DE875640C - Verfahren zur Gewinnung von proteolytischen Pankreasenzymen von Saeugetieren - Google Patents

Description

• Verfahren zur Gewinnung von proteolytischen Pankreasenzymen von Säugetieren ,Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung der proteolytiischen Pankreasenzyme, unten einfach Enzyme genannt, von säJugetieren., inslre-sond'ere Rindvieh und Schweinen, in Verbindung mit der Herstellung von Insulin aus denselben Drüsen.
• Zur Gewinnung von Insulin aus den Bauchspeicheldrüsen von Säugetieren, insbesondere Ri:nd'-vieh und Schweinen, verfährt man in. d°ir Technik derart, daß die zerkleinerten Drüsen mit geeigneten Extraktionsmitteln, die das Insulin au.fläsen können, unter solchen Bedingungen behandelt werden, daß die Enzyme daran gehindert werden, inalctivierend auf dass Insulin einzuwirken. Als geeignete Extraktionsm.ittelwerden in der Literatur Wasser, Äthyl- und Methylalkohol, unten einfach Alkohol genannt, Aceton oder Gemische: dieser Stoffe mit oder ohne Säure-, Alkali- oder Salzzusatz angegeben. Die meisten Methoden haben jedoch gemein:, da,ß an einem gewissem Zeitpunkt Alkohol oder Aceton zugesetzt werden., entweder sofort, d. h. zu den zerkleinerten Drüsen sol:bst, oder später zu einem z. B. wäßirigen Extrakt derselben, wonach das Insulin ohne besondere Rücksicht auf die Enzyme reim, hergestellt werden kann, ohne da,ß irgendeine nachweifsbare Inaktivierung des Insulins stattfindet.
• In den den Tieren sofort nach dem Schlachten entnommenen Drüsen befinden sich keine aktivem Enzyme. Die Enzyme liegen als. Proenzyme in vollständig inaktivem Zustand vor, werden aber schnell in den aktiven Zustand: umgewandelt, eis sei denn, daß die Drüsen sofort bis unter o° C eingefroren werden. Da die, aktiven. Enzyme auch bei niedriger Temperatur auf 'Insulin inaktivierend einwirken, verwnendiet man bei der Insulinfenstellung zur Erzielung der optimalen Insulinausbeuten immer frische oder wohlkonservierte Drüsen, d. h. sofort eingefrorene Drüsen, in denen die Enzyme also völlig oder nahezu inaktiv sind.
• Wenn das, Insulin bei den obengenanntein Extraktionsmethoden. rein hergestellt werden kann, ohne daß irgendeine nachweisbare Inaktivierung des Insulins stattfindet, hott man dies dem benutzten Al#kohul bzw. Aceton zugeschrieben, welcher gemäß einigen Forschern die Wirkung der Enzyme ausschaltet, während andere Forscher meinen, da.ß der Alkohol bzw. Aceton die Enzyme zerstört. Deinzufolge hat.man das bei der Insuliin.h-erstellung abgetrennte DrüsenmateLrial als ungeeignet zurr Gewinnung der Enzyme dar Bauchspeicheldrüsen. betrachtet und im ganzen genommen das -Material für ein Restmaterial angesehen, das nur für Futter usw. Verwendung finden kann.
• Zur Herstellung der Pankreas@enzympr äparate, welche in den letzteren Jahren verschiedene technisahe und pharmazeutische Verwendungen gefunden haben, hat man deshalb bisher die Driisen unmittelbar benutzen müssen, indem die Enzyme entweder durch Behandlung mit geeigneten Extraktionsmitteln, vorzugtsweiise wäß,rsgen Flüssigkeiten, extrahiert werden, oder man hat die Drüsen einfach getrocknet, gegebenenfalls .entfettet und pulverisiert, wozu Drüsen angewandt werden, in denen sämtliche Enzyme je nach der Temperatur durch kürzere oder längere Lagerung aktiviert worden -sind, je!d'enfadl@s so lange, bis sämtliche inaktiven Enzyme in aktive Enzyme umgewandelt worden, sind.
