CN104379160A - 双阿司匹林交联聚乙二醇化血红蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了具有高氧亲和力的聚乙二醇化双阿司匹林交联血红蛋白缀合物，其具有增强的亚硝酸盐还原酶活性，用于将氧、一氧化碳、氧化氮或其混合物递送到组织中以治疗各种疾病和病状。

Description

双阿司匹林交联聚乙二醇化血红蛋白
发明领域
本发明大体上涉及用于在微血管系统中与天然血红蛋白相比以提高的速率将亚硝酸盐还原为氧化氮的交联聚乙二醇化血红蛋白和血红蛋白组合物。具体地说，本发明是针对使用具有提高的亚硝酸盐还原酶活性并且还可以将氧、一氧化碳、氧化氮或其混合物递送到组织中的高氧亲和力分子内交联聚乙二醇化血红蛋白缀合物。
发明背景
基于血红蛋白的氧载体(“HBOC”)一直被与血管收缩相联系，所述血管收缩已被归因于血红素对氧化氮(NO)的清除作用。适合作为氧治疗剂的氧载体(有时称为“携带氧的血浆容量扩张剂”)(诸如稳定化血红蛋白(Hb))已显示具有有限的功效，因为其清除氧化氮，从而引起血管收缩和高血压。这些携带氧的解决方案引起血管收缩的倾向可在动物和人类中显现为高血压。尽管HBOC的血管收缩作用的潜在机制尚未充分了解，但已表明血红素铁可快速并且不可逆地与内源性NO(一种强大的血管扩张剂)组合，从而引起血管收缩。
部分因为这些血管收缩作用，迄今为止尚无氧载体作为氧治疗剂(OTA)完全成功，不过包含修饰型无细胞Hb的产品已成为最有前景的产品。美国军队研发了用双二溴水杨基-富马酸酯的α链间交联的人Hb(ααHb)作为原型红细胞替代物，但在其展现肺及全身血管阻力剧烈增加之后被放弃(Hess，J.等，1991，Blood 78：356A)。此产品的商业形式在令人失望的III期临床试验之后也被放弃(Winslow，R.M.，2000，Vox Sang 79：1-20)。
已提出两种分子途径，试图克服Hb的NO结合活性。第一种途径使用远端血红素口袋的定位诱变，以求形成NO结合亲和力降低的重组血红蛋白(Eich，R.F.等，1996，35：6976-83)。第二种途径使用化学修饰途径，其中通过寡聚化增加Hb的大小，以求降低或有可能完全抑制Hb从血管间隔中溢出进入胞间隙(Hess，J.R.等，1978，J.Appl.Physiol.74：1769-78；Muldoon，S.M.等，1996，J.Lab.Clin.Med.128：579-83；Macdonald，V.W.等，1994，Biotechnology 22：565-75；Furchgott，R.，1984，Ann.Rev.Pharmacol.24：175-97；以及Kilbourne，R.等，1994，Biochem.Biophys.Res.Commun.199：155-62)。
事实上，已产生对NO的关联结合速率降低的重组Hb，其在最大负荷大鼠实验中更少产生高血压(Doherty，D.H.等1998，NatureBiotechnology 16：672-676以及Lemon，D.D.等1996，Biotech 24：378)。然而，研究表明NO结合可能不是Hb的血管活性的唯一解释。已发现某些大Hb分子(诸如用聚乙二醇(PEG)修饰的大Hb分子)实际上无血管收缩，尽管其NO缔合速率与严重高血压ααHb的NO缔合速率目同(Rohlfs，R.J.等1998，J Biol.Chem.273：12128-12134)。此外，发现当在出血之前作为交换输血提供时PEG-Hb预防出血结果格外有效(Winslow，R.M.等1998，J.Appl.Physiol.85：993-1003)。
PEG缀合至Hb使其抗原性降低并且延长其循环半衰期。然而，已报导PEG缀合反应引起Hb四聚体解离成αβ-二聚体亚基，从而在接受低于40，000道尔顿(“Da”)的Hb单体单元的PEG-缀合物的交换输血大鼠中引起严重的血红蛋白尿(Iwashita和Ajisaka Organ-DirectedToxicity：Chem.Indicies Mech.，Proc.Symp.，Brown等1981，编著Pergamon，Oxford，England第97-101页)。分子量大于84，000道尔顿的聚环氧烷(“PAO”)缀合Hb是由Enzon，Inc.(美国专利号5，650，388)制备，其携带约10个拷贝的在α和ε氨基处键联至Hb的PEG-5,000链。此取代度描述为避免在哺乳动物中与血红蛋白尿有关的临床上显著的肾毒性。然而，缀合反应产生异质缀合群体并且含有其它不合需要的反应物，其必须通过柱色谱法去除。
PEG缀合典型地通过用生物分子表面上的官能团活化PEG部分的反应来进行。最常见的官能团是赖氨酸的氨基、组氨酸残基的咪唑基以及蛋白质的N端；半胱氨酸残基的硫醇基；以及丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基以及蛋白质的C端。通常通过将羟基端转化成能够在温和水性环境中与这些官能团反应的反应性部分来活化PEG。用于缀合治疗性生物药物的最常见单官能PEG之一是甲氧基-PEG(“mPEG-OH”)，其仅具有一个官能团(即羟基)，因此使与双官能PEG有关的交联和聚集问题减到最少。然而，mPEG-OH往往被高分子量双官能PEG(即“PEG二醇”)污染，归因于其生产过程其可在高达10至15％范围内(Dust J.M.等1990，Macromolecule 23：3742-3746)。此双官能PEG二醇的大小是所需单官能PEG的大致两倍。随着PEG的分子量增加污染问题进一步加重。mPEG-OH的纯度对于聚乙二醇化生物治疗剂的产生尤其关键，因为FDA要求最终药物产品的生产过程和质量的高水平的再现性。
Hb已以氧合与脱氧状态两者缀合至PAO。美国专利号6,844,317描述了通过在缀合之前将Hb与大气平衡来以氧合或“R”态对Hb进行缀合，以提高所得PEG-Hb缀合物的氧亲和力。其它描述了在缀合之前用于减小氧亲和力并且增加结构稳定性的脱氧步骤，从而使Hb能够承受化学修饰、透滤和/或无菌过滤以及巴氏灭菌法的物理应力(美国专利号5,234,903)。关于Hb的分子内交联，表明可能需要在修饰之前使Hb脱氧以使α链的赖氨酸99暴露于交联试剂(美国专利号5,234,903)。
Acharya等研究了在与PEG缀合之前用2-亚氨基硫杂环戊烷进行Hb硫醇化的动力学(美国专利号7,501，499)。观察到使亚氨基硫杂环戊烷的浓度从10倍(其引入平均五个非固有硫醇/四聚体)增加到30倍使Hb上非固有硫醇的数目几乎加倍。然而，PEG缀合之后所见的尺寸增加仅是微小的，甚至在硫醇数目加倍的情况下也是如此。这表明在20倍摩尔过量的马来酰亚胺基PEG-5000存在下的缀合反应以更少反应性硫醇覆盖Hb的表面，从而产生空间干扰，其抵抗更多反应性硫醇对Hb的进一步修饰。因此，为对修饰型Hb实现所要程度的缀合(即6±1PEG/Hb分子)，Acharya等用8-15倍摩尔过量的亚氨基硫杂环戊烷对Hb进行硫醇化，并且接着使硫醇化Hb与16-30倍摩尔过量的马来酰亚胺基PEG-5000反应。然而，在大规模生产中这些高摩尔过量反应物浓度使制备HBOC的成本显著增加并且使最终产品的异质性增加。此外，这种高摩尔过量的马来酰亚胺基PEG-5000还因产生更大数目的不需要的副反应物而产生更异质产品。
在前述研究中，观察到表面修饰血红蛋白的分子大小必须足够大以避免被肾清除并且实现所要循环半衰期。Blumenstein，J.等确定这可以84,000道尔顿(“Da”)或大于84,000道尔顿的分子量实现(“BloodSubstitutes and Plasma Expanders，”Alan R.Liss，编著，New York，N.Y.，第205-212页(1978))。在该研究中，作者将具有不同分子量的右旋糖酐缀合至Hb。他们报导Hb(分子量是64,000Da)与右旋糖酐(分子量是20,000Da)的缀合物从循环中缓慢清除并且极少穿过肾。另外，观察到使分子量增加超过84,000Da不显著改变这些清除曲线。分子内交联使四聚血红蛋白单元的亚基以化学方式结合在一起以防止形成通过肾过早排出的二聚体。(参见例如美国专利号5,296,465)。
