KR101086138B1 - 변형된 헤모글로빈 및 그의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 6개 ± 1개의 PEG쇄를 갖는 헤모글로빈 분자 (Hb)이며, 상기 PEG쇄 중 2개는 Hb의 Cys-93(β)에 결합되어 있고 나머지 PEG쇄는 Hb의 ε-NH2상에 도입된 티올기에 결합되어 있는 Hb를 제공한다. 또한, 본 발명은 (a) Hb를 8배 내지 15배 과량의 이미노티올란과 반응시켜 티올화 Hb를 형성하는 단계, 및 (b) 상기 티올화 Hb를 말레이미드 부분으로 관능화된 16배 내지 30배 과량의 PEG와 반응시켜 변형된 Hb를 형성하는 단계를 포함하는, 변형된 헤모글로빈 분자 (Hb)를 제조하는 방법을 제공한다.
헤모글로빈, Hb, 산소 친화도, 이미노티올란, PEG쇄, 티올화

Description

변형된 헤모글로빈 및 그의 제조 방법 {Modified Hemoglobin and Methods of Making Same}
관련 출원의 상호 참조
본 발명은 2002년 12월 23일자로 출원한 미국 가출원 제60/436,149호의 이점을 청구한다.
본 발명은 변형된 헤모글로빈 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
헤모글로빈 (Hb)은 적혈구의 주요 구성요소이며 산소를 폐에서부터 신체 전체로 운반한다. Hb는 적혈구 내에 함유될 때 2개의 산소가 연결된 αβ 이량체로 구성된 4량체 구조로 존재하고, 이들 각각의 분자량은 약 32 Kd이다. 각 이량체의 α 서브유닛과 β 서브유닛 각각은 단백질 쇄 및 헴 분자를 보유한다. α 단백질 쇄와 β 단백질 쇄의 서열은 공지되어 있다. Hb는 수혈에 잠재적으로 유용한 대용 혈액이며, 패혈성 쇼크시에는 산화질소를 포획하는 시약으로서, 암의 방사선 요법 동안에는 조직 산소화를 조정하기 위한 시약으로서 제안되었다. 또한, 재조합 DNA 기술에 의해서, 개개의 치료 용도에 따른 특별한 필요에 따라 조정된 산소 친화도를 갖는 변형된 Hb를 생성해 왔다.
정제된 무세포 Hb 용액 또는 분자내 가교된 Hb의 주입시에는 무세포 Hb의 혈관작용성(vasoactivity), 즉 무세포 Hb에 의한 동맥과 모세혈관의 수축이 Hb-기재의 산소 운반체를 개발하는데 있어서 주요 장애가 되어 왔다 ([Savitzsky et al. 1978], [Sloan et al. 1999], [Saxena et al. 1999]). 혈관작용성은 Hb의 NO 제거 효과(scavenging effect)로 인한 것이라고 여겨졌다 [Doharty et al. 1998]. Hb의 NO 제거 활성을 극복하기 위한 시도로서, 매우 상이한 2가지의 분자적 접근법이 진보되어 왔다. 제1 접근법은 재조합 DNA 접근법으로서, 말단 헴 포켓의 부위-특이적 돌연변이유발을 통해 Hb의 NO 결합 활성을 변형시킴으로써 Hb의 산화질소 제거 활성을 감소시키려는 시도에 이용되었다 [Eich et al, 1996]. 제2 접근법은 화학적 접근법으로서, 올리고머화를 통해 Hb의 분자 크기가 증대되고 이로 인해 Hb가 혈관 공간으로부터 간질성(間質性) 공간으로 혈관외유출되는 것이 감소되거나 또는 가능하게는 완벽하게 억제된다 ([Hess et al. 1978], [Thomas et al. 1993], [Muldoon et al. 1996], [Macdonal et al. 1994], [Furchgott 1984], [Kilbourn et al. 1994]). 그러나, 상기한 크기 증대 접근법은 Hb의 혈관작용성이 본질적으로 혈관외유출의 결과로서 매개되는 경우에만 성공할 것이다. 올리고머화로 매개되는 Hb의 크기 증대는 Hb의 혈관작용성을 조금 감소시키는 것으로 나타났지만, 재조합 DNA 기술 또는 소분자 이관능성 시약을 사용한 Hb의 올리고머화를 포함하는 크기 증대 접근법 어느 것으로도 비-승압성(non-hypertensive) Hb 용액은 생성되지 못했다. 한가지 예외는 분자 크기가 300 kDa을 훨씬 초과하고 평균 분자 반경이 24 nm인 Hb의 올리고머화 생성물 [Matheson et al. 2002]이며, 이것은 비-승압성이고 혈 관외유출되지 않는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 임상 시험 중인 현재의 올리고머화 생성물들 대개는 분자량이 200 kDa 내지 250 kDa 범위이다.
Hb의 α 및 ε-아미노기에서 Hb에 연결된 10개 카피의 PEG-5,000쇄를 운반하는 엔존 PEG화 Hb(Enzon PEGylated Hb)가 비-승압성인 것으로 입증되어, 대용 혈액 분야의 연구를 자극하였다 [Rolfs et al. 1998]. 4량체내(intra-tetramerically) 가교된 Hb, 올리고머화 Hb 및 PEG화 Hb의 NO 결합 활성 ([Winslow et al, 1998] ,[Vandegriff et al, 1997])은 이들의 '승압 효과'와 직접적인 상관관계를 보이지 않는다. 따라서, 무세포 Hb의 '승압 활성'의 감소는 제제의 NO 결합 활성 또는 제제의 분자 크기 그 어느 것과도 직접적인 상관관계가 없다고 여겨진다. 그러나, PEG화 Hb는 올리고머화 Hb에 비해 혈관작용성 수준이 상당히 더 낮은 것으로 나타났다. 10개 카피의 PEG-5,000을 운반하는 엔존의 PEG-Bv-Hb는 어떠한 '승압 효과'도 거의 나타내지 않았다. 문헌 [Vandegriff et al (1998)]은 PEG-Bv-Hb의 점도 및 삼투압이 올리고머화 Hb 샘플의 경우에 비해 높다는 것을 알아냈다. 삼투압으로부터 계산한 엔존 PEG화 Bv-Hb의 분자 반경은 올리고머화 Hb의 경우보다 상당히 크며 (15 nm), 분자 반경 계산치는 114,000 달톤이라는 분자 질량 계산치와 일치하지 않는다 [Vandegriff et. al. 1998]. 따라서, Hb는 분자 반경이 대략 15 nm가 될 때까지 그 크기가 증가되어야 하며 이것은 점도 및 삼투압에서의 상당한 증가를 수반하여 비-승압성 Hb 용액을 생성할 것이라는 가설이 있다 [Winslow 1999].
비-승압성 엔존 PEG화 Hb에서, PEG-5,000쇄는 소의 Hb PEG쇄의 α 및 ε-아미노기에 이소펩티드 결합을 통해 연결된다. PEG의 공유결합 부착은 유도체화된 아미노기의 알짜 양전하 손실을 수반한다. 최근 연구에서는, rHb1.1을 글루타르알데히드로 일관능성 변형시키면 Hb의 혈관작용성을 어느 정도까지 저하시키지만, rHb1.1의 올리고머화는 Hb의 혈관작용성을 더 높은 정도까지 감소시킨다는 것이 입증되었다. 따라서, PEG화에 의한 Hb의 혈관작용성 중화에 대한 분자적 기초를 이해하는데 있어서, Hb의 PEG화에 수반되는 Hb의 표면 전하 변형의 잠재적 역할이 고려될 필요가 있다.
PEG화로 인한 Hb의 표면 전하 변동과 비-승압성 Hb 생성 사이의 상관관계를 밝혀내기 위해서, Hb의 보존적 PEG화, 즉 Hb의 표면 전하를 변경시키지 않는 Hb의 PEG-변형과 관련한 새로운 접근법이 개발되었다 [Acharya et al. 1996]. 산화 조건하에서는 Hb의 Cys-93(β)에 대한 PEG-말레이미드의 반응성 및 선택도가 높다는 사실을 이용하여 4량체 1개 당 2개 카피의 PEG쇄를 운반하는 균일한 PEG화 Hb를 제조해 왔다. PEG-5K 또는 PEG-10K 또는 PEG-20K 각각을 2개 카피씩 운반하는 3가지의 상이한 PEG-HbA 제제가 생성되었다. Hb의 분자 용적 (유체역학적 용적), 분자 반경, 점도 및 삼투압에 있어서의 변화는 Hb에 공유결합으로 연결된 PEG의 질량과 상관관계가 있었고, 이들 분자 특성 모두가 승압 효과와 상관관계가 있었다. (PEG20K)2-Hb의 점도 및 삼투압은 비-승압성 Hb 분자인 엔존 PEG-Bv-Hb의 경우와 유사하였지만, 상기 PEG화 Hb는 혈관작용성이었다. 따라서, 상기 분자에서 단순히 점도, 삼투압 및 분자 용적 (유체역학적 용적)을 증가시키는 것만으로는 혈관작용성 문제에 대한 해결책이 달성될 수 없다.
발명의 요약
본 발명은 분자 용적이 증대되고 점도가 높고 삼투압이 높으며 O2 친화도가 높고 비-승압성인 데다가 혈관작용성 문제까지 해결하는 변형된 Hb를 제공한다. 추가로, 본 발명의 변형된 Hb는 간단하고 가변적이며 매우 효율적인 방법으로 제작할 수 있으며, 이러한 방법은 본 발명의 변형된 Hb의 제조를 비용면에서 효율적으로 만든다.
더욱 특히, 본 발명은 6개 ± 1개의 PEG쇄를 갖는 헤모글로빈 분자 (Hb)이며, 상기 PEG쇄 중 2개는 Hb의 Cys-93(β)에 결합되어 있고 나머지 PEG쇄는 Hb의 ε-NH2상에 도입된 티올기에 결합되어 있는 Hb를 제공한다.
또한, 본 발명은
(a) Hb를 8배 내지 15배 과량의 이미노티올란과 반응시켜 티올화 Hb를 형성하는 단계, 및
(b) 상기 티올화 Hb를 말레이미드 부분으로 관능화된 16배 내지 30배 과량의 PEG와 반응시켜 변형된 Hb를 형성하는 단계
를 포함하는, 변형된 헤모글로빈 분자 (Hb)를 제조하는 방법을 제공한다.
마지막으로, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 변형된 Hb 분자를 제공한다.
도 1은 이미노티올란-의존적 티올화로 매개되는 말레이미드 화학을 기재로 하여 Hb를 PEG화시키는 개략도를 제공한다. A: PEG화 반응의 제1 단계인 티올화를 단순화시킨 방식으로 도시하고, 상기 티올화 단백질에 말레이미드로 관능화된 PEG쇄를 접합시키는 것을 도시한다. 연결된 PEG쇄는 중심의 단백질 (Hb) 코어에서 돌출된 아암(arm)으로 도시되어 있다. B: 이미노티올란과 Hb의 ε-아미노기의 반응으로 γ-메르캅토 부티르이미딜 부분이 생성됨을 도시한다.
