简称HA8)的色谱峰。
实施例
本实施例的透明质酸的分离纯化方法包括如下步骤：
1)将透明质酸粗品冻干粉采用超纯水进行溶解，得到浓度为5mg/mL的透明质酸溶液，其中其浓度为冻干粉质量除以用水质量；
2)将步骤1)得到的透明质酸溶液上样到装有UniGel80Q(批号J07W08KD)介质的层析柱(规格为7.7-100BV)中进行层析，仪器为SCG赛谱制备色谱仪，分别采用纯水和氯化钠作为流动相进行上样和洗脱，其中，氯化钠的浓度为0.2mol/L，流动相纯水和氯化钠的pH均为5.0，层析柱的载量为20mg/mL，流速为1mL/min，波长为214nm，层析柱中介质的体积为4.65mL，以层析柱中介质的体积为1个柱体积算，纯水和氯化钠的用量分别为14、11个柱体积；
3)分段收集经步骤2)层析、洗脱后的目的峰值的透明质酸溶液，对符合要求的组份液进行分析，分析时所用的色谱柱为YMC-Pack Polyamine II色谱柱，采用磷酸二氢铵溶液与乙腈的混合液为流动相，得到纯化的二糖、四糖、六糖和八糖。
空白峰和透明质酸经分离纯化后的色谱图分别如图2和图3所示，由图3可以看出，1号峰和2号峰为二糖(简称HA2)的色谱峰，其中，2号峰位置出峰是由二糖的本身性质决定的，在此缓冲条件下，其与层析柱中的介质部分结合，部分流穿，因此会有两次出峰，3号峰为四糖(简称HA4)的色谱峰，4号峰为六糖(简称HA6)的色谱峰，5号峰为八糖(简称HA8)的色谱峰。其中，1号峰的色谱图如图4所示，分析结果如表3所示。
表3
峰号 保留时间(min) 面积 面积(％) 高度
1 8.572 896470 79.498 45155
2 10.308 30838 2.735 1108
3 10.771 60369 5.353 3869
4 11.013 32934 2.921 1302
5 16.981 107058 9.494 1066
总计 - 1127668 100 52501
2号峰的色谱图如图5所示，分析结果如表4所示。
表4
峰号 保留时间(min) 面积 面积(％) 高度
1 8.578 440308 71.098 21055
2 9.456 87778 14.174 1739
3 10.721 88786 14.336 3209
4 14.819 2430 0.392 68
总计 - 619302 100 26071
3号峰的色谱图如图6所示，分析结果如表5所示。
表5
峰号 保留时间(min) 面积 面积(％) 高度
1 8.128 1827 0.025 135
2 9.271 16351 0.221 819
3 9.51 47163 0.637 1265
4 11.075 7332742 99.033 279635
5 15.027 4328 0.058 142
6 23.981 1955 0.026 71
总计 - 7404366 100 282067
4号峰的色谱图如图7所示，分析结果如表6所示。
表6
峰号 保留时间(min) 面积 面积(％) 高度
1 11.088 31844 1.245 2118
2 14.874 2509577 98.116 60010
3 16.729 13848 0.541 424
4 21.401 2502 0.098 46
总计 - 2557772 100 62599
5号峰的色谱图如图8所示，分析结果如表7所示。
表7
Figure BDA0003277711000000091
Figure BDA0003277711000000101
经汇总分析，各类糖的纯度和回收率如表8所示。
表8
编号 组成 纯度(％) 回收率(％)
1 HA2 100 57.72
2 HA2 99.608 34.50
3 HA4 99.03 91.21
4 HA6 98.12 95.93
5 HA8 91.27 94.33
由表8可以看出，采用离子交换层析，载量20mg/mL可以获得90％纯度以上的HA2、HA4、HA6和HA8，收率均在90％以上。
将实验放大后，产能计算表如表9所示。
表9
Figure BDA0003277711000000102
Figure BDA0003277711000000111
由表9可以看出，采用直径600mm的层析柱，一次可以上样1.4Kg以上，可以实现放大生产。
对比例1
本对比例与实施例的区别之处在于，层析柱中的介质替换为UniGel-30DEAE，其他的与实施例的均相同。
分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经色谱分析，各糖的纯度和回收率如表10所示。
表10
编号 组成 纯度(％) 回收率(％)
1 HA2 90.05％ 21.5％
2 HA2 75.6％ 70.8％
3 HA4 85.45％ 75.54％
4 HA6 83.94％ 67.21％
5 HA8 87.5％ 55.64％
对比例2
