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Verfahren zur Herstellung von reinen Lösungen des Kallikrein-Inaktivators
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das Entfetten und Trocknen von Organen sind in technischem Massstab kostspielig und unrationell.
Ausserdem ist es für die therapeutische Anwendung nachteilig, dass die Präparate trotz der in den Anfangsstufen in verdünnter Lösung durchgeführten Enteiweissung nach der am Schluss erforderlichen hohen Konzentrierung vielfach noch Reste von Eiweiss enthalten, die beim Patienten allergische Reaktionen und anaphylaktischen Schock hervorrufen können.
Es wurde nun gefunden, dass man die obengenannten Nachteile vermeiden und in wenigen, technisch einfachen Stufen zu sehr reinen Lösungen des Kallikrein-Inaktivators gelangen kann, wenn man zerkleinerte, den Kallikrein-Inaktivator enthaltende tierische Organe, vorzugsweise Parotis, Leber oder Lunge, mit wässerigen, zweckmässig wassermischbare, organische Lösungsmittel, vorzugsweise Methanol, enthaltenden Lösungen von Salzen oder Hydroxyden der Erdalkalimetalle oder von Alkalisalzen extrahiert, den Extrakt mit einem Keton, vorzugsweise mit Aceton und in Gegenwart einer fein verteilten inerten Trägersubstanz, fällt, den abgetrennten Niederschlag, vorzugsweise nach Trocknung, mit Wasser extrahiert, das restliche Eiweiss aus der Lösung mit einem Eiweissfällungsmittel, vorzugsweise mit Sulfonsalicylsäure,
quantitativ fällt und nach Abtrennung des Niederschlags aus der verbleibenden Lösung überschüssiges Eiweissfällungsmittel mit Hilfe von Ionenaustauschern entfernt. Man erhält in hoher Ausbeute eine Inaktivatorlösung von grosser Reinheit und Konzentration, die ohne weiteres in hohen Dosen intravenös und intramuskulär verabreicht werden kann. Im einzelnen wird das Verfahren folgendermassen durchgeführt :
Besonders reich an Kallikrein-Inaktivator sind bekanntlich Lymph-und Ohrspeicheldrüsen, Leber, Milz und Pankreas sowie nach E. Werle die Lunge der Säugetiere. Die Organe werden in frischem oder gefrorenem Zustand im Cutter oder Fleischwolf zerkleinert. Die bei den bisherigen Methoden notwendige Entfettung oder Trocknung mit der zehnfachen Menge Aceton ist bei diesem Verfahren nicht erforderlich.
Die Freilegung des Wirkstoffes erfolgt durch einfaches Rühren der zerkleinerten Organe in der zweibis vierfachen Menge des Extraktionsmittels. Sie wird durchgeführt ohne Zusatz von Säuren, da hiedurch erhebliche Mengen von Begleitstoffen gelöst werden, die den weiteren Gang der Reinigung stören. Durch den Zusatz von Salzen oder Hydroxyden der Erdalkalimetalle oder von Alkalisalze wird eine sehr hohe Ausbeute bei gleichzeitig günstigem Reinheitsgrad erzielt. Dabei erweist es sich als zweckmässig, wenn dem Extraktionsmittel mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel, vorzugsweise Methanol zugesetzt werden.
So erhält man beispielsweise bei 1/2stündiger Extraktion von Parotis mit einer lU CaCL enthaltenden 75% igen Methanollösung bei 400C einen Reinheitsgrad von 35 y organischer Substanz pro KIE bei einer Ausbeute von zirka 500 000 KIE/kg Parotis. Unter den gleichen Bedingungen erhält man aus Lunge einen Reinheitsgrad von 7 bis 9 y bei einer Ausbeute von zirka 1, 2 Millionen KIE/kg Lunge.
Gelegentlich können zur Extraktion auch solche Lösungsmittel verwendet werden, die zunächst kein Wasser enthalten, das zur Extraktion erforderliche Wasser jedoch aus den frischen Drüsen aufnehmen.
