MXPA04006733A - Metodos y composiciones para transporte de oxigeno que comprenden una alta afinidad al oxigeno. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona a productos sanguineos, y mas particularmente a composiciones que comprenden una hemoglobina oxigenada modificada que tiene una alta afinidad por el oxigeno y metodos para hacer tales composiciones. Las composiciones de conformidad con la presente invencion tienen mejor estabilidad a la autooxidacion y caracteristicas de acarreo de oxigeno superiores.

Description

METODOS Y COMPOSICIONES PARA TRANSPORTE DE OXIGENO QUE COMPRENDEN UNA ALTA AFINIDAD Al OXIGENO REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la prioridad bajo 35 U.S.C. § 119(e) de la solicitud norteamericana No. de serie 60/347,741, presentada el 11 de enero del 2002. CAMPO TECNICO La presente invención se relaciona a productos sanguíneos, y más particularmente a composiciones que comprenden una hemoglobina modificada que tiene una alta afinidad para oxígeno y métodos para hacer tales composiciones . ANTECEDENTES DE LA INVENCION El Sistema Circulatorio y la Naturaleza de la Hemoglobina La sangre es el medio para suministrar nutrientes a los tejidos y remover productos de desecho de los tejidos para excreción. La sangre está compuesta de plasma en el cual están suspendidos glóbulos rojos (RBCs o eritrocitos) , glóbulos blancos (WBCs) , y plaquetas. Los glóbulos rojos comprenden aproximadamente 99% de las células en la sangre, y su principal función es el transporte de oxígeno a los tejidos y la remoción de dióxido de carbono de los mismos. El- ventrículo izquierdo del corazón bombea la sangre a través de las arterias y las arteriolas más pequeñas del · sistema circulatorio. La sangre luego entra a los capilares, donde ocurre la mayor parte del intercambio de nutrientes y productos de desecho celulares. (Ver, por ejemplo, A. C. Guyton, "Human Physiology And Mechanisms Of Disease" (3a ed. ; W. B. Saunders, Co., Philadelphia, Pa.)/ pp. 228-229 (1982)). Después, la sangre viaja a través de las vénulas y venas en su regreso al atrio o ventrículo derecho del corazón. Aunque la sangre que regresa al corazón está pobre en oxígeno comparada con aquella que es bombeada desde el corazón, cuando está en reposo, la sangre de retorno aún contiene aproximadamente 75% del contenido de oxígeno original. La función de oxigenación reversible (es decir, el suministro de oxígeno) de los RBCs se lleva a cabo mediante la proteína, hemoglobina. En los mamíferos, la hemoglobina tiene un peso molecular de aproximadamente 64,000 daltons y está compuesta de aproximadamente 6% de heme y 94% de globina. En su forma nativa, esta contiene dos pares de subunidades (es decir, es un tetrámero) , cada una que contienen un grupo heme y una cadena de polipéptido de globina. En solución acuosa, la hemoglobina está presente en equilibrio entre las formas tetraméricas (MW 64,000) y diméricas (MW 32,000); fuera del RBC, los dímeros se excretan prematuramente por el riñon (periodo de vida media del plasma, de aproximadamente 2-4 horas) . Junto con la hemoglobina, los RBCs contienen estroma (la membrana de RBC), que comprende proteínas, colesterol y fosfolipidos . Productos Sanguíneos Exógenos Debido a la demanda por productos sanguíneos en hospitales y en otras instalaciones, la investigación extensiva se ha dirigido al desarrollo de sustitutos sanguíneos y expandidores de plasma Un sustituto sanguíneo^ es un producto sanguíneo que es capaz de acarrear y suministrar oxígeno a los tejidos. Los sustitutos sanguíneos tienen un número de usos, incluyendo el reemplazo de la sangre perdida durante los procedimientos quirúrgicos y después de la hemorragia aguda, y para procedimientos de resucitación después de la lesión traumática. Los expandidores de plasma son sustitutos sanguíneos que se administran en el sistema vascular pero típicamente no son capaces de acarrear oxígeno. Los expandidores de plasma pueden ser usados, por ejemplo, para reemplazar el plasma perdido de las quemaduras, para tratar el choque de deficiencia de volumen y para efectuar la hemodilución (por ejemplo, para el mantenimiento de normovolemia y para disminuir la viscosidad la sangre) . Esencialmente, los sustitutos sanguíneos se pueden usar para estos propósitos o cualquier propósito en el cual la sangre de banco está actualmente administrada a pacientes. (Ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 4,001,401 de Bonson y colaboradores y 4,061,736 de Morris y colaboradores).

El suministro de sangre humana actual está asociado con varias limitaciones que pueden ser resueltas a través del uso de un sustituto sanguíneo exógeno. Por ilustrar, la disponibilidad difundida de sustitutos sanguíneos seguros y efectivos reduciría la necesidad por sangre de banco (alogeneica) . Además, tales sustitutos sanguíneos permitirían la infusión inmediata de una solución de resucitación después de la lesión traumática sin considerar la igualación cruzada (como es requerido para la sangre) ahorrando de esta manera tiempo valioso en el suministro de oxígeno al tejido isquémico. Del mismo modo, los sustitutos sanguíneos se pueden administrar a pacientes antes de la cirugía, permitiendo la remoción de sangre autóloga de los pacientes que podría ser regresada después en el procedimiento, si es necesario, o después de la cirugía. Así, el uso de productos sanguíneos exógenos no solamente protege a los pacientes de la exposición a la sangre no autóloga (alogeneica) , sino que conserva la sangre ya sea autóloga o alogeneica (de banco, igualada por cruzamiento) para su uso óptimo. Limitaciones de los Sustitutos Sanguíneos Actuales Los intentos para producir sustitutos sanguíneos (algunas veces referidos como "expandidores de plasmas de acarreo de oxígeno" ) así han producido hasta ahora productos con eficacia marginal o cuya fabricación es tediosa, costosa o ambas. Frecuentemente, el costo de fabricación de tales productos es tan alto que efectivameate evita el uso difundido de los productos, particularmente en aquellos mercados donde existe la necesidad más grande (por ejemplo, las economías del tercer mundo emergentes) . Los sustitutos sanguíneos pueden ser agrupados en las siguientes tres categorías: i) emulsiones" basadas en perfluorocarbono, ii) hemoglobina encapsulada en liposoma, y iii) hemoglobina libre de células modificada. Como es discutido enseguida, nada ha sido completamente exitoso, aunque productos que comprenden hemoglobina libre de células modificada se piensan que son lo más prometedor. Las composiciones basadas en perfluoroquímico disuelven el oxígeno como es opuesto a enlazarlo como un ligando. Para ser usado en sistemas biológicos, el perfluoroquímico debe ser emulsificado con un lípido, típicamente fosfolípido de yema de huevo. Aunque las emulsiones de perfluorocarbono son poco costosas de fabricar, ellas no acarrean suficiente oxígeno a dosis clínicamente toleradas para ser efectivas. A la inversa, mientras que la hemoglobina encapsulada en liposoma se ha mostrado que es efectiva, esta es demasiado costosa para el uso difundido. (Ver generalmente, Winslow, Robert M. , "Hemoglobin-based Red Cell Substitutes", Johns Hopkins University Press, Baltimore (1992)). La mayoría de los productos de sustitutos sanguíneos en experimentos clínicos actualmente están basados sobre hemoglobina modificada. Estos productos, frecuentemente referidos como portadores de oxigeno basados en hemoglobina (HBOCs) , generalmente comprenden una solución acuosa homogénea de una hemoglobina químicamente modificada, esencialmente libre de otro residuo de glóbulo rojo (estroma) . Aunque la hemoglobina libre de estroma (SEH) de humanos es la. materia prima más común para la preparación de un HBOC, también se han utilizado otras fuentes de hemoglobina. Por ejemplo, la hemoglobina se puede obtener o derivar de sangre animal, (por ejemplo, hemoglobina bovina o porcina) o de bacterias o levaduras o animales transgénicos o plantas molecularmente alteradas para producir un producto de hemoglobina deseado. La modificación química es generalmente una de reticulación intramolecular, oligomerización y/o conjugación polimérica para modificar la hemoglobina, de tal manera que su persistencia en la circulación es prolongada con relación a aquella de la hemoglobina no modificada, y sus propiedades de enlace de oxígeno son similares a aquellas de la sangre. La reticulación intramolecular químicamente enlaza conjuntamente subunidades de la unidad de hemoglobina tetramérica para impedir la formación de dimeros que, como se indicó previamente, son excretados prematuramente. (Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,296,465 de Rausch y colaboradores) .

