DD275482A1 - Verfahren zur isolierung von desoxyribonucleinsaeure - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Desoxyribonucleinsaeure aus Fischsperma und gehoert in das Gebiet der Biotechnologie. Das Ziel der Erfindung besteht in der Steigerung der Ausbeute an Desoxyribonucleinsaeure in ausreichender Reinheit aus Fischsperma bei nur geringem materiell-technischem Aufwand. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Desoxyribonucleinsaeure aus Fischsperma zu isolieren, wobei eine moeglichst vollstaendige Spaltung des Protein-DNA-Komplexes unter Vermeidung von Denaturierungen der DNA und ohne Anwendung von Enzymen erreicht werden soll. Erfindungsgemaess wird Fischsperma pro kg mit 70 g festem Natriumhydroxid und 130 ml Wasser versetzt einer 14taegigen Hydrolyse bei Raumtemperatur unterzogen, nach Zugabe von 33 g Calciumsulfat und 375 ml Wasser einer 15minuetigen Hydrolyse bei Temperaturen von 70 bis 80C und gelegentlichem Ruehren ausgesetzt, danach auf 40C abgekuehlt, nach Abtrennung der Feststoffe mit 2 kg ethanolischer Salzsaeure behandelt, 2mal mit 2 500 ml absolutem Ethanol gewaschen und getrocknet.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Desoxyribonucleinsäure aus Fischsperma und gehört in das Gebiet der Biotechnologie.

Die Erfindung kann in der biotechnologischen, chemischen und pharmazeutischen Industrie angewendet werden.

Desoxyribonucleinsäure und besonders ihre Bausteine werden in immer größerem Umfang in der Pharmazie als Biofeinchemikalien und in der Gentechnik eingesetzt.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Zur Gewinnung von Desoxyribonucleinsäure sind mehrere Verfahren bekannt.

In den Patentschriften DE 2950995, DE 3112338 und DD 142561 wird die chemische Synthese von Desoxyribonucleinsäure aus Nucleosiden beschrieben.

In wenigen Fällen wird Desoxyribonucleinsäure aus tierischen Rohstoffen und aus Geweben isoliert.

Nach DE 1260470 und SU 652187 wird Desoxyribonucleinsäure und Fischsperma durch Behandlung mit festem Natriumchlorid oder Natriumcitratlösungen gekoppelt mit einer Extraktion mittels Enzym, beispielsweise Trypsin, gewonnen.

Diese Verfahren haben den Nachteil, daß hohe Enzymkonzentrationen , etwa 0,4-0,8% bezogen auf den Einsatzstoff, angewendet werden müssen und daß die Spaltung des Protein-DNA-Komplexes nur unvollständig gelingt.

In US 3314937 und DE 1545659 ist die Einwirkung fester Salze wie beispielsweise Natriumchlorid auf tierische Gewebe und die sich anschließende Enteiweißung in einem halbfesten Medium bei 75-80⁰C beschrieben.

Durch die eingesetzte Salzkonzentration kommt es zur Denaturierung der DNA. Die notwendige Trennung des Desoxyribonucleinsäure von der begleitenden Ribonucleinsäure wird durch die hohe lonenkonzentration im Medium erschwert.

Das Versetzen von Fischmilch bei Temperaturen von 2°C bis 4⁰C in einem „Fleischwolf" entsprechend DE 1545659 erfordert hohe technische und technologische Aufwendungen, insbesondere hinsichtlich der Einhaltung von Bestimmungen zur Explosionssicherheit.

Auch die in DE 1142365 und DE 1202439 beschriebenen Methoden zur Isolierung von DNA aus Fischmilch sind mit Nachteilen behaftet, wie beispielsweise Lagerung des Ausgangsproduktes bei -10°C und tiefer und Behandlung des Ausgangsmaterials mit Ethanol oder Aceton oder aber die Ausgangsstoffe sind nur in frischem Zustand verwendbar.

Gemäß US 3770720 ist ein Verfahren bekannt, nach dem tierisches Ausgangsmaterial mit einem Zinksalzkomplex in Gegenwart des Komplexbildners Benzthionium behandelt wird. Diese Verfahrensweise verkompliziert durch mehrere Aufbereitungsschritte die DNA-Herstellung.

Auch der Einsatz von ionischen Netzmitteln gemäß DE 1235504 bringt nicht den notwendigen Effekt in der Verfahrenstechnik der DNA-Gewinnung, denn die danach isolierte DNA ist zwar biochemisch aktiv, das führt jedoch dazu, daß nach wenigen Tagen die DNA weitgehend abgebaut ist.

