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Verfahren zur Gewinnung von proteolytischen Pankreasenzymen von Säugetieren
,Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung der proteolytiischen Pankreasenzyme,
unten einfach Enzyme genannt, von säJugetieren., inslre-sond'ere Rindvieh und Schweinen,
in Verbindung mit der Herstellung von Insulin aus denselben Drüsen.
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Zur Gewinnung von Insulin aus den Bauchspeicheldrüsen von Säugetieren,
insbesondere Ri:nd'-vieh und Schweinen, verfährt man in. d°ir Technik derart, daß
die zerkleinerten Drüsen mit geeigneten Extraktionsmitteln, die das Insulin au.fläsen
können, unter solchen Bedingungen behandelt werden, daß die Enzyme daran gehindert
werden, inalctivierend auf dass Insulin einzuwirken. Als geeignete Extraktionsm.ittelwerden
in der Literatur Wasser, Äthyl- und Methylalkohol, unten einfach Alkohol genannt,
Aceton oder Gemische: dieser Stoffe mit oder ohne Säure-, Alkali- oder Salzzusatz
angegeben. Die meisten Methoden haben jedoch gemein:, da,ß an einem gewissem Zeitpunkt
Alkohol oder Aceton zugesetzt werden., entweder sofort, d. h. zu den zerkleinerten
Drüsen sol:bst, oder später zu einem z. B. wäßirigen Extrakt derselben, wonach das
Insulin ohne besondere Rücksicht auf die Enzyme reim, hergestellt werden kann, ohne
da,ß irgendeine nachweifsbare Inaktivierung des Insulins stattfindet.
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In den den Tieren sofort nach dem Schlachten entnommenen Drüsen befinden
sich keine aktivem Enzyme. Die Enzyme liegen als. Proenzyme in vollständig inaktivem
Zustand vor, werden aber schnell in den aktiven Zustand: umgewandelt, eis sei denn,
daß die Drüsen sofort bis unter o° C eingefroren werden. Da die, aktiven. Enzyme
auch bei niedriger
Temperatur auf 'Insulin inaktivierend einwirken,
verwnendiet man bei der Insulinfenstellung zur Erzielung der optimalen Insulinausbeuten
immer frische oder wohlkonservierte Drüsen, d. h. sofort eingefrorene Drüsen, in
denen die Enzyme also völlig oder nahezu inaktiv sind.
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Wenn das, Insulin bei den obengenanntein Extraktionsmethoden. rein
hergestellt werden kann, ohne daß irgendeine nachweisbare Inaktivierung des Insulins
stattfindet, hott man dies dem benutzten Al#kohul bzw. Aceton zugeschrieben, welcher
gemäß einigen Forschern die Wirkung der Enzyme ausschaltet, während andere Forscher
meinen, da.ß der Alkohol bzw. Aceton die Enzyme zerstört. Deinzufolge hat.man das
bei der Insuliin.h-erstellung abgetrennte DrüsenmateLrial als ungeeignet zurr Gewinnung
der Enzyme dar Bauchspeicheldrüsen. betrachtet und im ganzen genommen das -Material
für ein Restmaterial angesehen, das nur für Futter usw. Verwendung finden kann.
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Zur Herstellung der Pankreas@enzympr äparate, welche in den letzteren
Jahren verschiedene technisahe und pharmazeutische Verwendungen gefunden haben,
hat man deshalb bisher die Driisen unmittelbar benutzen müssen, indem die Enzyme
entweder durch Behandlung mit geeigneten Extraktionsmitteln, vorzugtsweiise wäß,rsgen
Flüssigkeiten, extrahiert werden, oder man hat die Drüsen einfach getrocknet, gegebenenfalls
.entfettet und pulverisiert, wozu Drüsen angewandt werden, in denen sämtliche Enzyme
je nach der Temperatur durch kürzere oder längere Lagerung aktiviert worden -sind,
je!d'enfadl@s so lange, bis sämtliche inaktiven Enzyme in aktive Enzyme umgewandelt
worden, sind.
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Die Erfindung beiruht nun auf der neuen ErkenntniG, d'afi die Enzyme
durch die Behandlung mit angesäuertem Alkohol oder Aceton zwecks Gewinnung des.