亚硝酸盐与氧合血红蛋白反应以形成高铁血红蛋白，并且与脱氧血红蛋白反应以形成高铁血红蛋白和氧化氮。在血红蛋白存在下亚硝酸盐的血管舒张作用不同于传统NO供体并且可部分通过血红蛋白的亚硝酸盐还原酶活性来解释。参见Crawford等2006Blood107：566-574；Huang等2005J Biol Chem 280：31126-31131；Huang等2005J Clin Invest 115：2099-2107。研究已显示亚硝酸盐仅通过与在血红蛋白四聚体情况下的脱氧血红素反应转化成NO(CosbV，K.等2003，Nat.Med.9：1498)，并且另外，在蛋白质血红素呈松弛或R态构象的情况下产生亚硝酸盐的更快还原。相信血红蛋白的这种亚硝酸盐还原酶活性是在变构控制下的并且当脱氧血红素呈R态构象时以最大速率产生NO。R态稳定化效应可例如通过在βCys93位点处进行修饰来产生，诸如马来酰亚胺PEG缀合产生增加的亚硝酸盐还原酶活性。另外，已证实当无细胞Hb引起血管收缩并且减少灌注时，MalPEG-Hb维持血液流动和微血管灌注压力，这被认为与缺乏血管收缩有关(Tsai，A.G.等2006，Blood 108：3603)。其它研究也表明用PEG的多个链修饰无细胞血红蛋白衍生物可抑制血管活性。使用具有五至六个PEG链的R态稳定化Hb的实验展示与天然Hb相比快为10倍的亚硝酸盐还原酶活性(Lui，F.E.等2008，Biochemistry 47(40)，10773-10780)。然而，推断出在可到达的赖氨酸残基处的任何进一步PEG缀合不促成增加的亚硝酸盐还原酶活性。
因此，需要一种通过使用与现有Hb相比具有增加的亚硝酸还原酶性质的高氧亲和力血红蛋白将氧、一氧化碳、氧化氮或其混合物递送到组织中并且在微血管系统中以提高的速率将亚硝酸盐还原为氧化氮的方法。
发明概述
在一个方面中，本发明是针对一种β，β-分子内交联聚氧化烯氧化物(PAO)血红蛋白缀合物，其P50如在37℃和pH 7.4下所测量在约2至5mmHg范围内。当在25℃下完全脱氧时血红蛋白缀合物展现最大亚硝酸盐还原酶活性，其比脱氧无基质血红蛋白在相同条件下测量时大为至少10倍。
本发明的另一个方面是针对一种β，β-分子内交联PAO血红蛋白缀合物，其P50如在37℃和pH 7.4下所测量在约2.0到5.0mmHg范围内，其中当在25℃下完全脱氧时血红蛋白缀合物的最大亚硝酸盐还原酶活性是至少0.25μM/秒。
本发明的另一个方面是针对包含β，β-分子内交联聚氧化烯氧化物血红蛋白缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物。所述组合物可用于治疗急性肝衰竭、β地中海贫血、烧伤、慢性严重肢体缺血、二氧化碳或氰化物中毒、慢性阻塞性肺病(COPD)、充血性心脏衰竭、缺氧、疟疾、器官缺血、周围性血管疾病、卟啉症、妊娠先兆子痫、败血病、镰状细胞疾病、视网膜病、眼内病状、睾丸扭转、外伤、休克、外伤性脑损伤、溃疡、血管痉挛或其组合。所述药物组合物还可以用作血管成形术的辅助物、作为整形外科的辅助物或作为植入心室辅助装置中的辅助物；作为血液替代物、心脏保护剂、冷冻保护剂、血液透析辅助物、肿瘤学试剂、器官防腐剂、性能增强剂、手术辅助剂或伤口愈合剂；用于成像；用于改善肺功能；或其组合。所述组合物还可以用于兽医学治疗由以下原因造成的失血：损伤、溶血性贫血、感染性贫血、细菌感染、因子IV破碎、脾功能亢进和脾肿大、家禽的出血性综合症、发育不全性贫血、再生障碍性贫血、特发性免疫溶血性病状、铁缺乏、同族免疫溶血性贫血、微血管病性溶血性贫血、寄生虫病或手术麻醉诱导的脑损伤或其组合。
本发明的另一个方面是针对一种治疗方法，其包括向有需要的受试者施用这种血红蛋白缀合物或药物组合物。所述方法用于治疗上文所描述的病状中的任何一种或更多种。
本发明的另一个方面是针对一种将氧、氧化氮、一氧化碳或其混合物递送到组织中并且在微血管系统中将亚硝酸盐还原为氧化氮(NO)的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用β，β-分子内交联聚氧化烯氧化物血红蛋白缀合物或药物组合物，其中在施用之后，血红蛋白变得未配位并且在微血管系统中将亚硝酸盐转化成氧化氮。
本发明的另一个方面是针对一种制备如上文所描述的β，β-分子内交联聚氧化烯氧化物血红蛋白缀合物的方法。所述方法包括以下步骤：将β，β-分子内交联血红蛋白与2-亚氨基硫杂环戊烷(2-IT)于水性稀释剂中混合以形成硫醇化血红蛋白；以及添加PAO到于水性稀释剂中的硫醇化血红蛋白中以形成β，β-分子内交联聚氧化烯氧化物血红蛋白缀合物。
其它目标和特征将部分显而易见并且部分在下文中指出。
附图简述
图1是无基质Hb(SFH)(---)和ββ-Hb(-)分别在非解离条件(PBS)下的尺寸排阻色谱，表明对ββ-Hb的DBBF交联的证实。
图2是无基质Hb(SFH)(---)和ββ-Hb(-)分别在解离条件(PBS)下的尺寸排阻色谱，表明对ββ-Hb的DBBF交联的证实。
图3是表明对β-亚基的DBBF交联的证实的逆相高效液相色谱，其中分别为(SFH)(---)和ββ-Hb(-)。
图4是PEG-ββ-Hb(---)和ββ-Hb(-)分别在非解离条件下的尺寸排阻色谱，表明PEG-ββ-Hb的聚乙二醇化。
图5是各种血红蛋白的亚硝酸盐还原性质的图形化描述。
相应参考字符指示在图式通篇中的对应部分。
优选实施方案的描述
已发现具有高氧亲和力β，β-分子内交联聚氧化烯氧化物血红蛋白缀合物，其与常规血红蛋白治疗剂相比具有增强的治疗性质。这些血红蛋白缀合物当脱氧时展现最大亚硝酸盐还原酶活性，其比脱氧无基质血红蛋白在相同条件下测量时大为至少10倍。血红蛋白缀合物在25℃下呈完全脱氧形式时的最大亚硝酸盐还原酶活性是至少0.25μM/s。血红蛋白可以配位形式递送以将氧、一氧化碳或氧化氮递送到受试者中并且一旦未配位就在微血管系统中将亚硝酸盐转化成氧化氮。
在不受任何特定理论限制的情况下，人们相信，通过使血红蛋白交联成氧合R态构象，其使非可解离四聚体中的脱氧血红素被锁在非挠性的R态中，这促进那些脱氧血红素处亚硝酸盐的还原。本发明的血红蛋白缀合物的出乎意料地大得多的亚硝酸盐还原酶活性提供更多NO，其逃脱血红素捕获并且从Hb释放到组织中，从而与其它血红蛋白治疗剂相比引起更大血管舒张效应。这种现象的产生被认为是因为高亲和力R态结构的交联促进血红素口袋内的性质以增强亚硝酸盐的还原。在没有交联的情况下，存在更多血红蛋白变构构象变化，在T态和R态血红素构象结构之间交替变化。甚至在四聚体内的脱氧血红素口袋中，交联的完全稳定化R态结构也被认为使血红素口袋内亚硝酸盐还原成NO增强。
本发明是针对一种β，β-分子内交联聚氧化烯氧化物(PAO)血红蛋白缀合物，其P50如在37℃和pH 7.4下所测量在约2至5mmHg范围内。当在25℃下完全脱氧时血红蛋白缀合物展现最大亚硝酸盐还原酶活性，其比脱氧无基质血红蛋白在相同条件下测量时大为至少10倍。
当在25℃下完全脱氧时血红蛋白缀合物可展现最大亚硝酸盐还原酶活性，其比脱氧无基质血红蛋白在相同条件下测量时大为至少15倍或至少20倍。优选地，当在25℃下完全脱氧时血红蛋白缀合物展现最大亚硝酸盐还原酶活性，其比脱氧无基质血红蛋白在相同条件下测量时大为10倍至约25倍，更优选地比脱氧无基质血红蛋白在相同条件下测量时大为约15倍至约25倍，大为10倍至约21倍，或大为约15倍至约21倍。
本发明的β，β-分子内交联PAO血红蛋白缀合物的P50如在37℃和pH 7.4下所测量可在约2.0至5.0mmHg范围内并且当在25℃下完全脱氧时最大亚硝酸盐还原酶活性是至少0.25μM/秒。优选地，当在25℃下完全脱氧时血红蛋白缀合物的最大亚硝酸盐还原酶活性是至少0.30μM/秒，并且更优选地是0.35、0.40或0.45μM/秒。血红蛋白缀合物的最大亚硝酸盐还原酶活性可在0.25至约0.50μM/秒或约0.30至约0.47μM/秒范围内。
本发明中可使用各种Hb。Hb可获自动物来源，诸如人、牛、猪或马血红蛋白。人Hb是优选的。Hb可获自天然来源或可通过已知的重组方法产生。
本发明的血红蛋白缀合物具有大于无基质血红蛋白的高氧亲和力。这意味着血红蛋白的P50如在37℃和pH 7.4下所测量将小于15mmHg，优选地是约2至约5mmHg，并且最优选地是约2至约4mmHg，或是3mmHg。
