ES2334044T3 - Vacunas para la prevencion y tratamiento de infeccion por vih. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido que comprende Nef o un fragmento o derivado inmunogénico de la misma, p17 Gag y p24 Gag o fragmentos o derivados inmunogénicos de las mismas, en el que hay al menos un antígeno de VIH o fragmento inmunogénico entre p17 Gag y Gag, comprendiendo adicionalmente el polipéptido RT o un fragmento o derivado inmunogénico de la misma, en el que los fragmentos o derivados inmunogénicos son capaces de aumentar una respuesta inmune frente al antígeno nativo.
Description
Vacunas para la prevención y tratamiento de
infección por VIH.
La presente invención se refiere a
construcciones de polipéptidos de VIH nuevas, a su uso en medicina,
a composiciones farmacéuticas que las comprenden y a procedimientos
para su fabricación. La invención también se refiere a
polinucleótidos que codifican los polipéptidos. En particular, la
invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden Nef de
VIH-1 y Gag de VIH-1 o fragmentos de
los mismos, y a polinucleótidos que los codifican. De forma más
particular, la invención se refiere a proteínas de fusión que
comprenden proteínas Nef de VIH-1, Pol de
VIH-1 y Gag de VIH-1 o fragmentos de
los mismos y a polinucleótidos que los codifican.
El VIH-1 es la causa primaria
del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) que está
catalogado como uno de los principales problemas de salud en el
mundo. Hay una necesidad de una vacuna para la prevención y/o
tratamiento de la infección por VIH.
El VIH-1 es un virus de ARN de
la familia de los retrovirales. El genoma del VIH codifica al menos
nueve proteínas que se dividen en tres clases: las proteínas
estructurales principales Gag, Pol y Env, las proteínas regulatorias
Tat y Rev, y las proteínas accesorias Vpu, Vpr, Vif y Nef. El
genoma del VIH muestra la organización
5'LTR-gag-pol-env-LTR3'
de todos los restrovirus.
La glicoproteína gp120 de envoltura del VIH es
la proteína viral que se usa para la adhesión a la célula huésped.
Esta adhesión está mediada por la unión de dos moléculas de
superficie de las células T de ayuda y macrófagos, conocidos como
CD4 y uno de los dos receptores de la quemoquina
CCR-5 o CXCR-4. La proteína gp120 se
expresa en primer lugar como una molécula precursoras mayor
(gp160), que luego se escinde
post-translacionalmente para dar gp120 y gp41. La
proteína gp120 está retenida sobre la superficie del virón mediante
conexión a la molécula gp41, que está insertada en la membrana
viral.
La proteína gp120 es la diana principal de los
anticuerpos de neutralización, pero desafortunadamente la mayoría
de las regiones inmunogénicas de las proteínas (bucle V3) son
también las partes más variables de la proteína. Por tanto, se cree
que el uso de gp120 (o su precursor gp160) como un antígeno para
vacuna para educir anticuerpos de neutralización va a ser de uso
limitado para una vacuna ampliamente protectora. La proteína gp120
también contiene epítopos que son reconocidos por linfocitos T
citotóxicos (CTL). Estas células efectoras son capaces de eliminar
las células infectadas con virus, y por tanto constituyen un segundo
mecanismo inmunológico antiviral principal. Al contrario que las
regiones diana de anticuerpos de neutralización algunos epítopos de
CTL parecen ser conservados relativamente entre diferentes cepas de
VIH. Por esta razón gp120 y gp160 pueden ser componentes
antigénicos útiles en vacunas que ayudan a educir respuestas inmunes
mediadas por células (particularmente CTL).
Proteínas de no envoltura de
VIH-1 incluyen, por ejemplo, proteínas estructurales
internas tales como los productos de genes gag y pol y otras
proteínas no estructurales tales como Rev, Nef, Vif y Tat (Green y
col., New England J. Med, 324, 5, 308 y siguientes (1991) y Bryant
y col. (Ed. Pizzo), Pediatr. Infect. Dis. J., 11, 5, 390 y
siguientes (1992).