도 2는 티올화로 매개되는 PEG-말레이미드 기재의 Hb의 PEG화를 도시한다. A: Hb와 말레이도페닐 PEG-5,000의 인큐베이션시에 Hb의 크기 증대에 미치는 이미노티올란의 영향. PBS (pH 7.4) 중의 Hb (4량체0 중 0.5 mm)를 알려진 농도의 이미노티올란의 존재 또는 부재하에 10 mM 말레이도페닐 PEG-5,000과 4시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 상시 생성물을, 연속하여 연결된 2개의 수퍼로스 컬럼을 사용하는 FPLC에 의한 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 상기 컬럼을 0.5 ml/분 유속의 PBS로 용출시켰다. PEG쇄가 접합된 Hb 분자의 크기 증대를 나타내기 위한 것으로서, HbA, (PEG5K)2-Hb, (PEG10K)2-Hb 및 (PEG20K)2-Hb의 용출 위치를 표시하였다. 1: 대조군 Hb, 2: 이미노티올란의 부재하에 10 mM 말레이도페닐 PEG-5,000와 4시간 동안 인큐베이션한 HbA, 3: 1 mM 이미노티올란 (2배 과잉의 몰수) 존재하의 PEG화, 4: 2.5 mM 이미노티올란 (5배 과잉의 몰수) 존재하의 PEG화, 5: 5 mM 이미노티올란 (10배 과잉의 몰수) 존재하의 PEG화. 10배 과잉 몰수의 (Hb의 몰수에 대한 값) 이미노티올란 존재하의 Hb 티올화에 대한 역학을 삽입도 a로 나타냈다. 삽입도 b는 Hb의 티올화 정도 (인큐베이션 4시간 후)를 Hb에 대한 이미노티올 란의 과잉 몰수에 대한 함수로서 보여준다. B: PEG-말레이미드 및 링커(linker) 화학 (PEG와 말레이미드 부분 사이의 연결기)에 있어서 온도, PEG의 분자 크기가 Hb의 크기 증대에 미치는 영향. 모든 PEG화 반응은 10배 과잉 몰수의 이미노티올란 및 20배 과잉 몰수의 PEG-말레이미드를 사용하여 4시간 동안 실온에서 수행하였고 밤새 4℃에서 수행하였다. 아래에 설명한 바와 같은 크기 배제 크로마토그래피로 크기 증대를 검정하였다 - A: HbA, B: PEG 말레이미드로서 Mal-Phe-PEG-5,000을 사용하여 실온에서 반응시킴, C: Mal-Phe-PEG-10,000을 사용하여 B에서와 같이 반응시킴, D: B에서와 같이 반응시키되, 4℃에서 밤새 수행함, E: D에서와 같이 반응시키되, PEG-말레이미드로서 말레이미도 에틸 PEG-5,000을 사용함.
도 3은 액타 익스플로러(Acta explorer)를 사용하는 크기 배제 크로마토그래피에 의한 (PEG5K)6-Hb의 정제를 도시한다. 정제용 규모의 실험을 180 mg의 로딩량(loading)으로 수행하였다. 용출은 PBS를 사용하여 분석용 규모의 실험으로 수행하였다 (도 2). PEG화는 10배 과잉 몰수의 이미노티올란 및 20배 과잉 몰수의 Mal-Phe-PEG-5,000을 사용하여 4℃에서 수행하였다. 삽입도는 정제된 (PEG5K)6-Hb의 분자 크기를 다른 PEG화 Hb의 분자 크기 및 비스-말레이도페닐 PEG-600을 사용하여 4량체간(inter-tetramerically) 가교시킨 αα-푸마릴 Hb (분자내 가교된 Hb)의 분자 크기와 비교한다. 상기 샘플은 4량체, 8량체, 12량체 및 16량체 형태의 αα-푸마릴 Hb의 위치 표시를 보조한다 - 1: 4량체간 가교된 αα-푸마릴 Hb, 2: 수퍼로스-12 정제용 컬럼으로 정제한 (PEG5K)6-Hb, 3: 엔존 PEG화 Hb인 (PEG5K)10- Hb, 4: 아펙스 바이오사이언시스(APEX Biosciences)의 PEG화 Hb 샘플인 (PEG3K)10-Hb.
도 4는 (PEG5K)6-Hb의 NMR 스펙트럼을 도시한다.
도 5는 PEG화 Hb의 점도를 단백질 농도에 대한 함수로서 도시한다. 백색 원은 (PEG5K)6-Hb를 나타내고, 흑색 마름모는 엔존 PEG화 Hb를 나타내며, 백색 삼각형은 (PEG5K)2-Hb를 나타낸다.
도 6은 (PEG5K)6-Hb의 콜로이드 삼투압을 단백질 농도에 대한 함수로서 도시한다. 백색 삼각형은 (PEG5K)2-Hb를 나타내고, 백색 원은 (PEG5K)6-Hb를 나타내며, 흑색 원은 재투석하여 샘플에 어떠한 유리 PEG 시약도 없음이 확실한 (PEG5K)6-Hb를 나타낸다. 흑색 마름모는 엔존 PEG화 Hb를 나타낸다. 엔존 PEG-Hb 및 (PEG5K)6-Hb의 콜로이드 삼투압은 유사함에 주목한다.
도 7은 (PEG5K)6-Hb의 혈관작용성을 도시한다 - A: 햄스터에게 4 g％의 (PEG5K)6-Hb를 10％ 과잉 부하(top load)로 주입한 후에 상기 동물에서의 평균 동맥압, B: 상기 동물에게 (PEG5K)2-Hb 및 (PEG5K)6-Hb를 10％ 과잉 부하로 주입한 후에 시간에 대한 함수로서 나타낸 소동맥 직경.
도 8은 햄스터를 (PEG5K)6-Hb, αα-푸마릴 Hb로 50％ 교환 수혈한 후에 상기 동물에서의 기능적 모세혈관 밀도를 대조군과 비교한 것이다. (PEG5K)6-Hb로 교환 수혈된 동물에서의 동맥 직경은 대조군 샘플에서의 동맥 직경과 유사하지만, αα-푸마릴 Hb로 50％ 교환 수혈된 동물은 대조군의 동맥 직경보다 더 좁다는 것에 주목한다. 또한, 상기 2종의 샘플을 사용한 교환 수혈의 경우에서 모세혈관의 밀도차에도 주목한다.
달리 언급하지 않는 한, "Hb"는 본원에서 사용된 바와 같이 인간 및 포유동물 공급원 (예를 들어 소 Hb, 돼지 Hb)의 헤모글로빈, 재조합 Hb 및 산소 친화도 및(또는) 자가산화도가 증가되거나 감소되도록 변형된 Hb (단리된 Hb 또는 재조합 Hb)를 포함한다. 추가로, Hb는 예를 들어 Cys-93(β)에서 비스-말레이도페닐 PEG (PEG쇄의 분자량이 2000 내지 10,000 달톤인 이관능성 시약)를 사용하여 가교된 Hb, αα-푸마릴 Hb 또는 ββ-푸마릴 Hb 또는 ββ-수바릴 HbA 등을 비롯하여 분자내 가교결합된 Hb (단리된 Hb 또는 재조합 Hb)를 포함할 수 있다.
본 발명에서, Hb는 6개 ± 1개의 PEG쇄를 보유하거나 운반하고, 상기 PEG쇄 중 2개는 Hb의 Cys-93(β)에 결합되어 있고 나머지는 Hb의 ε-NH2에 도입된 티올기에 결합되어 있다. 티올기는 Hb의 γ-메르캅토 부티르아미딘화된 ε-NH2와 결합되는 것이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 각 PEG쇄의 분자량은 3,000 내지 10,000 달톤, 더욱 바람직하게는 약 5,000 달톤이다. 또한, PEG쇄는 숙신이미딜 연결기를 통해 Hb에 연결되는 것도 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 Hb 분자는 비-승압성이기도 하다.
본 발명의 Hb 분자는 Hb를 8배 내지 15배 과량의 이미노티올란과 반응시켜 티올화 Hb를 형성한 후에 상기 티올화 Hb를 말레이미드 부분으로 관능화된 16배 내지 30배 과량의 PEG와 반응시켜 변형된 Hb를 형성함으로써 제조된다. 바람직한 실시양태에서는 단계 (a)에서 Hb를 9배 내지 12배 과량의 이미노티올란과 반응시키고, 티올화 Hb는 말레이미드 부분으로 관능화된 18배 내지 22배 과량의 PEG와 반응시키는 것이 바람직하다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 단계 (a)에서는 Hb를 약 10배 과량의 이미노티올란과 반응시키고, 단계 (b)에서는 상기 티올화 Hb를 말레이미드 부분으로 관능화된 약 20배 과량의 PEG와 반응시킨다. 또한, Hb의 티올화 및 티올화 Hb의 PEG-변형은 동시에 수행할 수도 있고 2-단계 방법으로 수행할 수도 있으며, 둘다 본 발명의 범위에 속한다. 상기 방법에 사용되는 PEG의 분자량과 관련하여, PEG의 분자량은 바람직하게는 3,000 내지 10,000 달톤이고, 더욱 바람직하게는 약 5,000 달톤이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 상기 방법으로 생성되는 변형된 Hb는 비-승압성이다.
본 발명의 방법에서, 변형된 Hb는 여러개의 산화 형태 특이적 반응성 티올기를 운반하는 포유동물 Hb (개 Hb, 고양이 Hb, 닭 Hb, 마우스 Hb) 또는 α쇄 및 β쇄에서 원하는 위치에 추가의 반응성 시스테인을 보유하는 재조합 인간 Hb로부터 로부터 직접 제조될 수 있고, 이들 Hb에 말레이미드 부분으로 관능화된 과량의 PEG를 처리하여 변형된 Hb를 생성한다.
상기 방법과 관련된 화학은 도 1A 및 도 1B에 개략적으로 나타냈다. 이미노티올란은 유리 티올기를 운반하지 않으며 이것이 일단 ε-아미노기와 반응하면 티올기가 계내(in situ) 생성된다. 유도체화된 ε-아미노기 (아미딘)은 이 관능기의 고유 양전하를 보유한다 (도 1B). 따라서, Hb를 티올화 시약 및 PEG-말레이미드와 함께 인큐베이션하여 PEG화 Hb를 생성할 수 있으며, 이때 티올화 시약이 PEG-말레이미드 시약을 소모해 버릴 위험이 없다. PEG화의 수준은 티올화 (이미노티올란과 Hb의 반응) 수준으로 결정된다. 티올화 수준은 1차적으로 이미노티올란의 농도 및 주어진 형태적 상태의 Hb의 ε-아미노기가 이미노티올란에 의한 아미딘화에 대하여 갖는 반응성에 대한 함수이다.
PEG화 반응은 말레이미드 중 PEG의 분자 크기 및 PEG-말레이미드에서 말레이미드와 PEG쇄 사이의 링커 화학 모두에 독립적이라는 점에서 가변적이다. 상기 접근법을 이용하여 Hb의 티올화 수준 및(또는) PEG-말레이미드 중 PEG의 분자 질량을 변경시킴으로써, Hb의 분자 용적 (크기)을 임의의 원하는 수준까지 증대시킬 수 있다. 보존적 PEG화 기술이 최적화되어, 산소 친화도가 높은 크기-증대된 PEG화 Hb를 여러가지로 생성하였다. 본 발명의 변형된 Hb는 알짜 전하 및 유체역학적 용적 둘다의 측면에서 분자 균일성의 정도가 높은 것으로 나타났고, 이때의 유체역학적 용적은 분자량이 약 250,000 달톤인 구형(求刑) 단백질의 것에 상응한다. 비-승압성 PEG화 Hb에 대한 어떠한 디자인일 지라도 더 적은 질량의 PEG쇄를 더 많은 수로 사용하여 Hb의 분자 표면을 더 많이 차폐시키려는 시도가 이루어져야 한다고 여겨진다.