血红蛋白缀合物的胶体渗透压(COP)可以是至少约50mmHg，优选地至少约60、65、70或75mmHg。
血红蛋白是β，β-分子内交联的以防止解离成二聚体并且避免被肾清除，从而延长循环半衰期。双(2，5-二溴水杨基)富马酸酯(DBBF)交联剂用于交联血红蛋白分子的两个β82赖氨酸残基。可使用已知DBBF交联方法中的任一种，诸如由Walder等，Biochemistry，1979；18(20)：4265-70所描述的方法。
用于缀合本发明的血红蛋白的聚环氧乙烷包括但不限于聚环氧乙烷、聚环氧丙烷以及聚环氧乙烷/聚环氧丙烷共聚物。PAO的分子量是约2,000至约20,000道尔顿，优选地约3,000至约10,000道尔顿，更优选地4,000至约6,000道尔顿，并且最优选地约5,000道尔顿。目前最常见的用于修饰Hb的表面的PAO是PEG，因为其药物可接受性和商业可利用性。基于分子内环氧乙烷的重复亚单元(即-CH2CH2O-)的数目，PEG可以各种分子量获得，以基于缀合至Hb的PEG分子的数目和大小实现所要分子量。
血红蛋白可以平均约7至约11个PAO分子/血红蛋白四聚体进行缀合。优选地，血红蛋白缀合到平均约9至约10个PAO分子/四聚体。
PAO聚合物的末端基团中的一者或两者转化成反应性官能团(“活化”)。举例来说，PEG-OH已用于制备PEG-卤化物、甲磺酸酯或甲苯磺酸酯，其接着通过与氨水(Zalipsky，S.等，1983，Eur.Polym.J.19：1177-1183)、叠氮化钠或钾或邻苯二甲酰亚胺钾进行亲核置换反应转化成PEG-胺(“PEG-NH2”)。活化的PEG可接着通过PEG胺基团(“-NH2”)与血红素蛋白的羧基(“-COOH”)的相互作用缀合至血红素蛋白。
除用胺基团官能化PEG并且将其转化成马来酰亚胺基之外，用其活化的PEG已知用于本领域中。举例来说，PEG可用(仅举几个例子)碳酸对硝基苯酯、醛、氨基丙基、氨基乙基、硫醇、氨基氧基、酰肼以及碘乙酰胺活化。这种官能性PEG可使用已知方法缀合至蛋白质的表面氨基酸侧链。
PEG-NH2可进一步官能化以与除羧基以外的基团缀合。举例来说，美国专利号6,828,401公开了PEG-NH2与马来酰亚胺反应以形成mPEG-马来酰亚胺。在此反应中，mPEG-OH与甲苯磺酰化试剂(对甲苯磺酰氯)和碱催化剂(三亚乙基胺)在有机溶剂(二氯甲烷)存在下反应以产生mPEG-甲苯磺酸酯。mPEG-甲苯磺酸酯接着与28％氨水和马来酸酐在N，N-二甲基乙酰胺(“DMAc”)与N-环己基吡咯烷酮(“CHP”)的有机溶剂混合物中反应以产生马来酰胺酸化合物。此化合物接着与五氟苯基三氟乙酸酯在二氯甲烷存在下反应以产生mPEG-马来酰亚胺。
或者，可通过使mPEG-OH与甲苯磺酰化试剂(对甲苯磺酰氯)和碱催化剂(三亚乙基胺)在有机溶剂(二氯甲烷)存在下反应以产生mPEG-甲苯磺酸酯来制备mPEG-马来酰亚胺。mPEG-甲苯磺酸酯接着与28％氨水反应以制备mPEG-NH2。mPEG-NH2接着与N-甲氧基羰基马来酰亚胺(MCM)在饱和碳酸氢钠(NaHCO3)存在下反应以产生mPEG-马来酰亚胺。
人Hb中可使用胺反应性化学进行修饰以便缀合至PAO的氨基酸残基侧链的非限制性实例呈现于下表1中：
表1-胺反应性化学和潜在修饰位点
一种增加Hb上的可用缀合位点的数目的方法是引入巯基(也称为硫醇化)，其倾向于与MalPEG比自由胺更具反应性。用于蛋白质硫醇化的各种方法是已知的。在一种方法中，无蛋白胺与丙酸3-(2-吡啶基二硫代)琥珀酰亚胺酯反应，随后用二硫苏糖醇(“DTT”)或三(2-羧乙基)膦(“TCEP”)还原。此反应释放2-吡啶硫酮发色团，其可用于确定硫醇化的程度。胺还可以通过依次与琥珀酰亚胺基乙酰基硫代乙酸酯和50mM羟胺或肼在接近中性的pH值下反应来间接硫醇化。
描述于美国专利号5,585，484中的另一种方法在缀合之后维持Hb的氨基(α-或ε-)的正电荷。此方法涉及通过2-IT对Hb的ε-氨基进行酰胺化以将巯基引至蛋白质上。此方法与先前所用的琥珀酰亚胺基化学相比具有至少两个额外的优势：1)在巯基情况下马来酰亚胺基的高反应性和选择性促成在有限过量的试剂情况下对硫醇的几乎定量的修饰，以及2)2-IT的硫醇基是潜伏性的并且仅因试剂与蛋白质氨基的反应而原位产生。这些优势提供一个额外的益处：其允许Hb与用于表面修饰的硫醇化和聚乙二醇化试剂同时孵育。
举例来说，MalPEG可通过硫醇化Hb的胺以在Hb表面上引入硫醇基来缀合至Hb。Hb中可用于反应的两个固有硫醇基位于βCys93处，并且Hb表面上的外加硫醇基可与马来酰亚胺基PAO的马来酰亚胺反应以形成聚乙二醇化Hb缀合物。
当血红蛋白呈氧合状态时，聚环氧烷可经由硫醇反应性部分共价连接至血红蛋白分子上暴露的氨基酸侧链的硫醇基。
马来酰亚胺-PEG可缀合至选自以下的血红蛋白硫醇部分：血红蛋白的半胱氨酸残基的固有硫醇部分、血红蛋白的硫醇化赖氨酸残基的硫醇部分或其组合。
马来酰亚胺-PEG包括用于将马来酰亚胺连接至PEG的接头。接头可包括但不限于亚烷基(诸如亚乙基、亚丙基或亚异丙基)、亚苯基、酰胺(-NH-C(o)-)或氨基甲酸苯酯(例如-Ph-NH-C(O)-)。优选地，聚氧化烯通过由亚烷基或亚苯基并且更优选地亚烷基(诸如亚乙基)组成的接头连接到硫醇反应性部分。
马来酰亚胺-PEG可具有以下结构
其中Hb是血红蛋白，S是血红蛋白的硫醇，R3是亚烷基或亚苯基，X是末端基团，m是缀合至血红蛋白的马来酰亚胺基活化的PEG聚合物的平均数目，并且n是平均分子量是约2,000至约20,000道尔顿的PEG的氧化乙烯单元的平均数目。优选地，R3是亚烷基，诸如亚乙基；X是羟基、芳氧基(诸如苯甲氧基)或C1-C20烷氧基，更优选地是C1-C10烷氧基，并且更优选地是C1-C5烷氧基，诸如甲氧基或乙氧基；n是约3,000至约10,000道尔顿，更优选地4,000至约6,000道尔顿，并且最优选地约5,000道尔顿；并且m是约7至约11，并且更优选地约9或约10。
可使用硫醇反应性化学修饰的氨基酸残基侧链的非限制性实例呈现于下表2中：
表2-硫醇反应性化学和潜在修饰位点
位于血红蛋白的βCys93残基处的两个固有硫醇可聚乙二醇化或可与N-乙基马来酰亚胺反应。这些半胱氨酸残基的此类修饰使P50降低并且具有R态稳定化效应。
PAO-Hb的分子量可通过缀合反应来调节。常规想法表明增加反应物的摩尔比将使结合于Hb的PEG分子的数目增加。这包括Hb的硫醇化过程(即增加硫醇化剂与Hb的摩尔比)与缀合过程(即增加硫醇活化的PEG与硫醇化Hb的摩尔比)两者。然而，这些过量摩尔比仅使得6±1个PEG分子/Hb结合(参见美国专利号7,501,499)。
最近已确定使用更低的反应物摩尔比可使更大数目的PAO分子结合于Hb。在硫醇化之前和之后以及缀合之后，Hb上的可用硫醇基的数目使用二硫吡啶比色分析来确定(Ampulski，R.S.等，1969，Biochem.Biophys.Acta 32：163-169)。人Hb在β93半胱氨酸残基处含有两个固有反应性硫醇基，这通过二硫吡啶反应得以认实。在用2-IT硫醇化SFH之后，反应性硫醇基的数目从两个增加到超过七个。在此实例中，平均8个PEG分子结合于Hb。这是使用在硫醇化反应中相对于SFH 7.5倍摩尔过量的2-IT以及在缀合反应中相对于硫醇化Hb 12倍摩尔过量的MalPEG来实现。
当血红蛋白呈氧合状态时用聚环氧烷来缀合血红蛋白以增加Hb-PAO缀合物的氧亲和力。
因此，本发明的另一个方面是针对一种制造血红蛋白缀合物的方法。所述方法包括以下步骤：将β，β-分子内交联血红蛋白与2-亚氨基硫杂环戊烷(2-IT)于水性稀释剂中混合以形成硫醇化血红蛋白；以及添加PAO到于水性稀释剂中的硫醇化血红蛋白中以形成β，β-分子内交联聚氧化烯氧化物血红蛋白缀合物。
在此方法中，2-亚氨基硫杂环戊烷以相对于血红蛋白浓度约8与约25倍摩尔过量之间、优选地约15倍摩尔过量的浓度存在。
硫醇化可在约7至约9的pH值下进行。
缀合可在约7至约9的pH值下进行。
在此方法中，PAO-马来酰亚胺基于100％末端活性以相对于血红蛋白浓度约10至约40倍摩尔过量之间、优选地约28倍摩尔过量的浓度存在。
