KR100360946B1 - 재조합인간초-산화물불균화효소(rhSOD)의고분자결합체및이를제조하는방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 인간 초산화물 불균화효소(rhSOD: recombinant human Superoxide Dismutase)의 혈중 반감기를 증가시키기 위해 그의 고분자 결합체를 형성하는 방법에 관한 것으로, 합성 고분자의 히드록시기를 카르복실기로 산화시켜 고분자의 카르복실 유도체를 생성시키고, 상기 유도체를 활성화시키고, 상기 활성화된 유도체를 rhSOD에 결합시켜 제조된 rhSOD-합성 고분자 결합체는 rhSOD 만의 경우에 비해 활성은 그대로 유지하면서도 반감기는 훨씬 증가되어 임상치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

재조합 인간 초-산화물 불균화효소(rhSOD)의 고분자 결합체 및 이를 제조하는 방법

본 발명은 생물학적인 활성을 갖는 단백질을 화학적으로 변형시키는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 재조합 인간 초-산화물 불균화효소(rhSOD: recombinant human Superoxide Dismutase)의 혈중 반감기를 증가시키기 위해 합성 고분자와 선택적으로 공유결합시켜 그들의 결합체를 형성시키는 방법 및 그에 의해 형성된 결합체에 관한 것이다.

초-산화물 불균화효소는 미생물로부터 고등생물에 이르기까지 대부분의 생명체에 다양하게 존재하는 효소의 일종으로, 그 발달 단계 또는 종에 따라 그 종류가 약간씩 다르다.

초-산화물(superoxide)은 산소 대사 및 거식 작용 등의 정상적인 생명활동 과정 중에서도 그 부산물로 생성되며, 생체 외적으로는 방사선 조사, 적외선 조사, 산화 질소 화합물 등에 의해서도 발생될 수 있다. 상기 초-산화물은 거식세포의 발열반응(W. F. Peglone 등, PNAS, 77, 1159-1163(1980))과, 신장 및 심장과 같은 기관 이식후에 조직 접합부위의 화농을 일으키는 주요 인자인데, 초-산화물 불균화효소에 의해 제거된다.

임상적인 치료제로서의 초-산화물 불균화효소는 항발열제, 국소 빈혈증후 손상의 보호작용, 항암제 치료후 세포독성과 심장독의 부작용을 감소시키는 역할, 항암작용, 노화과정에서 노화방지 역할 등에 유효한 것으로 연구되고 있다.

초-산화물 불균화효소를 주사제로서 사용하는 데는 몇가지 해결해야 할 문제가 있는데, 그 중 하나는 초산화물 불균화효소가 혈중 반감기가 짧다는 것이다. 즉, 초-산화물 불균화효소를 혈액내에 투여하는 경우, 혈액내에 잔류하는 시간이 평균 약 5분 정도로 매우 짧고, 대부분은 신장을 통해 체외로 배출되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 초산화물 불균화효소가 치료제로서 그 효과를 발휘하기 위해서는 혈증 반감기가 더 연장되어야한다. 또 다른 문제는 세포에 대한 친화성이 약하여 세포내 침투가 어렵다는 것이다.

한편, 합성 고분자를 이용하여 단백질의 생리 화학적 성질을 변형시킨 예들은 여러 연구진들에 의해서 개발되어 왔다. 목적하는 단백질과 고분자를 결합시킴으로써, 단백질의 항원성 문제를 해결하거나, 생리적 pH에서의 용해도를 증가시키거나, 혈중 반감기를 증가시키는 것이다.