본 발명은 하기하는 비제한적인 실시예를 참조로 할 때 더욱 잘 이해될 수 있다. 하기하는 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 더욱 충분하게 예시하기 위해 제시된 것이며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주해서는 않된다.
실시예 1
I. 재료 및 방법
헤모글로빈: 앞서 기재한 문헌 [Acharya et al. 1983]에 기재된 바와 같이, 인간 HbA를 적혈구 용해물로부터 정제하였다.
말레이도페닐 폴리에틸렌 글리콜 (Mal-Phe-PEG) 시약의 합성: PEG-5,000 및 PEG-10,000의 일관능성 말레이도페닐 유도체는 문헌 [Acharya, et al. 1996]의 절차에 따라 합성하였다. 말레이도에틸 PEG-5,000은 미국 알라바마주 헌트스빌에 소재하는 쉐어워터스(Shearwaters)로부터 구입하였다.
HbA와 Mal-Phe-PEG 시약의 반응: PBS (pH 7.4) 중의 헤모글로빈 A (0.5 mM)을 10배 과잉 몰수의 Mal-Phe-PEG-5,000과 4℃에서 반응시켰다. PEG에 의한 HbA의 변형을 역상 고압 액체 크로마토그래피 (RPHPLC) 및 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로 모니터링하였다. 상기 반응 생성물을 50 mM Tris-아세테이트 완충액 (pH 8.5)에 대해 투석하고, 이온 크로마토그래피로 정제하였다. PEG화 Hb를 아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences)의 Q-세파로스(Q-Sepharose) 고성능 수지상에서 AKTA 익스플로러 10 단백질 정제 시스템을 이용하여 이온 크로마토그래피로 정제하였다. Q-세파로스 고성능 컬럼 (2.6 cm×62 cm)을 50 mM Tris-아세테이트 완충액 (pH 8.5)으로 평형화하고, 50 mM Tris-아세테이트 (pH 8.5) 및 50 mM Tris-아세테이트 (pH 7.0)로 구성된 선형 감소 pH 구배를 컬럼 용적의 8배 초과로 사용하여 단백질을 용출시켰다. 컬럼 용출물을 240 nm 및 540 nm에서 모니터링하였다.
산소 친화도 측정: 37℃에서 PBS (pH 7.4) 중에 Hem-O-Scan (아민코(Aminco))를 사용하여 1 mM의 헤모글로빈 4량체 농도로 산소 평형 곡선을 작성하였다.
점도 측정: PEG화 Hb의 점도는 PBS 완충액 (pH 7.4) 중 4 g/dL의 단백질 농도로 37℃에서 레오미터(Rheometer)로 측정하였다. 상기 장치를 탈이온수로 보정한 후에 Hb 샘플의 점도를 측정하였다.
콜로이드 삼투압 측정: PEG화 헤모글로빈의 콜로이드 삼투압은 웨스코(Wescor) 4420 콜로이드 삼투압계를 사용하여 측정하였다. 모든 측정은 실온에서 PBS (pH 7.4) 중 2 g/dL 헤모글로빈 샘플을 이용하여 행하였다. 30 kDa 컷-오프(cut-off)의 막을 사용하였다. 상기 장치를 오스모콜(Osmocoll) 참조용 표준 물질로 시험한 후에 샘플에 대한 측정을 실시하였다.
PEG화 Hb의 RPHPLC 분석: 다양한 PEG화 Hb의 글로빈 쇄를 앞서 기재한 방법에 따라 RPHPLC로 분석하였다. 간략하게 말하자면, 비닥(Vydac) C4 (4.6×250 mm) 컬럼에서 0.1％ TFA를 함유하는 35％ 내지 50％ 아세토니트릴의 선형 구배를 사용하여 100분 동안 분리하였다. 컬럼 용출물을 210 nm에서 모니터링하였다.
PEG화 Hb의 혈관작용성: 본질적으로는 앞서 기재한 문헌 ([Mirhashemi et al. 1988], [Tsai et al. 1996])의 절차에 따라, 햄스터 피부 폴드 윈도우(fold window) 미소순환 모델에서 조사하였다. 연구는 55 g 내지 70 g 체중의 수컷 골든 시리안 햄스터(Golden Syrian Hamster) (미국 챨스 리버스(Charles Rivers))에 대해 수행하였다. 모든 동물 연구는 미국 샌디에고에 소재하는 캘리포니아 대학의 동물 실험 위원회(Animal Subject Committee)의 승인을 받았으며, 실험 동물의 사육 및 사용에 대해서는 NIH 지침 [NIH publication #85-23 Rev. 1985]을 준수하였다.
각각의 동물은 그 자신의 기저 수준으로 기능하였다. 상기 동물에게 경정맥 카테터를 통해 미세주입 펌프 (CMA 100 마이크로인젝션 펌프(CMA 100 Microinjection Pump), 스웨덴 CMA)로 10％ 과다혈액량을 0.20 ml/분의 속도로 주입하였다. 주입 직후 및 주입한 지 30분 후에 혈압, 소동맥 직경 및 기능적 모세혈관 밀도를 측정하였다.
이미노티올란에 의한 Hb 티올화의 역학: 이미노티올란에 의한 Hb의 아미딘화 후에는 티올화 정도를 추정할 수 있다. 소정량의 이미노티올란과 주어진 시간 동안 인큐베이션한 Hb 샘플 중 티올기의 수는, 문헌 [Ampuslki (1969)]에 기재된 바와 같이 디티오피리딘을 사용하여 추정한다. 4,4'-디티오피리딘 [4-PDS, MW = 220.32, 알드리치 케미칼 컴파니(Aldrich Chemical Co.))을 PBS 중에 최종 농도 3 mM (또는, 원한다면 그 이상의 농도)로 용해하여, 상기 시약의 스톡(stock) 용액을 제조하였다. 이미노티올란과 인큐베이션한 Hb의 분취액을 디티오피리딘과 인큐베이션했고, 상기 단백질상에 존재하는 반응성 술피드릴기의 수는 4-PDS를 324 nm ( ε324 = 1.98×10-4 M-1cm-1)에서 모니터링할 수 있는 4-티오피리돈 (4-TP)으로 전환시킴으로써 추정하였다.
이미노티올란-의존적 티올화로 매개되는 PEG-말레이미드 기재의 HbA의 보존적 PEG화: 인산염 완충 염수 (PBS) 중 HbA (0.5 mM 4량체)를 원하는 수준의 과잉 몰수의 이미노티올란 (바이오어피니티 시스템(BioAffinity System))과 4℃ (또는 실온)에서 이미노티올란에 대하여 2배 과잉 몰수의 PEG-5,000의 메일드(Mailed) 페닐 카르바메이트 (바이오어피니티 시스템) 또는 메일드 에틸 PEG-5,000 (쉐어워터스) 또는 PEG-1000의 메일드 페닐 카르바메이트의 존재하에서 원하는 기간의 시간 동안 반응시켰다. 상기 반응은 4℃에서 수행하는 것이 실온에서 수행하는 것보다 바람직한데, 실온에서는 PEG-말레이미드가 존재하더라도 티올화 Hb의 티올기가 어느 정도 산화되지만 4℃에서는 이러한 산화가 상당히 감소된다고 여겨지기 때문이다. PEG화 반응은 일반적으로 0.5 mM의 단백질 농도에서 수행하지만, 0.25 mM 또는 1 mM Hb의 Hb 농도를 사용하여 수행할 수도 있다.
또한, 티올화 매개된 PEG화를 2-단계 반응으로도 연구하였다. 우선 Hb를 원하는 과량의 이미노티올란과 인큐베이션하여 Hb를 티올화한 후에 원하는 과잉 몰수의 (이미노티올란에 대하여) PEG-말레이미드를 첨가하여 티올화 Hb의 PEG 변형을 달성하여 수행한다.
비-승압성 Hb를 생성하기 위해서, Hb (4량체로 표현함)에 대하여 10배 과잉인 몰수로 티올화시키고, 티올화된 단백질을 20배 과잉 몰수의 원하는 PEG-말레이 미드로 PEG화시켰다. 일반적으로, 이것은 1-단계 반응으로 수행되어 티올기의 산화를 감소시킨다. 상기 반응이 실온에서 수행되는 경우에는, 원하는 분자를 수득하는데 일반적으로 4 내지 6시간의 반응 시간이 필요하다. 상기 반응을 4℃에서 수행하는 경우에는, 일반적으로 밤새 (약 16시간) 반응시킨다.
Mal-Phe-PEG-10,000을 사용하여 티올화 매개된 PEG-말레이미드 기재의 PEG화로 달성한 Hb의 표면 개질(decoration)은, 0.25 mM의 단백질 농도로 수행하였는데, 이것은 더 높은 농도의 Hb로 상기 반응을 실시하면 20배 과잉 몰수의 Mal-PEG-2000을 사용했을 때 반응 혼합물의 점도가 아마도 더 높아질 것이므로 불완전한 반응을 초래하기 때문이다.
컷-오프가 12 내지 14,000 달톤인 투석 튜빙을 사용하여 상기 반응 생성물을 PBS에 대하여 철저하게 투석하였다. 미반응물 (잉여량의 PEG-말레이미드)은 투석되어 밖으로 배출되었다. PEG화 생성물을 파마시아 액타(Pharmacia Acta)에 연결된 수퍼로스 12 컬럼을 사용한 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 이와 같이 단리한 PEG화 Hb인 (PEG5K)6-Hb를 이후 필요시까지 -80℃에 저장하였다.
티올화 매개된 PEG-말레이미드 기재의 PEG화시의 크기 증대 측정: 파마시아 FPLC 시스템을 사용하여, Hb의 크기 증대를 티올화 매개된 PEG-말레이미드 기재의 다양한 보존적 PEG화에 대한 함수로서 분석하였다. 연속하여 연결된 2개의 수퍼로스 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 샘플은 PBS (pH 7.4)를 사용하여 0.5 ml/분의 유속으로 실온에서 용출시켰고, 5 mm 프로브를 사용 하여 29℃에서 300.15 MHZ로 분석하였다. Hb 샘플은 0.1 M 중 4 내지 7％ 농도였다.
II. 결과
A) 보존적 PEG화 기술의 개발
(i) 티올화 매개된 말레이미드 화학 기재의 Hb의 PEG화에 의한, HbA의 유체역학적 용적의 증가: Hb를 이미노티올란의 부재 및 존재하에서 20배 과잉 몰수의 Mal-Phe-PEG5K와 4.5시간 동안 실온에서 인큐베이션시키고, 이때의 Hb의 크기 배제 크로마토그래피 양상을 도 2A에 나타내었다. 이미노티올란 자체가 없으면, Hb는 PEG-Phe-PEG-5,000로 완벽하게 변형된다 (도 2A, b). 변형되지 않은 Hb는 대략 57분에 용출된 반면 (도 2A, a), Mal-Phe-PEG5K와 인큐베이션한 HbA는 대략 50분에 용출되었다. 상기 생성물의 용출 위치는 2개의 Cys-93(β)가 Mal-Phe-PEG5K로 변형된 Hb에 상응한다. 상기 컬럼에서, Cys-93(β)에서 연결된 (SP-PEG10K)2-HbA 및 (SP-PEG20K)2-HbA의 용출 위치는 각각 대략 47분 및 44분이고, 참고로 표시하였다.