本发明的血红蛋白缀合物可呈氧合或脱氧形式，可与CO或NO配位，或可以是包括这四种形式中的两种或更多种的混合物。HbO2是通过使非氧合血红蛋白与空气、纯O2气体或O2/氮气混合物平衡来制备。
可通过本领域中已知的任何方法来进行脱氧。一个简单方法是使血红蛋白溶液暴露于惰性气体，诸如氮气、氩气或氦气。为保证脱氧相对均匀，在此过程中使Hb溶液循环。监测脱氧以达到所要水平可通过使用联合血氧计682(Instrument Laboratories)来进行。如果需要部分再氧合，那么可使脱氧Hb暴露于氧气或含有氧气的气体混合物，诸如空气。
用以用另一种气体替换分子氧的气体交换可通过气体渗透膜(诸如聚丙烯或乙酸纤维素膜)来实现。参见例如已公布的美国专利申请号2006/0234915。使用这些膜的市售气体交换装置包括来自Hoechst-Celanese(Dallas，TX)的CelgardTM聚丙烯微孔空心纤维装置或来自American Laboratory(East Lyme，CT)的Cell-PharmTM空心纤维氧合器。在Hoechst-Celanese CelgardTM装置中，通过在以5-20psi用氮气吹扫系统的同时使水性Hb溶液以10-100ml/min/ft2穿过聚丙烯微孔性中空过滤器来使氧合Hb脱氧。通常使Hb循环约5至30分钟以实现所要百分比的脱氧Hb。用于产生脱氧Hb的另一种方法包括使Hb溶液暴露于化学还原剂，诸如抗坏血酸钠、连二硫酸钠以及亚硫酸氢钠。通过调节还原剂浓度、反应时间以及温度使Hb部分脱氧。或者，可使用还原剂使Hb基本上脱氧，并且接着可再引入氧气以形成部分脱氧产物。举例来说，在添加抗氧化剂之前可使Hb暴露于100mM浓度的亚硫酸氢钠约一小时。
可使用任何已知用于形成氧合血红蛋白的方法、简单来说通过用CO取代O2来使Hb与CO配位。这通常涉及向血红蛋白的溶液中引入CO源以使得血红蛋白变得与CO而非O2配位。(K.D.Vandegriff等，Biochem.J.382：183-189(2004))。因为血红蛋白对CO具有比对氧气更高的亲和力，所以不必首先使血红蛋白脱氧。因此，最方便的形成CO-Hb复合物的方式是通过向血红蛋白的溶液中引入100％气态CO。
HbNO可通过使脱氧血红蛋白与氧化氮气体反应或通过使CO-Hb暴露于NO气体以使得NO与CO交换来制备。HbNO还可以通过使脱氧血红蛋白与小分子NO供体(如PROLI NONOateTM(即1-(羟基-NNO-氧化偶氮基)-L-脯氨酸二钠盐；Cayman Chemical，AnnArbor，Michigan)反应来制备。
应注意，NO(自由基)结合于球蛋白链中的氨基酸侧基的血红蛋白不是如本文所定义的NO-Hb复合物，因为此类化合物不含替代氧作为血红素口袋中的配体的双原子(非电离)NO。举例来说，当天然血红蛋白在使得其结合于自由巯基的条件下暴露于NO供体时形成亚硝酰基血红蛋白(美国专利号6,627,738)。此类亚硝酰基血红蛋白仍携带氧，然而本发明的NO-Hb复合物不携带氧。此外，当通过针对巯基部分的反应(诸如上文所描述)形成修饰型血红蛋白时，这些部分不再可用于NO结合。
本发明的PAO-Hb缀合物可在用于非肠道施用的药学上可接受的载体(诸如水性稀释剂)中调配成包含PAO-Hb缀合物的药物组合物。载体中PAO-Hb缀合物的浓度可根据应用变化。优选地，PAO-Hb缀合物浓度在约0.1g/dl至约10g/dl、更优选地约2.0g/dl至约8.0g/dl并且最优选地约4.0至约6.0g/dl范围内。血红蛋白的适当浓度的选择取决于最终血红蛋白产物的胶体渗透压(oncotic)性质。优选地，本发明的组合物与全血相比可以处于正常胶体渗透压或与血浆相比处于高胶体渗透压。可调节血红蛋白浓度以在各迹象下获得所要胶体渗透压。
当组合物调配成非肠道药物时，溶液通常包含与全血等渗并且维持血红蛋白的可逆的氧、CO或NO携带和递送性质的生理学相容电解质载体。
药学上可接受的载体可以是水性稀释剂。水性稀释剂可包括胶体的水溶液或非携氧组分的水溶液，诸如蛋白质(诸如白蛋白)的水溶液、糖蛋白的水溶液、多糖的水溶液或其组合。水性稀释剂可包括水性无细胞溶液。
合适的水性稀释剂包括但不限于生理盐水、生理盐水-葡萄糖混合物、林格氏溶液(Ringer′s solution)、乳酸化林格氏溶液、洛克-林格氏溶液(Locke-Ringer′s solution)、克雷布斯-林格氏溶液(Krebs-Ringer′ssolution)、哈特曼氏平衡生理盐水(Hartmann′s balanced saline)、肝素化柠檬酸钠-柠檬酸-葡萄糖溶液、乙酸溶液、多电解质溶液(例如来自Baxter International，Deerfield，IL的Plasma或Plasma)、乳糖酸盐溶液以及聚合血浆取代物，诸如聚环氧乙烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、环氧乙烷-丙二醇缩合物或其组合。
组合物可另外包含药学上可接受的填料、盐以及本领域中所熟知的其它物质，其选择取决于剂型、所治疗的病状、根据本领域中的普通熟练技工的判断所要实现的特定目的以及此类添加剂的性质。举例来说，组合物可包括生理缓冲剂、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖醇或山梨糖醇)、醇或聚醇、药学上可接受的盐(例如氯化钠或氯化钾)、表面活性剂(例如聚山梨醇酯80)、抗氧化剂、抗细菌剂、胶体渗透压剂(例如白蛋白或聚乙二醇)或还原剂(抗坏血酸、谷胱甘肽或N-乙酰半胱氨酸)。
药物组合物的粘度是至少约2厘泊(cP)。更具体地说，粘度在约2至约5cP并且特别地约2.5至约4.5cP范围内。
为避免施用中的并发症，药物组合物具有高纯度，即不含基质、磷脂以及热原质，内毒素水平如通过LAL(鲎变形细胞溶解物)测试所测量不超过0.25EU/ml，并且高铁血红蛋白不到8％。
药物组合物可诸如通过皮下、静脉内或肌肉内注射或以大体积非肠道溶液形式非肠道施用。组合物还可以通过灌胃来施用。
血红蛋白缀合物作为治疗剂的典型剂量可以是约1至约15,000毫克血红蛋白/千克患者体重。举例来说，当用作氧治疗剂时，剂量将介于100至7500mg/kg患者体重、更优选地500至5000mg/kg体重并且最优选地700至3000mg/kg体重之间。因此，对于人类患者来说典型剂量可以是1克至超过1000克。应了解含于各剂型的个别剂量中的活性成分的单位含量本身不需要构成有效量，因为必要的有效量可通过施用许多个别剂量来达到。剂量的选择取决于所使用的剂型、所治疗的病状以及根据本领域技术人员的判断所要实现的特定目的。
PAO-Hb缀合物和药物组合物可用于将氧、CO和/或NO递送至受试者。将氧、氧化氮、一氧化碳或其混合物递送至组织中并且将亚硝酸盐还原以在微血管系统中进一步产生内源性氧化氮(NO)的方法包括向有需要的受试者施用血红蛋白缀合物或组合物，其中在施用之后，血红蛋白变得未配位并且在微血管系统中将亚硝酸盐转化成氧化氮。
本发明的血红蛋白缀合物和其组合物可用于：治疗急性肝衰竭、β地中海贫血、烧伤、慢性严重肢体缺血、二氧化碳或氰化物中毒、慢性阻塞性肺病(COPD)(例如急性加重)、充血性心脏衰竭(例如急性心脏衰竭、慢性心脏衰竭)、缺氧(例如高海拔使用，包括用于肺水肿、减压病)、疟疾(例如脑型疟疾(恶性阻塞事件)、器官缺血(例如急性肠缺血(扭转)、急性肠缺血(栓塞)、心源性休克、急性血管器官缺血、中风(CAT扫描之前)、中风(CAT扫描之后)、心肌梗塞/严重心脏缺血)、周围性血管疾病、卟啉症、妊娠先兆子痫、败血病、镰状细胞疾病(例如中风/暂时性缺血性发作、脾隔离、肝隔离、异常勃起)、视网膜病/眼内病状(例如视网膜中央动脉阻塞、中央静脉阻塞)、睾丸扭转、外伤/休克(例如外伤性出血性休克、非外伤性出血性休克、入院前/现场使用(军事/紧急事件)、外伤性脑损伤/爆炸)、溃疡或血管痉挛；用作血管成形术的辅助物、用作整形外科(皮瓣)(例如急性治疗、慢性治疗)或用作植入心室辅助装置中的辅助物；用作血液替代物(例如用于急性失血、耶和华见证人(Jehovah′s Witness)、难以交配的患者、稀有血型、镰刀状再生障碍危象、镰刀形红细胞贫血病围手术期管理、急性溶血性贫血(自体免疫)、急性溶血性贫血(毒素)或其它难治性贫血)、心脏保护剂、冷冻保护剂、血液透析辅助物、肿瘤学试剂(例如放射线疗法或化学疗法的辅助物，实性肿瘤)、器官防腐剂(例如离体、在供体内、在接受者内)、性能增强剂(例如平民/运动员、军队)手术辅助物(例如心肺分流术(预充)、心肺分流术(调节)、肺缺血、手术前适应、破裂性主动脉瘤、胸主动脉(解剖或动脉瘤)的替换)或伤口愈合剂；用于成像(x射线或磁共振成象(MRI))；用于改善肺功能(例如急性肺损伤、慢性肺损伤、暂时性病毒性肺炎、新生儿窘迫综合症)；或其组合。此类用途包括向有需要的受试者施用缀合物或组合物。