Los altos costos de fabricación de productos HBOC han limitado grandemente su viabilidad comercial. Además, los presentes inventores han encontrado que los HBOCs conocidos tienen una tendencia a liberar cantidades excesivas de oxigeno a los tejidos en las paredes de las arteriolas antes que en los capilares. Esto puede dar por resultado insuficiente oxigeno disponible para el suministro por el HBOC a los tejidos que circundan los capilares. Esto es a pesar del hecho de que la carga inicial del HBOC con oxigeno puede ser relativamente alta, comparada con aquella normalmente alcanzada con los glóbulos rojos naturales, excepto en el caso de mutantes de muy baja afinidad. En la mayoría de los casos, los HBOCs se han diseñado para tener afinidades de oxigeno que son los mismas como, o menores que, aquella de la hemoglobina nativa. Sin embargo, como es discutido en lo anterior, esto puede dar por resultado insuficiente suministro de oxígeno a los tejidos. Por consiguiente, la presente invención se relaciona a un sustituto sanguíneo que comprende un HBOC con altas afinidades al oxígeno en un diluyente acuoso. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Los métodos y composiciones de la presente invención son útiles en una variedad de instalaciones incluyendo salas de emergencia, salas de operación, conflictos militares, hospitales de cáncer y clínicas veterinarias. La baja toxicidad y alta estabilidad de la presente invención permiten el almacenamiento a temperatura ambiente sin comprometer la eficacia del sustituto sanguíneo descrito. La presente invención también evita el requerimiento para la igualación cruzada por tipo de sangre y la prueba de laboratorio asociada, permitiendo una intervención más temprana y más segura en el tratamiento del paciente. La combinación de baja toxicidad, estabilidad a largo plazo y aplicabilidad universal de la presente invención, por lo tanto, presenta un sustituto particularmente útil para la sangre. En un aspecto, la presente invención proporciona un producto de sustituto sanguíneo que comprende hemoglobina oxigenada modificada en la superficie, en donde la hemoglobina oxigenada modificada en la superficie tiene una P50 menor que la hemoglobina libre de estroma nativa de la misma fuente de animal (es decir, de la misma especie de animal) cuando se miden en las mismas condiciones. Las fuentes de animales adecuados incluyen, por ejemplo, humanos, vacas, cerdos, caballos. En una modalidad preferida, el producto de sustituto sanguíneo toma la forma de una composición que comprende la hemoglobina oxigenada modificada en la superficie y un diluyente acuoso. En una modalidad especifica, la hemoglobina oxigenada modificada en la superficie tiene una P50 menor que 10 torr, de preferencia menor que 7 torr. En otro aspecto, la presente invención proporciona un producto de .sustituto sanguíneo producido al unir covalentemente uno o más óxidos de polialquileno a la hemoglobina oxigenada. En una modalidad especifica, el producto de sustituto sanguíneo se produce al unir covalentemente un polímero de un óxido de polialquileno tal como polietilenglicol (PEG) que tiene la fórmula H (OCH2CH2) nOH, donde n es mayor que o igual a 4. De preferencia, el producto tiene una relación de methemoglobina/hemoglobina total menor que 0.10. Todavía en otro aspecto, la presente invención proporciona un producto de sustituto sanguíneo estable a la autooxidación a 24 °C, que comprende un conjugado de PEG-hemoglobina, en donde la relación de methemoglobina/hemoglobina total es menor que 0.10 y el conjugado de PEG-hemoglobina tiene una P50 menor que 10 torr. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para hacer una composición de sustituto sanguíneo que comprende las etapas de: a) preparación de hemoglobina que tiene una relación de methemoglobina/hemoglobina total menor que 0.10; b) unión covalentemente de óxido de polialquileno a la hemoglobina para formar hemoglobina oxigenada modificada en la superficie que tiene una P50 menor que 10 torr; y c) suspensión de la hemoglobina oxigenada modificada en la superficie en un diluyente adecuado. De preferencia la preparación de hemoglobina además comprende el aislamiento de hemoglobina de los glóbulos rojos. Además, la etapa de preparación de la hemoglobina además puede comprender el aislamiento de hemoglobina de los glóbulos rojos, en donde la hemoglobina tiene una relación de methemoglobina/hernoglobina total de 0.10 o más grande, y la -exposición de la hemoglobina a condiciones aeróbicas (es decir, la atmósfera) durante un tiempo suficiente para bajar la relación de methemoglobina/hernoglobina total a menor que 0.10. Esta etapa puede ser llevada a cabo en la ausencia de un agente reductor que contiene tiol. Todavía en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para usar un producto de sustituto sanguíneo para suministrar oxígeno a un tejido, que comprende administrar el producto en un diluyente acuoso a un mamífero en necesidad del mismo. Otros aspectos de la presente invención son descritos por toda la especificación. BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 representa el cromatograma FPLC de MalPEG-Hb y SFH. La Figura 2 representa las curvas de equilibrio de oxígeno para MalPEG-Hb y SFH. La Figura 3 representa los patrones de FPLC de elución para las dos hemoglobinas modificadas con PEG (PHP y POE) y la hemoglobina no modificada (SFH) . Observar' que los patrones para PHP y POE son cualitativamente, pero no cuantitativamente, similares. También, observar el pico pequeño de la hemoglobina aparentemente no modificada en la curva de POE. La Figura 4 representa las curvas de equilibrio de oxígeno para las dos hemoglobinas modificadas con PEG (PHP y POE) . Observar que ninguna tiene cooperatividad significante. La Figura 5 representa la proporción de oxidación a través del tiempo cuando la MalPEG-hemoglobina está a temperatura ambiente. Se midieron muestras por duplicado de 2 botellas separadas almacenadas de la misma manera. La proporción de oxidación es de 1 por ciento por hora de hemoglobina total, ocurriendo de 5.0 a 5.5 por ciento en 10 horas . La Figura 6 representa el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de los dos grupos de animales que recibieron ya sea PHP o POE. La Figura 7 representa la presión media arterial en animales que recibieron las dos hemoglobinas modificadas con PEG (PHP y POE) . La respuesta es inmediata y más grande en los animales que recibieron PHP. Sin embargo, la presión es mejor mantenida en los animales de POE durante el periodo de hemorragia . La Figura 8 representa un resumen de varias proporciones de oxidación a través del tiempo" cuando MalPEG-Hb se almacena durante seis días a -20 °C, cinco días a +4°C, y luego diez horas a temperatura ambiente (24°C). . La Figura 9 representa la proporción de oxidación a través del tiempo cuando MalPEG-Hb se almacena durante cinco días a +4°C. La Figura 10 representa la proporción de oxidación a través del tiempo cuando MalPEG-Hb se almacena durante diez horas a temperatura ambiente. DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se dirige a sustitutos sanguíneos que comprenden HBOCs que tienen alta afinidad al oxígeno. Para ciertas aplicaciones, estas composiciones son capaces de suministrar oxígeno a los tejidos más eficientemente que los sustitutos sanguíneos con afinidades al oxígeno que se aproximan a la hemoglobina nativa. Definiciones Para facilitar el entendimiento de la invención expuesta en la descripción que sigue, un número de términos se definen enseguida. El término "hemoglobina" se refiere generalmente a la proteína contenida dentro de los glóbulos rojos que transporta oxigeno. Cada molécula de hemoglobina tiene 4 subunidades, 2 cadenas a y 2 cadenas ß, que están arregladas en una estructura tetramérica. Cada subunidad también contiene un grupo heme, que es el centro que contiene hierro que enlaza oxigeno. Asi, cada molécula de hemoglobina puede enlazar 4 moléculas de oxigeno. El término "hemoglobina modificada" incluye, pero no está limitada a, hemoglobina alterada por una reacción química tal como la reticulación intra- e inter-molecular, la manipulación genética, la polimerización, y/o la conjugación con otros grupos químicos (por ejemplo, óxidos de polialquileno, por ejemplo polietilenglicol, u otros aductos tales como proteínas, péptidos, carbohidratos, polímeros sintéticos y similares). En esencia, la hemoglobina es "modificada" sí algunas de sus propiedades estructurales o funcionales se han alterado de su estado nativo. Como se utiliza en la presente, el término "hemoglobina" por sí mismo se refiere a la hemoglobina no modificada, nativa, así como hemoglobina modificada. El término "hemoglobina modificada en la superficie" se usa para referirse a hemoglobina descrita en lo anterior a la cual grupos químicos tales como dextrano u óxido de polialquileno se han unido, más usualmente de manera covalente. El término "hemoglobina oxigenada modificada en la superficie" se refiere a hemoglobina que está en el estado "R" cuando es modificada en la superficie. El término "hemoglobina libre de estroma" se refiere a hemoglobina de la cual se han removido todas las membranas de glóbulos rojos. El término "methemoglobina" se refiere a una forma oxidada de hemoglobina que contiene hierro en el estado férrico y no puede funcionar como un portador de oxigeno. El término "MalPEG-Hb" se refiere a hemoglobina a la cual se ha conjugado PEG activado con malemidilo. Tal MalPEG puede ser además referido por la siguiente fórmula: Hb- (S-Y-R-CH2-CH2-[0-CH2-CH2]n-0-CH3)m Fórmula I donde Hb se refiere a hemoglobina tetramérica, S es un grupo tiol superficial, Y es el enlace covalente de succinimido entre Hb y Mal-PEG, R es grupo alquilo, amida, carbamato o fenilo (dependiendo de la fuente de materia prima y el método de síntesis química), [0-CH2-CH2]n son la unidades de oxietileno que constituyen la cadena principal del polímero de PEG, donde n define la longitud del polímero (por ejemplo, MW = 5000), y OCH3 es el grupo metoxi terminal. PHP y POE son dos diferentes hemoglobinas modificadas con PEG. El término "perfluorocarbono" se refiere a moléculas sintéticas, inertes que contienen átomos de flúor, y que consisten completamente de átomos de halógeno (Br, F, Cl) y de carbono. En la forma de emulsiones, ellas están bajo desarrollo como sustancias sanguíneas, debido que tienen la habilidad para disolver muchas veces más oxigeno que cantidades equivalentes de plasma o agua. El término "expandidor de plasma" se refiere a cualquier solución que puede ser dada a un sujeto para tratar la pérdida de sangre. El término "capacidad de acarreo de oxigeno" o simplemente "capacidad de oxigeno" se refiere a la capacidad de un sustituto sanguíneo para acarrear oxígeno, pero no necesariamente se relaciona con la eficiencia en la cual suministra oxígeno. La capacidad de acarreo de oxígeno es generalmente calculada de la concentración de hemoglobina, puesto que se conoce que cada gramo de hemoglobina enlaza 1.34 mi de oxígeno. Así, la concentración de hemoglobina en g/dl multiplicado por el factor 1.34 produce la capacidad de oxígeno en ml/dl. La concentración de hemoglobina se puede medir mediante cualquier método conocido, tal como al utilizar el Fotómetro de ß-Hemoglobina (HemoCue, Inc., Angelholm, Sweden) . De manera similar, la