Hb와 Mal-Phe-PEG5K의 반응 혼합물에 이미노티올란을 포함시키면, 변형된 Hb는 크기 배제 크로마토그래피 컬럼으로부터 (PEG5K)2-HbA의 용출 위치보다 더 앞서 용출되었다. 새로운 PEG-말레이미드 부위가 명백하게 생성되었고, 따라서 Hb상에 새로운 PEG-말레이미드 반응성 부위가 제공되었다. 변형된 Hb (PEG화 Hb)는 크기 배제 크로마토그래피에서 이미노티올란 농도에 의존하는 방식으로 더 빨리 용출되 었다. 이미노티올란의 농도가 높을 수록 변형된 Hb가 용출되는 위치는 더 빨랐는데, 이것은 Hb의 티올화 수준이 반응 혼합물 중 이미노티올란의 농도 증가에 대한 함수로서 증가하며, 이러한 티올화 수준 증가가 Hb의 겉보기 분자 크기 증가에 기여함을 시사한다. 2.5 mM 이미노티올란 (4량체 1개 당 5배 과잉 몰수)의 존재하에 생성된 PEG화 Hb는 (SP-PEG10K)2-HbA의 용출 위치에 가까운 위치에서 용출되었다 (도 2A, d). 5 mM 이미노티올란의 존재하에 형성된 샘플은 (SP-PEG20K)2-HbA의 용출 위치에 매우 가까운 위치에서 용출되었으나, 유체역학적 용적은 (SP-PEG20K)2-HbA의 경우보다 약간 더 작다고 여겨졌다 (도 2A, e). 그러나, 이 물질은 피크의 상향 측에 작은 숄더(shoulde)가 있었다.
Mal-Phe-PEG의 농도 (10 mM)는 변화시키지 않고 이미노티올란 농도를 7.5 mM로 더 증가시키면, PEG화 Hb 피크의 용출 양상이 약간 더 넓어지지만, 숄더로서 용출되는 생성물의 수율은 약간 증가하는 것에 불과하였다 (데이타는 나타내지 않음). 이미노티올란의 농도를 10 mM로 증가시킨 경우라도, 피크 상향 측의 숄더 농도에 약간 변화가 있다는 점을 제외하고는 이러한 용출 양상이 유의하게 변화하지 않았다.
또한, PEG 농도가 피크 상향 측 숄더에 미치는 영향을 PEG-말레이미드 농도 증가에 대한 함수로서 연구하였다. Mal-Phe-PEG의 농도를 도 2e에서 사용된 농도의 거의 두배로 증가시킬 때 상당히 감소된 (거의 보이지 않음) 이 숄더는 주요 피크의 용출 위치에 거의 영향을 주지 않았다.
10배 과잉 몰수의 이미노티올란에 의한 Hb 티올화의 역학을 도 2A (삽입도 a)에 나타내었다. 평균적으로, 10배 과잉 몰수의 이미노티올란으로 티올화된 Hb는 4량체 1개 당 약 7개의 반응성 -SH기 (디티오피리딜에 대한 것임)를 운반하는데, 이 중 2개는 Cys-93(β)의 내재적 -SH기이고 나머지는 이미노티올란과 Hb의 반응성 표면인 ε-아미노기와의 반응으로 도입된 내재적 티올기이다 (Hb의 γ-메르캅토 부티르아미딘화). 10배 과잉 몰수의 이미노티올란을 사용하였기 때문에, 티올화 효율은 거의 50％였다. PEG화 Hb는 4량체 1개 당 반응성 티올이 약 0.5 몰 (비-변성 조건하)이었으며, 이는 평균적으로 거의 약 6.5개 카피의 PEG쇄가 Hb에 도입되어 이러한 PEG화 Hb를 생성한 것임을 시사한다.
또한, Hb의 티올화를 0.5 mM의 단백질 농도에서 이미노티올란 농도에 대한 함수로서 연구하였다 (도 2A. 삽입도 b). 이미노티올란의 농도를 4량체 1개 당 평균 5개의 외재적 티올기가 도입되는 10배 과잉의 몰수로부터 30배로 증가시키면, 티올화 Hb상의 외재적 티올의 수가 거의 2배가 되었다. 그러나, PEG화로 나타난 크기 증대는 단지 소량에 불과하였는데, 이는 PEG화 Hb가 티올화 Hb의 모든 외재적 티올에서 반응할 수는 없음을 시사한다. 이러한 결과는 10배 과잉 몰수의 이미노티올란 및 20배 과잉 몰수의 Mal-Phe-PEG5K의 존재하에서는 PEG화 Hb가 표면 Hb 분자를 커버하여, PEG가 이러한 티올화 매개된 PEG-5,000 말레이미드 의존적 PEG화를 통해 Hb의 분자 크기를 증대시키는 이러한 단계에서는 티올화 Hb가 PEG화 Hb의 추가의 외재적 티올의 변형에 대해 더욱 큰 저항성을 갖게 되는 '군집(crowding) 상 황'을 유의하게 초래함을 시사한다고 풀이된다. 따라서, 이후의 모든 연구에서, PEG를 사용한 Hb의 표면 개질로 생성되는 PEG화 Hb는 20배 과잉 몰수의 Mal-Phe-PEG-5,000의 존재하에 10배 과량 (4량체로서의 단백질에 대한 값)의 이미노티올란을 사용하였다.
(ii) 티올화 매개된 말레이미드-PEG 기재의 Hb의 PEG 변형에서의 가변성: 온도, pH, 링커 화학 및 PEG-말레이미드 중 PEG의 분자 크기가 (PEG5K)6-HbA의 형성에 미치는 영향은, 10배 과잉 몰수의 이미노티올란 및 20배 과잉 몰수의 PEG-말레이미드를 사용하고 검정 시스템으로서는 수퍼로스 12 컬럼에서의 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 조사하였다. 온도를 4℃로 저하시키면 PEG쇄가 티올화 단백질에 부착되는 속도가 느려지는 것으로 보이지만, Hb의 티올화 속도에는 큰 영향을 미치지는 않았고, 최대 9시간의 반응으로 반응이 확실하게 완결되지만 편의상의 문제 때문에 일반적으로는 밤새 반응 (14 내지 16시간)시키는 것을 선택하였다 (도 2B, 곡선 c). 2-단계 방법으로 PEG화를 수행하여, 우선 티올화를 수행한 후 PEG화시키는 것은 크기 증대에 영향을 미치지 않는다고 여겨졌다 (데이타는 나타내지 않음). PEG를 사용한 표면 개질은 pH 6.5, 7.4 및 8.5의 3가지 pH 값에서 수행하였다. 10 mM 인산염 완충액을 사용하여 pH 6.5, 7.5 및 8.5에서 형성시킨 PEG화 생성물을 pH 7.4로 하여 PBS 중에서 수립한 생성물과 비교하였다. 모든 생성물은 표면 개질로 인해 달성되는 크기 증대의 면에서 유사하였다.
PEG-5,000을 사용한 표면 개질시에 나타나는 크기 증대는 링커 화학과도 무 관하였으며, 메일드-페닐-PEG-5,000을 사용하여 수득한 반응 생성물은 유체역학적 용적이 PEG-에틸-PEG-5,000을 사용한 경우와 본질적으로 동일하였다 (도 2B, 곡선 d). 주어진 세트의 티올화 조건하에서의 Hb의 크기 증대는 PEG-말레이미드 중 PEG의 분자 크기에 민감하였다. PEG쇄의 질량이 5,000에서 10,000로 증가하면, 나타나는 크기 증대가 PEG-5,000 말레이미드를 사용한 경우보다 더 높았다 (도 2B, 곡선 e).
(iii) (PEG 5 ) 6 -HbA의 정제: (PEG)6-HbA 최대 1 g의 물질을 생성하기 위한 겔 여과 프로토콜을 개발하였다. 일반적으로, HbA (0.5 mm)를 10배 과잉 몰수의 이미노티올란 및 20배 과잉 몰수의 인산염 완충액 염수 (pH 7.4) 중에서 4시간 내지 6시간 동안 인큐베이션한 후, 상기 반응 혼합물로 100배 과량의 PBS에 대한 투석을 3회 교환으로 실시하여 잉여 (미반응) 이미노티올란 및 말레이미드 PEG를 제거하였다. 투석된 샘플을 약 1 mm로 농축하고 파마시아 액타 익스플로러 10에 연결된 정제용 수퍼로스 12 컬럼을 사용하여 겔 여과하였다. 상기에서 논의한 조건하에 PEG화시킨 HbA 샘플의 전형적인 크로마토그래피 프로파일을 도 6A에 나타내었다. 용출물을 3가지 파장에서 모니터링하여, Hb와 반응하지 않은 임의의 PEG-말레이미드의 용출에 대한 모니터링을 용이하게 했다. PEG화 Hb는 샘플 중에 존재하는 미반응 PEG-말레이미드보다 훨씬 먼저 용출되었다. 겔로 여과한 PEG화 샘플을 약 6 g/dL로 농축시켰다. HbA는 티올화 매개된 말레이미드 화학 기재의 PEG화 반응 동안 또는 이후의 정제 단계 동안에 어떠한 검출가능한 자가산화도 발생하지 않아서 met-Hb형의 생성물을 생성하였다. PEG화 Hb 샘플은 적어도 최대 1년의 기간까지는 임의의 자가산화 없이 -80℃에 저장할 수 있다.
(iv) Hb의 보존적 PEG화로 인한 Hb 크기 증대의 정량: 정제된 (PEG5K)6-Hb의 용출 양상을 비스-말레이도페닐 PEG-600을 사용하여 4량체간 가교결합시킨 αα-푸마릴 Hb의 경우와 비교하였다 (도 3의 삽입도 b 및 a). 앞서 언급한 바와 같이, 보존적으로 PEG화된 Hb인 (PEG5K)6-Hb는 (PEG20K)2-HbA보다 약간 더 작았으며 (PEG10K)2-HbA보다는 더 컸다. 이것의 유체역학적 용적은 분자 질량이 약 250,000 달톤인 구형 단백질의 경우에 상응한다고 여겨진다. 여기서의 PEG-질량은 약 30,000이었고, 따라서 분자 질량 계산치는 겨우 95,000 달톤에 불과하였다. 그러나, 이것의 유체역학적 용적은 분자 질량이 250,000인 단백질에 상응하는 것이었다. 따라서, 질량이 30,000인 6개 카피의 PEG-5,000쇄를 Hb에 혼입하는 것은, 질량이 거의 180,000인 구형 단백질을 Hb에 혼입하는 것과 동등하다. 따라서, PEG는 Hb의 유체역학적 용적을 단단하게 팩킹(packing)된 구형 단백질의 거의 6배로 증가시키는 잠재력을 나타낸다. 이러한 결론은, PEG화 부위가 Cys-93(β)로 제한되면 크기 증대는 사용된 PEG-말레이미드 중 PEG 분자 크기에 대한 함수로서 달성된다는 문헌 [Manjula et al (2002)]의 최근 PEG화 연구로부터의 결론과 유사하다. 따라서, PEG화로 인해 발생하는 크기 증대는 Hb에 연결된 전체 PEG-질량과 직접적인 상관관계가 있다고 여겨지며, PEG-질량이 여러가지 수의 카피로 주어지는 경우에는 부가적이다.