• Die Erfindung beiruht nun auf der neuen ErkenntniG, d'afi die Enzyme durch die Behandlung mit angesäuertem Alkohol oder Aceton zwecks Gewinnung des. Insulins nicht zerstört werden, sondern -daß, dadurch eine von der Konzentration des benutzten Alkohols, bzw. Acetomis bedingte Ausfällung der Enzyme erfolgt. Die Ausfäalung ist doch auch vom. Verhältnis zwischen . Flüssigkeit und Drüsen bei .diel Extraktion (dem Extraktionsverhältnis) abhängig, wird aiber, wnenn man nicht ganz extreme Bedingungen anwendet, bei über 2o bfiis 6o Volumprozent Alkohol bzw. Aceton stattfinden, indem 2o Volumprozent für ein kleines Extraktionsverhältnis und 6o Volumprozent für ein großes Extraktionsver'häfnis gilt. Die Enzyme befinden sich also tatsächlich mm Rückstand der Insulingewnnnung, wenn dabei in Abhängigkeit -des Extraktionsverhiilltrrifsses, über 2,o bis 6o Volumproz@ent Alkohol oder Aceton angewandt worden, .ist. In den zahlmeiohen Stoffen, welche bei der weiteren Aufarb'witung des Insulins werden, befindet sich keine Enzym. Der Erfolg der Insulinigewinnung düvrfte somit dem Umstand zu verdanken sein, da,ß mann in ernenn gegebenen Zeitpunkt ein Lösungsmittel verwendet, das unter den gegebenem. Bedingungen gleichzeitig als Fällmittel für die Enzyme wirksam. ist. Die letzteren. befiniden sich also in ungelöstem und inaktivem Zustand im Rückstand von der Herstellung von Insulin aus frischen odier wohlkonservierten Drüsen und können erst aktivIert werden, nachdem sie wieder aufgelöst worden. sind.
• Zur Erzielung eines -,virks@amen Enzympräparates aus dem Rückstand der Insulingewi nung muß man erfindunbs",:,nemäß somit nur dafür sorgen, da,ß die ausgefällten Enzyme in Lösung gebracht und einer Aktivierung unterworfen werden.
• Das Verfahren gefnäß-der Erfindung isst. somit dadurch gekennzei.duvet, daß man als Ausgangsmaterial denje,ni,gen Rückstand verwendet, der bei der Insulinextraktion aus zerkleinerten frischen oder wohlkonservierten Pankreasdrüsen mit saurem Alkohol oder Aceton angefallen isst, indem man diesem Rückstand die Enzyme mittels eines wäßrigen Mediums entzieht, worin gegebenenfalls anwesender Alkohol oder Aceton mit einer Konzentration unterhalb 6o Volumprozent, vorzugsweise unterhalb 2o Volumprozeint, vorhanden, ist.
• Gemäß der ETfindung wird eis also möglich, Insulin und Enzym aufs, denselben Drüsen. herzustellen, indem man zunächst. das Insulin beli einem passenden pH-Wert unter Verwendung einer solchen Alkohol- bzw. Aaetonmenge extrahiert, daß die Konzentration, dieses Stoffes in Abhängigkeit des verwendeten Exbrakti@ousverhältrnisses 2o bis 6o Volumprozent Überschreitet, oder indem man einen Drüsenextrakt mit Alkohol oder Aceton bis auf eine Konzentration von: 2'o bis 6o Volumprozent versetzt und diese Flüssigkeit auf Insulin verarbentet@, wonach, man den Rückstand einer Enzymextraktion unter-,virft, wobei man dafür Sorge trägt, daß bei, dieser Extraktion, unter 6o Volumproz'ent, vorzugsweise unter 2:o Volumpfozeut, Alkohol bzw. Aceton vorhanden ist oder, mit anderen Worten, man das Fällmittel durch ein enzymdös,endes@ Mittel ersetzt und darauf das gelöste Enzym aktiviert.
• Zur näheren. Beleuchtung der Bedeutung der Alkohol- und Acotonkonzentration sei mit Äthylalkohol als Beispiel erwähnt, daß die Fällung der Enzyme! bei; einem Extraktionsverhältnis vorn 7 : r bei etwa 3,0 Volumprozent Alkohol anfängt und bei etwa 40 Volumprozent praktisch quantitativ isst. In diesem Falle muß man bei der Insulinextraktion also eine Äthylialkoholkonzentration über q.o Volumprozent verwenden, während die Alkoholkonzen.-tration. bei der Enzymextraktion unter 30 Valump.rozenti liegen muß.
• Die beim Verfahren gemäß .der Erfindung erzielte Enzymausbeute i'sb von den Bedingungen der Insulingewinnung und der Enzymgewinnung abhänig ig.
• Was die Bedingungen ,der Insu lingewinnung anbelangt, so ist die Enzymausbeute unabhängig von der angewandten Allrohol- bzw. Acetonkonzentratiom, wenn dieselbe über 2o bis 6o Volumprozent liegt, und unabhängig von der, angewandten 72-,xtraktion!szeit, wenn dieselbe nur lang genug gewesen ist, um Kontakt z,wiischen dem angewandten Alkohol bzw. Aceton und den Enzymen zu erzielen und. die letzteren auszufällen. r Was die Bedingungen der Enzym"-"e.wi.nnung anbelangt, so! Ist diie Ausbeute in erster Linie. abhängig von der Konzentration des benutzten _Ukohols. bzw. Acetons. Bei zo bis 6o- Vo@lumproze@nt Alkohol bz.w. Aceton und. mehr, je nach, dem Extraktionsverhäiltnis, verbleiben die Enzyme unaufgelöst, darunter fangen die Enzyme an, sich aufzulösen, und die Ausbeute ist somit stark steigend mit fallender Alkohol- oder ilicetonkonztm.tra,tion:. Auch die Extraktionszeit spielt eine Rodclc, so. daß eine verkürzte Extraktionszeit fallende Ausbeuten gibt.