Die Wirkung der einzelnen Salze und Hydroxyde ist nicht spezifisch ; sie variieren nur die Extraktionsbedingungen, welche bei der Verwendung von CaCl optimal sind. Man kann beispielsweise auch mit Mg Cl 2'Ammonsulfat, Kochsalz oder ähnlichen Salzen arbeiten. Bei Verwendung von Hydroxyden darf die Lösung nicht zu stark und zu lange alkalisch gehalten werden.
Die Extraktionkann inwässerigemMedium zwischen 0 und 90oC, zweckmässig zwischen 20 und 600C durchgeführt werden ; enthält das Extraktionsmittel wassermischbare organische Lösungsmittel, so wird zweckmässig bei relativ niedrigen Temperaturen gearbeitet, um ein Verdampfen des Lösungsmittels zu vermeiden.
Die Extraktionsdauer richtet sich nach dem Ausgangsmaterial, der angewendeten Temperatur und
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lOChlorcalciumlösung rührt man bei 400C zweckmässig 1/2 - 1 Stunde.
Als wassermischbare organische Lösungsmittel kommen ausser Methanol u. a., auch Äthanol, Propanol, Dioxan und Aceton in Frage.
In der nächsten Stufe wird der Wirkstoff mit einem wasserlöslichen Keton niedergeschlagen, vorzugsweise mit Aceton. Doch können auch andere Ketone, wie Methyläthylketon, Methylisobutylketon oder Cyclohexanon Verwendung finden. Je nach der Art des Fällungsmittels und der Extraktionslösung benötigt man zur quantitativen Fällung die 2 1/2-bis achtfache Menge Keton. Erfolgt die Fällung aus Freilegungen, die den Wirkstoff schon in relativ reiner Form enthalten, so bildet sich kein Niederschlag, sondern eine feine milchige Suspension, die den Wirkstoff in Form kleinster öliger Tröpfchen enthält. Diese setzen sich an den Wänden des Kessels und am Rührer als hauchdünner Film fest und können in technischem Massstab so nicht gewonnen werden.
Deshalb rührt man in die Lösung vor der Ketonfällung eine geeignete
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inerte Trägersubstanz in feiner Verteilung hinein und lässt erst dann das Fällungsmittel zufliessen. Dabei werden die winzigen öligen Tröpfchen von dem Träger-z. B. Kieselgur, Schlämmkreide u. - voll- ständig aufgenommen. Nach Absetzen des Rührers sinkt der beschwerte Trägerstoff schnell zu Boden und kann von der überstehenden klaren Lösung leicht abgetrennt werden. Auf diese Weise erfolgt die Fällung des Inaktivators fast ohne Verlust, und ein Zentrifugieren oder Filtrieren der relativ grossen Volumina wird vermieden.
Die mit dem Inaktivator beladene Trägermasse wird zweckmässig vor der Weiterverarbeitung getrocknet ; war die Fällung mit Aceton erfolgt, so breitet man sie auf einem Trockenblech an der Luft aus und erhält in wenigen Stunden ein staubtrockenes Pulver. Wurden Ketone mit höherem Siedepunkt verwendet, so wäscht man den Träger vor Trocknung mit etwas Äther.
Aus diesem Pulver lässt sich der Wirkstoff mit Wasser in wenigen Minuten ohne Verlust herauslösen
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denes Eiweiss wird nun durch Fällung mit einer relativ geringen Menge eines Eiweissfällungsmittels - am besten durch eine wässerige Sulfosalicylsäurelösung - quantitativ entfernt. Nach Abtrennung des Eiweissniederschlags befindet sich der Inaktivator praktisch quantitativ in der Restlösung, während bei der Enteiweissung mit Trichloressigsäure, Uranylacetat und Methaphosphorsäure manchmal grössere Verluste auftreten.