Insulins nicht zerstört werden, sondern -daß, dadurch eine von der Konzentration
des benutzten Alkohols, bzw. Acetomis bedingte Ausfällung der Enzyme erfolgt. Die
Ausfäalung ist doch auch vom. Verhältnis zwischen . Flüssigkeit und Drüsen bei .diel
Extraktion (dem Extraktionsverhältnis) abhängig, wird aiber, wnenn man nicht ganz
extreme Bedingungen anwendet, bei über 2o bfiis 6o Volumprozent Alkohol bzw. Aceton
stattfinden, indem 2o Volumprozent für ein kleines Extraktionsverhältnis und 6o
Volumprozent für ein großes Extraktionsver'häfnis gilt. Die Enzyme befinden sich
also tatsächlich mm Rückstand der Insulingewnnnung, wenn dabei in Abhängigkeit -des
Extraktionsverhiilltrrifsses, über 2,o bis 6o Volumproz@ent Alkohol oder Aceton
angewandt worden, .ist. In den zahlmeiohen Stoffen, welche bei der weiteren Aufarb'witung
des Insulins werden, befindet sich keine Enzym. Der Erfolg der Insulinigewinnung
düvrfte somit dem Umstand zu verdanken sein, da,ß mann in ernenn gegebenen Zeitpunkt
ein Lösungsmittel verwendet, das unter den gegebenem. Bedingungen gleichzeitig als
Fällmittel für die Enzyme wirksam. ist. Die letzteren. befiniden sich also in ungelöstem
und inaktivem Zustand im Rückstand von der Herstellung von Insulin aus frischen
odier wohlkonservierten Drüsen und können erst aktivIert werden, nachdem sie wieder
aufgelöst worden. sind.
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Zur Erzielung eines -,virks@amen Enzympräparates aus dem Rückstand
der Insulingewi nung muß man erfindunbs",:,nemäß somit nur dafür sorgen, da,ß die
ausgefällten Enzyme in Lösung gebracht und einer Aktivierung unterworfen werden.
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Das Verfahren gefnäß-der Erfindung isst. somit dadurch gekennzei.duvet,
daß man als Ausgangsmaterial denje,ni,gen Rückstand verwendet, der bei der Insulinextraktion
aus zerkleinerten frischen oder wohlkonservierten Pankreasdrüsen mit saurem Alkohol
oder Aceton angefallen isst, indem man diesem Rückstand die Enzyme mittels eines
wäßrigen Mediums entzieht, worin gegebenenfalls anwesender Alkohol oder Aceton mit
einer Konzentration unterhalb 6o Volumprozent, vorzugsweise unterhalb 2o Volumprozeint,
vorhanden, ist.
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Gemäß der ETfindung wird eis also möglich, Insulin und Enzym aufs,
denselben Drüsen. herzustellen, indem man zunächst. das Insulin beli einem passenden
pH-Wert unter Verwendung einer solchen Alkohol- bzw. Aaetonmenge extrahiert, daß
die Konzentration, dieses Stoffes in Abhängigkeit des verwendeten Exbrakti@ousverhältrnisses
2o bis 6o Volumprozent Überschreitet, oder indem man einen Drüsenextrakt mit Alkohol
oder Aceton bis auf eine Konzentration von: 2'o bis 6o Volumprozent versetzt und
diese Flüssigkeit auf Insulin verarbentet@, wonach, man den Rückstand einer Enzymextraktion
unter-,virft, wobei man dafür Sorge trägt, daß bei, dieser Extraktion, unter 6o
Volumproz'ent, vorzugsweise unter 2:o Volumpfozeut, Alkohol bzw. Aceton vorhanden
ist oder, mit anderen Worten, man das Fällmittel durch ein enzymdös,endes@ Mittel
ersetzt und darauf das gelöste Enzym aktiviert.
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Zur näheren. Beleuchtung der Bedeutung der Alkohol- und Acotonkonzentration
sei mit Äthylalkohol als Beispiel erwähnt, daß die Fällung der Enzyme! bei; einem
Extraktionsverhältnis vorn 7 : r bei etwa 3,0 Volumprozent Alkohol anfängt
und bei etwa 40 Volumprozent praktisch quantitativ isst. In diesem Falle muß man
bei der Insulinextraktion also eine Äthylialkoholkonzentration über q.o Volumprozent
verwenden, während die Alkoholkonzen.-tration. bei der Enzymextraktion unter
30 Valump.rozenti liegen muß.
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Die beim Verfahren gemäß .der Erfindung erzielte Enzymausbeute i'sb
von den Bedingungen der Insulingewinnung und der Enzymgewinnung abhänig ig.