• Zur Lösung der Enzyme ist es technisch zweckmäßig, Wasser zu benutzen, und es hat sich gezeigt, da:ß eine wäßrige Extraktion in 24 Stunden unter Verwendung von 7 Teilen, Extraktionsflüssiglceit gute Ausbeuten -gibt.
• Wie es sich aus dem Vorhergehenden ergibt, ist es für die. Enzymausbeute aussehlaggebe:nd:, daß der .Mkohol- bzw. Aceton:gehalt dein Rückstandes der Insulinheirs:telluag bis unter 2o biis 6o Volumprozent herabgesetzt wird. Zur Erziielung dieser Wirkung kann ein, stark alkohol- bzw. aceto.nhaltiger Rückstand mit ausreichend großen Mengen des enzymlösenden, Mittels, z. B. Wassiar, behandelt werden. Zweckmäßiger iis:t es, d@aß die Hauptmenge des Alkohol- bzw. Acetongehaltes des Rückstandes zunächst entfernt wird, z. B. durch Pressen. oder Eindampfen, wonach die Enzymextraktion erfolgt. Hierdurch erhält man mehr konzentrierte Enzymlösungen und bessere Bedingungen für die Wiederge:wi,nn;u@ng deis benutzten Alkohols bzw. Acetons.
• Das Verfahren. der Erfindung- bezweckt eine Verwertung des von der sauren alkoholischen: Insulinextraktion herrührenden Drüsenrückstandes. Wenn, man dabei z. B@. Salzsäure, Phospbors,äure, Milchsäure oder Essigsäure verwende-ty können die Enzyme mittels Wassers aus dem Rückstand extrahiert werden, wenn. man dafür Sorge trägt, daß bei der Extraktion weniger als 6o Volumprozent, vorzugsweise weniger als 20 Valumprozent _\lkohol vorhanden ist.
• Wenn man bei der Insu.li-nextraktion. dagegen Schwefelsäure benutzt, zeigt es sieh, daß die Enzyme in einem solchen Zustand im Rückstand vorliegen, da:ß sie nicht unmittelbar extrahiert we@rde:n können, auch nicht, wenn die Alkohol- bzw. Acetonkonzentration bei der Enzymextraktion auf Nu.1@I herabgesetzt wird, die: Extraktionszeit lang und die Menge der Extraktionsflüssligkei:t groß ist. Eine Extraktion gelingt dagegen erfindungsgemüß, wenn als Extraktionsmittel eine: s,taike: Harnstofflösung, über 5ovol.umprozentige Essigsäure, 85volumprozentige Ameisensäure, flüssiges. Phenol angewandt wird oder durch vorsichtige Extraktion reit einem alkaJ:Ischen Medium. Es bat sich aber erfindungsgemäß gezeigt; daß man auch eine einfach wäßrige: Extraktion anwenden kann, wenn der Rückstand einer kurzen Erhitzung, z. B. auf ioo° C, unterworfen wird.
• Was den pH-Wert der Enzymextraktion anbelangt, so ruß derselbe zwischen etwa i und 7, zweckmäßig zwischen i und 4 liegen.. Schließlich sei bemerkt, daß das Patina 755 295 ein Verfahren zur gleichzeitigen. Gewinnung von Enzymen und Insulin aus Pankreas betrifft, wobei man auch Insulin, und Enzyme aufs demselben Dnüs"enmaterial gewinnen kann. Dieses Verfahren ist jedoch vom Verfahren der vorliegenden Erfindung grundsätzlich versohieden, indem es darein besteht:, daß man die Enzyme aus frischen. oder wohlkonservierten Drüsen zunächst mittels eimies sauren, wäß,rigen Extraktionsmittels bei. niedriger Temperatur und/oder kurzer Extraktionszeit extrahiert und darauf das Insiuiltin nach bekannten. Verfahren aus dem Extraktionsrückstand gewinnt.
• Zur Erläuterung des Verfahrens gemäß der Erfindung dienen untenstehendle Beispiele: Beispiel i i kg irische oder wohlkonservierte Bauchspeicheldrüsen werden zerkleinert und mit 4 1 8oo/oigem Äthylalkobo@l., der mit 30 ml konzentrierter Salzsäure versetztist, 3 Stundenextrahiert. DilzFlü!ssigk-cit wird ahfiltriert und kann. in üblicher Weise auf Insulin verarbeitet werden:, während der Rücknstand mit. 7 1 Wasser 24 Söunden enzymextrahiert wird. Danach wird abgeschleudert, und aus der Flü ssigk eit werden die Enzyme gewonnen. Man erhält eine Ausbeute von etwa io Millionen. Fuld-Groß-Einhaiten. Betreffend die Definition der Ful.d-Groß-Einhait wird auf Gerbereichemisches Taschenbuch, 5. Au:fl., 1943, .S. 89 bifs 9i, verwiesen.