이에 관해서는 다수의 학술 논문 또는 특허가 발표되어 있다. 예를들어, 미합중국 특허 제 4,261,973 호에는 항원성인 알러겐(allergen)분자를 비항원성인 수용성 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 결합시켜 항원성을 감소시키는 기술, 미합중국 특허 제 4,310,144 호에는 헤모글로빈과 PEG를 결합시켜 헤모글로빈의 산소운반능력을 강화시키는 기술, 미합중국 특허 제 4,179,337 호에는 효소 또는 인슐린을 PEG 또는 폴리프로필렌 글리콜과 결합시켜 항원성을 감소시키는 기술, 미합중국 특허 제 4,495,285 호에는 폴리알킬렌글리콜을 플라스미노겐 활성화인자에 결합시켜 항원성을 제거하는 기술, 미합중국 특허 제 4,766,106 호에는 인터페론 베타(IFN-β) 및 인터루킨-2(IL-2)를 PEG와 결합시켜 용해도 및 혈중 반감기를 증가시키는 기술, 그리고, 미합중국 특허 제 4,496,689 호에는 α-1-단백질 가수분해효소 억제인자를 PEG 또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG)과 결합시키는 기술이 개시되어있다. 또한, EP 152,847 호는 효소와 PEG의 결합체에 관해서, JP 5,792,435 호는 몇몇 아미노산이 폴리에톡실기로 치환된 폴리펩티드에 관하여 기술하고 있다.

그 외에도, 여러 논문에 중합체와 단백질의 결합체에 관해서 보고되어있다. PEG와 결합된 효소들은 단백질 가수분해효소에 대해 안정하며, 그 3차 구조를 유지하는데 있어서 천연의 단백질 보다 안정한 것으로 보고되어 있다(Enzyme Eng., 613, 460-467). 또한, PEG와 결합된 면역글로블린 G는 열에 대한 안정성이 증가하는 것으로 기술되어 있다(Biochim. Biophys.4cta., 788, 248-255).

혈중 반감기 증가에 관해서도 다수 보고되어 있는데, 예를들어, PEG-우리카제(미합중국 특허 제 4,609,546 호), PEG-아르기나제(Cancer Biochem. Biophys., 7, 261-268), PEG-SOD(Res, Commun, Chem. Pathol, Pharmacol., 29, 113-217), PEG-스트렙토키나제(Blood, 76, 73-79), PEG-G-CSF(Cancer Res., 51, 3710-3714) 등 여 러가지에 있어서, 임상 치료에 사용될 수 있는 단백질이 혈중 반감기가 증가되었음을 기술하고있다.

PEG를 단백질과 결합시키는 방법은 여러가지가 알려져 있다. 예를들어, 시아누릭 클로라이드(cyanuric chloride)를 이용하는 방법(Rev. Makromol. Chem.Phys., 25(3), 325-373), 1,1'-카르보닐디이미다졸을 이용하는 방법(Anal. Biochem., 131, 25-33), 숙신산 또는 글루타르산의 무수물을 이용하는 방법(PNAS USA, 84, 1487-1491), 4-히드록시-3-니트로 벤젠 술폰산을 이용하는 방법(Anal. Biochem., 164, 494-501), 클로로포름산의 유도체를 이용하는 방법(Immunol. Rev., 41, 200-247) 등이 있다.

그러나, 앞에 상술한 문헌들 어느것도 유전공학적으로 생산된 재조합 인간 초산화물 불군화효소와 고분자의 결합체에 대해 자세히 기술한 것은 없다.

따라서, 본 발명의 목적은 재조합 인간 초-산화물 불균화효소의 혈중 반감기를 증가시키기 위해 폴리에틸렌 글리콜 등의 합성고분자와 결합시키는 방법 및 이에 의해 제조된 결합체를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 히드록시기를 갖는 합성 고분자의 히드록시기를 산화시켜 카르복실 유도체를 생성시키고, 상기 유도체를 활성화시키고, 상기 활성화된 유도체를 재조합 인간 초-산화물 불균화효소(rhSOD)에 결합시키는 단계를 포함하는, 재조합 인간 초-산화물 불균화효소와 합성 고분자의 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명을 상세히 설명하면 하기와 같다.