Der Einsatz von Gips zur Reinigung von Alkalisalzen der Desoxyribonucleinsäure wird in DE 1142365 vorgeschlagen, jedoch verbunden mit einer nachfolgenden doppelten Umsetzung mit einem organischen Metallsalz zum entsprechenden Metallsalz der DNA.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht in der Steigerung der Ausbeute an Desoxyribonucleinsäure in ausreichender Reinheit aus Fischsperma bei nur geringem materiell-technischem Aufwand.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, mit nur geringem materiell-technischem Aufwand aus Fischsperma Desoxyribonucleinsäure zu isolieren, wobei möglichst eine vollständige Spaltung des Protein-DNA-Komplexes unter Vermeidung von Denaturierungen der DNA und ohne Anwendung von Enzymen erreicht werden soll.

Die Aufgabe der Erfindung wird dadurch gelöst, daß Fischsperma bei Normaltemperatur mit Natronlauge vorhydrolysiert und anschließend im gleichen Reaktionsgefäß mittels Temperaturerhöhung auf 70 bis 80°C die Hydrolyse zu Ende geführt wird.

Dabei wird gleichzeitig durch Zugabe von Kalziumsulfat oder anderen schwerlöslichen Kalziumverbindungen die isolierte DNA gereinigt, indem die verunreinigenden Begleitverbindungen, wie Aminosäuren, Proteine und ähnliches an den Kalziumionen adsorptiv gebunden werden.

Die Feststoffe werden durch Zentrifugieren/Separieren abgetrennt und aus der wäßrigen Lösung die DNA mittels ethanolischer Salzsäure ausgefällt.

Erfindungsgemäß wird dazu Fischsperma pro kg mit 70g Ätznatron, die in 130 ml Wasser gelöst sind, versetzt und unter gelegentlichem Rühren bis zu 28 Tagen, vorzugsweise bis zu 14 Tagen, bei Umgebungstemperatur zwischengelagert.

Nach Zugabe von 33g Calciumsulfat und 375ml Wasser erfolgt eine thermische Behandlung bei Temperaturen von 70 bis 8O⁰C über eine Zeitdauer von 15 Minuten bei gelegentlichem Rühren. Unter diesen Bedingungen werden die Bestandteile des Fischspermas völlig gelöst und Lipide, Aminosäuren sowie andere Verunreinigungen an die Calciumverbindung adsorbiert.

Nach Abkühlung auf 40⁰C werden die noch festen Bestandteile mittels Zentrifuge oder Separator abgetrennt.

Durch Zugabe von 2kg ethanolischer Salzsäure, bestehend aus 1,75kg Ethanol und 250g konzentrierter Salzsäure, pro 1 Hydrolyselösung wird die Rein-DNA ausgefällt und anschließend 2mal mit 2,5kg Ethanol pro kg DNA gewaschen und in einer Gefriertrocknungsanlage getrocknet.

Ausführungsbeispiel

200kg Heringsmilch werden mit 14kg festem Natriumhydroxid, welches in 26kg Wasser gelöst sind, versetzt und 13 Tage unter gelegentlichem Rühren bei Normaltemperatur vorhydrolysiert. Nach Zugabe von 600 g Kalziumsulf at und 7,51 Wasser wird diese Mischung für 15 Minuten einer Wärmebehandlung bei 73°C unterzogen. Nach Abkühlung auf 40⁰C wird die Mischung mittels Zentrifuge aufgetrennt in 22I feste Phase und 200I feststofffreie Hydrolyselösung.

Der Feststoffanteil wird verworfen.

Die feststofffreie Hydrolyselösung wird mit 295kg einer Mischung aus 260kg 80%igem Ethanol und 35kg konzentrierter Salzsäure kontaktiert. Unter diesen Bedingungen fallen etwa 5,5kg Desoxyribonucleinsäure aus.

Die gewonnene DNA wird 2mal mit 12,5 kg 80%igem Ethanol gewaschen und nach der Abtrennung des Alkohols 4 Stunden luftgetrocknet oder mittels Gefriertrocknung auf einen Feuchtigkeitsgehalt < 1 % gebracht.

Claims (3)

1. Verfahren zur Isolierung von Desoxyribonucleinsäure aus Fischsperma durch Hydrolyse mittels Natriumhydroxid, Fällung bei Raumtemperatur, Abtrennung und Reinigung, gekennzeichnet dadurch, daß Fischsperma pro kg mit 70g festem Natriumhydroxid und 130 ml Wasser versetzt einer 14tägigen Hydrolyse bei Raumtemperatur unterzogen, nach Zugabe von 33g Calciumsulfat und 375 ml Wasser einer 15minütigen Hydrolyse bei Temperaturen von 70 bis 8O⁰C und gelegentlichem Rühren ausgesetzt, danach auf 4O⁰C abgekühlt, nach Abtrennung der Feststoffe mit 2kg ethanolischer Salzsäure behandelt, 2mal mit 2500ml absolutem Ethanol gewaschen und getrocknet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Fischsperma Heringssperma ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die ethanolische Salzsäure aus 0,250kg Salzsäure und 1,750kg Ethanol besteht.