La Nef del VIH es una proteína temprana, esto
es, es expresada pronto en infección y en ausencia de proteína
estructural.
El gen de Nef codifica pronto una proteína del
VIH accesoria que ha demostrado poseer varias actividades. Por
ejemplo, se sabe que la proteína Nef provoca la baja regulación de
CD4, receptor del VIH, y moléculas de clase I MHC de la superficie
celular, aunque está en debate la importancia biológica de estas
funciones. De forma adicional, Nef interactúa con la ruta de señal
de las células T e induce un estado activo, que en cambio puede
promover expresión génica más eficiente. Algunos aislados del VIH
presentan mutaciones en esta región, lo que hace que no codifiquen
proteína funcional y se vean seriamente comprometidos en su
replicación y patogénesis in vivo.
El gen de Gag se translada como una poliproteína
precursora que se escinde mediante proteasa para dar productos que
incluyen la proteína matriz (p17), la cápsida (p24), la
nucleocápsida (p9), p6 y dos péptidos espaciales, p2 y p1.
El gen Gag da lugar a la proteína precursora Gag
de 55 kilodalton (kD), también denominada p55, que se expresa a
partir del ARNm viral no empalmado. Durante la translación el
término N de p55 es miristoilado, activando su asociación con el
aspecto citoplasmático de las membranas celulares. La poliproteína
Gag asociada a la membrana recluta dos copias del ARN genómico
viral con otras proteínas virales y celulares que activa la
germinación de la partícula viral desde la superficie de una célula
infectada. Tras la germinación se esciende la p55 mediante la
proteasa codificada viralmente (un producto del gen de pol) durante
el proceso de maduración viral en cuatro proteínas más pequeñas
designadas MA (matriz [p17]), CA (cápsida [p24]), NC (nucleocápsida
[p9]), y p6.
Además de las 3 proteínas Gag principales, todos
los precursores de Gag contienen otras regiones distintas, que se
escinden y permanecen en el virión como péptidos de varios tamaños.
Estas proteínas tienen diferentes papeles, por ejemplo, la proteína
p2 tiene un papel propuesto en la regulación de la actividad de la
proteasa y contribuye a la cronología correcta del procesamiento
proteolítico.
El polipéptido p17 (MA) se deriva del extremo
miristoilado, de terminal N de la p55. La mayoría de las moléculas
de MA permanecen adheridas a la superficie interna de la bicapa
lípida del virión, estabilizando la partícula. Se recluta un
subconjunto de MA dentro de las capas más profundas del virión,
donde comienza a formar parte del complejo que acompaña al ADN
viral al núcleo. Estas moléculas de MA facilitan el transporte
nuclear del genoma viral debido a que es reconocida una señal
cariofílica en MA por parte de la maquinaria de importación nuclear
celular. Este fenómeno permite al VIH infectar las células que no se
dividen, una propiedad inusual para un retrovirus.
La proteína p24 (CA) forma el núcleo cónico de
las partículas virales. Se ha demostrado que la ciclofilina A
interactúa con la región p24 de la p55 llevando a su incorporación a
las partículas de VIH. La interacción entre Gag y ciclofilina A es
esencial debido a que la disrupción de esta interacción por parte de
la ciclosporina A inhibe la replicación viral.
La región NC de Gag es responsable del
reconocimiento específico de la denominada señal de empaquetamiento
del VIH. La señal de empaquetamiento consiste en cuatro estructuras
tallo-bucle localizadas cerca del extremo 5' del
ARN viral, y es suficiente para mediar la incorporación de un ARN
heterólogo en los viriones de VIH-1. La NC se une a
la señal de empaquetamiento a través de interacciones mediadas por
dos motivos dedo de cinc. La NC también facilita la transcripción
inversa.
La región polipeptídica p6 media las
interacciones entre p55 Gag y la proteína accesoria Vpr, llevando a
la incorporación de Vpr en viriones de ensamblado. La región p6
también contiene un denominado dominio tardío que se requiere para
la liberación eficiente de viriones de germinación desde una célula
infectada.