• Beispiel 2 i kg frische oder wöh:lkons-rvie:rte Bauchspeicheldrüsen werden zerkleinert und mit. 6 1 8oo/oige,m Aceton, das mit 35 ml konzentrierter Salzsäure versetzt ist, 4 Stunden extrahiert. Die Flüssigkeit wird abfiltriert und kann. in üblicher Weise auf Insulin verarbeitet werden. Der Rückstand wird nach weiterer Zerkleinerung mit 71 Wasscr 24 Stunden enzymextrahier , danach abgeschleudert, und aus der Flüssigkeit werden die Enzyme gewonnen. Man erhäilt eine Ausbeute von etwa io Millionen Fuld-Groß-Einheiten.
• Beispiel 3 i kg frische oder wohlkonservierte Bauchspeicheldrüsen werden zerkleinert und mit 2,1 8oo/oigeim Äthylalkohol, der mit io ml konzentrierter Schwefelsäare versetzt ist, 3 Stunden extrah i;ert. Die Flüssigkeit wird aba schleudert und kann in üblicher Weise auf Insulin verarbeitet werden:, während der Rückstand mit 3 1 33o/oi@ge:r Harnstoffläsung 2 Stunden enzymextrahiert wird. Nach dem A,bschleudern werden die Enzyme aus der Flüssig-keit gewonnen. Man erhält eiine Ausbeute von etwa 8 Millionen Fuld-Groß-Einheiten.
• Beispiel 4.
• i kg frische oder wohlkonservierte B.auchspeicheldrüsen werden zerkleinert und mixt 6 1 8o°/oigem Äthylalkohol, der mit ioml konzentrierter Schwefelsäure versetzt ist, 8 Stunden extrahiert. Die Flüssigkeit wird abgeschleudert und kann in üblicher Weisse auf Insulin verarbeitet werden, wübrend der Rückstand nach dem Pressen mit 41 Wassec, das, mit 2#o rn:l konzentrierter Selzsäune. versetzt ist, verrührt und schnell auf ioo° C erhitzt wird, wonach sofort wieder abgekühlt wird. Nach dem AbGchleudern werden die Enzyme aus der Flüssigkeit gewonnen. Man einhält eine Ausbeute von etwa 9 Millionen Füld-Groß-Einheiten.
• Diese Ausbeutern stellen Durchschnittsausbieuten dar. Mit b,e@sondbrs gutem Drüsenmaterial können erheblich größere Ausbeuten: erhalten werden.

Claims (1)

1. PATENTANSPRÜCHE: i. Verfahren zur Gewinnung vom: proteolyti- schaen Pankreasenzymen aus Säugetieren, ins- besondere Rindvieh und Schweinen, dadurch gekennzeichnet, daß mann als Ausgangsmaterfal denjenigen Rückstand verwende, dar bei der Insulinextraktion aus zerkleinerten frischen oder wohlkonservierten Panil<:reasdr'üsen mit saurem Alkohol oder Aceton angefallen isst, in- dem mann diesem Rückstand die Enzyme mittels eines wäßri"gen @ Mediums entzieht, worin ge- geableneanfafs anwesender Alkohol oder Aceton mit einer K@on2entration unterhalb, 6o Volum- prozent, vorzugsweiise unterhalb 2o Volutnprozent, enthalten ist. 2z. Verfahren. nach. Anspruch. i, dadurch ge- kennzeichnet, daß die Hauptmenge des Alkohol-bzw. Acetongehaltes des Rückstandes vor der Enzymextraktion z. B. durch Pressen entfernt wird. 3. Verfahren nach Anspruch i und 2z, dadurch gekennzeichnet, daß angesäuertes Wasser als Extraktionsmittel für die Enzyme angewandt wird. 4. Verfahren nach Anspruch i bis 3., dadurch gekennzeichnet, daaß der Rückstand, wenn er schwefelstauer ist, bei der Enzymeextraktion einer kurzen. Ef tzung unterworfen wird. 5. Verfahren nach Anspruch i und 2; dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme mittels einer starken Harnstoffläsung, starker Essigsäure, starker Amensensäure, flüssigen Phenöls oder eines alkalischen Mediums aus dem schwefelsauren Rückstand extrahiert werden. 6. Verfahren nach je einem der Ansprüche i Dias 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymauflösung bei einem pH-Wert-vQn etwa i bis 7, zweckmäßig i bis 4, vorgenommen wird.