本对比例与实施例的区别之处在于，层析柱中的流动相替换为20mM Tris-HCl缓冲液，pH为8.0，其他的与实施例的相同，
分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经色谱分析，各糖的纯度和回收率如表11所示。
表11
编号 组成 纯度(％) 回收率(％)
1 HA2 75％ 60％
2 HA2 69％ 65％
3 HA4 48％ 63％
4 HA6 58％ 54％
5 HA8 75％ 60％
本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (15)

1.一种透明质酸的分离纯化方法，其特征在于，所述分离纯化方法包括如下步骤：
1)将透明质酸粗品冻干粉进行溶解，得到透明质酸溶液；
2)将步骤1)得到的透明质酸溶液上样到装有UniGel介质的层析柱中进行层析，所述UniGel介质的型号为UniGel80Q，分别采用纯水和无机盐作为流动相进行上样和洗脱，所述流动相的pH为4.5-5.5；
3)分段收集经步骤2)层析、洗脱后的目的峰值的透明质酸溶液，对符合要求的组份液进行分析，得到纯化的二糖、四糖、六糖和八糖；
所述无机盐为氯化钠；
步骤3)中，所述分析时所用的色谱柱为YMC色谱柱，所述YMC色谱柱为YMC-PackPolyamine II色谱柱；
步骤3)中，所述分析时采用磷酸二氢铵溶液与乙腈的混合液为流动相。
2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤1)中，所述透明质酸粗品冻干粉采用纯水进行溶解。
3.根据权利要求2所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤1)中，所述纯水为超纯水或去离子水。
4.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤1)中，所述透明质酸溶液的浓度为5-10mg/mL。
5.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)中，所述无机盐的浓度为0.1-0.3mol/L。
6.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)中，所述流动相的pH为4.9-5.1。
7.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)中，所述流动相采用酸进行调节。
8.根据权利要求7所述的分离纯化方法，其特征在于，所述酸为磷酸、醋酸、柠檬酸或盐酸。
9.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)中，所述层析柱的载量为15-25mg/mL。
10.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)中，以层析柱中介质的体积为1个柱体积算，所述流动相的用量为25-35个柱体积。
11.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)中，所述纯水与所述无机盐的体积比为(5-8):(3-5)。
12.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)中，所述纯水与所述无机盐的体积比为7:4。
13.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述磷酸二氢铵溶液与乙腈的体积比为(88-92):(8-12)。
14.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述磷酸二氢铵溶液的浓度为0.1-0.15mol/L。
15.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述分离纯化方法包括如下步骤：
1)将透明质酸粗品冻干粉采用纯水进行溶解，得到浓度为5-10mg/mL的透明质酸溶液；
2)将步骤1)得到的透明质酸溶液上样到装有UniGel80Q介质的层析柱中进行层析，分别采用纯水和无机盐作为流动相进行上样和洗脱，其中，所述无机盐的浓度为0.1-0.3mol/L，所述流动相的pH为4.5-5.5，所述层析柱的载量为15-25mg/mL，以层析柱中介质的体积为1个柱体积算，所述流动相的用量为25-35个柱体积；
3)分段收集经步骤2)层析、洗脱后的目的峰值的透明质酸溶液，对符合要求的组份液进行分析，分析时所用的色谱柱为YMC-Pack Polyamine II色谱柱，采用磷酸二氢铵溶液与乙腈的混合液为流动相，得到纯化的二糖、四糖、六糖和八糖。
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