신규한 티올화 매개된 말레이미드 화학 기재의 PEG화 프로토콜로 생성된 (PEG5K)6-HbA의 크기 배제 크로마토그래피 양상을 비-혈관작용성 PEG화 Hb인 엔존 (PEG5K)10-Bv-Hb의 경우와 비교하였다 (도 3 삽입도의 곡선 c). 상기 물질 역시 (PEG5K)6-Hb와 마찬가지로 분자 크기 분포의 면에서 매우 균일하였다. 이러한 PEG화 Hb는 4량체 1개 당 10개 카피의 PEG-5,000을 가졌으며 (총 PEG-질량: 50,000), 따라서 (PEG5K)6-Hb과 비교할 때의 크기 증대는 더 높을 것으로 기대되었다. 그러나, 상기 Hb에서 나타난 크기 증대는 (PEG5K)6-Hb에서 나타난 크기 증대만큼 높지 않았다. 이러한 예외에 대한 분자적 기초는 현 단계에서는 그다지 명확하지 않다. 한편, 4량체 1개 당 10개 카피의 PEG-3,000을 운반하는 또다른 PEG화 Hb인 PHP는, 이 생성물에서 4량체 1개 당 PEG 질량의 수준이 (PEG5K)6-Hb의 경우와 유사하다는 사실을 고려할 때 (PEG5K)6-Hb과 유사한 유체역학적 용적을 가질 것으로 예측되었다. PHP는 매우 불균일하였다 (도 3 삽입도의 곡선 d). 이것은 (PEG5K)6-Hb보다 크기 증대가 적은 소량의 물질을 운반하고, (PEG5K)6-Hb와 크기 증대가 유사한 소량의 몇가지 물질 및 (PEG5K)6-Hb보다 크기 증대가 더 큰 소량의 몇가지 물질을 운반한다. 이관능성 PEG-3,000을 사용하여 표면 개질시키고, 상기 샘플 중에 존재하는 4량체내 가교 및(또는) 4량체간 가교가 PHP의 불균질성 수준이 매우 높다는 것에 기여할 수 있다.
B) (PEG5)6-HbA의 분자적 특징, 속일적(束一的) 특징 및 기능적 특징
(i) (PEG 5 ) 6 -HbA의 1 H-NMR 분광법: Hb의 양성자 핵 자기 공명 분광법은, HbA에서 임의의 주어진 부위에서 화학적 변형 또는 돌연변이가 일어난 HbA의 3차 및 4차 구조 변화를 모니터링하기 위한 우수한 도구이다. Cys-93(β)의 위치는 상기 분자에서 형태적으로 민감한 영역이고, 술피드릴 특이적 시약에 대한 Cys-93(β)의 반응성은 상기 분자의 산화 형태의 독특한 특징이며 탈산화 구조에서는 미반응성이다. 도 4A는 (PEG20)2-HbA 및 (PEG5)6-HbA의 양성자 NMR 스펙트럼을 일산화탄소 형태와 탈산화 형태 둘다에서 29℃에서의 0.1 M 인산염 완충액 (pH 7.0) 중 HbA의 경우와 비교한다. 이들 2가지 샘플은 4량체 1개 당의 PEG-질량이 거의 동량 [(PEG20)2-HbA에서는 40,000인 반면, (PEG5)6-HbA에서는 30,000임]이었다. PEG화 샘플에서는 Hb의 PEG화로 인한 분자 크기의 증가 때문에 더 넓은 공명이 관찰된다는 점을 제외하면 10 내지 14 ppm의 스펙트럼 영역에서의 화학적 이동(shift)에는 유의한 차이가 없었는데, 이는 PEG-20,000을 사용하여 오직 Cys-93(β)에서만 Hb를 PEG화시키거나 또는 PEG-5,000을 사용하여 Cys-93(β) 및 Hb의 4개 이상의 다른 ε-아미노기에서 Hb를 PEG화시켰을 때 상기 단백질의 α1β1 계면에서 변경된 것은 없음을 지시한다. 도 4B는 2가지 PEG화 Hb의 고리-전류(ring-current)-이동된 양성자 공명을 일산화탄소 형태의 HbA의 경우와 비교한다. 고리 전류 이동된 양성자 공명은 약간 변경되었는데, 이는 PEG화 Hb-샘플의 헴의 미소환경에 약간의 변동이 있음을 반영하는 것이다. 도 4C는 탈산화 형태의 PEG화 Hb의 α쇄 및 β쇄의 근위 히스티딘 잔기의 초미세 이동된 NδH 1H-공명을 나타낸다. -75 ppm에서 β쇄의 근위 히스티딘의 NδH로의 화학적 이동은 -2 내지 -3 ppm만큼 상류로 이동한 것이며, 이는 PEG화 샘플 중 β-헴 환경이 변동되었음을 반영한다. 이러한 상류 이동은 (PEG5)6-HbA의 경우보다 (PEG20)2-HbA에서 조금 더 두드러진다. 도 5D는 HbA의 2가지 PEG화 샘플에서 일어난 초미세 이동되고 교환가능한 양성자 공명을 탈산화 형태의 HbA의 경우와 비교한다. 초미세 이동된 공명은 HbA의 경우보다 더 넓다. 16 내지 24 ppm의 스펙트럼 영역의 공명에 약간의 변화가 있을 뿐 아니라, Hb의 PEG화로 인해 상기 분자의 β-헴의 미소환경에도 변화가 있음을 반영한다. α1β2 서브유닛 계면의 α-Tyr(42)와 β-Asp(99) 사이에 존재하는 중요한 H-결합에서 나타난 14 ppm의 공명은 PEG화 샘플에서 변화하지 않았다. 따라서, PEG화 Hb의 α1β2 서브유닛 계면에는 변화가 없다.
(ii) (PEG 5 ) 6 -HbA의 분자 반경: (PEG5)6-HbA의 분자 반경을 동적 광 산란법으로 측정하였고, (PEG5)2-HbA 및 본 발명자들이 이전에 측정하였던 (PEG20)2-HbA의 경우와 비교하였다 (표 1 참조). (PEG5)6-HbA의 분자 반경은 대략 6.8 nm이다. 이러한 분자 반경은 (PEG20)2-HbA의 분자 반경 (이전에 7.04인 것으로 추정되었음)보다 약간 더 작은 것이다. (PEG5)2-HbA 및 HbA의 값은 각각 4.2 및 3.1이다. 따라서, HbA에 부가되는 질량은 대략 30,000에 불과할 지라도, 상기 단백질의 분자 반경은 약 6개 카피의 PEG-5K쇄로 표면 개질된 경우의 2배를 초과한다. 따라서, (PEG5)6-Hb는 분자량이 94,000인 구형 단백질에서 예측되는 증대된 분자 크기를 나타내고, 이와 같이 Hb의 크기가 증대된 영역에서의 PEG 팩킹은 단백질 코어에서만큼 치밀하지 않다. 분자 질량이 114,000인 엔존 PEG Bv-Hb의 분자 반경은 (PEG5)6-Hb의 분자 반경보다 작고 (5.53 nm) (PEG10K)2-HbA 및 (PEG5K)4-개 Hb의 분자 반경에 가깝다. 또한, Mal-에틸-PEG-5,000을 사용하여 생성한 (PEG5)6-Hb의 분자 반경은 Mal-Phe-5,000을 사용하여 생성한 경우보다 거의 10％ 더 작다는 것도 염두에 둘 수 있다. (PEG10K)6-Hb의 분자 반경은 대략 9.8이기 때문에, 분자 반경이 (PEG5K)6-HbA로 얻어지는 7 nm를 초과하는 PEG화 Hb를 수득하기 위해서는 더 높은 분자 크기의 PEG를 사용할 필요가 있다.
(iii) 보존적 PEG화 및 비보존적 PEG화 프로토콜로 생성된 PEG화 Hb의 분자 밀도의 비교: PEG화로 달성되는 크기 증대 (유체역학적 용적의 증가)가 구형 단백질에서의 경우보다 거의 6배 더 효율적이기 때문에 (동등한 질량을 기초로 할 때), PEG화 Hb의 증대된 용적 중의 원자의 분자 밀도는 밀집된 구형 단백질에서의 경우에 비해 낮다는 것을 암시한다. 다양한 PEG화 Hb의 증대된 분자 용적에서 PEG의 분자 밀도는 표 1에도 제공하였다. Hb의 증대된 분자 용적 중 PEG의 분자 밀도는, Cys-93(β)에 연결된 PEG의 분자 질량이 5,000에서 20,000으로 증가하기 때문에 거 의 50％ 감소한다. 분자 밀도의 감소는 PEG쇄와 주어진 PEG화 Hb의 PEG-쉘(shell) 내부에서 점유도가 높아진 용매 분자 사이의 상호작용이 감소하였음을 암시한다. PEG-쉘 중 PEG 밀도가 낮으면 '버섯 형태'로 존재한다고 여길 수 있지만, PEG-쉘에서의 밀도가 높으면 '브러쉬-보더(brush-border) 형태'로 존재한다고 간주될 수 있고, (PEG5)6-Hb에서는 PEG-쉘의 분자 밀도가 (PEG20)2-Hb에서보다 훨씬 더 작다. 한편, 엔존 PEG Bv-Hb의 PEG-쉘의 분자 밀도는 매우 높은데, 이는 PEG-쉘 중의 PEG쇄 사이의 상호작용이 (PEG5)6-Hb의 PEG-쉘에서의 경우에 비해 더 강하다는 것을 시사한다. 상기 연구는 엔존 PEG화 Hb와 보존적 PEG화 기술로 생성된 새로운 PEG화 Hb 사이에서 PEG쇄의 팩킹 차이를 분명하게 반영한다. 보존적 PEG화로 생성된 샘플은 '버섯 형태'로 존재하고 엔존 PEG화 샘플은 '브러쉬-보더 유사 형태'로 존재한다고 간주할 수 있다.
(iv) (PEG 5 ) 6 -HbA의 속일적 성질: 도 5는 (PEG5)2-HbA 및 (PEG5)6-HbA의 점도를 1 g/dL 내지 10 g/dL 범위의 단백질 농도에 대한 함수로서 비교한다. (PEG5)2-HbA의 점도는 단백질 농도가 1 g/dL에서 10 g/dL로 증가함에 따라 오직 약간의 점도 증가만을 나타내었고, PEG화 용액의 점도는 단백질 농도에 직접 비례한다고 여겨졌다. 한편, (PEG5)6-HbA 용액의 점도가 매우 묽은 용액 (1 g/dL)에서의 (PEG5)2-HbA의 경우와 유사하다고 할지라도, (PEG5)6-HbA 용액의 점도는 단백질 농도에 따라 기하급수적으로 증가하였다. 10 당량의 PEG-5K쇄 (이소펩티드 연결기를 통해 소 Hb의 α 및 ε-NH2에 결합함)를 운반하는 1 내지 5 g/dL 농도 범위의 엔존 PEG 소 Hb의 점도 역시 비교용으로 나타내었다. 연구한 모든 농도에서, 엔존 PEG 소 Hn의 점도는 (PEG5)6-HbA의 점도와 유사하였다. 상기 결과는 연결기 및 PEG화 부위의 화학적 성질이 PEG화에 강한 영향을 미치거나 또는 PEG화 Hb 용액의 점도가 4량체 1개 당 6개 카피의 PEG-5K쇄가 존재하는 포화 값에 도달한다는 것을 시사한다.