capacidad de oxígeno se puede medir mediante la cantidad de oxígeno liberado de una muestra de hemoglobina o sangre al utilizar, por ejemplo, un instrumento de celda de combustible (por ejemplo, Lex-02-Con; Lexington Instruments) . El término "afinidad al oxígeno" se refiere a la avidez con la cual un portador de oxígeno tal como hemoglobina enlaza oxígeno molecular. Esta característica es definida por la curva de equilibrio de oxigeno que relaciona el grado de saturación de moléculas de hemoglobina con oxigeno (eje Y) con la presión parcial de oxigeno (eje X) . La posición de esta curva es denotada por el valor, · P50, la presión parcial de oxigeno en la cual el portador de oxigeno es medio saturado con oxigeno, y está inversamente relacionada con la afinidad al oxigeno. Por consiguiente, entre menor es la P50, más alta es la afinidad de oxigeno. La afinidad al oxigeno de la sangre completa (y componentes de la sangre completa tales como glóbulos rojos y hemoglobina) se puede medir mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. (Ver, por ejemplo, Winslow y colaboradores, J. Biol. Chem. 252 ( 7 ): 2331-37 (1997)). La afinidad al oxigeno también puede ser determinada usando un Analizador HEMOSMR TM comercialmente disponible (TCS Scientific Corporation, New Hope, Pennsylvania) . (Ver, por ejemplo, Vandegriff and Shrager en "Methods in Enzymology" (Everse y colaboradores, eds.) 232:460 (1994)). El término "hipertónico" significa una solución coloidal con una presión osmótica coloidal (oncótica) que la sangre ( Aproximadamente 25-27 mm Hg) . La presión osmótica coloidal puede ser medida mediante cualquier técnica adecuada, tal como en un instrumento Wescor. El término "componente de acarreo de oxigeno" se refiere ampliamente a una sustancia capaz de acarrear oxigeno en el sistema circulatorio del cuerpo y suministrar por lo menos una porción de ese oxigeno a los tejidos. En modalidades preferidas, el componente de acarreo de oxigeno es hemoglobina nativa o modificada, y también es referida en la presente como "portador de oxigeno basado en hemoglobina", o "HBOC". El término "parámetros hemodinámicos" se refiere ampliamente a mediciones indicativas del estado de presión, flujo y volumen de la sangre, incluyendo mediciones tal como la presión sanguínea, rendimiento cardiaco, presión atrial derecha y presión diastólica del extremo ventricular izquierdo . El término "cristaloide" se refiere a moléculas pequeñas (usualmente menores que 10 Á) tales como sales, azúcares y reguladores. Distinto a los coloides, los cristaloides no contienen ninguno de los componentes oncóticamente activos y se equilibran entre la circulación y los espacios intersticiales muy rápidamente. El término "coloide" en contraste a "cristaloide" se refiere a moléculas más grandes (usualmente más grandes que 10 Á) que se equilibran a través de las membranas biológicas dependiendo de su tamaño y carga e incluye proteínas tales como albúmina y gelatina, así como almidones tales como pentaalmidón y hetaalmidón. El término "presión osmótica coloide" se refiere a la presión ejercida por un coloide para equilibrar el balance de fluido a través de una membrana. El término "estable a la autooxidación" se refiere a la habilidad de un HBOC para mantener una baja proporción de autooxidación. HBOC se considera estable a 24 °C sí la relación de methemoglobina/hemoglobina total no se incrementa más de 2% después de 10 horas a 24 °C. Por ejemplo, sí la proporción de autooxidación es 0.2Hr_1, entonces sí el porcentaje inicial de la methemoglobina es 5%, el HBOC sería considerado estable a temperatura ambiente durante 10 horas sí este porcentaje no se incrementó arriba de 7%. El término "relación de methemoglobina/hemoglobina total" se refiere a la relación de hemoglobina desoxigenada a la hemoglobina total. El término "mezcla" se refiere a una asociación conjunta de dos o más sustancias sin la ocurrencia de una reacción, mediante la cual ellas perderían sus propiedades individuales; el término "solución" se refiere a una mezcla líquida; el término "solución acuosa" se refiere a una solución que contiene algo de agua y también puede contener una o más de otras sustancias líquidas con agua para formar una solución multicomponente; el término "aproximadamente" se refiere al valor real que está dentro de una gama, por ejemplo, de 10%, del valor indicado. El término "polietilenglicol" se refiere a polímeros líquidos o sólidos de la fórmula química general H (OCH2CH2) nOH, donde n es más grande que o igual a 4. Se puede utilizar cualquier formulación de PEG, sustituida o no sustituida. El significado de otra terminología utilizada en la presente debe ser fácilmente entendida por alguien de habilidad razonable en la técnica. La Naturaleza del Suministro y Consumo de Oxígeno Aunque el uso exitoso de las composiciones y métodos de la presente invención no requieren comprensión de los mecanismos implícitos de suministro y consumo de oxígeno, el conocimiento básico que considera algunos de estos mecanismos putativos puede ayudar a entender la disposición que sigue. Generalmente se ha asumido que los capilares son los transportadores primarios de oxígeno al tejido. Sin embargo, considerando el tejido en reposo, los descubrimientos actuales indican que hay aproximadamente una equipartición entre la liberación de oxígeno arteriolar y capilar. Es decir, la hemoglobina en el sistema arterial se cree que suministra aproximadamente un tercio de su contenido de oxígeno en la red arteriolar y un tercio en los capilares, mientras que el resto sale de la microcirculación por medio del sistema venoso. Las arterias por sí mismas son sitios de utilización de oxígeno. Por ejemplo, la pared de la arteria requiere energía para efectuar la regulación del flujo de sangre a través de la contracción contra la resistencia vascular. Así, la pared arterial normalmente es un sitio significante para la difusión de oxígeno fuera de la' sangre. Sin embargo, las composiciones de suministro de oxígeno actuales (por ejemplo, HBOCs) pueden liberar demasiado de su contenido de oxígeno en el sistema arterial, y de esta manera inducir una reducción autorreguladora en la perfusión capilar. Por consiguiente, la eficiencia del suministro de oxígeno de un sustituto sanguíneo realmente puede ser impedida al tener demasiado oxígeno o una afinidad al oxígeno muy baja. La proporción de consumo de oxígeno por la pared vascular, es decir, la combinación de oxígeno requerida para el trabajo mecánico y el oxígeno requerido para la biosíntesis química, puede ser determinada al medir el gradiente en la pared del vaso. Ver, por ejemplo, Winslow y colaboradores, en "Advances in Blood Substitutes" (1997), Birkhauser, ed., Boston, MA, páginas 167-188. la presente- tecnología permice mediciones de presión parcial de oxígeno precisas en una variedad de vasos. El gradiente medido es directamente proporcional a la proporción de utilización de oxígeno por el tejido en la región de la medición. Tales mediciones muestran que la pared del vaso tiene una utilización de oxígeno de línea de base que se incrementa con los incrementos en la inflamación y constricción, y es bajada por la relajación. El gradiente de la pared del vaso es inversamente proporcional a la oxigenación del tejido. La vasoconstricción incrementa el gradiente de oxigeno (metabolismo del tejido), mientras que la "asodilatación baja el gradiente. Gradientes más altos son indicativos del hecho de que más oxigeno es utilizado por la pared del vaso, mientras que menos oxigeno está disponible para el tejido. El mismo fenómeno se cree que está presente por toda la microcirculación. La Relación Entre Vasoconstricción y Afinidad al Oxigeno La razón fundamental para el desarrollo de un HBOC con alta afinidad al oxigeno esta basada, en parte, en estudios pasados que usan hemoglobinas libres de células como alternativas a las transfusiones de glóbulos rojos. Algunos de los efectos fisiológicos de estas soluciones permanecen incompletamente entendidos. De estos, quizás el más controversial es la propensión a ocasionar vasoconstricción, que se puede manifestar como hipertensión en animales y hombres (Amberson, W., "Clinical experience with hemoglobin-saline solución", Science 106: 117-117 (1947)) (Keipert, P., A. Gonzales, C. Gómez, V. Macdonald, J. Hess, y R. Winslow, "Acute changes in systemic blood pressure and uriñe output of conscious rats following exchange transfusión with diaspirin-crosslinked hemoglobin solution", Transfusión 33: 701-708, (1993) ) . La hemoglobina humana reticulada entre las cadenas a con bis-dibromosalicil-fumarato (aaHb) se desarrolló por el Ejercito de los Estados Unidos como un sustituto modelo de glóbulos rojos, pero fue abandonado por el Ejercito'- después de la demostración de varios incrementos en la resistencia pulmonar y vascular sistémica (Hess, J., V. acdonald, A. urray, V. Coppes, and C, Gómez, "Pulmonary and systemic hipertensión after hemoglobin administration", Blood 78:356A (1991)). Una versión comercial de este producto también fue abandonada después de un experimento clínico de Fase II decepcionante (Winslow, R. M. " a-Crosslinked hemoglobin: Was failure predicted by preclinical testing?" Vox sang 79: 1-20 (2000) . La explicación más comúnmente avanzada para la vasoconstricción producida por la hemoglobina libre de células es que fácilmente enlaza el factor de relajación derivado del endotelio, óxido nítrico (NO) . De hecho, se han producido hemoglobinas recombinantes con afinidad reducida para NO que se presentan que son menos hipertensivas en experimentos de ratas de carga superior (Doherty, D. H., M. P. Doyle, S. R. Curry, R. J. Vali, T. J. Fattor, J. S. Olson, y D. D. Lemon, "Rate of reaction with nitric oxide determines the hypertensive effect of cell-free hemoglobin", Wature Biotechnology 16: 672-676 ( 1998 )) (Lemon, D. D., D. H. Doherty, S. R. Curry, A. J. Mathews, M. P. Doyle, T. J.

Fattor, y J. S. Olson, "Control of the nitric oxide-scavenging activity of hemoglobin", Art Cells, Blood Subs . , and Immob. Biotech 24:378 (1996)). Sin embargo, los estudios sugieren que el enlace de NO no puede ser la única explicación para la vasoactividad de la hemoglobina. Se ha encontrado que ciertas moléculas de hemoglob." na grandes, tales como aquellas modificadas con polietilenglicol (PEG), fueron virtualmente libres del efecto hipertensivo, aunque sus proporciones de enlace de NO fueron idénticos a aquellos de la OÍCXHB (Rohlfs, R. J. , E. Bruner, A. Chiu, A. Gonzales, M. L. Gonzales, D. Magde, M. D. agde, K. D. Vandegriff, y R. M. Winslow, "Arterial blood pressure responses to cell-free hemoglobin solutions and the reacion with nitric oxide", J. Biol. Chem 273: 12128-12134 (1998)). Además, se encontró que la PEG-hemoglobina fue extraordinariamente efectiva en prevenir las consecuencias de la hemorragia cuando se da como una transfusión de intercambio antes de la hemorragia (Winslow, R. M. , A. Gonzales,, M. Gonzales, M. Magde, M. McCarthy, R. J. Rohlfs, y K. D. Vandegriff, "Vascular resistance and the efficacy of red cell substitutes", J Appl Physiol 85: 993-1003 (1998)). Este efecto protector correlacionado con la falta de hipertensión, sugiere que la vasoconstricción es responsable para el desempeño decepcionante de muchos de los productos basados en hemoglobina estudiados hasta la fecha.