Der Überschuss des Fällungsmittels wird durch Ausrühren mit einem geeigneten Ionenaustauscher entfernt. Als besonders geeignet erwies sich der Anionen-Austauscher Amberlite IRA-410, Korngrösse 0,29 bis 0,85 mm, der mit Natronlauge beladen war. Aber auch andere Austauscher können Verwendung finden, z. B. Lewatit MIH, beladen mit NH3. Die Entfernung der Sulfosalicylsäure gelingt besonders schnell, wenn man die Lösung zuerst 10 Minuten lang mit einem Kationenaustauscher, etwa Amberlite IK-120, beladen mit HCl, behandelt. Fügt man dann zu der kationen-freien Lösung den obengenannten Anionen-Austauscher hinzu, so ist bereits nach 20 - 25 Minuten keine Spur von Sulfosalicylsäure mehr nachweisbar.
Dieses Verfahren bietet grosse Vorteile gegenüber dem Arbeiten mit Austauscher-Säulen, das infolge der geringen Durchlaufgeschwindigkeit sehr zeitraubend ist und notwendigerweise zu starker Volumenvergrösserung und Verdünnung führt. Ausserdem kann bei der Ausrührmethode leicht der Zeitpunkt festgestellt werden, an dem der Austausch beendet ist. Die dann sofort mögliche Abtrennung der Lösung vom Austauscher verhindert die sonst durch sekundäre Reaktion zu erwartenden erheblichen Verluste. Eine Bindung des Inaktivators an den Austauscher, wie sie in den deutschen Patentschriften Nr. 1014288 und Nr. 1011576 beschrieben wird, findet nicht statt.
Die salz-und eiweissfreie Lösung wird vom Austauscher abgesaugt, mit wenig Aqua redest. nachgewaschen, auf PH 5 - 6 eingestellt, und kann nach biologischer Wertbestimmung verdünnt, steril filtriert und auf Ampullen abgefüllt werden. Sie ist pyrogenfrei, enthält keine Antigene und wird selbst in sehr hohen Dosen bei intravenöser Anwendung vom Menschen reaktionslos vertragen. Technische Grossansätze liefern gleichbleibende Ausbeuten, welche die der bekannten Verfahren um das Zwei- bis Dreifache
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Lösung von 150 g Calciumchlorid in 2, 21 Wasser und 12,8 l Methanol eingetragen. Dann wird innerhalb einer 1/2 Stunde auf 400C angeheizt und diese Temperatur 1 Stunde lang konstant gehalten.
Man kühlt auf 100C und trennt die Flüssigkeit auf einer Filterpresse oder Schleuder vom Rückstand ab. Dieser wird mit 1, 51 7 öligen Methanol gewaschen-und die geklärten Filtrate vereinigt.
Dann setzt man der Lösung unter kräftigem Rühren 60 g Kieselgur zu und lässt 40 l Aceton zufliessen.
Nach 1/2 Stunde stellt man den Rührer ab ; das mit dem Wirkstoff beladene Kieselgur setzt sich sofort zu Boden ; die überstehende Lösung ist kristallklar und wird vom Bodensatz abgehebert. Der Rückstand wird zentrifugiert, mit 600 cm3 Aceton nachgewaschen und dann auf einem Trockenblech ausgebreitet. In wenigen Stunden erhält man ein staubtrockenes Pulver, das mit 260 cm3 Aqua redest. 10 Minuten lang ausgerührt wird. Der Wirkstoff geht in Lösung, das Kieselgur wird abgesaugt und mit 250 cm3 Aqua redest. nachgewaschen.
In die vereinigten Filtrate lässt man unter Rühren so viel einer 20% igen wässerigen Sulfosalicylsäurelösung einfliessen, bis die Enteiweissung vollständig ist. Dazu sind 65 - 80 cm3 des Fällungsmittels erforderlich. Der Niederschlag wird über einer Filternutsche abgesaugt, der Wirkstoff befindet sich in der Lösung.