另外，本发明的血红蛋白和组合物可用于治疗非外伤性出血性休克、入院前外伤、外伤性出血性休克、急性肺损伤、成人呼吸窘迫综合症、外伤性脑损伤、中风、实性肿瘤癌症、器官退化(离体)、器官退化(在接受者中)、严重败血病/败血性休克、心肌梗塞/心脏缺血、心源性休克、急性心脏衰竭、肺栓塞、通过手术治疗的各种病状(例如血管成形术的辅助物、胸廓主动脉修复的辅助物、心肺分流术的辅助物、心肺分流术的预充溶液(priming solution))或其组合。
本发明的血红蛋白和组合物适用的许多临床环境包括以下环境：
外伤。全血的急剧损失可使得流体从胞间隙和细胞内间隙转移以替换丢失体积的血液，同时使血液分流远离所述皮肤和内脏的低优先级器官。使血液分流远离器官并且有时消除这些器官中的O2水平并且产生进行性组织死亡。主要目标是氧合受影响的组织。此外伤可以是入院前的或可产生外伤性出血性休克或外伤性脑损伤。
缺血。缀合物和其组合物还可以用于将氧、CO和/或NO递送至红血细胞或许多其它氧治疗剂不能穿透的区域。这些区域可包括位于红血球流的阻塞的下游的任何组织区域，诸如血栓、镰刀形红细胞阻塞、动脉阻塞、血管成形术球囊、手术仪器以及遭受氧饥饿或缺氧的任何组织的下游区域。可治疗所有类型的组织缺血，包括例如中风、正在显现的中风、暂时性缺血性发作、心肌顿抑和冬眠、急性或非稳定性绞痛、正在显现的绞痛、梗塞等。具体地说，产生缺血的病状包括急性心脏衰竭、心源性休克、心肌梗塞/心脏缺血、中风、肺栓塞、非外伤性出血性休克或脑血管损伤。
血液稀释。在此应用中，施用治疗剂以替换(或取代)所去除的自体血液的O2水平。这允许在手术期间和之后使用所去除的自体血液来进行必要的输血。需要操作前血液去除的一种此类手术是心肺分流术程序。
败血病/败血性休克。在败血病中，尽管大量流体治疗和用血管收缩剂治疗，一些患者仍可变得具有高血压。在此情况下，过量产生氧化氮(NO)产生更低血压。因此，血红蛋白是用于治疗这些患者的理想药剂，因为血红蛋白以高亲合力结合NO。
缺氧症。当患者具有由肺炎或胰腺炎引起的急性肺损伤时，可观察到低氧血并且可通过提供本发明的血红蛋白或组合物以氧合所影响组织来减轻。
癌症。将O2递送至实性肿瘤团块的缺氧内核使其对放射线疗法和化学疗法的敏感性增加。因为肿瘤的微血管系统不同于其它组织，所以通过增加O2水平进行敏化需要缺氧核心内不加载O2。换言之，P50应非常低以防止O2的早期加载，从而增加O2水平，以确保肿瘤对后续放射线和化学疗法治疗的最佳敏化。
手术。本发明的血红蛋白和组合物可在各种手术程序期间使用。举例来说，其可在心肺分流术程序期间用作血管成形术、胸廓主动脉修复的辅助物或作为心肺预充溶液。
器官灌流。在器官离体或在器官捐赠接受者中维持的时间期间，维持O2含量有助于保存结构和细胞完整性并且使梗塞形成最大化。血红蛋白和组合物可持续这种器官的需氧量。
血红蛋白和其组合物还可以用于非人类，诸如家庭动物(例如家畜和伴侣动物，诸如犬、猫、马、鸟、爬行动物)。预期本发明可用于罹患归因于损伤、溶血性贫血等的失血的家庭动物和野生动物的紧急治疗。兽医学用途包括治疗由以下原因造成的失血：损伤、溶血性贫血、感染性贫血、细菌感染、因子IV破碎、脾功能亢进和脾肿大、家禽的出血性综合症、发育不全性贫血、再生障碍性贫血、突发性免疫溶血性病状、铁缺乏、同族免疫溶血性贫血、微血管病性溶血性贫血、寄生或手术麻醉诱导的脑损伤。
定义
除非另外指出，否则当本公开中使用术语“一个(种)”、“一(a或an)”时，其意指“至少一个(种)”或“一个或多个(一种或多种)”。
如本文所用的“活化的聚环氧烷”或“活化的PAO”是指具有至少一个官能团的PAO分子。官能团是与所要与PAO缀合的分子上的自由胺、巯基或羧基相互作用的反应性部分。举例来说，一种与自由巯基反应的此类官能团是马来酰亚胺基。与自由胺反应的官能团是琥珀酰亚胺基。
“脱氧血红蛋白”或“未配位血红蛋白”意指无外源性配体与血红素结合的任何血红蛋白。
“血红蛋白”或“Hb”通常是指转运氧的血红素蛋白。在人类中，各Hb分子具有4个亚基，2个α链亚基和2个β链亚基，其以四聚体结构排列。各亚基还含有一个血红素基团，其是以亚铁(Fe2+)形式结合配体O2、NO或CO的含铁中心。因此，各Hb分子可结合到4种配体分子上，分别形成HbO2、HbNO或HbCO配位化合物。另外，血红蛋白可与O2、NO以及CO的混合物配位。
“基于血红蛋白的氧载体”(HBOC)是指携带氧但还适用于携带其它分子气体(诸如一氧化碳和氧化氮)的血红蛋白。
“高氧亲和力”是指血红蛋白已被修饰以展现大于无基质血红蛋白(SFH)的氧亲和力。因此，“高氧亲和力”Hb的P50小于SFH的P50，SFH的P50如在37℃和pH 7.4下所测量是15mmHg。
“配位血红蛋白”意指外源性配体结合于血红素的血红蛋白。常见优选配体包括氧、一氧化碳以及氧化氮。
“MalPEG”是指马来酰亚胺基聚乙二醇，并且包括经由接头与聚乙二醇连接的马来酰亚胺基部分。
“MalPEG-Hb”是指已缀合马来酰亚胺基活化的PEG的Hb。缀合是通过使MalPEG与Hb上的硫醇基(并且在更低程度上与氨基)反应以形成MalPEG-Hb来进行。硫醇基可见于存在于Hb的氨基酸序列中的半胱氨酸残基中，诸如在βCys 93处的两个固有硫醇，并且还可以通过修饰表面氨基以含有硫醇基来引入。称为MP4(Sangart，Inc.)的示例性MalPEG-Hb具有以下分子式：
其中Hb是血红蛋白；S是血红蛋白上的硫醇基；n是5,000道尔顿聚环氧烷聚合物的氧化乙烯单元的数目；并且m是缀合至血红蛋白的马来酰亚胺基活化的聚环氧烷聚合物的平均数目并且是7-8。
“高铁血红蛋白”或“metHb”是指含有呈三价铁状态的铁的Hb的氧化形式。MetHb不充当氧或CO载体。如本文所用的术语“高铁血红蛋白％”是指氧化Hb与总Hb的百分比。
“甲氧基-PEG”或“mPEG-OH”是指羟基端的氢用甲基(-CH3)置换的PEG。
“修饰型血红蛋白”或“修饰型Hb”是指已通过化学反应(诸如分子内和分子间交联、聚合、缀合和/或重组技术)改变以使得Hb不再呈其“天然”状态的Hb。除非另外指出，否则如本文所用，术语“血红蛋白”或“Hb”是指天然未修饰Hb和修饰型Hb。
“亚硝酸盐还原酶活性”或“NRA”是血红蛋白或基于血红蛋白的蛋白质将亚硝酸盐还原为氧化氮的能力。“最大亚硝酸盐还原酶活性”是血红蛋白或基于血红蛋白的蛋白质能够将亚硝酸盐还原为氧化氮的最大速率。“初始亚硝酸盐还原酶活性”是当添加亚硝酸盐到完全脱氧的蛋白质中时，血红蛋白或基于血红蛋白的蛋白质将亚硝酸盐还原为氧化氮的初始速率。
术语“非氧合”意指血红素蛋白或血红蛋白呈非配位脱氧状态，或其与除O2以外的气体(诸如NO或CO)配位。
“氧亲和力”是指氧载体(诸如Hb)结合分子氧的亲合力。此特征通过氧平衡曲线来确定，所述氧平衡曲线将Hb分子的氧饱和度(Y轴)与氧分压(X轴)相联系。此曲线的位置由“P50”值表示，P50是使氧载体用氧半饱和时的氧分压，并且与氧亲和力逆相关。因此，P50越低，氧亲和力越高。全血(以及全血的组分，诸如红血球和Hb)的氧亲和力可通过本领域中已知的各种方法来测量。(参见例如Winslow，R.M.等，J.Biol.Chem.1977，252：2331-37)。氧亲和力还可以使用市售HEMOXTM分析器(TCS Scientific Corporation，New Hope，PA)来确定。(参见例如Vandegriff和Shrager，“Methods in Enzymology”(Everse等，编著)232：460(1994))；以及Vandegriff等，Anal.Biochem.256(1)：107-116(1998))。