Basado es estas observaciones, se desarrolló una hipótesis para explicar la vasoconstricción, como una alternativa, o posiblemente además, del efecto de enlace de NO. Aunque no se desea que sea enlazada por alguna teoria particular,' se cree que un componente sustancial del efecto vasoactivo de la hemoglobina es una respuesta reflexiva a la difusión de la hemoglobina en el espacio libre de células. Esta hipótesis se probó en un sistema capilar in vitro, y se demostró que la PEG-hemoglobina que tiene una constante de difusión reducida, transfirió O2 de una manera muy similar a aquella de los glóbulos rojos nativos (McCarthy, . R., K. D. Vandegriff, y R. M. Winslow, "The role of facilitated diffusion in oxygen transport by cell-free hemoglobin: Implications for the design hemoglobin-based oxygen carriers", Biophysical Chemistry 92: 103-117 (2001)) . La afinidad al oxigeno seria esperada para desempeñar una función en su difusión facilitada por la hemoglobina en el espacio plasmático, puesto que el cambio en la saturación de la hemoglobina a la pared del vaso es una determinante del gradiente de difusión de la hemoglobina misma. La afinidad al oxigeno de la hemoglobina libre de célula puede desempeñar una función adicional en la regulación del tono vascular, puesto que la liberación de O2 a las paredes del vaso en las arteriolas activaran la vasoconstricción (Lindbom, L., R. Turna, y K. Arfors, "Influence of oxygen on perfusión capillary density and capillary red cell velocity in rabbit skeletal muscle", Microvasc Res 19: 197-208 (1980) . En el pliegue de piel de hámster, el P02 en tales vasos está en la gamma de 20-40 Torr, donde la curva de equilibrio de oxigeno de glóbulo rojo normal está más inclinada ( Intaglietta, M. , P. Johnson, y R. Winslow, "Microvascular and tissue oxygen distribution", Cardiovasc Res 32: 632-643 (1996)). Asi desde un punto de vista teórico, puede ser importante para el P50 de la hemoglobina libre de célula que sea menor que aquel de los glóbulos rojos (es decir, afinidad al 02 más alta) , para prevenir la liberación de 02 en los vasos reguladores arteriolares . Componente de Acarreo de Oxigeno En modalidades preferidas, el portador de oxigeno (es decir el componente de acarreo de oxigeno) es un portador de oxigeno basado en hemoglobina, o HBOC. La hemoglobina puede ser ya sea nativa (no modificada); subsecuentemente modificada por una reacción química tal como la reticulación intra- o inter-molecular , polimerización, o la adición de grupos químicos (por ejemplo, óxidos de polialquileno, u otros aductos); o puede ser recombinantemente diseñada. Los genes de alfa- y beta-globina humanos ambos han sido clonados y secuenciados . Liebhaber y colaboradores, P.N.A.S. 77: 7054-7058 (1980); Marotta y colaboradores, J. Biol . Chem. 353: 5040-5053 (1977) (cDNA de beta-globulina) . Además, muchas hemoglobinas modificadas recombinantemente producidas ahora se han producido usando la mutagénesis dirigida al sitio, aunque estas variedades de hemoglobina "mutante" se reportaron que tienen afinidades al oxigeno indeseablemente altas. Ver, por ejemplo, Nagai y colaboradores, P.N.A.S., 82: 7252-7255 (1985) . La presente invención no está limitada por la fuente de la hemoglobina. Por ejemplo, la hemoglobina puede ser derivada de humanos y animales. Las fuentes preferidas de hemoglobina para ciertas aplicaciones son humanas, vacas y cerdos. Además, la hemoglobina puede ser producida por otros métodos, incluyendo la síntesis química y las técnicas recombinantes . La hemoglobina se puede adicionar a la composición de producto sanguíneo en forma libre, o puede ser encapsulada en una vesícula, tal como una partícula sintética, microglobo o liposoma. Los componentes de acarreo de oxígeno preferidos de la presente invención deben estar libres de estroma y libres de endotoxina. Ejemplos representativos de componentes de acarreo de oxígeno son descritos en un número de patentes norteamericanas expedidas, incluyendo la patente norteamericana No. 4,857,636 de Hsia; la patente norteamericana No. 4,600,531 de Walder, la patente norteamericana No. 4,061,736 de Morris y colaboradores; la patente norteamericana No. 3,925,344 de Mazur; la patente norteamericana No. 4,529,719 de Tye; la patente norteamericana No. 4,473,496 de Scannon; 4,584,130 de Boecio y colaboradores; la patente norteamericana No. 5,250,665 de Kluger y colaboradores; la patente norteamericana No. 5,020,588 de Hoffman y colaboradores; y la patente norteamericana No. 4,826,811 y lv patente norteamericana No. 5,194,590 de Sehgal y colaboradores. Además de las fuentes mencionadas en lo anterior de hemoglobina, recientemente se ha encontrado que la hemoglobina de caballo tiene ciertas ventajas como el componente de acarreo de oxígeno en las composiciones de la presente invención. Una ventaja es que cantidades comerciales de sangre de caballo son fácilmente disponibles, desde las cuales se puede purificar hemoglobina de caballo. Otra ventaja inesperada es que la hemoglobina de caballo muestra propiedades químicas que pueden incrementar su utilidad en los sustitutos sanguíneos de la presente invención. Reportes previos han indicado que la hemoglobina de caballo se auto-oxida a methemoglobina más rápido que la hemoglobina humana, lo cual la haría menos deseable como un componente de sustituto sanguíneo. Ver, por ejemplo, J.G. McLean y I.M. Lewis, Research in Vet. Sci . , 19: 259-262 (1975) . Para minimizar la autooxidación, McLean y Lewis usaron un agente reductor, glutationa, después de la lisis del glóbulo rojo. Sin embargo, la hemoglobina que se utiliza para preparar las composiciones de la presente invención, sin considerar si la fuente de hemoglobina es humana o de caballo, no requiere el uso de agentes reductores para prevenir la autooxidación después de la lisis del' glóbulo rojo. Mas recientemente, se ha reporta-jo que la hemoglobina de caballo tiene una afinidad al oxigeno que es diferente de aquella de la hemoglobina humana. Ver,- por ejemplo, M. Mellegrini y colaboradores, Eur J. Biochem., 268 : 3313-3320 (2001) . Tal diferencia desalentaría la selección de la hemoglobina de caballo para preparar sustitutos sanguíneos que imitan la hemoglobina humana. Sin embargo, cuando se incorpora en las composiciones de la presente invención, no se observa diferencia significante (menor que 10%) en la afinidad al oxígeno entre los conjugados que contienen hemoglobina humana y de caballo. Por consiguiente, contrario a estas propiedades aparentemente indeseables, en las composiciones de la presente invención, la hemoglobina de caballo es equivalente sí no es que superior a la hemoglobina humana. Para uso en la presente invención, el HBOC tiene una afinidad al oxígeno que es más grande que la sangre completa, y de preferencia dos veces aquella de la sangre completa, o alternativamente, más grande que aquella de la hemoglobina libre de estroma (SFH), cuando se mide bajo las mismas condiciones. En muchos casos, esto significa que el HBOC en el sustituto sanguíneo tendrá una P50 menor que 10, y más de preferencia menor que 7. En el estado libre, SFH tiene una P50 de aproximadamente 15 torr, mientras que la P50 para la sangre completa es de aproximadamente 28 torr. Previamente se ha sugerido que el incremento de la afinidad al oxígeno, y de esta manera la disminución de la P50, puede incrementar el suministro de oxígeno a los tejidos, aunque esto implicó que una P50 menor que aquel de la SFH no sería aceptable. Ver inslow y colaboradores, en "Advances in Blood Substitutes"' (1997), Birkhauser, ed., Boston, MA, en la página 167, y la patente norteamericana No. 6,054,427. Esta sugerencia contradice la creencia ampliamente mantenida de que las hemoglobinas modificadas para el uso como sustitutos sanguíneos deben tener menores afinidades al oxígeno, y deben tener P50s que se aproximan a aquellos de la sangre completa. Por consiguiente, muchos investigadores han usado fosfato de piridoxilo para elevar la P50 de la SFH de 10 a aproximadamente 20-22, puesto que la hemoglobina piridoxilada más fácilmente libera oxígeno cuando se compara con la SFH. Existen muchos procedimientos científicos diferentes para fabricar HBOCs con alta afinidad al oxígeno (es decir, aquellos con P50s menores que la SFH) . Por ejemplo, estudios han identificado los residuos de aminoácidos que desempeñan una función en la afinidad al oxigeno, tal como B-93 Cisteina, y asi la mutagénesis dirigida al sitio ahora fácilmente puede ser llevada a cabo para manipular la afinidad al oxigeno al nivel deseado. Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,651,124. Muchos otros procedimientos se discuten en la patente norteamericana No. 6,054,427. Toxicidad Asociada con la Hemoglobina La hemoglobina se conoce gue muestra autooxidación cuando reversiblemente cambia de la forma ferrosa (Fe2+) a la forma férrica (Fe3+) o methemoglobina . Cuando esto sucede, el oxigeno molecular se disocia de la oxihemoglobina en la forma de un anión de superóxido (O2-) . Esto también da por resultado la desestabilización del complejo heme-globina y la desnaturalización eventual de las cadenas de globina. Tanto la formación de radicales de oxigeno y la desnaturalización de la proteina se cree que desempeñan una función de toxicidad in vivo de los HBOCs (Vandegriff, K.D., Blood Substitutes, Physiological Basis of Efficacy, páginas 105-130, Winslow y colaboradores, ed., Birkhauser, Boston, MA (1995) ) . Con la mayoría de HBOCs, hay una relación negativa entre la afinidad del oxígeno y la oxidación de hemoglobina, es decir, entre más alta es la afinidad al oxígeno, menor es la proporción de autooxidación. Sin embargo, los efectos de diferentes modificaciones de hemoglobina sobre la afinidad al oxigeno y la proporción de autooxidación no siempre son predecibles. Además, el balance óptimo entre la afinidad al oxigeno y la proporción de autooxidación no está bien entendido. ' La presente invención se relaciona, en parte, al descubrimiento inesperado de que los conjugados de PEG-Hb descritos en la presente, muestran proporciones muy bajas de autooxidación. Cuando se mide como una proporción de oxidación, este valor debe ser tan bajo como sea posible (es decir, 0.2% por hora de hemoglobina total, más de preferencia 0.1% por hora de hemoglobina total, a temperatura ambiente por al menos 3 horas, y más de preferencia al menos 10 horas. Asi, los HBOCs de la presente invención permanecen estables durante la administración y/o el almacenamiento a temperatura ambiente. Modificaci.ones del Componente de Acarreo de Oxigeno En una modalidad preferida, el componente de acarreo de oxigeno es hemoglobina modificada. Una modificación preferida a la hemoglobina es la "modificación en la superficie", es decir, la unión covalente de grupos químicos a las cadenas laterales de aminoácidos expuestas sobre la molécula de hemoglobina. La modificación se lleva a cabo principalmente para incrementar el tamaño molecular de la hemoglobina, mucho más frecuentemente mediante la unión covalente de porciones poliméricas tales como _ polímeros sintéticos, carbohidratos, proteínas y similares. Generalmente, se prefieren polímeros sintéticos . Los polímeros hidrofílicos sintéticos adecuados incluyen, ínter alia, óxido de polialquileno, tales como óxido de polietileno ( (CH2CH2c; n) , óxido de polipropileno ( (CH (CH3) CH20) n) o un- copolímero de óxido de polietileno/polipropileno ( (CH2CH20) n- (CH (CH3) CH20) n) . Otros polímeros sintéticos de cadena recta, ramificada y opcionalmente sustituidos que serían adecuados en la práctica de la presente invención son bien conocidos en el campo médico . Más comúnmente, el grupo químico unido a la hemoglobina es polietilenglicol (PEG) , debido a su aceptabilidad farmacéutica y disponibilidad comercial. Los PEGs son polímeros de la fórmula química general H (OCH2-CH2) n0H, donde n es generalmente mayor que o igual a 4. Las formulaciones de PEG son usualmente seguidas por un número que corresponde a su peso molecular promedio. Por ejemplo, PEG-200 tiene un peso molecular promedio de 200 y puede tener una gama de 190-210. Los PEGs son comercialmente disponibles en un número de diferentes formas, y en muchos casos llegan preactivados y listos para conjugarse con las proteínas . Un aspecto importante de las modalidades preferidas de la presente invención es que la modificación en la superficie toma lugar cuando la hemoglobina está en el estado oxigenado o "R". Esto es fácilmente llevado a cabo al permitir que la hemoglobina se equilibre con la atmósfera (o, alternativamente, se puede llevar a cabo la oxigenación activa) antes de la conjugación. Al realizar la conjugación a la hemoglobina oxigenada, la afinidad al oxigeno de la hemoglobina resultante es incrementada. Tal etapa generalmente se considera como que está contraindicada, puesto que muchos investigadores describen la desoxigenación antes de la conjugación para disminuir la afinidad al oxigeno. Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5, 234, 903. Aunque en muchos aspectos el desempeño de las hemoglobinas modificadas en la superficie es . independiente del enlace entre la hemoglobina y el modificador (por ejemplo, PEG) , se cree que enlazadores más rígidos tales como sustituyentes enlazadores de- 1 a 6 átomos de carbono alifáticos o aromáticos, insaturados pueden mejorar la fabricación y/o características de los conjugados cuando se comparan con aquellos que tienen modos de unión más flexibles y de esta manera deformables. El número de PEGs a ser adicionados a la molécula de hemoglobina puede variar, dependiendo del tamaño del PEG. Sin embargo, el tamaño molecular de la hemoglobina modificada resultante debe ser suficientemente grande para evitar que sea evacuada por los ríñones para alcanzar el periodo de vida media deseado. Blumenstein y colaboradores, determinaron que este tamaño se alcanza arriba de un peso molecular de 84,000. (Blumenstein y colaboradores, en "Blood Substitutes and Plasma Expanders", Alan R. Liss, editors, New York, New York, páginas 205-212 (1978)). En la misma, los autores conjugaron hemoglobina a dextrano de peso molecular variable. Ellos reportaron que un conjugado de hemoglobina (con un peso molecular de 64,000) y dextrano (que tiene un peso molecular de 20,000) "se evacuó lentamente de la circulación e insignificantemente a través de los ríñones", peor el incremento del peso molecular arriba de 84,000 no alteró las curvas de evacuación. Por consiguiente, como mes determinado por Blumenstein y colaboradores, es preferible que el HBOC tenga un peso molecular de por lo menos 84,000. En una modalidad de la presente invención, el HBOC es un "MalPEG", que se establece para hemoglobina a la cual se ha. conjugado PEG activado con malemidilo. Tal MalPEG puede ser referido adicionalmente por la siguiente fórmula: Hb-(S-Y-R-CH2-CH2-[0-CH2-CH2]n-0-CH3)m Fórmula I donde Hb se refiere a hemoglobina tetramérica, S es un grupo tiol superficial, Y es el enlace covalente de succinimido entre Hb y Mal-PEG, R es grupo alquilo, amida, carbamato o fenilo (dependiendo de la fuente de materia prima y el método de síntesis química), [0-CH2-CH2]n son, la unidades de oxietileno que constituyen la cadena principal del polímero de PEG, donde n define la longitud del polímero (por ejemplo, MW = 5000), y O-CH3 es el grupo metoxi terminal. Componente Cristaloide En una modalidad de la presente invención, el sustituto sanguíneo también puede comprender un cristaloide. El componente cristaloide puede ser cualquier cristaloide que, en la forma de la composición de sustituto sanguíneo, es de preferencia capaz de alcanzar una osmolaridad mayor que 800 mOsm/1, es decir, hace al sustituto sanguíneo "hipertónico". Ejemplos de cristaloides adecuados y sus concentraciones en el sustituto sanguíneo incluyen, por ejemplo, NaCl al 3%, NaCl al 7%, NaCl al 7.5% y NaCl al 7.5% en dextrano al 61. Más de preferencia el sustituto sanguíneo tiene una osmolaridad de entre 800 y 2400 mOsm/1. El uso de hemoglobina recombinantemente puede producidas en soluciones con una osmolaridad entre 300 - 800 mOsm/1 que además comprenden un coloide (es decir, una molécula menos difusible que la dextrosa) se ha reportado previamente. Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,661,124. Sin embargo, esta patente enseña constantemente la producción de sustitutos sanguíneos con osmolaridades arriba de 800, y sugiere que la concentración de hemoglobina debe estar entre 6-12 g/dl. En contraste, la eficiencia de acarreo de oxígeno de las composiciones de la presente invención permiten que sean utilizadas concentraciones menores de hemoglobina, tal como más grandes que 6 g/dl o aún más grandes que 4 g/dl. T Cuando el sustituto sanguíneo ademá?: comprende un cristaloide y es hipertónico, las composiciones de la presente invención pueden proporcionar funcionalidad mejorada ¦ para la recuperación rápida de los parámetros hemodinámicos sobre otras composiciones de sustituto sanguíneo, que incluyen un componente coloide. La infusión cristaloide altamente hipertónica de pequeño volumen (por ejemplo, 1-10 ml/kg) proporciona beneficios significantes en la recuperación rápida y sostenida de los parámetros hemodinámicos aceptables en la hemorragia controlada. (Ver, por ejemplo, Przybelski, R. J., E. K. Daily y M. L. Birnbaum, "The pressor effect of hemoglobin — good or bad?" In inslow, R. M . , K. D. Vandegriff y M. Intaglietta, eds. Advances in Blood Substitutes. Industrial Opportunities and Medical Challenges. Boston, Birkhauser (1997), 71-85). Las soluciones cristaloides hipertónicas solas, sin embargo, no restauran adecuadamente el transporte de oxígeno cerebral. Ver D. Prough y colaboradores, "Effects of hypertonic saline versus Ringer's solution on cerebral oxygen transport during resuscitation from hemorrhagic shock", J. Neurosurg. 64: 627-32 (1986). Formulación Los sustitutos sanguíneos de la presente invención se formulan al mezclar el portador de oxígeno y otros excipientes opcionales con un diluyente adecuado. Aunque la concentración del portador de oxígeno en el diluyente puede variar de acuerdo con la aplicación, y en particular basado en la dilución de post-ad.ninistración esperada, en modalidades preferidas, debido a las otras características de las composiciones de la presente invención que proporcionan efectos de suministro de oxigeno y terapéuticos mejorados, usualmente es innecesario que la concentración este por arriba de 6 g/dl, y más de preferencia está entre 0.1 y 4 g/dl. Los diluyentes adecuados (es decir, uno que es farmacéuticamente aceptable para inyección intravenosa) incluye, intra alia, proteínas, glicoproteínas, polisacáridos y otros coloides. No se propone que estas modalidades sean limitadas a algún diluyente particular. Así, se propone que el diluyente comprende soluciones de albúmina libres de células, acuosa, otros coloides, u otros componentes que no acarrean oxígeno, y la solución acuosa tiene una viscosidad de por lo menos 2.5 cP. En algunas modalidades preferidas, la viscosidad de la solución acuosa está entre 2.5 y 4 cP. Se contempla que la presente invención también comprende soluciones con una viscosidad de 6 cP o más grande. Aplicaciones A. Aplicaciones Clínicas Se contempla que la presente invención y sus modalidades serán útiles en aplicaciones donde es clínicamente indicado una restauración rápida de los niveles de O2 o un nivel de 02 incrementado o un reemplazo de los niveles de 02. Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,054,427. Las numerosas aplicaciones en las cuales los métodos y composiciones de la presente invención encuentran uso incluyen lo siguiente: Trauma. Una pérdida aguda de sangre completa puede dar por resultado un desplazamiento de fluido de los espacios intersticiales y intracelulares para reemplazar el volumen perdido de sangre mientras que se desvía de la sangre lejos de los órganos de baja prioridad incluyendo la piel y el intestino. La desviación de la sangre lejos de los órganos reduce y algunas veces elimina los niveles de O2 en estos órganos y da por resultado la muerte del tejido progresivo. La restauración rápida de los niveles de 02 se contempla en cuanto a que da por resultado un salvamento significativamente mejor de los tejidos en pacientes que sufren de tal pérdida de sangre aguda. Isquemia. En la isquemia, un órgano particular (u órganos) son "subalimentados" de oxígeno. Secciones pequeñas del órgano, conocidas como infartos, comienzan a morir como un resultado de la falta de 02. La restauración rápida de los niveles de O2 es critica para determinar la formación de infarto en tejidos críticos. Las condiciones que dan por resultado la isquemia incluyen el ataque cardiaco, ataque apopj-éjico, o trauma cerebrovascular . Hemodilución: En esta aplicación clínica, un sustituto sanguíneo se requiere para reemplazar la sangre que es removida pre-operativamente . Se contempla que la remoción de sangre del paciente ocurre para prevenir un requerimiento por transfusiones alogeneicas post-operativamente . En esta aplicación, el sustituto de sangre se administra para reemplazar (o sustituir) los niveles de O2 de la sangre autóloga removida. Esto permite el uso de la sangre autóloga removida para transfusiones necesarias durante y después de la cirugía. Una cirugía de tal clase que requiere remoción de sangre pre-operativa sería un procedimiento de desviación (bypass) cardiopulmonar . Choque Séptico. En la sepsis agobiante, algunos pacientes pueden llegar a ser hipertensivos a pesar de la terapia de fluido masiva y el tratamiento con agentes vasoconstrictores. En este caso, la sobreproducción de óxido nítrico (NO) da por resultado la presión sanguínea disminuida. Por lo tanto la hemoglobina se acerca a un agente ideal para el tratamiento de estos pacientes debido a que la hemoglobina enlaza NO con una avidez que iguala al 02. Cáncer. El suministro de 02 al núcleo interno hipóxico de una masa tumoral incrementa su sensibilidad a la radioterapia y la quimioterapia. Debido a que la microvasculatura de uri tumor es distinta que de otros tejidos, la sensibilización a través de los niveles de 02 incrementados, requiere que 02 sea descargado dentro del núcleo hipóxico. En otras palabras, la P50 debe ser muy, -baja para prevenir la .descarga temprana del 02, incrementando los niveles de 02, para asegurar la sensibilización óptima del tumor a los tratamientos de radiación y quimioterapia subsecuentes . Anemia Crónica. En estos pacientes, el reemplazo de la hemoglobina perdida o metabolizada es comprometido o completamente ausente. Se contempla que el sustituto sanguíneo debe reemplazar o incrementar más efectivamente los niveles de 02 reducidos en el paciente. Anemia Drepanocítica . En la anemia drepanocítica, el paciente es debilitado por una pérdida de los niveles de 02 que ocurre durante el proceso enfermizo así como una proporción de cambio de glóbulos rojos muy alta. El proceso enfermizo es una función del P0_ donde entre menor es el P0;, más grande es la proporción enfermiza. Se contempla que el sustituto sanguíneo ideal restauraría los niveles de 0: del paciente dentro de una gamma normal durante una crisis enfermi za . Cardioplegia . En ciertos procedimientos quirúrgicos cardiacos, el corazón es detenido mediante soluciones electrociticas apropiadas y la reducción de la temperatura del paciente. La reducción de la temperatura significativamente reducirá la P50, posiblemente previniendo la descarga de 02 bajo cualquiera de las condiciones fisiológicas ordinarias. El reemplazo de los niveles de 02 se contempla como el daño del tejido potencialmente reductor y la muerte durante tales procedimientos. Hipoxia. Soldados, habitantes de montaña y atletas mundialistas bajo condiciones extremas pueden sufrir de niveles de 02 reducidos debido a que la extracción de 02 del aire en el pulmón es limitada. La extracción de 02 limitada además limita el transporte de 02. Se contempla que un sustituto sanguíneo podría reemplazar o incrementar los niveles de 02 en tales individuos. Perfusión de Órgano. Durante el tiempo en que un órgano es mantenido ex vivo, el mantenimiento de contenido de 02 es esencial para preservar la integridad estructural y celular y minimizar la formación de infarto. Se contempla que un sustituto de sangre sostendría los requerimientos de 02 para tal órgano. Cultivo de Células. Este requerimiento es virtualmente idéntico a aquel de la perfusión de órgano, excepto que la proporción de consumo de 02 puede seí más alta.

Hematopoyesis. Se contempla que el sustituto sanguíneo sirve una fuente para heme y hierro para uso en la síntesis de nueva hemoglobina durante la hematopoyesis. B. Aplicaciones Veterinarias La presente invención también se utiliza en seres no humanos. Los métodos y composiciones de la presente invención se pueden utilizar con animales domésticos tales como ganado y animales de compañía (por ejemplo, perros gastos, caballos, pájaros, reptiles) , así como otros animales en acuarios, zoológicos, acuarios de agua salada y otras instalaciones que alojan animales. Se contempla que la presente invención encuentra utilidad en el tratamiento de emergencia de animales domésticos y silvestres que sufren de una pérdida de sangre debido a lesión, anemias hemolíticas, etc. Por ejemplo, se contempla que las modalidades de la presente invención son útiles en condiciones tal como la anemia infecciosa equina, anemia infecciosa felina, anemia hemolítica debido a sustancias químicas y otros agentes físicos, infección bacteriana, fragmentación del factor IV, hipersplenación y esplenomegalia , síndrome hemorrágico en aves de corral, anemia hipoplástica, anemia aplástica, condiciones hemolíticas inmunes idiopáticas, deficiencia de hierro, anemia hemolítica isoinmune, síndrome hemolítico microangiopático, parasitismo, etc. En particular, la presente invención encuentra usos en áreas donde son difíciles de encontrar donadores de sangre para animales de especies raras y/o exóticas. EJEMPLOS Ejemplo 1 Producción de Hemoglobina Libre de Estroma Etapa 1 - Adquisición de glóbulos rojos de fecha anterior Glóbulos rojos empacados de fecha anterior se adquieren de una fuente comercial, tal como el San Diego Blood Bank o de American Red Cross. De preferencia, el material de fecha anterior se recibe no más de 45 días desde el tiempo de colección. RBCs empacados (pRBCs) se almacenan a 4 + 2°C hasta que se procesan adicionalmente (1 - 7 días) . Todas las unidades se clasifican para la infección viral y se someten a la prueba de ácido nucleico antes del uso. Etapa 2 - Acumulación de sangre de fecha anterior Glóbulos rojos empacados son acumulados en un recipiente estéril en un equipo limpio. El volumen de glóbulos rojos empacados se anota y la concentración de hemoglobina se determina usando un co-oxímetro comercialmente disponible u toro método reconocido en la técnica. Etapa 3 - Leucodisminución La leucodisminución (es decir, remoción de glóbulos blancos) se lleva a cabo usando la filtración en membrana. Los conteos de leucocitos inicial y final se hacen para inspeccionar la eficiencia de este proceso.