PEG화 Hb 샘플의 콜로이드 삼투압을 단백질 농도에 대한 함수로서 도 6에 나타내었다. 샘플의 삼투압은 단백질 농도에 대한 함수로서 증가하였다. 이러한 증가는 (PEG5)2-HbA를 사용할 때 작으며, 단백질 농도 (1 내지 6.8 g/dL의 범위)에 따라 선형 증가하는 것으로 나타났다. 한편, (PEG5)6-HbA 용액의 삼투압은 단백질 농도가 증가함에 따라 기하급수적으로 증가하였다. 다시, 상기 농도가 일치하는 경우에는 엔존 (PEG5)10-Bv-Hb의 삼투압이 (PEG5)6-HbA의 경우와 유사하였다. 상기 결과는 PEG화 Hb 샘플의 삼투압이 상기 샘플의 점도와 직접적인 상관관계가 있음을 시사한다.
(v) (PEG 5 ) 6 -HbA의 기능적 특성: 37℃에서 50 mM 비스-Tris/50 mM Tris 아세테이트 (pH 7.4) 중 (PEG5)6-HbA의 산소 친화도 및 알로스테릭(allosteric) 이펙터(effector) 존재하의 이의 조정을 표 1에 나타내었다. Hb의 P50은 HbA의 PEG화를 8.0의 대조군 값에서 6.5으로 저하시켰다 (산소 친화도 증가). ββ-클레프트(cleft)에서 결합하여 HbA의 산소 친화도를 저하시키는 이펙터인 DPG가 5배 과량으 로 존재하는 것은, 산소 친화도에 유의한 영향을 미치지 않았다. 한편, 1 M 염화나트륨의 존재는 PEG화물의 산소 친화도를 약간 저하시켰고 (P50이 6.5에서 8.5로 증가함), 염소의 부재하에서는 변형되지 않은 HbA의 경우와 유사하였다. 한편, 변형되지 않은 Hb의 산소 친화도는 1.0 M 염소의 존재하에 유의하게 저하되었다. Hb의 αα-말단에 결합하여 상기 분자의 산소 친화도를 감소시키는 알로스테릭 이펙터인 L-35의 존재하에서는 (PEG5)6-HbA의 P50 증가가 산소 친화도를 약간 감소시키는 효과가 있었으나, 변형되지 않은 HbA를 사용한 경우에 비해서는 현저하게 감소시켰다. 따라서, 티올화 매개된 말레이미드 화학 기재의 PEG화 HbA는, HbA가 DPG의 존재에 반응하려는 경향을 거의 완벽하게 억제하였고, 상기 분자가 염소 및 L-35에 반응하려는 경향을 크게 감소시켰다.
(PEG5)6-HbA의 02 친화도는, 순환되는 샘플의 값이 PBS에서의 경우와 유사하였기 때문에 PBS 중에서 측정하였다. PBS 중에서도, (PEG5)6-HbA의 산소 친화도 (P50 = Hg 9.5 mm)는 대조군 HbA (P50 = Hg 15 mm)보다 더 높은 것으로 나타났다. (PEG5)6-HbA의 산소 친화도는 (PEG5)2-HbA의 경우 (P50 = 11.8)보다 단지 약간만 더 높았다. (PEG5)6-HbA는 HbA의 리신 잔기의 ε-NH2기에서의 추가 변형에 더하여 (PEG5)2-HbA에서와 같이 변형된 Cys-93(β)를 갖기 때문에, 상기 산소 친화도 결과는 HbA의 ε-아미노기의 티올화 매개된 PEG화 자체는 Hb의 산소 친화도에 유의한 영향을 미치지 않음을 시사한다. 메일드-에틸-PEG5K를 사용한 HbA의 티올화 매개된 표면 개질: 시판되는 말레이미드 PEG-시약은 말레이미드 부분과 PEG쇄 사이에 알킬 스페이서 연결을 갖는다. 말레이미드 알킬 PEG 시약에도 본원에서 개발된 새로운 PEG화 절차의 보편성을 정립하려는 시도에서, 본 발명자들은 이제 티올화 매개된 말레이미드 화학 기재의 반응에서 Mal-Phe-PEG5K를 Mal-에틸-PEG5K로 대체하였다. 이러한 PEG와 HbA의 반응은 반응 효율이 약간 낮다는 점을 제외하고는 예상대로 진행되었다. 평균 6개의 PEG쇄를 운반한다고 예측되는 생성물 [(SE-PEG5K)6-HbA]은, 겔 여과시에 다소 지연 용출되었다는 점을 제외하고는 (SP-PEG5K)6-HbA의경우와 유사한 겔 여과 양상을 나타내었다. 또한, 표 2에 나타낸 바와 같이, (SE-PEG5K)6-HbA의 분자 반경은 (SP-PEG5K)6-HbA의 경우보다 약간 더 작았다.
B. (PEG5K)6-HbA의 승압 활성
(i) 10％ 과잉 부하 실험에 의한 햄스터 연구: 2개 및 6개 카피의 PEG-5K쇄로 PEG화된 Hb의 혈관수축 활성의 변화를, 햄스터 피부 폴드 윈도우 모델에서 10％ 과잉 부하 실험으로 평균 동맥압을 측정하고 소동맥 직경 (A2)을 측정하여 조사하였다. 도 7A에 나타낸 바와 같이, (PEG5K)2-HbA의 주입은 수 분 이내에 즉각적인 혈압 증가를 야기하였다. 한편, (PEG5K)6-HbA 샘플은 동일 기간 동안 혈압을 변화시키기 않았다. 도 7B는 (PEG5K)2-HbA 및 (PEG5K)6-HbA의 10％ 과잉 부하 용액을 사용 하여 햄스터에게 주입하고 다양한 기간이 지난 후의 동맥 직경을 비교하였다. (PEG5K)6-HbA의 샘플은 (PEG5K)2-HbA 샘플에 의한 경우보다 폐포 직경을 출발 값에 훨씬 더욱 가깝게 보존하였다. 이러한 분석은, 무세포 Hb를 6개 카피 수준의 PEG-5K쇄로 PEG화시키면 무세포 Hb의 내재적 혈관작용성을 유의한 수준까지 억제함을 확인시켜 준다.
(ii) 햄스터에서 (PEG 5K ) 6 -HbA를 사용한 50％ 교환 수혈이 기능적 모세혈관 밀도에 미치는 영향: 도 8은 (PEG5K)6-HbA로 50％ 교환 수혈된 햄스터에서의 모세혈관 혈류를 도시하고, 대조군 (교환 수혈을 실시하지 않음) 및 αα-푸마릴 HbA로 50％ 교환 수혈을 실시한 경우와 비교한 것이다. 이와 같이, (PEG5K)6-HbA로 50％ 교환 수혈된 햄스터는 모세혈관 밀도를 높게 유지하지만, αα-푸마릴 HbA는 기능적 모세혈관 밀도를 유의하게 감소시키는 것이 명백하다. 따라서, PEG-5,000쇄에 의한 Hb의 표면 개질은 무세포 Hb의 내재적 혈관수축 활성을 중화시킬 수 있다.
III. 논의
Hb 단백질의 표면 전하를 변경시키지 않으면서 PEG화에 의해 Hb의 분자 크기를 증대시키기 위한 신규하고 간단하면서 가변적인 프로토콜을 개발하였다. 이것은, 산화 또는 탈산화 조건하에서 이미노티올란과의 반응에 의해 Hb의 ε-아미노기 세트를 PEG 말레이미드 반응성 부위로 활성화 (티올화)시킨 후에 상기 티올화 Hb를 원하는 PEG 말레이미드로 변형시키는 단계를 포함한다. 이러한 접근법을 최적화하여 6개 카피의 PEG-5,000을 운반하는 PEG화 Hb를 생성하였고, 이것은 비-승압성인 것으로 밝혀졌다.
이미노티올란이 없을 때, 산화 조건하에서는 PEG 말레이미드를 사용한 Hb의 PEG화가 Cys-93(β)의 변형으로만 제한된다 (즉, 4량체 1개 당 2개 카피). 이러한 PEG화 Hb는 분자량이 128 KDa인 구형 단백질의 경우와 유사한 유체역학적 용적을 나타낸다. 4개의 다른 시스테인 잔기는 매립되어 있어서 이용된 반응 조건하에서는 PEG 말레이미드와의 반응에 이용될 수 없다. Cys-93(β) 역시 PEG-말레이미드와의 반응에 이용될 수 없게 된다.
이미노티올란은 Hb의 ε-아미노기 일부를 PEG 말레이미드 반응성 부위로서 이미노티올란 농도 의존적 방식으로 활성화시킨다. γ-메르캅토 부티르이미데이트의 고리화 형태인 이미노티올란은 유리 티올기를 운반하지 않으며, 이것이 일단 ε-아미노기와 반응하면 티올기가 계내 생성된다. Hb와의 반응시에, 아미데이트 반응성 ε-아미노기 세트는 말단부에서 유리 -SH기를 갖는 γ-메르캅토 부티르이미디닐 부분으로서 유도체화된다. ε-아미노기의 내재적 양전하는 이와 같이 유도체화된 ε-아미노기에서 보존된다. 티올기 중에서, 이러한 새로운 외재적 티올기가 말레이미드로 관능화된 원하는 분자 크기의 PEG쇄 부착에 대한 표적화 부위이다. 그러나, PEG와 말레이미드 사이에서 알킬 링커 또는 알킬아미드 링커를 사용하여 PEG를 말레이미드로 관능화시키는 다른 접근법이 동등하게 효율적인 PEG화제이며, 즉 이때의 PEG화 반응은 말레이미드 화학을 기재로 한다. 따라서, 이러한 PEG화 접근법은 PEG화 Hb에서 Hb의 알짜 전화를 보존한다는 잇점을 갖는다.
10배 과잉 몰수의 이미노티올란과 인큐베이션한 산화 Hb는 Hb의 거의 5개의 ε-아미노기를 PEG-말레이미드 반응성 부위로서 활성화시킨다. 20배 과잉 몰수의 PEG-말레이미드가 10배 과잉 몰수의 이미노티올란과 함께 존재하는 경우에는 평균 6개의 PEG5K-쇄를 갖는 PEG화 생성물이 생성된다 [(PEG5)6-Hb]. 도입된 6개의 PEG쇄 중 2개는 Cys-93(β)의 술피드릴기에 존재하고, 나머지는 Hb의 티올화된 Lys 잔기에 존재한다. 6개의 PEG-5,000쇄를 운반하는 Hb가 추가의 PEG-5,000쇄 도입에 대한 저항성 정도를 높인다고 여겨진다. 현 단계로서는, 이것이 이미노티올란에 의해 활성화되는 Hb의 다른 표면 a-아미노기의 티올기를 PEG 말레이미드와의 반응으로부터 차폐하면서, Hb상에서의 균일한 표면 커버율 정도를 반영하는지 여부는 명확치 않다.