如本文所用的术语“氧治疗剂”是指能够结合于分子氧并且将其携带至有需要的细胞/组织/器官中的血红素蛋白。当以CO配位或NO配位血红素蛋白形式施用时，一旦CO或NO从血红素部分释放，血红素基团就自由结合于分子氧并且携带分子氧。
“聚乙二醇”或“PEG”是指具有化学通式H(OCH2CH2)nOH的聚合物，其中“n”大于或等于4，优选地是约45至约500，更优选地约70至约250，并且最优选地约90至约140，或是约115。聚合物可以是取代或未取代的，并且末端羟基可用不同常规末端基团(诸如甲氧基或羧基)置换。PEG可商购自许多来源(例如CarbowaxTM(Dow Chemical，Midland，MI)、(Arch Chemicals，Norwalk，CT)以及Solbase)。
“聚乙二醇缀合血红蛋白”、“PEG-Hb缀合物”或“PEG-Hb”是指共价连接至少一种PEG的Hb。
“溶液”是指液体混合物并且术语“水溶液”是指含有一些水并且还可以与水一起含有一种或多种其它液体物质以形成多组分溶液的溶液。
“无基质血红蛋白”或“SFH”是指已去除红血球膜的Hb。
“表面修饰血红蛋白”是指已连接化学基团(通常是聚合物)(诸如右旋糖酐或聚环氧烷)的血红蛋白。术语“表面修饰氧合血红蛋白”是指当表面被修饰时呈“R”态的Hb。
“末端活性”是用能够与血红素蛋白或血红蛋白的活性基团反应的部分官能化的PAO的百分比的指示。“100％末端活性”指示用于缀合反应的PAO的摩尔过量是以所有PAO均具有能够与血红素蛋白或血红蛋白的活性基团反应的部分为基础来表示的。举例来说，如果可用的Mal-PEG具有80％末端活性以使得80％的PEG用Mal官能化，并且以相对于血红蛋白20倍摩尔过量使用Mal-PEG，那么基于100％末端活性此摩尔比可表示为Mal-PEG相对于血红蛋白16倍摩尔过量。
“硫醇化”是指使分子上巯基的数目增加的方法。举例来说，使蛋白质与2-亚氨基硫杂环戊烷(“2-IT”)反应使得蛋白质表面上的自由胺转化为巯基。这些巯基接着可用于与硫醇反应性部分(诸如马来酰亚胺)反应。
“未配位血红蛋白”是指含有至少一个未与分子气体(诸如氧、一氧化碳或氧化氮)配位的血红素部分的任何血红蛋白。因此，只要血红素部分中的一者未与分子气体配位，就认为血红蛋白“未配位”。
本说明书中所引用的所有出版物、专利以及专利申请以引用的方式并入本文中用于本文所具体引用的主题，如同各个这些出版物、专利或专利申请具体并且个别地被指示以引用的方式并入本文中一般。
已详细描述本发明，将显而易见的是改进和改变是可能的，而不会脱离本发明在随附权利要求中所界定的范围。
实施例
提供以下非限制性实施例以进一步说明本发明。
实施例1：聚乙二醇化ββ-DBBF交联血红蛋白缀合物的制备
压积红血球(“RBC”)获自商业来源，诸如当地血库、纽约血液中心(New York Blood Center)或美国红十字会(American Red Cross)。从采集时起获得材料不超过45天。在使用之前对所有单元关于病毒感染进行筛检并且进行核酸测试。通过膜滤法对非白细胞耗尽汇集单位进行白细胞耗尽以去除白血球。使压积RBC汇集到无菌容器中并且在2-15℃下储存直到进一步处理。记录体积，并且使用市售联合血氧计(co-oximeter)或其它领域认可的方法测定Hb浓度。
使用0.45μm切向流过滤用六体积的0.9％氯化钠洗涤RBC，随后通过降低盐的浓度进行细胞溶解。使用相同膜进行Hb提取。通过用于白蛋白的分光光度分析对细胞洗涤物进行分析，以检验血浆组分的去除。在寒冷条件下通过0.16μm膜处理溶解产物以纯化Hb。在无菌去热原条件下收集纯化Hb并且接着进行超滤以去除病毒。可进行其它减少病毒步骤，包括溶剂/去垢剂处理、纳米过滤以及阴离子Q膜纯化。此过程中的所有步骤均在2-15℃下进行。
使用30-kD膜将Hb从溶解产物交换进入林格氏乳酸盐(Ringer′slactate，RL)或磷酸盐缓冲盐水(“PBS”，pH 7.4)。将Hb浓缩至1.1-1.5mM(按四聚体)。使用10到12体积的RL或PBS进行溶剂交换。此过程在2-15℃下进行。在硫醇化之前将在RL或PBS中制备的溶液的pH值调节至8.0。将Hb通过0.45或0.2μm一次性过滤囊进行无菌过滤并且在进行化学修饰反应之前在4±2℃下储存。
交联：如先前由Walder等，Biochemistry，1979；18(20)：4265-70所描述通过由压积红细胞制备的无基质血红蛋白(SFH)与双(3，5-二溴水杨基)富马酸酯(DBBF)的反应来制备ββ-DBBF交联Hb。在约2-8℃下，使于硼酸盐缓冲剂(pH值～8.5)中的氧合SFH与两倍摩尔过量的DBBF反应约16小时。
硫醇化：使用如上文所描述制备的SFH，使用相对于Hb 15倍摩尔过量的2-亚氨基硫杂环戊烷(2-IT)进行硫醇化。将比率和反应时间最佳化，以使用于PEG缀合的硫醇基的数目最大化并且使产物异质性减到最低。将于RL(pH 7.0-8.5)、PBS或任何类似缓冲剂中的约1mM Hb(四聚体)与于相同缓冲剂中的15mM 2-IT组合。在10±5℃下连续搅拌此混合物约6小时。
在硫醇化之前和之后及然后再在Hb-PEG缀合之后，使用二硫吡啶比色分析(Ampulski，R.S.等，Biochem.Biophys.Acta 1969，32：163-169)测量在Hb四聚体表面上可用的硫醇基的数目。人Hb在β93半胱氨酸残基处含有两个固有反应性硫醇基，这通过二硫吡啶反应得以证实。SFH以1：＜8(SFH：2-IT)硫醇化之后，反应性硫醇基的数目从两个增加到大于七个硫醇。
PEG缀合：使用基于100％末端活性相对于起始四聚体Hb浓度28倍摩尔过量的MalPEG将MalPEG缀合至硫醇化ββ-DBBF交联Hb。首先使Hb与大气平衡以氧合Hb。将于RL(pH 7.0-8.5)、PBS或任何类似缓冲剂中的约1mM硫醇化Hb与于相同缓冲剂中的28mM MalPEG组合。在10±5℃下连续搅拌此混合物约6小时。
将所得PEG-Hb缀合物通过70-kD膜(即＜0体积过滤)进行处理以去除未反应试剂。通过尺寸排阻液相色谱(“LC”)在540nm和217nm下对此过程进行监测。将浓度调节到4.4g/dl Hb并且将pH值调节到6.0-7.8。
将PEG-Hb缀合物使用0.2μm一次性无菌囊进行无菌过滤并且在4±2℃下收集到无菌去热原容器中。将PEG-Hb缀合物稀释到4.4g/dl RL并且将pH值调节到7.4±0.2pH值并且接着无菌过滤(0.2μm)并且等分到无内毒素无菌容器中。
最终聚乙二醇化ββ-DBBF交联血红蛋白缀合物(“PEG-ββ-Hb”)的性质显示于表3中：
表3：PEG-ββ-Hb的性质
性质 值
Hb浓度(g/dL) 4.4
pH 7.4
聚乙二醇化的程度 7.6
COP(mm Hg) 85
P50mm Hg 2.6
希尔数(n值) 1.05
经由标准方法论进一步证实PEG-ββ-Hb的结构。尺寸排阻色谱法证实DBBF交联的存在(图1和2)。逆相高效液相色谱法证实血红蛋白的β球蛋白亚基的DBBF交联的存在(图3)。ββ-DBBF Hb的聚乙二醇化是使用尺寸排阻色谱法证实(图4)。
实施例2：由PEG-ββ-Hb展现增强的亚硝酸盐还原酶活性
出于比较的目的，使来自实施例1的脱氧聚乙二醇化ββ-DBBF交联血红蛋白和其它血红蛋白物质于密封透明小容器中在连二亚硫酸钠存在下厌氧地与亚硝酸钠反应。使用相对于血红素十倍过量的亚硝酸盐，并且以分光光度法监测反应。使用脱氧血红蛋白、铁-亚硝酰基-血红蛋白以及高铁血红蛋白的母体光谱对所得光谱数据进行去卷积。所述速率是曲线作为所述衍生物的所述失踪的脱氧血红蛋白以及所述最大速率用于比较目的。
SFH和聚乙二醇化ββ-DBBF交联血红蛋白分别以0.0215μM/s和0.462μM/s的最大速率将亚硝酸盐还原为NO，表明与SFH相比聚乙二醇化ββ-DBBF交联血红蛋白的最大速率高为21倍。
参考图5，测定了若干类型的修饰型Hb的亚硝酸盐还原酶活性，包括马来酰亚胺缀合非交联血红蛋白，其在Hbβ93Cys处反应以降低P50。所测试的马来酰亚胺包括小分子N-乙基马来酰亚胺(NEM)和MP4(Sangart，Inc.)以及表4中指定的其它血红蛋白。