본 발명에 사용하는 합성 고분자는 히드록시기를 갖는 것으로서, 예를들면 또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜이 있다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 활성화된 유도체는 다음과 같은 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 구소련 특허 제 SU 1,155,583 호에 기술된 방법에 의해 PEG의 말단 히드록시기를 과망간산 칼륨으로산화시켜 카르복실기로 전환시키고, 이어서, 상기 PEG의 카르복실 유도체를 수용액 또는 염화메틸렌과 같은 유기 용매 중에서 트리메틸아세틸클로라이드와의 치환반응 또는 메탄술포닐클로라이드와의 치환반응에 의하여 PEG 활성 유도체로 전환시킨다.

PEG 대신 메톡신 폴리에틸렌 글리콜에 대해서도 동일한 방법으로 활성화된 유도체를 제조할 수 있으며, 상기 일련의 반응을 화학 반응식으로 나타내면 다음과 같다.

<PEG 말단의 히드록시기 산화>

<트리메틸 아세틸 클로라이드에 의한 PEG-COOH 의 활성화>

본 발명에서 PEG 및 mPEG는 분자량 4,000 및 8,000 의 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 분자량 5,000 의 메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG)을 사용목적에 적합하게 선택할 수 있다.

폴리에틸렌 글리콜을 수용액 또는 유기용매에 용해시켜 1∼3 당량의 과망간산칼륨을 가하고, 1 당량의 수산화나트륨으로 반응액을 알

칼리성이 되도록 한 후, 약 2-3 시간 동안 교반한다. 이때 온도는 25~28℃로 유지한다. 산화반응이 끝난 반웅물을 여과하거나 원심분리해서 흑갈색의 침전물을 버리고, 상등액에 디메틸에테르를 첨가하여 고분자 유도체를 침전시킨다. 침전된 유도체를 감압하에서 건조시킨다. 벤젠과 디클로로메탄올 3:1의 비율로 섞은 용매에 상기 수득한 폴리에틸렌글리콜의 카르복실 유도체를 용해시켜 얼음중탕에서 0-5℃를 유지시킨다. 여기에 3 당량의 트리메틸아세틸클로라이드와 트리메틸아민을 첨가해 2시간 동안 반응시킨다. 반응물을 여과하여 흰색 침전물을 제거하고, 여액에 석유 에테르를 가하여 침전된 침전물을 감압하에서 건조시킨다.

상술한 바와 같이 하여 제조된 PEG 활성 유도체는 이어서 재조합 인간 초-산화물 불균화효소와 결합하게 되는데, 이 반응은 나트륨 테트라보레이트 또는 보레이트 완충용액 중에서 수행한다. 상기 반응은 매우 빨라서 5분에 거의 90%가 완료되며 30분이내에 반응이 종결된다.

본 발명에서 제조된 활성화된 PEG 유도체의 장점은 기존의 공지된 방법에 의해 제조된 것들과 비교했을 때 반응속도가 매우 높다는 것이다. 이 경우에 있어서 반응속도가 높다는 것은 수율과도 밀접한 관계를 가지는데, 반응시간이 길면 활성화된 고분자의 유도체가 가수분해되므로 단백질과 결합하는 비율이 매우 낮아지게 된다. 반면에 반응속도가 높은 경우는 반응의 선택성이 낮아질 수도 있으나, 이점에 있어서는 다른 방법의 경우와 비교했을 때 큰 차이가 없다.

여기서 선택적이라는 의미는 단백질 한 분자에 1개 또는 2개 이상의 합성 고분자를 결합시키는 것을 말하는 것이다. 본 발명의 방법의 특징은 합성 고분자가 단백질을 구성하는 아미노산중 일차적으로 라이신 잔기의 아민기와 선택적으로 결합할 수 있도록 하는 것이다. 이때 고분자와 단백질간에 형성되는 결합 형태는 아미드 결합으로 생리적인 조건에서 매우 안정한 결합이다. 다른 방법들에 의해 형성된 결합 형태는 주로 에스테르 결합으로 생리적인 조건에서 가수분해가 될 수 있다는 단점이 있는 것으로 지적되어 왔다. 본 발명은 이점에 있어서 개선된 공유결합 형태를 제공한다.