(PEG5)6-Hb의 질량 계산치는 약 94 KDa이다. 그러나, 크기 배제 크로마토그래피에서 (PEG5)6-Hb는 250 kDa의 분자 크기인 것과 같이 거동하는데, 즉 (PEG5)6-Hb는 분자 질량이 약 250 KDa인 구형 단백질의 경우에 상응하는 유체역학적 용적을 나타낸다. 따라서, 구형 단백질의 분자 규모상, PEG쇄는 Hb의 유체역학적 용적, 분자 용적을 구형 단백질의 거의 6배로 증가시킨다.
PEG-말레이미드를 사용하여 이전에 수립되었던 PEG화 Hb의 분자 용적 증가와 본 발명의 연구로 생성된 것과의 상관관계는 이와 같은 크기 증대를 보여주는데 사용된 PEG의 질량 및 각각의 생성물에서 PEG쇄의 팩킹은 상이함을 시사한다. 이전의 부위 특이적 PEG화 생성물 연구에서, PEG쇄의 분자 질량 증가는 크기가 증대된 Hb 분자의 PEG-쉘 중 PEG의 분자 밀도를 감소시킨다. 이것은, 2개의 Cys-93(β)에 고정(anchoring)된 PEG쇄의 분자 크기로 풀이될 수 있는데, 이들은 서로와 상호작용함으로써 PEG쇄가 분자 운동을 하는 분자 용적 (단백질 주변의 PEG-쉘)을 증가시킬 수 있다. Hb 주변의 PEG-쉘이 6개의 PEG-5,000쇄 [2개는 Cys-93(β)상에 존재하고 나머지 4개는 이미노티올란에 의해 활성화된 α-아미노기에 존재함]로 생성되는 경우에는, 이들의 분자 운동을 위한 최대 공간에 접근하는 것으로 보인다. (PEG10)6-Hb를 이용한 1차 계산치는 PEG쇄가 움직이는 분자 공간의 분자 밀도가 (PEG5)6-Hb의 PEG-쉘과 유사하거나 또는 (PEG5)6-Hb의 경우에 비해 훨씬 덜 치밀할 수 있음을 시사한다.
놀랄만한 관찰 결과는, 엔존 PEG Hb의 PEG-쉘의 분자 밀도가 (PEG5)6-Hb의 분자 밀도보다 상당히 더 높다는 사실이다. 2가지의 매우 상이한 화학을 이용하여 2가지 PEG화 Hb를 조립하였다. 보존적 프로토콜로 본 발명의 PEG화를 수행하여, Hb 분자의 알짜 전하가 PEG화 생성물에서 보존되도록 하여, 상기 단백질의 수화된 쉘에서 일어나는 PEG화 Hb에서의 변동이 제한되도록 하였다. 유도체화된 α 및 ε-아미노기의 고유 양전하가 최종 생성물 중에 보존되지 않는 비보존적 프로토콜로 엔존 PEG화를 수행하였다. 따라서, 이러한 프로토콜은 상기 단백질의 수화된 쉘을 변동시킬 것이라고 예상될 수 있다. 분자적 기초가 무엇이든 간에, 상기 2가지 접근법이 Hb 주변에 PEG-쉘 (Hb 분자를 둘러싸는 PEG-쉘 중 PEG쇄의 구성 (분자 밀도)은 매우 상이함)을 생성한 것이라고 여겨진다.
메일드-에틸-PEG-5,000을 사용하여 생성한 (PEG5)6-Hb의 PEG-쉘의 분자 밀도 는 메일드 페닐 PEG-5,000을 사용하여 생성한 (PEG5)6-Hb의 PEG-쉘의 경우보다 더 높지만, 엔존 PEG-Hb의 분자 밀도만큼 높지는 않다. PEG와 관능화기 사이의 접합 연결기 및 스페이서 연결기로 표현되는 고정화 부위에서의 PEG쇄의 화학은 숙신이미도 페닐 PEG화 Hb, 숙신이미도 에틸 PEG화 Hb 및 아세트아미도 PEG화 Hb의 3가지 생성물로 존재하며, 하기에서 개략적으로 비교하여 제시하였다. 메일드 페닐 PEG화 Hb와 메일드 에틸 PEG화 Hb는 활성화 아암 (γ-메르캅토 부티르이미딜), 접합기 (숙신이미딜)를 공통적인 분자 요소로서 갖는다. Mal-Phe-PEG 시약에서는 PEG쇄와 접합 아암 사이의 링커가 페닐 에틸 카르바메이트이지만, Mal-에틸-PEG 시약에서는 에틸 링커이다. 따라서, Mal-Phe-PEG 시약에서는 더 긴 링커 쇄를 사용하고 상기 링커 내에 페닐기가 존재한다는 점이 상기 쇄를 고정부의 일부에 견고하게 만드는 반면, Mal-에틸-PEG 시약은 페닐 고리가 없기 때문에 Hb에 부착된 PEG쇄의 회전 자유도가 더 높다. 한편, 엔존 PEG-Hb는 활성화 아암이 없기 때문에 PEG쇄가 단백질 표면에 더 가깝다. 이것은 접합기로서 아세트아미딜 부분을 갖지만, 접합 단위와 PEG쇄 사이에는 링커기가 없다. 접합 아암의 이소펩티드 연결기는 부분적인 이중 결합 특징을 갖는다고 기대되기 때문에, 이러한 PEG화의 화학적 접근법에 내재적인 어느 정도의 견고성을 기대할 수도 있다. 따라서, 엔존 전략 (보존적 PEG화 접근법)에서는 PEG를 단백질 표면에 매우 가깝게 배치 (ε-아미노기의 고유 양전하로부터 2 Å 내지 3 Å 이내)하는 반면, 티올화 매개된 PEG 말레이미드 기재의 PEG화는 PEG쇄를 단백질 표면과 거리를 두고 배치 (ε-아미노기의 고유 양전하로부터 연장 된 형태로 약 15 Å 내지 21 Å 떨어짐)한다. 따라서, 보존적 PEG화로 생성된 PEG-쉘은 단백질 코어와 PEG-쉘 사이에 Hb의 한정된 수화 구(球)를 가질 수 있다. 이것은, PEG화 Hb의 PEG-쉘 중의 PEG의 분자 밀도가 링커 화학 (PEG와 말레이미드 사이의 연결) 및 커플링 화학 (PEG와 Hb 측쇄 사이의 연결) 둘다에 대한 함수임을 시사한다.
본 발명의 중요한 발견은 (PEG5K)6-Hb이 비-승압성이라는 점이다. 무세포 Hb의 내재적 승압 활성을 중화시키는 것은 (PEG5K)6-Hb의 물리적/화학적 특성이다. (PEG5K)6-HbA는 분명하게 크기가 증대된 Hb 분자이다. Hb의 분자 크기 증대는, Hb가 간질성 공간으로 혈관외유출되므로 혈장 중에서 순환하는 Hb보다 NO를 포획하는데 더욱 효과적일 것이라는 개념을 기초로 하여 Hb의 승압 활성을 극복하기 위해 개발된 초기 디자인 전략의 하나였다. 이러한 개념은 분자 크기가 250 KDa 범위인 올리고머화 Hb가 덜 혈관작용성이라는 관찰에 의해 지지된다고 여겨진다. 흥미롭게도, 메테슨(Matheson) 등은 더욱 최근에 분자 크기가 300 kDa을 훨씬 초과하고 평균 분자 반경이 24 nm (반경이 12 nm 내지 33 nm 사이에 분포된 불균일 생성물)인 올리고머화 생성물을 생성하였고, 이것이 신장의 폐문(肺門) 림프에서 나타나지 않아서 혈관외유출이 없음을 지시한다는 점에 주목하였다. 상기 생성물은 또한 승압 반응을 완벽하게 억제하였다. 사까이(Sakai)에 의한 관찰은 분자 크기와 승압 효과 사이의 상관관계를 입증하였는데, 승압 반응의 정도는 분자 크기에 반비례하였다. 직경이 1000 nm에 가까운 캡슐화 Hb는 혈관수축을 초래하지 않았다. 그러 나, (PEG5K)6-Hb의 분자 크기는 대략 7 nm에 불과하여, 임상 시험 중인 많은 올리고머화 Hb의 최신 버전의 분자 크기와 유사하다. 이들 대부분이 다양한 혈관수축 정도를 보이고 있기 때문에, 이것 자체에 의한 크기 증대는 (PEG5K)6-Hb를 비-승압성으로 만드는 1차 요인일 수 없다.
그러나, 평균 6개 개 카피의 PEG-5,000쇄를 운반하는 본 발명의 보존적으로 PEG화된 Hb가 비-승압성이며 점도 및 삼투압이 엔존 PEG-Hb의 경우와 가깝게 나타난다는 사실은, 본 발명의 신규한 보존적 PEG화 기술의 몇가지 잠재적 잇점을 드러내는 것이다: (i) 4량체 1개 당 6개 카피의 PEG-5,000쇄를 갖는 Hb의 보존적 PEG화에 의한 크기 증대 (유체역학적 용적의 증가)는 10개 카피의 PEG-5,000쇄를 갖는 소 Hb의 비보존적 PEG화의 경우보다 양호하다; (ii) 보존적 PEG화시에 유체역학적 용적을 증가시키는 효율이 더 높다는 것은, Hb 분자 표면상에서 PEG쇄의 팩킹이 덜 치밀함을 시사한다. 이것은, Hb 분자 주변의 PEG쇄로 생성된 새로이 수화된 쉘 (물로 찬 피막) 중의 PEG의 분자 밀도 계산치와 일치한다; (iii) 보존적 PEG화 기술은 비보존적 PEG화 기술보다 점도 및 삼투압을 더욱 효율적으로 증가시킨다 (이것은 Hb에 공유결합으로 부착된 PEG-5,000쇄에 대해 표준화하여 비교할 때 그러함). 이는, PEG를 사용한 표면 개질과 관련한 점도 변화를 측정하는데 있어서 PEG화에 의해 Hb 주변에 생성된 새로운 PEG 쉘에서 PEG 분자 밀도의 잠재적 역할 및 이들이 비-승압성 Hb 분자를 생성하려는 경향을 가짐을 시사한다.
Hb 기재의 산소 운반체의 초기 디자인은 적혈구의 산소 친화도를 모방하여 산소 친화도를 낮게 하려고 시도하였다. 엔존이 생성한 PEG화 Hb에 소의 Hb를 선택한 것은 최종 생성물의 산소 친화도를 낮게 하려는 것이었다. 소 Hb의 산소 친화도는 비보존적 PEG화시에 증가하였지만, 본 발명에 따라 보존적으로 PEG화된 Hb의 산소 친화도는 엔존 PEG화 Hb의 산소 친화도보다 상당히 더 높다. 자가조절 이론은 산소가 적은 Hb 기재의 산소 운반체를 주입할 때 순환계의 동맥 측으로 산소가 과잉 공급되어 혈관수축이 발생한다는 것을 밝혀냈다. 이것으로, Hb 기재의 산소 운반체의 산소 친화도를 증가시킴으로써 혈관수축이 감소될 수 있음이 예상된다. (PEG5K)6-Hb의 산소 친화도는 엔존 PEG-Hb보다 더 높고, 겨우 (본 발명의 보존적으로 PEG화된 Hb보다는 산소 친화도가 약간 더 낮은 엔존 PEG-Hb가 10개 카피의 PEG-5,000을 갖는다는 것과 비교할 때) 6개 카피의 PEG-5,000쇄를 갖는 본 발명의 보존적으로 PEG화된 Hb의 비-승압성 측면은 본 발명의 제제의 산소 친화도가 더 높기 때문임을 반영하는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 (PEG5K)6-Hb의 비-승압성 특성이 다수의 인자에 의한 사건이고, Hb의 물리적 특성 또는 기능적 특성 중 오직 하나만을 모방하는 여러 종의 Hb 디자인이 필요하며 이들 분자의 혈관작용성을 정립할 필요가 있음을 고려한다.