表4：修饰型血红蛋白的性质
Hb 缀合化学 每四聚体的取代度 P50(氧亲和力)
SFH N/A - 16
MP4OX 马来酰亚胺 8(PEG 5K) 4
P5K2 马来酰亚胺 2(PEG 5K) 8
P5K4 马来酰亚胺 4(PEG 5K) 5
NEM2 马来酰亚胺 2(NEM) 9
NEM8 马来酰亚胺 8(NEM) 5
SVA-PEG-Hb 琥珀酰亚胺 未测试 7
αα-Hb DBBF - 33
即-Hb DBBF - 8
PEG-αα-Hb DBBF/马来酰亚胺 7(PEG 5K) 9
PEG-即-Hb DBBF/马来酰亚胺 7.6(PEG 5K) 3
α或β亚基之间交联的Hb展现不同P50。P50值在3mmHg(PEG-ββ-Hb)至33mmHg(αα交联Hb)范围内。观察到P50与亚硝酸盐还原酶活性之间存在直接相关性。具有高氧亲和力(低P50)的Hb以与低亲和力Hb相比更高的速率将亚硝酸盐还原为NO。在10倍过量的亚硝酸盐情况下，亚硝酸盐还原的最大速率从0.46μM/s(PEG-ββ-Hb)变化到0.015μM/s(αα交联Hb)。通过此反应产生的NO可逃脱血红素捕获并且从Hb释放，并且NO释放速率与亚硝酸盐还原酶活性有关。总而言之，这些结果表明氧亲和力在无细胞Hb设计中是重要的，不仅增强血红蛋白配体的递送，而且使亚硝酸盐还原酶活性最大化。
当引入本发明的元素或其优选实施方案时，冠词“一(a/an)”、“该”以及“所述”旨在指存在所述元素中的一者或多者。术语“包含”、“包括”以及“具有”旨在是包括性的并且意味着可能存在除所列元素以外的其它元素。
鉴于以上内容，将可见的是本发明的若干目标得以实现并且其它有利结果得以达成。
因为在以上组合物和方法中可作出各种变化而不会脱离本发明的范围，所以以上描述中所含以及随附图式中所显示的所有内容应视为说明性的并且不具限制意义。

Claims (69)

1.一种β，β-分子内交联聚氧化烯氧化物血红蛋白缀合物，其P50如在37℃和pH 7.4下所测量在约2至5mmHg范围内，其中当在25℃下完全脱氧时所述血红蛋白缀合物展现最大亚硝酸盐还原酶活性，其比脱氧无基质血红蛋白在相同条件下测量时大为至少10倍。
2.如权利要求1所述的血红蛋白缀合物，其中所述血红蛋白缀合物当完全脱氧时展现最大亚硝酸盐还原酶活性，其比脱氧无基质血红蛋白在相同条件下测量时大为至少15倍。
3.如权利要求1所述的血红蛋白缀合物，其中所述血红蛋白缀合物当完全脱氧时展现最大亚硝酸盐还原酶活性，其比脱氧无基质血红蛋白在相同条件下测量时大为至少20倍。
4.如权利要求1所述的血红蛋白缀合物，其中所述血红蛋白缀合物当完全脱氧时展现最大亚硝酸盐还原酶活性，其比脱氧无基质血红蛋白在相同条件下测量时大为10倍至约25倍。
5.如权利要求1所述的血红蛋白缀合物，其中所述血红蛋白缀合物当完全脱氧时展现最大亚硝酸盐还原酶活性，其比脱氧无基质血红蛋白在相同条件下测量时大为约15倍至约25倍。
6.如权利要求1所述的血红蛋白缀合物，其中所述血红蛋白缀合物当完全脱氧时展现最大亚硝酸盐还原酶活性，其比脱氧无基质血红蛋白在相同条件下测量时大为10倍至约21倍。
7.如权利要求1所述的血红蛋白缀合物，其中所述血红蛋白缀合物当完全脱氧时展现最大亚硝酸盐还原酶活性，其比脱氧无基质血红蛋白在相同条件下测量时大为约15倍至约21倍。
8.一种β，β-分子内交联聚氧化烯氧化物(PAO)血红蛋白缀合物，其P50如在37℃和pH 7.4下所测量在约2.0至5.0mmHg范围内，当在25℃下完全脱氧时所述血红蛋白缀合物的最大亚硝酸盐还原酶活性是至少0.25μM/秒。
9.如权利要求8所述的血红蛋白缀合物，其中最大亚硝酸盐还原酶活性是至少约0.30μM/秒。
10.如权利要求8所述的血红蛋白缀合物，其中最大亚硝酸盐还原酶活性是至少约0.35μM/秒。
11.如权利要求8所述的血红蛋白缀合物，其中最大亚硝酸盐还原酶活性是至少约0.40μM/秒。
12.如权利要求8所述的血红蛋白缀合物，其中最大亚硝酸盐还原酶活性在0.25至约0.50μM/秒范围内。
13.如权利要求8所述的血红蛋白缀合物，其中最大亚硝酸盐还原酶活性在0.30至约0.47μM/秒范围内。
14.如权利要求1-13中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中所述血红蛋白缀合至平均约7至约11个PAO分子/四聚体。
15.如权利要求14所述的血红蛋白缀合物，其中所述血红蛋白缀合至平均约9至约10个PAO分子/四聚体。
16.如权利要求1-15中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中当所述血红蛋白呈氧合状态时所述聚环氧烷经由硫醇反应性部分共价连接至血红蛋白分子上暴露的氨基酸侧链的硫醇基。
17.如权利要求16所述的血红蛋白缀合物，其中所述聚环氧烷通过由亚烷基或亚苯基组成的接头键联至硫醇反应性部分。
18.如权利要求1-17中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中所述血红蛋白是在所述血红蛋白分子的两个β82赖氨酸残基处双(2，5-二溴水杨基)富马酸酯交联的。
19.如权利要求1-18中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中胶体渗透压是至少75mmHg。
20.如权利要求1-19中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中P50是约2至约4mmHg。
21.如权利要求20所述的血红蛋白缀合物，其中P50是约3mmHg。
22.如权利要求1-21中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中所述血红蛋白缀合物与氧配位。
23.如权利要求1-22中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中所述血红蛋白缀合物与一氧化碳配位。
24.如权利要求1-23中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中所述血红蛋白缀合物与氧化氮配位。
25.如权利要求1-24中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中所述血红蛋白缀合物是脱氧的。
26.如权利要求1-25中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中所述PAO是聚乙二醇(PEG)。
27.如权利要求26所述的血红蛋白缀合物，其中所述PEG的平均分子量是约2,000至约20,000道尔顿。
28.如权利要求26所述的血红蛋白缀合物，其中所述PEG的平均分子量是约3,000至约10,000道尔顿。
29.如权利要求26所述的血红蛋白缀合物，其中所述PEG的平均分子量是约4,000至约6,000道尔顿。
30.如权利要求29所述的血红蛋白缀合物，其中所述PEG的平均分子量是约5,000道尔顿。
31.如权利要求26-30中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中所述PEG是马来酰亚胺-PEG。
32.如权利要求31所述的血红蛋白缀合物，其中所述马来酰亚胺经由亚烷基或亚苯基接头键联至所述PEG。
33.如权利要求32所述的血红蛋白缀合物，其中所述亚烷基接头是亚乙基接头。
34.如权利要求31-33中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中所述马来酰亚胺-PEG是缀合至所述血红蛋白的硫醇部分，所述硫醇部分选自所述血红蛋白的半胱氨酸残基的固有硫醇部分、所述血红蛋白的硫醇化赖氨酸残基的硫醇部分或其组合。
35.如权利要求1-34中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中N-乙基马来酰亚胺缀合至所述血红蛋白的β93半胱氨酸残基。