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Zur Entfernung des überschüssigen Eiweissfällungsmittels rührt man in die Lösung 150 cm3 mit Salzsäure beladenen Kationenaustauscher Amberlite IR-120 mit einer Korngrösse von 0, 29 bis 0, 85 mm ein. Nach 10 - 15 Minuten trennt man die saure Lösung vom Austauscher und wäscht mit etwas Aqua redest. nach. Dann rührt man die Lösung mit 400 cms Anionenaustauscher Amberlite IRA-410 mit einer Korngrösse von 0,29 bis 0, 85 mm, der mit Natronlauge beladen wurde, bis in einer Probe keine Spur von Salicylsäure mehr nachweisbar ist (Farbreaktion mit Eisenchlorid). Die vom Austauscher abgetrennte Lösung wird mit wenig Salzsäure neutralisiert.
Sie enthält 1450000 Kallikrein- Inaktivator-Einheiten (KIE) ; 1 KIE ist gebunden an 1,7 y organischer Substanz. An Stelle von Methanol kann auch Äthanol als organisches Lösungsmittel verwendet werden.
Führt man die Freilegung des Wirkstoffes aus den Drüsen mit einer wässerigen Chlorcalciumlösung ohne Zusatz eines organischen Lösungsmittels durch, so erhält man 525 000 KIE vom Reinheitsgrad 13 y.
Das ChlorcaJcium kann ersetzt werden durch Magnesiumchlorid, Magnesiumsulfat, Strontiumchlorid, Bariumchlorid, Ca1ciumhydroxyd, Natriumchlorid, Natriumbicarbonat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Natriumsulfat, Calciumnitrat, Calciumacetat, Natriumacetat oder Natriumnitrat.
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grad 9, 8 y.
Wenn man bei dem zuerst beschriebenen Verfahren die Enteiweissung statt mit Sulfosalicylsäure mit Trichloressigsäure vornimmt, so wird eine Ausbeute vom 970000 KIE mit einem Reinheitsgrad von 4, 1 y erzielt.
Verwendet man an Stelle von Rinderparotis Rinderleber und verfährt im übrigen wie oben angegeben, so erhält man den Kallikrein-Inaktivator in ähnlichen Ausbeuten.
Beispiel 2 : 5 kg gut zerkleinerte Rinderlunge werden mit einer Lösung von 150 g Chlorcalcium in 13 l Methanol unter Rühren l Stunde lang auf 400C erwärmt, der Drüsenrückstand nach Kühlung abgeschleudert und mit 1, 51 Methanol nachgewaschen. Die vereinigten Filtrate werden durch ein Seitz-Filter geklärt und in diese Lösung 60 g Kieselgur eingerührt. Dann lässt man 40 l Aceton einfliessen, rührt noch 1/2 Stunde und trennt den Niederschlag ab. Man wäscht den Rückstand mit etwas Aceton nach und trocknet ihn an der Luft.
Das Pulver wird zweimal mit je 200 cm3 Aqua redest. je 1/4 Stunde lang extrahiert und die vereinigten Filtrate mit 65 cm3 einer 20% gen wässerigen Sulfosalicylsäurelösung quantitativ gefällt. Nach Abtrennung des Niederschlags rührt man die Lösung 10 Minuten lang mit 70 cm3 des Ionenaustauschers AmberliteIR-120, saugt ab und rührtdas Filtrat 1 Stunde mit 450 cm3des Austauschers Amberlite IRA-410.
Die vom Austauscher abgetrennte Lösung wird mit wenig Salzsäure neutralisiert. Es werden 4 250 000 KIE vom Reinheitsgrad 0, 7 y erhalten.
Führt man die Extraktion des Wirkstoffes aus den Drüsen nicht in einer methanolischen, sondern mit einer 1 0gen wässerigen Chlorca1ciumlösung durch, so werden zur Fällung des Wirkstoffes 110 l Aceton benötigt.Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie beschrieben. Die Ausbeute beträgt 1050000 KIE bei einem Reinheitsgrad von 7,2 y.