보존적으로 PEG화된 Hb인 (PEG5K)6-Hb는 무세포 Hb의 혈관작용성을 최소화하는데 요구되었던 수 년에 걸쳐 진보해 온 많은 특성을 갖는다: (i) 혈관작용성 소동맥에서 무세포 Hb에 의한 산소 해리(off-loading)를 제한하기 위해서 Hb의 산소 친화도가 높음; (ii) 모세혈관 층에서의 산소 해리를 보장하기 위해서 협동적 결합 을 보유함; (iii) 혈관외유출을 감소시키기 위해서 분자 크기 (유체역학적 용적)가 큼; (iv) 소동맥 벽에 적절한 전단 응력을 생성하면서 또한 산화 Hb 및 산소, 이산화탄소 및(또는) 산화질소의 확산 상수를 저하시키기 위해서 Hb 용액의 점도가 높음; 및 (v) 통상적인 변형된 Hb에 비해 콜로이드 압력이 높아서 혈장 증량제로서의 대용 혈액의 효과를 증가시킴 (많은 혈장 증량제 제제에서 디자인되는 특징임). 따라서, (PEG5K)6-Hb에서의 관찰 결과는 놀랄 만한 일이 아니다.
현 단계에서는, (PEG5K)6-Hb에 대해 상기 분자를 구성하는 여러가지 물리적 파라미터 및 기능적 특성이 명백하게 확인되지는 않았으나, 본 발명의 신규한 보존적으로 PEG화된 Hb는 Hb 기재의 산소 운반체를 개발하는 통상적인 디자인 전략과는 다른 새로운 부류의 Hb 기재의 산소 운반체의 새로운 구성원으로서 간주되어야 한다. 또한, 여기서 한 세트의 속일적 특성 및 산소 친화도 자체를 정하는 것은 Hb 분자를 비-승압성으로 만드는데 충분하지 않다는 것도 명심해야 한다. 최근의 문헌 [Manjula et al (2003)]에서 나타난 바와 같이, 산소 친화도가 높은 [산소 친화도가 (PEG5K)6-Hb의 경우와 유사함] PEG화 Hb [Cys-93(β)에서 부위 특이적으로 PEG화됨]의 분자 용적을 증가시키는 것은 점도 및 삼투압을 증가시키긴 했지만 Hb의 혈관작용성에는 어떠한 유의한 변화도 없었다. 한편, 4량체 1개 당 PEG쇄의 알짜 질량이 (PEG20)2-Hb의 경우보다 더 낮은 (PEG5K)6-Hb는 비-승압성이다. 6개 카피의 PEG-5K쇄로 Hb 분자 표면을 차폐시키는 것은 2개 카피의 PEG-20K에 의한 경우보다 더 우수한데, 이것은 이러한 관찰에 대한 가장 훌륭한 설명일 것이다. 이것은 Hb 의 분자 표면에서 PEG-5K쇄의 위치가 Hb 분자 표면의 차폐를 달성하는데 임의의 역할을 수행하는지 여부에 관한 중요한 의문점을 제기하며, 만일 그러하다면 이것이 Hb의 이미노티올란 매개된 티올화에 의한 것일 수 있다. Hb에서 이미노티올란에 의해 티올화되는 부위의 확인 및 규정된 카피 수의 PEG-5,000쇄를 사용하여 부위 특이적으로 PEG화된 Hb의 제조는 PEG화 반응의 이러한 측면을 통찰하는데 매우 중요하다. 10개의 PEG쇄를 운반하는 PEG화 부류에 속하는 비-승압성 Hb의 첫번째 예인 엔존 PEG화 Hb 이후로도, PEG화 Hb 생성에 비보존적 프로토콜을 이용하여 비-승압성 Hb를 생성하기 위해서는 Hb의 PEG화 수준이 더 높을 필요가 있는지의 여부와 비-승압성 Hb를 생성하는데 필요한 PEG화 및 산소 친화도의 최적 수준은 어느 정도인지가 명확하지 않다.
Hb 기재의 산소 운반체, 즉 승압 활성의 무세포 Hb를 개발하는데 있어서, 상기 분자에 PEG-5,000쇄를 사용하여 이미노티올란-의존적 티올화로 매개되는 PEG-말레이미드 기재의 표면 개질을 실시함으로써, 당면한 주요 장애가 극복되었다. 본원에서 개발한 PEG화 기술은 매우 단순한 것이며, 산화 조건하에 수행될 수 있고, PEG화 Hb를 단리하기 위한 성가신 크로마토그래피 정제 프로토콜을 포함하지 않는다. 이러한 보존적 PEG화 기술을 디자인할 때에는, 특히 엔존 PEG화 Hb 개발에 이용되는 비보존적 PEG화 반응인 아실화 반응과 비교하여 부반응을 최소화하기 위해 특별한 주의를 기울였다. Hb의 ε-아미노기에서 이미노티올란에 의한 아미딘화의 선택도, 활성 에스테르 또는 무수물을 사용한 α 및 ε-아미노기의 아실화보다 상당히 더 높은 유도체화 효율은 이러한 신규한 PEG화 프로토콜의 유리한 측면의 일 부이다. 이미노티올란 및 PEG-말레이미드의 안정성은 숙신이미딜 활성 에스테르 및 PEG-산의 산 무수물보다 상당히 더 높다. 따라서, 주어진 수의 PEG쇄를 이미노티올란 매개된 보존적 티올화를 통해 도입하는데 필요한 과량의 PEG-말레이미드는, 초기 버전의 비-승압성 PEG화 Hb를 생성하는데 이용되던 비보존적 PEG화 프로토콜에 필요했던 것보다 상당히 더 적을 것이다. 이러한 기술로 비-승압성 Hb 분자를 생성하는데에는 복잡한 탈산소화 장치가 필요치 않다. 따라서, 상기한 신규 PEG화 기술은 비-승압성 Hb를 생성하는데 있어서 비용면에서 매우 효과적이다.
Figure 112005033083815-pct00001
Figure 112005033083815-pct00002
샘플의 산소 친화도를 50 mM 비스-Tris/50 mM Tris 아세테이트 (pH 7.4) 중에서 37℃에서 Hem-O-scan을 이용하여 측정하였다. 단백질 농도는 약 0.6 mM로 유지하였다. 분석한 샘플은 2％ 미만의 met Hb를 함유하였다.
참고 문헌 목록
Figure 112005033083815-pct00003
Figure 112005033083815-pct00004
Figure 112005033083815-pct00005
본원에서 상기 언급한 모든 간행물들은 특허 문헌인지, 계류 중인 출원물인지, 간행된 문헌인지 등에 관계없이 본원에 그 전문이 참고로 도입된다. 본 발명은 명확히 설명하고 이해를 돕기 위해 조금 상세하게 기술하였으나, 본원의 개시 내용을 이해한 당업자라면 첨부하는 청구의 범위에 기재된 본 발명의 진정한 범위에서 벗어나지 않고도 기술된 형태 및 세부사항에 여러가지 변화를 가할 수 있음을 인식할 것이다.

Claims (27)

  1. 6개 ± 1개의 PEG쇄(폴리에틸렌 글리콜쇄)를 가지며, 상기 PEG쇄 중 2개는 헤모글로빈 분자 (Hb)의 Cys-93(β)에 결합되어 있고 나머지 PEG쇄는 Hb의 ε-NH2상에 도입된 티올기에 결합되어 있으며, 각 PEG쇄의 분자량이 3,000 내지 10,000 달톤인 헤모글로빈 분자.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 각 PEG쇄의 분자량이 약 5,000 달톤인 헤모글로빈 분자.
  4. 제1항에 있어서, 각 PEG쇄가 숙신이미딜 연결기를 통해 Hb에 연결된 헤모글로빈 분자.
  5. 제3항에 있어서, 각 PEG쇄가 숙신이미딜 연결기를 통해 Hb에 연결된 헤모글로빈 분자.
  6. 삭제
  7. 제1항, 제3항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 비-승압성(non-hypertensive)인 헤모글로빈 분자.
  8. (a) 헤모글로빈 분자 (Hb)를 8배 내지 15배 몰 과량의 이미노티올란과 반응시켜 티올화 Hb를 형성하는 단계, 및
    (b) 상기 티올화 Hb를 말레이미드 부분으로 관능화된 16배 내지 30배 몰 과량의 분자량 3,000 내지 10,000 달톤의 PEG와 반응시켜 각 PEG쇄가 3,000 내지 10,000 달톤의 분자량을 갖는 6개 ± 1개의 PEG쇄를 갖는 변형된 Hb를 형성하는 단계
    를 포함하는, 각 PEG쇄가 3,000 내지 10,000 달톤의 분자량을 갖는 6개 ± 1개의 PEG쇄를 갖도록 변형된 헤모글로빈 분자 (Hb)를 제조하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 단계 (a)에서 Hb를 9배 내지 12배 몰 과량의 이미노티올란과 반응시키는 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 단계 (a)에서 Hb를 약 10배 몰 과량의 이미노티올란과 반응시키는 것인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 단계 (b)에서 티올화 Hb를 말레이미드 부분으로 관능화된 18배 내지 22배 몰 과량의 PEG와 반응시키는 것인 방법.
  12. 제8항에 있어서, 단계 (b)에서 티올화 Hb를 말레이미드 부분으로 관능화된 약 20배 몰 과량의 PEG와 반응시키는 것인 방법.
  13. 제8항에 있어서, 단계 (a)에서는 Hb를 9배 내지 12배 몰 과량의 이미노티올란과 반응시키고, 단계 (b)에서는 티올화 Hb를 말레이미드 부분으로 관능화된 18배 내지 22배 몰 과량의 PEG와 반응시키는 것인 방법.
  14. 제8항에 있어서, 단계 (a)에서는 Hb를 9배 내지 12배 몰 과량의 이미노티올란과 반응시키고, 단계 (b)에서는 티올화 Hb를 말레이미드 부분으로 관능화된 약 20배 몰 과량의 PEG와 반응시키는 것인 방법.
  15. 제8항에 있어서, 단계 (a)에서는 Hb를 약 10배 몰 과량의 이미노티올란과 반응시키고, 단계 (b)에서는 티올화 Hb를 말레이미드 부분으로 관능화된 18배 내지 22배 몰 과량의 PEG와 반응시키는 것인 방법.
  16. 제8항에 있어서, 단계 (a)에서는 Hb를 약 10배 몰 과량의 이미노티올란과 반응시키고, 단계 (b)에서는 티올화 Hb를 말레이미드 부분으로 관능화된 약 20배 몰 과량의 PEG와 반응시키는 것인 방법.
  17. 삭제
  18. 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, PEG의 분자량이 약 5,000 달톤인 방법.
  19. 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 Hb가 비-승압성인 방법.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된, 각 PEG쇄가 3,000 내지 10,000 달톤의 분자량을 갖는 6개 ± 1개의 PEG쇄를 갖도록 변형된 Hb.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
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