36.如权利要求31-34中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中所述马来酰亚胺-PEG具有以下结构
其中：
Hb是血红蛋白，
S是所述血红蛋白的硫醇，
R3是亚烷基或亚苯基，
X是末端基团，
m是缀合至所述血红蛋白的马来酰亚胺基活化的PEG聚合物的平均数目，并且
n是平均分子量为约2,000至约20,000道尔顿的PEG的氧化乙烯单元的平均数目。
37.如权利要求36所述的血红蛋白缀合物，其中R3是亚乙基。
38.如权利要求36或37所述的血红蛋白缀合物，其中X是甲氧基或羧基。
39.如权利要求38所述的血红蛋白缀合物，其中X是甲氧基。
40.如权利要求36-39中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中n是约3,000至约10,000道尔顿。
41.如权利要求36-39中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中n是4,000至约6,000道尔顿。
42.如权利要求36-39中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中n是约5,000道尔顿。
43.如权利要求36-42中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中m是约7至约11。
44.如权利要求36-42中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中m是约9或约10。
45.一种药物组合物，其包含如权利要求1-44中任一项所述的β，β-分子内交联聚氧化烯氧化物血红蛋白缀合物和药学上可接受的载体。
46.如权利要求45所述的药物组合物，其中所述组合物在全血下处于正常胶体渗透压。
47.如权利要求45或46所述的药物组合物，其中所述组合物与血浆相比处于高胶体渗透压。
48.如权利要求45-47中任一项所述的药物组合物，其用于治疗急性肝衰竭、β地中海贫血、烧伤、慢性严重肢体缺血、二氧化碳或氰化物中毒、慢性阻塞性肺病(COPD)、充血性心脏衰竭、缺氧、疟疾、器官缺血、周围性血管疾病、卟啉症、妊娠中的先兆子痫、败血病、镰状细胞疾病、视网膜病、眼内病状、睾丸扭转、外伤、休克、外伤性脑损伤、溃疡、血管痉挛或其组合。
49.如权利要求48所述的药物组合物，其中所述器官缺血包括急性肠缺血(扭转)、急性肠缺血(栓塞)、心源性休克、急性血管器官缺血、中风、心肌梗塞或严重心脏缺血。
50.如权利要求45-47中任一项所述的药物组合物，其用于治疗非外伤性出血性休克、入院前外伤、外伤性出血性休克、急性肺损伤、成人呼吸窘迫综合症、外伤性脑损伤、中风、实性肿瘤癌症、器官退化(离体)、器官退化(在接受者体内)、严重败血病、败血性休克、心肌梗塞、心脏缺血、心源性休克、急性心脏衰竭、肺栓塞或其组合。
51.如权利要求45-47中任一项所述的药物组合物，其用作血管成形术的辅助物、作为整形外科的辅助物或作为植入心室辅助装置中的辅助物；作为血液替代物、心脏保护剂、冷冻保护剂、血液透析辅助物、肿瘤学试剂、器官防腐剂、性能增强剂、手术辅助剂或伤口愈合剂；用于成像；用于改善肺功能；或其组合。
52.如权利要求中45-47任一项所述的药物组合物，其用于对由以下原因造成的失血进行兽医学治疗：损伤、溶血性贫血、感染性贫血、细菌感染、因子IV破碎、脾功能亢进和脾肿大、家禽的出血性综合症、发育不全性贫血、再生障碍性贫血、特发性免疫溶血性病状、铁缺乏、同族免疫溶血性贫血、微血管病性溶血性贫血、寄生或手术麻醉诱导的脑损伤。
53.一种治疗方法，其包括向有需要的受试者施用如权利要求1-44中任一项所述的血红蛋白缀合物或如权利要求45-47中任一项所述的药物组合物。
54.如权利要求53所述的治疗方法，其中所述受试者是动物。
55.如权利要求53所述的治疗方法，其中所述受试者是人类。
56.如权利要求53-55中任一项所述的治疗方法，其中所述方法是用于治疗以下疾病的方法：急性肝衰竭、β地中海贫血、烧伤、慢性严重肢体缺血、二氧化碳或氰化物中毒、慢性阻塞性肺病(COPD)、充血性心脏衰竭、缺氧、疟疾、器官缺血、周围性血管疾病、卟啉症、妊娠先兆子痫、败血病、镰状细胞疾病、视网膜病、眼内病状、睾丸扭转、外伤、休克、外伤性脑损伤、溃疡、血管痉挛或其组合。
57.如权利要求56所述的治疗方法，其中所述器官缺血包括急性肠缺血(扭转)、急性肠缺血(栓塞)、心源性休克、急性血管器官缺血、中风、心肌梗塞或严重心脏缺血。
58.如权利要求53-55中任一项所述的治疗方法，其中所述方法是用于治疗以下疾病的方法：非外伤性出血性休克、入院前外伤、外伤性出血性休克、急性肺损伤、成人呼吸窘迫综合症、外伤性脑损伤、中风、实性肿瘤癌症、器官退化(离体)、器官退化(在接受者中)、严重败血病、败血性休克、心肌梗塞、心脏缺血、心源性休克、急性心脏衰竭、肺栓塞或其组合。
59.如权利要求53-55中任一项所述的治疗方法，其中所述血红蛋白四聚体或药物组合物是作为血管成形术的辅助物、作为整形外科的辅助物或作为植入心室辅助装置中的辅助物；作为血液替代物、心脏保护剂、冷冻保护剂、血液透析辅助物、肿瘤学试剂、器官防腐剂、性能增强剂、手术辅助剂或伤口愈合剂；用于成像；用于改善肺功能；或其组合形式施用。
60.如权利要求53-55中任一项所述的治疗方法，其中所述血红蛋白四聚体或药物组合物是作为血管成形术的辅助物、胸主动脉修复的辅助物、心肺分流术的辅助物或心肺分流术的预充溶液施用。
61.如权利要求53或54所述的治疗方法，其中所述受试者是非人类动物并且所述方法是用于因以下原因造成的失血的兽医学治疗的方法：损伤、溶血性贫血、感染性贫血、细菌感染、因子IV破碎、脾功能亢进和脾肿大、家禽出血性综合症、发育不全性贫血、再生障碍性贫血、特发性免疫溶血病状、铁缺乏、同族免疫溶血性贫血、微血管病性溶血性贫血、寄生或手术麻醉诱导的脑损伤。
62.一种将氧、氧化氮、一氧化碳或其混合物递送到组织中并且在微血管系统中将亚硝酸盐还原为氧化氮(N0)的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如权利要求1-44中任一项所述的β，β-分子内交联聚氧化烯氧化物血红蛋白缀合物或如权利要求45-60中任一项所述的药物组合物，其中在施用之后，在所述微血管系统中所述血红蛋白中未配位的血红素将亚硝酸盐转化为氧化氮。
63.一种制备如权利要求1-44中任一项所述的β，β-分子内交联聚氧化烯氧化物血红蛋白缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
将β，β-分子内交联血红蛋白与2-亚氨基硫杂环戊烷(2-IT)于水性稀释剂中混合以形成硫醇化血红蛋白；以及
添加PAO到于所述水性稀释剂中的所述硫醇化血红蛋白中以形成所述β，β-分子内交联聚氧化烯氧化物血红蛋白缀合物。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述2-亚氨基硫杂环戊烷以相对于蛋白质浓度约8倍与约25倍摩尔过量之间的浓度存在。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述2-亚氨基硫杂环戊烷以相对于血红蛋白浓度约15倍摩尔过量的浓度存在。
66.如权利要求63-65中任一项所述的方法，其中PAO-马来酰亚胺以相对于蛋白质浓度约10倍与约40倍摩尔过量之间的浓度存在。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述PAO-马来酰亚胺以相对于血红蛋白浓度约28倍摩尔过量的浓度存在。
68.如权利要求63-67中任一项所述的方法，其中所述硫醇化步骤是在约7至约9的pH值下进行。
69.如权利要求63-68中任一项所述的方法，其中添加所述PAO-马来酰亚胺到所述硫醇化蛋白质中以形成PAO-马来酰亚胺缀合蛋白质的步骤是在约7与约9之间的pH值下进行。
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