또한 본 발명의 방법은 시아누릭 클로라이드를 사용한 방법에서와 같은 단백질과 고분자 사이의 연결물질(crosslinker)를 사용하지 않기때문에 항원성의 문제가 유발되는 것을 방지할 수 있다.

본 발명에 따라 폴리에틸렌글리콜과 결합된 초산화물 불균화효소는 래트(rat)에서 실험했을 때 혈중반감기가 매우 높아진 것으로 나타났다. 분자량 8,000의 고분자를 결합시켰을 때 혈중에서의 지속시간은 3시간이 경과했을 때까지 변화가 없는 것으로 보아 혈중 반감기는 적어도 6시간을 훨씬 넘는 것으로 보인다. 이러한 결과는 변형되지 않은 재조합 초산화물 불균화 효소 혈중반감기가 6 분인 것과 비교해 볼 때 현격한 차이를 보이는 것이라고 할 수 있다.

또한 본 발명의 초-산화물 불균화효소와 PEG의 결합체는 효소로서의 생물학적 활성이 90% 이상이며, 이량체(dimer)인 이 효소는 PEG와 결합되었을 때 2개의 서브유니트(subunit)로 분리되는 것으로 보이나 활성에 큰 변화는 없었다.

본 발명에 기술된 방법은 초-산화물 불균화효소외에 다른 종류의 활성 단백질에도 적용하여 용해도, 항원성, 혈중반감기등의 문제를 해결하여 임상적인 치료제로서의 성질을 한층 높이는데 이용될 수도 있다.

본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 예시한 것으로서 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

실시예 1 : rhSOD와 고분자 결합체의 제조

(1) 고분자의 산화반응

A. 메톡시 폴리에틸렌 글리콜의 산화

mPEG 40g을 H₂O 100㎖에 용해시키고, NaOH 0.34g 을 첨가하였다. 여기에 과망간산칼륨(KMnO₄) 1.42g 을 조금씩 첨가하고 25℃ 에서 2시간 동안 교반하였다. 흑갈색의 반응물을 12,500xg 로 5분간 원심분리(JA14, Beckman)하였다. 침전물을 버리고 상등액을 CHCl₃200㎖로 추출하여 유기층을 모아 합한 유기층을 감압상태에서 100㎖로 농축한 다음 에틸에테르 500㎖를 넣어 침전시켰다. 침전물은 건조시켜 밀봉보관하였다. IR(infrared spectroscopy) 분석으로 카르복실기가 유도되었음을 확인하였다.

B. 유기용매상에서 폴리에틸렌 글리콜의 산화

분자량 4,000 의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 20g 을 디클로로메탄 50㎖에 용해시키고, 수산화나트륨 0.9g을 넣어 교반하였다. 과망간산칼륨 1.73g을 첨가하여 용해시킨후 물 0.9㎖을 넣고 상온에서 4시간 동안반응시켰다. 여기에 에탄올 3㎖를 첨가해 30분간 더 반응시켜 잔류하는 과망간산칼륨을 모두 제거하였다. 암갈색의 반응물을 12,500xg 로 5분간 원심분리해서 침전물을 버리고 상등액을 취한다. 상등액에 디에틸에테르 150㎖를 첨가하여 혼합한 후 바로 원심분리하여 상등액을 얻었다. 상등액에 디에틸에테르 100㎖를 더 넣어 PEG 의 카르복실 유도체를 침전시켰다. 침전물을 감압하에 건조시켜 IR 분석으로 카르복실기가 유도되었음을 확인하였다.

C. PEG 8,000 의 산화

실시예 1(1)의 A 및 B의 방법으로 PEG 8,000을 산화시켰다.