Etapas 4 - Separación de células y lavado de células Glóbulos rojos de la sangre se lavan con 6 volúmenes de cloruro de sodio al 0.9%. El proceso se lleva a cabo a 4 + 2°C. El lavado de células se analiza para verificar la remoción de componentes plasmáticos mediante un ensayo espectrofotométrico par¿ albúmina. Etapa 5 - Lisis de glóbulos rojos y remoción de restos celulares Glóbulos rojos lavados se lisan por lo menos 4 horas o durante la noche a 4 + 2°C con agitación usando 6 volúmenes de agua. El lisado se procesa en el frío para purificar la hemoglobina. Esto se logra al procesar el lisado a través de una membrana de 0.16 µp?. La hemoglobina purificada se colecta en un recipiente despirogenado estéril. Todas las etapas en este proceso se llevan a cabo, a 4 + 2°C. Etapa 6 - Remoción viral La remoción viral se realiza mediante ultrafiltración a 4 + 2°C. Etapa 1 - Concentración e intercambio de solvente La hemoglobina purificada del lisado y la ultrafiltración se intercambia en lactato de Ringer (RL) o solución salina regulada con fosfato (PBS, pH 7.4) utilizando una membrana de 10-kD. La hemoglobina luego se concentra utilizando la misma membrana a una concentración de 1.1-1.5 mM (en el tetrámero) . Diez a 12 volúmenes de RL o PBS se utilizan para el intercambio de solvente. Este proceso se lleva a cabo a 4 + 2°C. El pH de la solución preparada en RL se ajusta a 7.0-7.6. Etapa 8 - Filtración estéril La hemoglobina en PBS o lactato de Ringer (RL) se filtra estérilmente a través de una cá sula" de filtro desechable de 0.45- o 0.2-µp? y se almacena a 4 + 2°C antes de que se realice la reacción de modificación química. Otros métodos para purificar hemoglobina- son bien conocidos en la técnica. Además, el uso de un agente reductor (por ejemplo, glutationa u otro agente reductor que contiene tiol) para prevenir la autooxidación después de la lisis de las células es usualmente innecesario. Ejemplo 2 Modificación de la Hemoglobina Libre de Estroma Etapa 1 - Tiolación La tiolación se lleva a cabo usando un exceso molar de 10 veces de iminotiolano sobre hemoglobina durante 4 horas a 4 + 2°C con agitación continua. Condiciones de la reacción: • Hemoglobina 1 mM (tetrámero) en RL (pH 7.0 - 7.5) o PBS (pH 7.4) • Iminotiolano 10 mM en RL (pH 7.0 - 7.5) o PBS (pH 7.4) . La relación de SFH: iminotiolano 1:10 y el tiempo de reacción se optimizaron para maximizar el número de grupos tiol PEGilados y para minimizar la heterogeneidad del producto . Etapa 2 - PEGilación de la hemoglobina tipiada La hemoglobina tiolada es PEGilada usando un exceso molar de 20 veces de Mal-PEG (con un enlazador de alquilo o fenilo) basado en la concentración de partida de hemogj obina tetramérica. La hemoglobina primero se deja equilibrar con la atmósfera para oxigenar la hemoglobina. La reacción toma lugar durante 2 horas a 4 + 2°C con agitación continua. Condiciones de reacción: • Hemoglobina tiolada 1 m en RL o PBS (pH 7.4) • Mal-PEG 20 mM en RL o PBs (pH 7.4) Etapa 3 - Remoción de reactivos sin reaccionar Hb PEGilada es procesada a través de una membrana de 70-kD para retirar los reactivos sin reaccionar en exceso o la hemoglobina. Una filtración de 20 volúmenes se lleva a cabo para asegurar la remoción de los reactivos sin reaccionar, la cual es inspeccionada mediante la cromatografía de exclusión de tamaño a 540 nm y 280 nm. La concentración de proteína se diluye a 4 g/dl. El pH se ajusta a 7.3 + 0.3 usando NaOH 1N. Etapa 3 - Filtración estéril El producto MalPEG-Hb final se filtra estérilmente usando una cápsula desechable estéril de 0.2-µ?? y se colecta en un recipiente despirogenado estéril a 4 + 2°C. Etapa 4 - Formulación de MalPEG-Hb Hb PEGilada se diluye a 4 g/dl de RL, el pH se ajusta a 7.4 + 0.2. Etapa 5 - Llenado estéril La composición de sustituto sanguíneo final se filtra estérilmente (0.2 µ?t?) y se toman alícuotas en peso en frasquitos de vidrio estéril y se cierran con tapones de caucho estériles con sellos estrechados en una campana de flujo laminar y se almacenas a -80°C hasta el uso. Ejemplo 3 Análisis Fisicoquímico de la MalPEG-Hb Metodología para el análisis fisicoquímico La homogeneidad y el tamaño molecular del sustituto sanguíneo de malPEG-Hb se caracterizan por la Cromatografía Líquida (LC) . La LC analítica se utiliza para evaluar la homogeneidad de la hemoglobina PEGilada y el grado de remoción de Mal-PEG. La absorbencia a 540 nm se utiliza para evaluar la hemoglobina y resuelve la hemoglobina PEGilada de la hemoglobina sin reaccionar mediante la posición pico. La absorbencia a 280 nm se usa para resolver la hemoglobina PEGilada del Mal-PEG libre, que absorbe en el espectro ultravioleta (UV) debido a las estructuras de anillo en el MalPEG. Espectros ópticos se colectan usando un espectrofotómetro de arreglo de diodo de exploración rápida (Milton Roy 2000 o Hewlett Packard Modelo 8453) en el Soret y las regiones visibles para el análisis de concentración de hemoglobina y el por ciento de methemoglobina mediante el análisis multicomponente (Vandegriff, K.D. y R.E., Shrager. Evaluation of oxigen equilibrium binding to hemoglobin by rapid-scanning spectrophotometry and singular valué decomposition. Meth. Enzymol. 232: 460-485 (1994). La concentración de MalPEG-Hb y el porcentaje de hemoglobina se determinaron usando un co-oxímetro. La viscosidad se determina utilizando un Reómetro. La Presión Osmótica Coloide se determina usando un osmómetro coloide. Los parámetros de enlace de oxígeno se determinan de las curvas de equilibrio de oxígeno. Las especificaciones preferidas para la composición de sustituto sanguíneo se presentan en la Tabla 1: Tabla 1 Prueba Especificación Concentración de hemoglobina (g/1) 4.2 + 0.2 Methemoglobina (%) < 10 pH 7.4 + 0.4 Conductividad (mS/cm) 12 + 4 Endotoxina (EU/mL) < 0.5 Tiempo de retención FPLC (min) 43 + 3 Ancho pico de FPLC a media altura (min) 6 + 2 Viscosidad (cPs) 2.5 + 1.0 COP (mmHg) 50 + 20 P50 (Torr) 6 + 2 Número de Hill (a P50) 1,2 + .5 Esterilidad Aprobatoria Números de sitios PEGilados sobre alPEG-Hb Para la modificación de la superficie, el número "m" en la Fórmula I es el parámetro que define el número de polímeros PEG unidos a la superficie de la hemoglobina. Hb- (S-Y-R-CH2-CH2-[0-CH2-CH2]n-0-CH3)ra Fórmula I Para determinar este número, un ensayo colorimétrico de ditiopiridina (Ampulski, R. V. Ayers, y S. Morell. Determination of the reactive sulfhydryl groups in heme proteins with 4, 4' -dipyridinesdisulde . Biocheim. Biophys. Acta 163-169, 1969) se utiliza para medir el número de grupos tiol disponibles sobre la superficie del tetrámero de Hb antes y después de la tiolación y luego nuevamente después de la PEGilación de Hb. La hemoglobina humana contiene 2 grupos tiol reactivos intrínsicos en los residuos 93Cys, que se confirma mediante la reacción de ditiopiridina. Después de la tiolación de SFH una relación de SFH: iminotiolano 1:10, el número de grupos tiol reactivos se incrementa de 2 a 6 tioles basados en la reacción de ditiopiridina. Después de la reacción de PEGilación, el número de grupos tiol reactivos se disminuye a 1.3. Esto indica que existen 4-5 sitios PEGilados sobre MalPEG-Hb. Análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de MalPEG-Hb contra SFH FPL se realiza para el análisis del producto MalPEG-Hb final. Los cromatogramas típicos se muestran en la Figura 1 para MalPEG-Hb comparado con la SFH sin modificar. El tiempo de retención para SFH es de aproximadamente 57 min. El tiempo de retención para MalPEG-Hb es aproximadamente 44 min. Características físicas y químicas de MalPEGH-Hb Las propiedades físicas de MalPEG-Hb comparadas con la sangre y la hemoglobina humana sin modificar (SFH) se muestran enseguida en la Tabla 2. Tabla 2 Sangre SFH MalPEG-Hb P50 (Torr) 28 15 5 N50 (número de Hill) 2.9 2.9 1.2 Efecto Bohr (ALog — -0.46 -0.20 ?50/???) Viscosidad (cPs)1 4.0 0.9 2.5 COP (mm Hg)1 27 16 50 MW (kD)2 N/A 65 90 Radio Molecular (nM) 4000 3.22 9 determinado a 15 g/dl para sangre completa y aproximadamente 4 g/dl para soluciones de hemoglobina. 2Determinado para mediciones de COP y FPLC _ Afinidad al Oxígeno Las curvas de enlace de equilibrio de hemoglobina-oxígeno se midieron como es descrito previamente (Van'degriff, K. D., R. K. Rohlfs, M. D. Magde y R M. Winslow. Hemoglobinoxygen equilibrium curves measured during enzymatir oxygen consumption. Anal. Bioche . 256: 107-116, 1998). MalPEG-Hb muestra una alta afinidad al oxígeno (P50 = 5 mm Hg) y baja cooperatividad (n50 = 1.0 - 1.4). La Figura 2 muestra curvas representativas que comparan la hemoglobina libre de estroma (SFH) y soluciones de MalPEG-Hb. Viscosidad La propiedad de solución de la MalPEG-Hb es debido a la fuerte interacción entre las cadenas de polietilenglicol y las moléculas de agua de solvente. Esto se cree que es un atributo importante para un sustituto sanguíneo por dos razones: 1) viscosidad más alta disminuye la constante de difusión de tanto la molécula de PEG-Hb y las moléculas de ligando gaseosas que se difunden a través del solvente, y 2) la viscosidad más alta incrementa el esfuerzo cortante de la solución que fluye contra la pared endotelial, induciéndola liberación de vasodilatadores para contrarrestar la vasoconstricción. Como es mostrado en la Tabla 2, la viscosidad de la solución MalPEGH-Hb es de 2.5 cPs. Presión Osmótica Coloidal (COP) La COP de soluciones de hemoglobina que contienen hemoglobina no modificada, intra- e intermolecularmente reticulada, o conjugada en la superficie con PEG se ha medido para determinar sus propiedades de solución macromoleculares (Vandegriff, K. D., R. J. Rohlfs, y R. M. Wislow. Colloid osmotic effects of hemoglobin-based oxygen carriers . In Winslow, R. ., K.D. Vandegriff y M. Intaglia, eds, Advances in Blood Substitutes Industrial Opportunities and Medical Challenges. Boston, Birkhauser, pp. 207-232 (1997). Las hemoglobinas tetraméricas muestran comportamiento de solución casi ideal; mientras que las hemoglobinas conjugadas con PEG tienen actividad osmótica coloidal significativamente más alta y muestran no idealidad de la solución (Vandegriff, K. D., M. Mcarthy, R. J. Rohls y R.M. Winslow. Colloid osmotic properties of modified hemoglobins: chemically cross-linked versus polyetilene glycol surface-conjugated. Biophys. Chem. 69: 23-30 (1997). Como se muestra en la Tabla 2, la COP de la solución MalPEG-Hb es 50. Estabilidad La estabilidad de las soluciones de hemoglobina que contienen hemoglobina conjugada en la superficie con PEG se ha determinado al examinar la proporción de autooxidación. A temperatura ambiente, la autooxidación de MalPEG-Hb se