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Was die Bedingungen ,der Insu lingewinnung anbelangt, so ist die Enzymausbeute
unabhängig von der angewandten Allrohol- bzw. Acetonkonzentratiom, wenn dieselbe
über 2o bis 6o Volumprozent liegt, und unabhängig von der, angewandten 72-,xtraktion!szeit,
wenn dieselbe nur lang genug gewesen ist, um Kontakt z,wiischen dem angewandten
Alkohol bzw. Aceton und den Enzymen zu erzielen und. die letzteren auszufällen.
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Was die Bedingungen der Enzym"-"e.wi.nnung anbelangt, so! Ist
diie Ausbeute in erster Linie. abhängig von der Konzentration des benutzten _Ukohols.
bzw. Acetons. Bei zo bis 6o- Vo@lumproze@nt Alkohol bz.w. Aceton und. mehr, je nach,
dem Extraktionsverhäiltnis, verbleiben die Enzyme unaufgelöst, darunter fangen die
Enzyme an, sich aufzulösen, und die Ausbeute ist somit stark steigend mit fallender
Alkohol- oder ilicetonkonztm.tra,tion:. Auch die Extraktionszeit spielt eine Rodclc,
so. daß eine verkürzte Extraktionszeit fallende Ausbeuten gibt.
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Zur Lösung der Enzyme ist es technisch zweckmäßig, Wasser zu benutzen,
und es hat sich gezeigt, da:ß eine wäßrige Extraktion in 24 Stunden unter Verwendung
von 7 Teilen, Extraktionsflüssiglceit gute Ausbeuten -gibt.
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Wie es sich aus dem Vorhergehenden ergibt, ist es für die. Enzymausbeute
aussehlaggebe:nd:, daß der .Mkohol- bzw. Aceton:gehalt dein Rückstandes der Insulinheirs:telluag
bis unter 2o biis 6o Volumprozent herabgesetzt wird. Zur Erziielung dieser Wirkung
kann ein, stark alkohol- bzw. aceto.nhaltiger Rückstand mit ausreichend großen Mengen
des enzymlösenden, Mittels, z. B. Wassiar, behandelt werden. Zweckmäßiger iis:t
es, d@aß die Hauptmenge des Alkohol- bzw. Acetongehaltes des Rückstandes zunächst
entfernt wird, z. B. durch Pressen. oder Eindampfen, wonach die Enzymextraktion
erfolgt. Hierdurch erhält man mehr konzentrierte Enzymlösungen und bessere Bedingungen
für die Wiederge:wi,nn;u@ng deis benutzten Alkohols bzw. Acetons.
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Das Verfahren. der Erfindung- bezweckt eine Verwertung des von der
sauren alkoholischen: Insulinextraktion herrührenden Drüsenrückstandes. Wenn, man
dabei z. B@. Salzsäure, Phospbors,äure, Milchsäure oder Essigsäure verwende-ty können
die Enzyme mittels Wassers aus dem Rückstand extrahiert werden, wenn. man dafür
Sorge trägt, daß bei der Extraktion weniger als 6o Volumprozent, vorzugsweise weniger
als 20 Valumprozent _\lkohol vorhanden ist.
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Wenn man bei der Insu.li-nextraktion. dagegen Schwefelsäure benutzt,
zeigt es sieh, daß die Enzyme in einem solchen Zustand im Rückstand vorliegen, da:ß
sie nicht unmittelbar extrahiert we@rde:n können, auch nicht, wenn die Alkohol-
bzw. Acetonkonzentration bei der Enzymextraktion auf Nu.1@I herabgesetzt wird, die:
Extraktionszeit lang und die Menge der Extraktionsflüssligkei:t groß ist.
Eine
Extraktion gelingt dagegen erfindungsgemüß, wenn als Extraktionsmittel eine: s,taike:
Harnstofflösung, über 5ovol.umprozentige Essigsäure, 85volumprozentige Ameisensäure,
flüssiges. Phenol angewandt wird oder durch vorsichtige Extraktion reit einem alkaJ:Ischen
Medium. Es bat sich aber erfindungsgemäß gezeigt; daß man auch eine einfach wäßrige:
Extraktion anwenden kann, wenn der Rückstand einer kurzen Erhitzung, z. B. auf ioo°
C, unterworfen wird.