제 1 도에서 (A)는 PEG의 IR 스펙트럼이고, (B)는 유도체인 PEG-COOH의 IR 스택트럼을 나타낸다. (B)에서 1610cm^-1부근의 피크는 카르보닐기의 흡광을 나타내는 것으로 -COOH 가 유도되었음을 알 수 있다.

(2) 고분자의 활성화 반응

A. mPEG 카르복실 유도체의 활성화

상기 (1)의 A단계에서 수득된 mPEG-COOH 10g을 벤젠과 디클로로메탄의 3:1(v/v) 혼합물 25㎖ 에 용해시켰다. 상기 용액을 에탄올-얼음 중탕에서 -2℃∼-5℃ 로 유지한 후, 트리메틸아세틸클로라이드 0.73㎖를 조금씩 첨가하였다. 여기에 트리에틸아민 0.289㎖를 온도가 올라가지 않도록 천천히 떨어뜨린 후 2시간 동안 계속 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 여과하여 침전물을 제거한 후 여과액에 석유에테르 75㎖를 조금씩 부어 침전을 형성시켰다. 침전물을 벤젠과 디클로로메탄의 3:1(v/v) 혼합물 25㎖ 에 다시 용해시킨후 석유에테르 75㎖로 다시 침전시켰다. 상기 세척 및 침전과정을 한번 더 반복하였다. 침전물은 감압하에 건조시킨 후 습기가 통하지 않도록 밀봉해서 보관하였다.

B. PEG 4,000 및 PEG 8,000의 카르복실 유도체의 활성화

상기 (1)의 B 및 C 단계에서 각각 수득된 PEG 4,000 및 PEG 8,000의 카르복실 유도체를 상기 A와 같은 방법으로 활성화시켰다.

(3) 결합

A. 활성화된 mPEG 5,000 과 rhSOD 의 결합

재조합 인간 초산화물 불균화효소(rhSOD)는 1992년 10월 2일 자로 출원된 대한민국 특허 출원 제 92-18092 호에 기술된 방법으로 정제한 것을 사용하였다.

상기 (2)의 A 단계에서 수득한 활성화된 PEG를 rhSOD의 몰수에 대해 1, 2, 3, 4 및 5 배가 되도록 각각 첨가하여, 반응 완충용액으로서 40mM 나트륨 테트라보레이트 (pH 9.2) 중에서 반응시켰다.

상기 완충용액 25㎖에 rhSOD가 165mg이 되도록 하여 4℃에서 활성화된 Ac-mPEG(activated mPEG)를 0.2g 씩 5분 간격으로 모두 1.5g을 첨가하고 30분 더 반응시켰다. mPEG 와 공유결합된 rhSOD는 SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) 및 HPLC (high performance liquid chromatography)를 이용하여 반응 정도를 분석하였다.

B. 활성화된 PEG 4,000 및 PEG 8,000 과 rhSOD 의 결합

상기(2)의 B 및 C 단계에서 각각 수득한 활성화된 PEG 4,000 및 PEG 8,000을 상기 A와 같은 방법으로 rhSOD 와 결합시켰다.

제 2 도는 PEG-rhSOD 결합체의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다. 여기에서, 제 1 열 내지 제 9 열은 활성화된 PEG의 농도를 10 μM 내지 90μM의 범위로 10μM 씩 증가시킨 시료이고, 제 10 열은 표준 단백질이다. 0 PEG-rhSOD는 PEG가 결합되지 않은 rhSOD를 나타내고, 1 내지 3 PEG-rhSOD는 rhSOD 분자 하나에 각각 1 내지3개의 PEG가 결합된 형태를 나타낸다. 이로부터 알 수 있는 바와 같이, 활성화된 PEG의 양이 증가할 수록 rhSOD의 양은 줄어들고, PEG-rhSOD의 양이 단계적으로 증가한다.