incrementó de aproximadamente 5% de MetHb a 5.5% de MetHb en 10 horas como se muestra en la Figura 5. La proporción de autooxidación para MalPEG-Hb fue de 0.05% por hora. Ejemplo 4 Comparación de Hemoglobinas Modificadas con Diferentes P50s La función de la afinidad de oxigeno en la eficacia de la hemoglobina libre de célula usando hemoglobina modificada mediante la conjugación a polioxietileno (POE) es de interés particular en el estudio de la eficacia de tales materiales como substitutos sanguíneos. Esta modificación, primero descrita por Iwashita y colaboradores (Ajisaka, K. y Y. Iwashita, "Modification of human hemoglobin with poliethylene glicol: A new candidate for blood substitute. BBRC 97: 1076-1081 (1980)) (Iwasaki, K., K. Ajisaka y Y. Iwashita, "Modification of human hemoglobin with polyoxietylene glycol: A new candidate for blood substitutes", Biochem Biophys Res Comm 97: 1076-1981 (1980)), retiene un efecto hipertensivo, y se ha encontrado que es útil en el tratamiento del choque séptico. Como parte de la preparación de este producto, la hemoglobina se hizo reaccionar con piridoxal-5-fosfato (PLP) para elevar su P50, cercano al valor para la sangre humana. Así, fue posible preparar dos soluciones de hemoglobina modificada con POE, una con y una sin modificación previa con PLP. Estas soluciones son idénticas en todo respecto excepto para su P50, y se probaron para su habilidad para soportar la función fisiológica en ratas durante una hemorragia severa (60% de volumen de sangre) . Materiales y Métodos : Sustitutos Sanguíneos Las soluciones de hemoglobina modificadas; con o sin modificación de PLP para formar "PHP" se prepararon como es descrito en lo anterior en el Ejemplo 1. Animales Ratas macho Sprague-Da ley .se usaron para este estudio. Las presiones sistólica y diastólica se inspecciona durante el estudio; las fracciones máxima y mínima, respectivamente, y la presión media arterial (MAP) fue la presión diastólica + 1/3 (sistólica-diastólica) . El dP/dt se calculó de la pendiente positiva máxima para cada ciclo de presión. Valores promedio de frecuencia cardiaca, presiones sistólica, diastólica, media arterial, presión del pulso y dP/dt se promediaron para cada minuto de datos. Mediciones de gases sanguíneos, hematologicas y de lactato El pH arterial, PC02 y P02 se midieron en un analizador de gases sanguíneos usando 100 µ? de muestras heparinizadas de sangre. El ácido láctico se midió en la sangre de la arteria usando un analizador de Lactato. El C02 total, el bicarbonato estándar (HC03~) , y el exceso de base (BE) se calcularon de PC02, pH y la concentración de hemoglobina usando algoritmos previamente descritos (Winslo , R. , "A model for" res cell 02uptake", Int J Clin Monit Comput 2: 81-93 (1985)). La hemoglobina total y la hemoglobina plasmática cada una se midieron usando equipo comercialmente disponible. El hematocrito se midió usando muestras de aproximadamente 50 µ? · de sangre arterial mediante microcentrifugación . Transfusión de Intercambio La transfusión de intercambio se llevó a cabo a una proporción de aproximadamente 0.5 ml/min a un volumen total de solución que igualó 50% del volumen de sangre estimado. El volumen de sangre se asumió que es de 65 ml/kg. La bomba peristáltica se hizo funcionar de modo que la sangre se retiró a exactamente la misma proporción como se infusionó el material de prueba. Las soluciones de prueba se calentaron a 37 °C en un baño de agua antes de la infusión y se mantuvieron calientes durante la infusión. Hemorragia El protocolo de hemorragia que los inventores utilizaron está basado sobre el modelo de Hannon y Wade (Hannon, J., C. Wade, C. Bossone, M. Hunt, R. Coppes y J. Loveday, "Blood gas and acid-base status of conscious pigs subjected to fixed-volume hemorrhage and resuscitated with hypertonic salí dextran", Circ Shock 32: 19-29 (1990)). La hemorragia se comenzó aproximadamente 3 minutos después de la terminación de la transfusión de intercambio al bombear hacia fuera sangre arterial de la arteria femoral a una proporción de 0.5 ml/min para retirar 60% del volumen de sangre hasta el término de 60 minutos. Muestras de sangre (0.3 mi) se tomaron cada 10 minutos para el análisis hematológico y de gas sanguíneo. Análisis estadístico y de supervivencia Para los análisis de supervivencia, los animales se observaron por un mínimo de 120 minutos después del inicio del inicio de la hemorragia. Los datos se agruparon en intervalos de 10 minutos, y para cada intervalo la proporción acumulativa viva y su error estándar se calcularon. Resultados : Propiedades de la Solución Las soluciones usadas se describen enseguida en la Tabla 3. la concentración de hemoglobina total, viscosidad y la presión osmótica coloidal (COP) son bien igualadas. El P50 de la PHP (19.7 Torr) fue más alta que aquella del POE (12.2 Torr). Los grados de cooperatividad (parámetro de Hill, n) fueron equivalentes de las dos soluciones. Los patrones FPLC para las dos soluciones se dan en la Figura 3. Mientras que hay un pico pequeño en cada uno que corresponde a la hemoglobina no modificada, el volumen de la hemoglobina aparece en un conjunto de picos heterogéneos que eluye significativamente más antes que la hemoglobina sin modificar (SFH) . Los patrones para las dos hemoglobinas modificadas con PEG son cualitativamente similares.

Tabla 3 Tabla 1. Propiedades de las soluciones de prueba PHP POE Hb, g/dl 8.0 8.3' Viscosidad (cP) 2.8 2.8 COP, mm Hg 62.7 56.5 *3?{? 10"1) 1.368 2.228 *a2(x 10"3) 9.680 21.070 *a3 (x 10-5) 0.752 46.500 *a4 (x 10"5) 1.537 8.766 P50 19.7 12.2 n50 1.48 1.49 * Afinidad al Oxigeno Medida a 37°C, pH 7. La afinidad al oxigeno del POE fue significativamente más alta que aquella de la PHP (Figura 4). Ningún producto, sin embargo, muestra cooperatividad significante. Experimentos en Animales Todos los experimentos se resumen en la Tabla A . Un número más grande de animales recibieron PHP (18) que POE (11), y el peso promedio de los animales PHP fue significativamente más grande que aquel del grupo POE (P<0.001). Sin embargo, esta diferencia en peso se tomo en cuenta para calcular el grado de hemorragia, asumiendo un volumen de sangre total de 65 ml/kg. Por lo tanto, los volúmenes consecuentes de transfusión de intercambio y hemorragia fueron diferentes también. No obstante, el tiempo medio para la muerte fue significativamente más corto para los animales PHP (93 minutos) comparado con los animales POE (116 minutos) . Esta diferencia fue estadísticamente significante (P<0.02). Sí los animales sobrevivieron al período de observación, 120 minutos después del inicio de la hemorragia, ellos se consideraron "clasificados" para el propósito del análisis de supervivencia de Kaplan-Meier (Figura 5) . Tabla 4 *Volumen Volumen Volumen Tiempo de de de para la WT Sangre Hemorragia Hemorragia muerte (g) (mi) (mi) (%) (minutos) PHP n 18 18 18 18 18 PHP 291 18.89 11.10 58.79 93 sd 24 1.59 0.90 0.35 29 POE - n 11 11 11 11 11 POE 334 21.74 12.78 58.77 116 sd 41 2.65 1.60 0.39 12 P 0.001 0.001 0.001 0.915 0.020 *Basado en 65 ml/kg de volumen de sangre total Hematología y regulación de ácido-base Las mediciones de linea de base, de post-ET y post-hemorragia (60 minutos) se muestran en la Tabla 5. El hematocrito medio fue ligeramente más alto en los animales POE comparado con los animales PHP, pero después de la transfusión de intercambio los valores fueron idénticos en los dos grupos. Al final del periodo de hemorragia, el hematocrito medio en los animales POE fue nuevamente ligeramente más alto que los animales PHP. Diferencias menores similares se encuentran en los valores de hemoglobina total, con los animales POE que son ligeramente más altos en todos los puntos de muestreo. La hemoglobina plasmática no fue diferente en los dos grupos, pero fue significativamente más alta en los animales POE después del periodo de intercambio . La concentración de ácido láctico arterial fue significativamente más alto en los animales POE comparado con los animales PHP en todas las etapas del estudio. Los valores en exceso de base no fueron significativamente diferentes entre los dos grupos, aunque hay una sugerencia de que los valores son menores en el grupo PHP comparado con el grupo POE. Además, la diferencia entre los valores de linea de base para los animales PHP (10.24 mEg/1) es más alta que para los animales POE (7.01 mEg/1) . Tabla 5 n PHP sem n POE sem P HCT Linea de base 17 39 .80 0. 57 10 "43 .15 0. 23 0. 0032 Post ET 17 17 .89 0. 43 10 19 .25 0. 62 0. 3568 60 minutos 15 13 .29 0. 47 10 15 .85 0. '14 0. 0015 HB Linea de base 17 13 .59 0. 22 10 15 .08 0. 17 0. 0057 Post ET 17 8-•70 0. 1S 10 9. 74 0. 07 0. 0007 60 minutos 15 6. 34 0. 21 10 7. 38 0. 06 0. 0016 PLHB Linea de base 16 0. 00 0. 00 10 0. 00 0. 00 Post ET 16 2. 86 0. 07 10 2. 99 0. 09 60 minutos 15 1. 93 0. 07 10 2. 47 0. 02 0. 0001 LACT Linea de base 9 0. 70 0. 06 7 2. 68 0. 16 0. 0001 Post ET 9 1. 59 0. 10 7 4. 21 0. 24 0. 0004 60 minutos 9 10 .62 0. 89 7 17 .27 1. 18 0. 0360 BE Linea de base 17 6. 22 1. 28 9 5. 41 0. 08 0. 6530 Post ET 17 6. 20 1. 41 5 5. 60 0. 13 0. 8101 60 minutos 15 -4 .02 1. 60 6 -1 .60 0. 53 0. 