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Was den pH-Wert der Enzymextraktion anbelangt, so ruß derselbe zwischen
etwa i und 7, zweckmäßig zwischen i und 4 liegen.. Schließlich sei bemerkt, daß
das Patina 755 295 ein Verfahren zur gleichzeitigen. Gewinnung von Enzymen und Insulin
aus Pankreas betrifft, wobei man auch Insulin, und Enzyme aufs demselben Dnüs"enmaterial
gewinnen kann. Dieses Verfahren ist jedoch vom Verfahren der vorliegenden Erfindung
grundsätzlich versohieden, indem es darein besteht:, daß man die Enzyme aus frischen.
oder wohlkonservierten Drüsen zunächst mittels eimies sauren, wäß,rigen Extraktionsmittels
bei. niedriger Temperatur und/oder kurzer Extraktionszeit extrahiert und darauf
das Insiuiltin nach bekannten. Verfahren aus dem Extraktionsrückstand gewinnt.
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Zur Erläuterung des Verfahrens gemäß der Erfindung dienen untenstehendle
Beispiele: Beispiel i i kg irische oder wohlkonservierte Bauchspeicheldrüsen werden
zerkleinert und mit 4 1 8oo/oigem Äthylalkobo@l., der mit 30 ml konzentrierter
Salzsäure versetztist, 3 Stundenextrahiert. DilzFlü!ssigk-cit wird ahfiltriert und
kann. in üblicher Weise auf Insulin verarbeitet werden:, während der Rücknstand
mit. 7 1 Wasser 24 Söunden enzymextrahiert wird. Danach wird abgeschleudert, und
aus der Flü ssigk eit werden die Enzyme gewonnen. Man erhält eine Ausbeute von etwa
io Millionen. Fuld-Groß-Einhaiten. Betreffend die Definition der Ful.d-Groß-Einhait
wird auf Gerbereichemisches Taschenbuch, 5. Au:fl., 1943, .S. 89 bifs 9i, verwiesen.
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Beispiel 2 i kg frische oder wöh:lkons-rvie:rte Bauchspeicheldrüsen
werden zerkleinert und mit. 6 1 8oo/oige,m Aceton, das mit 35 ml konzentrierter
Salzsäure versetzt ist, 4 Stunden extrahiert. Die Flüssigkeit wird abfiltriert und
kann. in üblicher Weise auf Insulin verarbeitet werden. Der Rückstand wird nach
weiterer Zerkleinerung mit 71 Wasscr 24 Stunden enzymextrahier , danach abgeschleudert,
und aus der Flüssigkeit werden die Enzyme gewonnen. Man erhäilt eine Ausbeute von
etwa io Millionen Fuld-Groß-Einheiten.
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Beispiel 3 i kg frische oder wohlkonservierte Bauchspeicheldrüsen
werden zerkleinert und mit 2,1 8oo/oigeim Äthylalkohol, der mit io ml konzentrierter
Schwefelsäare versetzt ist, 3 Stunden extrah i;ert. Die Flüssigkeit wird aba schleudert
und kann in üblicher Weise auf Insulin verarbeitet werden:, während der Rückstand
mit 3 1 33o/oi@ge:r Harnstoffläsung 2 Stunden enzymextrahiert wird. Nach dem A,bschleudern
werden die Enzyme aus der Flüssig-keit gewonnen. Man erhält eiine Ausbeute
von etwa 8 Millionen Fuld-Groß-Einheiten.
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Beispiel 4.
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i kg frische oder wohlkonservierte B.auchspeicheldrüsen werden zerkleinert
und mixt 6 1 8o°/oigem Äthylalkohol, der mit ioml konzentrierter Schwefelsäure versetzt
ist, 8 Stunden extrahiert. Die Flüssigkeit wird abgeschleudert und kann in
üblicher
Weisse auf Insulin verarbeitet werden, wübrend der Rückstand nach dem Pressen mit
41 Wassec, das, mit 2#o rn:l konzentrierter Selzsäune. versetzt ist, verrührt und
schnell auf ioo° C erhitzt wird, wonach sofort wieder abgekühlt wird. Nach dem AbGchleudern
werden die Enzyme aus der Flüssigkeit gewonnen. Man einhält eine Ausbeute von etwa
9 Millionen Füld-Groß-Einheiten.
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Diese Ausbeutern stellen Durchschnittsausbieuten dar. Mit b,e@sondbrs
gutem Drüsenmaterial können erheblich größere Ausbeuten: erhalten werden.