제 3 도는 PEG-rhSOD 결합체의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다. 여기에서, (A)는 활성화된 PEG가 없는 경우, (B)는 활성화된 PEG농도가 10μM , (C)는 50μM, (D)는 90μM인 경우를 나타낸다. 이로부터 알 수 있는 바와 같이,이량체인 rhSOD가 PEG와 결합하면서 단량체로 분리되고 PEG의 양이 증가함에 따라 PEG-rhSOD의 분자량이 점차 증가한다.

(4) 정제

상기 (3)의 A, B 및 C 단계에서 수득한 mPEG-rhSOD 및 PEG-rhSOD 결합체 100㎖를 10mM트리스-HCl pH 7.8 완충용액으로 평형화된 Q-세파로즈(Sepharose) 컬럼에 주입하고, 동일한 용액 200㎖ 로 세척한 후, 100mM NaCl이 포함된 동일한 완충용액으로 용출속도 1㎖/분에서 용출시켰다.

실시예 2. PEG-rhSOD 의 혈중 반감기 측정

래트(Sprague Dawley rat, 화학연구소)는 200-250g 사이의 것을 사용했다. rhSOD(대조군), PEG-rhSOD 각각에 대해 5 마리씩의 래트를 사용하였다. rhSOD(24mg/㎖), PEG-rhSOD(22mg/㎖)을 각각 400㎕ 씩 주사하였다 이어서,0, 1, 2.5, 5, 10, 20, 40, 60, 120, 180 분마다 혈액을 400㎕ 씩 채취하여 원심분리로 혈구를 제거하고 혈장만 얻었다. 맥코이드 및 프리도비치의 문헌[McCoid and Fridovich, J. Biol. Chem., 244,6049-6055(1969)]에 기술된 방법을 사용하여, 각혈장 2㎕에 포함된 SOD의 효소활성을 측정해 혈중반감기를 계산하였다.

제 4 도는 PEG-rhSOD 결합체와 rhSOD의 혈중 활성을 나타낸 그래프로서, 여기에서, 기호 □, ◇, ● 및 ■는 PEG-rhSOD를 투여한 4 마리의 래트 각각에 대한 활성을 나타내고, 기호 △, ○ 및 ■는 rhSOD만을 투여한 경우의 각각의 래트에 대한 활성을 나타낸다. 결과는 rhSOD의 혈중 반감기가 약 6분 정도인 것에 비해 PEG-rhSOD 결합체는 3시간이 경과한 후에도 효소활성이 변하지 않았음을 보여준다. 이로부터 본 발명의 방법으로 형성된 PEG-rhSOD가 천연 rh-SOD에 비하여 혈중 반감기가 횔씬 증가되었음을 알 수 있다.

제 1 도 (A) 및 (B)는 각각 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 그의 카르복실 유도체인 PEG-COOH를 IR로 분석한 결과이고,

제 2 도는 PEG-rhSOD 결합체를 폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 결과이고,

제 3 도는 PEG-rhSOD 결합체의 분자량의 변화를 HPLC로 분석한 결과이고,

제 4 도는 PEG-rhSOD 결합체와 천연 rhSOD의 혈중 활성을 나타낸 그래프이다.

Claims (2)

1. (1) 분자량 4,000 내지 8,000인 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 (mPEG)의 히드록시기를 산화시켜 카르복실 유도체를 생성시키고, (2) 상기 유도체에 트리메틸아세틸클로라이드를 처리하여 활성화시키고, (3) 상기 활성화된 유도체를 재조합 인간 초-산화물 불균화효소 (rhSOD)의 라이신 잔기에 아미드 결합에 의해 결합시키는 단계를 포함하는,

   재조합 인간 초-산화물 불균화효소와 PEG 또는 mPEG의 결합체를 제조하는 방법.
2. 제 1항의 방법에 의해 제조되고 재조합 인간 초-산화물 불균화효소와 PEG 또는 mPEG가 아미드 결합으로 연결된 결합체.