4678 Presión media arterial durante la transfusión de intercambio La presión media arterial durante la transfusión de intercambio se muestra en la Figura 6. las presiones medias arteriales de linea de base son indistinguibles para los dos grupos. Sin embargo, la respuesta de la presión sanguínea a la infusión de las PEG-hemoglobinas es significativamente diferente entre los dos grupos. La elevación inicial en MAP es más grande en los animales PHP comparado con los animales POE, y es sostenida para la duración del período de infusión. En contraste, el MAP en los animales POE regresa a la línea de base al final de la infusión. En el inicio de la hemorragia, la caída en la MAP es inmediata en los animales PHP y retardada en el grupo POE. Además, la MAP es sostenida en o casi los valores de línea de base para la hemorragia completa y más allá para los animales POE, mientras que la MAP nunca regresa a los valores de línea de base en los animales PHP. Especialmente en los animales, la dispersión en los datos, como es indicado por los errores estándar incrementados, se incrementa con el tiempo con forme los animales caen fuera del grupo PHP. Discusión : En este estudio, los inventores estudiaron 2 soluciones de hemoglobina modificadas estrechamente igualadas ("sustitutos sanguíneos") con respecto a su habilidad para proteger ratas de una hemorragia severa (60% de volumen de sangre) . Para probar esta habilidad, los animales primero recibieron una transfusión de intercambio de 50% (de volumen de sangre) con una de las dos soluciones de prueba. Las soluciones por sí mismas difirieron solamente en su afinidad al oxigeno, y fueron igualadas muy cercanamente en el patrón FPLC, la presión oncótica, la viscosidad y la concentración. Otros estudios que intentan mostrar los efectos de las variables especificas sobre los resultados fisiológicos no han sido capaces de comparar las soluciones también igualadas. Ver, por ejemplo, Sakai, H., Hará, H., Tsai, A, G . , Tsuchida, E., Johnson, P. C. y Intaglietta, M., "Changes in resistance vessels during hemorrhagic shock " and resuscitation in conscious hámster model", Am J. Physiol 276(45), H563-H571. (1999), Sakai, H . , H. Hará, M. Yuasa, A. Tsai, ?. Takeoka, E. Tsuchida y M. Intaglietta, "Molecular dimensions of Hb-based 02 carriers determine constriction of resistance arteries and hypertension", Am J Physiol 279: H908-H915, (2000) . Estos experimentos representan el primer caso en el cual la soluciones estrechamente igualadas podrían ser comparadas con solamente una variable, P50, que es significativamente diferente. El grupo de animales que recibieron POE tuvieron ligeramente, pero significativamente, hematocrito más altos, niveles totales de hemoglobina y hemoglobina plasmática. Sin embargo, es muy improbable que estas diferencias puedan explicar el resultado o interpretación de los experimentos. Claramente, las dos soluciones afectan la presión sanguínea de diferentes maneras, como es mostrado en la Figura 4. En el tiempo de infusión, el efecto sobre la presión sanguínea debe ser una función de las propiedades _ de la solución infusionada, no los animales recipientes. La respuesta de la presión sanguínea es más grande y sostenida en los animales PHP comparado con los animales POE. La supervivencia de los animales claramente no es enlazada al efecto presor de las soluciones de hemoglobina, como se ha sugerido por algunos investigadores en el pasado, debido a que la supervivencia (y una sugerencia de menor déficit de base) es mejor en los animales POE comparado con los animales PHP, en los cuales el efecto de la presión sanguínea es menor y solamente transiente. Ver, Przybelski, R. J., E. K. Daily y M. L. Birnbaum, "The pressor effect de hemoglobin — good or bad?" In Winslow, R, M. , K. D. Vandegriff, y M. Intaglietta, eds. Advances in Blood Substitutes. Industrial Opportunities and Medical Challenges. Boston, Birkhauser (1997), 71-85. Tomados conjuntamente, estos resultados sustentan la hipótesis que una P50 menor es beneficioso para el uso de la hemoglobina libre de célula como un portador de oxígeno. La hipótesis está basada en 2 conceptos. Primero, que el gradiente de difusión para la hemoglobina libre de célula es una función del gradiente de oxihemoglobina entre la fuente de oxígeno, el glóbulo rojo y la pared del vaso. Este gradiente, a su vez es dependiente de la forma y posición de la curva de equilibrio de oxígeno (McCarthy, M. R., K. D.

Vandegriff, y R. M. Winslow, "The role of facilitated diffusión in oxygen transport by cell-free hemoglobin: Implications for the design of hemoglobin-based oxygen carriers", Biophysical Chemistry 92: 103-317 -(2001)). Segundo, esta consideración conduce a la segunda base conceptual de la hipótesis de los inventores de que la alta afinidad al oxigeno (h jo P50) efectivamente "impide" al 02 de la circulación hasta que la molécula de hemoglobina portadora llega a las regiones de la circulación en la cual el P02 es muy bajo, como en el tejido isquémico o hipóxico. Ejemplo 5 Estabilidad de la MalPEG-Hb El propósito de este estudio fue determinar la estabilidad de la MalPEG-Hb durante una simulación de las condiciones de almacenamiento y manejo de las muestras para experimentos clínicos de Fase I. Se estimó la estabilidad durante las tres etapas de manejo. La etapa I representó la transferencia de almacenamiento congelado en la instalación de producción a condiciones de temperatura durante el envío al sitio clínico (estudio de almacenamiento congelado) . La etapa II representó la descongelación de la MalPEG-Hb durante 24 horas a +4°C y el almacenamiento subsecuente a +4°C durante 5 días (estudio de refrigeración) . La etapa III representó la descongelación de la MalPEG-Hb durante 24 horas a +4°C y el almacenamiento subsecuente de la MalPEG-Hb a temperatura ambiente por varios días antes de la administración al paciente (estudio a temperatura ambiente) . Métodos experimentales La estabilidad se definió por la proporción de oxidación del material de prueba de la MalPEG-Hb. El porcentaje de methemoglobina en la muestra se midió usando co-oximetría (IL Co-oximetría 682) . Las visiones se hicieron por duplicado en cada punto del tiempo de acuerdo con el protocolo . Las temperaturas se inspeccionaron mediante el termómetro o registro de diagramas de temperatura. El estudio de almacenamiento congelado se condujo sobre una gama de temperatura de -21.0±3.0°C. El estudio refrigerado se condujo sobre una gama de temperatura de +4.0±0.2°C. El estudio a temperatura ambiente se condujo sobre una gama de temperatura de +21.0±1.0°C. La temperatura, la hemoglobina total y el por ciento de methemoglobina se registraron en cada uno de los puntos del tiempo indicados. En los estudios refrigerado y congelado, se tomaron mediciones en el tiempo cero (completamente descongelado) una hora después, y luego cada 24 horas durante cinco días. En el estudio a temperatura ambiente, las mediciones se tomaron en el tiempo cero (completamente descongelado) y subsecuentemente cada hora durante 10 horas.

Resultados MalPEG-Hb no mostró cambio en el por ciento de hemoglobina durante el almacenamiento de 6 días a -20°C como se muestra en la figura 8. De manera similar, MalPEG-Hb no mostró cambio en el por ciento de hemoglobina durante el almacenamiento de 5 dias a +4°C como se muestra en la figura 9. Durante el almacenamiento a temperatura ambiente, -MalPEG-Hb mostró menos de 1 por ciento de incremento en la methemoglobina durante un periodo de diez horas como es mostrado en la Figura 10. Los ejemplos expuestos en lo anterior se proporcionan para proporcionar a aquellos expertos ordinarios en la técnica con una declaración completa y descripción de como hacer y usar las modalidades preferidas de las composiciones, y no se proponen para limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención. Las modificaciones de los modos descritos en lo anterior para llevar a cabo la invención que son obvias para personas expertas en la técnica, se proponen que están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones. Todas las publicaciones, patentes, y solicitudes de patentes citadas en esta especificación se incorporan en la presente por referencia como si cada publicación, patente o solicitud de patente fuera específicamente e individualmente indicada que es incorporada en la presente por referencia.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un producto de sustituto sanguíneo adaptado para el suministro de oxígeno a tejidos, caracterizado porque comprende hemoglobina- oxigenada, modificada con óxido de polialquileno (PAO) , en donde la hemoglobina oxigenada, modificada con PAO tiene una P50 menor que la hemoglobina libre de estroma nativa de la misma fuente de animal cuando se mide bajo las mismas condiciones. 2. Una composición para uso como un sustituto sanguíneo, caracterizada porque comprende el producto de sustituto sanguíneo de la reivindicación 1 en un diluyente acuoso . 3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la concentración de hemoglobina está entre 0.1 a 4.0 g/dl. 4. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la viscosidad es de 2.5 +/- 1.0 cPs. 5. El producto de sustituto sanguíneo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la hemoglobina oxigenada, modificada con PAO tiene una P50 menor que 10 torr. 6. El producto de sustituto sanguíneo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la hemoglobina oxigenada, modificada con PAO tiene una P50 menor que 6 torr. 7. El producto de sustituto sanguíneo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la hemoglobina oxigenada, modificada con PAO tiene una P50 de 6 +/- 2 torr. 2. El producto de sustituto sanguíneo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el PAO es polietilenglicol (PEG) de acuerdo con la fórmula de H (OCH2CH2) n0H, en donde n es mayor o igual a 4. 9. El producto de sustituto sanguíneo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el PAO está unido a los grupos tiol en la superficie sobre la hemoglobina . 10. El producto de sustituto sanguíneo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque por lo menos alguno de los grupos tiol en la superficie se adicionan químicamente a la hemoglobina antes de la unión. 11. El producto de sustituto sanguíneo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el PAO está unido a la hemoglobina con un enlazador. 12. El producto de sustituto sanguíneo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque enlazador es un grupo alquilo, amida, carbamato o fenilo. 13. El producto de sustituto sanguíneo de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el enlazador es una porción de 1 a 6 átomos de carbono alifática o aromática, insaturada. 14. El producto de sustituto sanguíneo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque tiene una fórmula: Hb- (S-Y-R-CH2-CH2 [0-CH2-CH2] n0-CH3 ) ra en donde: Hb es hemog"bobina tetramérica; S es un grupo tiol en la superficie; Y es un enlace covalente entre la hemoglobina y PEG; R es un enlazador; y m es mayor qué 2. 15. El producto de sustituto sanguíneo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque m es 4-5. 16. El producto de sustituto sanguíneo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la hemoglobina además comprende methemoglobina. 17. El producto de sustituto sanguíneo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el por ciento de methemoglobina es menor que 10%. 18. Un método para hacer el producto de sustituto sanguíneo de la reivindicación 1, caracterizado porque comprende las etapas de: a) preparar una solución de hemoglobina; b) tiolar la hemoglobina para adicionar grupos tiol en la superficie; c) oxigenar la hemoglobina para formar una hemoglobina oxigenada; y d) unir covalentemente por lo menos un PAO a los grupos tiol en la superficie sobre la hemoglobina para formar hemoglobina oxigenada, modificada con PAO. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la etapa d) da por resultado la unión de grupos tiol nativos y grupos tiol adicionados.