El gen de Pol codifica dos proteínas que
contienen las dos actividades necesitadas por el virus en la
infección precoz, la RT y la proteína integrasa necesarias para la
integración del ADN viral en el ADN de la célula. El producto
primario de Pol se escinde mediante la proteasa del virión para dar
el péptido RT de terminal amino que contiene necesariamente
actividades para la síntesis de ADN (actividad de ADN polimerasa
dependiente de ARN y ADN así como también una función de ARNasa H)
y proteína integrasa de terminal carboxi. La RT del VIH es un
heterodímero de RT (p66) de longitud completa y un producto de
escisión (p51) al que le falta el dominio de ARNasa H de terminal
carboxi.
RT es una de las proteínas más altamente
conservadas codificada por el genoma retroviral. Dos actividades
principales de RT son la ADN Pol y la ribonucleasa H. La actividad
de ADN Pol de RT usa ARN y ADN como templados de forma
intercambiable y como todas las ADN polimerasas conocidas es incapaz
de iniciar la síntesis de ADN de nuevo, pero requiere una molécula
pre-existente para servir como un cebador (ARN).
La actividad de la ARNasa H inherente en todas
las proteínas RT juega el papel esencial, ya en la replicación, de
eliminación del genoma de ARN cuando tiene lugar la síntesis de ADN.
Degrada de forma selectiva el ARN de todas las moléculas híbridas
ARN-ADN. Estructuralmente la polimerasa y la ribo H
ocupan dominios no solapados, separados con la Pol cubriendo las
dos terceras partes de los amino de la Pol.
La subunidad catalítica p66 está plegada en 5
subdominios distintos. El terminal amino 23 de estos tiene la parte
con actividad de RT. El terminal carboxi de estos es el dominio
ARNasa H.
El documento WO 03/025003 describe
construcciones de ADN que codifican p17/24 Gag, Nef y RT del
VIH-1, en los que las secuencias de ADN pueden
estar optimizadas con codón para parecerse a genes humanos altamente
expresados. Estas construcciones son útiles en vacunas de ADN.
Se han sugerido proteínas de fusión que
contienen múltiples antígenos de VIH como candidatos a vacunas para
VIH, por ejemplo, la fusión Nef-Tat como se describe
en el documento WO 99/16884. Sin embargo, las proteínas de fusión
no son de producción directa; puede haber dificultades en la
expresión de las mismas debido a que no se corresponden con
proteínas nativas. Puede haber dificultades a nivel de
transcripción, o posteriormente. Estas tampoco son de formulación
directa en una composición farmacéuticamente aceptable. De forma
notable, la mayoría de los enfoques de vacunas para VIH que
implican múltiples antígenos condensados conjuntamente, son
enfoques de ADN o vector vivo más que proteínas de fusión de
polipéptidos.
La presente invención proporciona construcciones
nuevas para uso en vacunas para la profilaxis y tratamiento de
infecciones por VIH y SIDA.
En un aspecto la invención proporciona un
polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones.
En las construcciones y composiciones de acuerdo
con la invención como se describen en esta invención, la Nef es
preferiblemente una Nef de longitud completa.
En las construcciones de acuerdo con la
invención la p17 Gag y p24 Gag son preferiblemente p17 y p24 de
longitud completa respectivamente.
En las construcciones de acuerdo con la
invención la p17 Gag y p24 Gag son preferiblemente p17 y p24 de
longitud completa respectivamente.
El polipéptido comprende tanto p17 como p24 Gag
o fragmentos inmunogénicos de los mismos. En una construcción de
este tipo el componente p24 Gag y el componente p17 Gag están
separados por al menos un antígeno de VIH adicional o fragmento
inmunogénico, tal como Nef y/o RT o fragmentos inmunogénicos o
derivados de las mismas.
La construcción de polipéptido de acuerdo con la
invención comprende además RT o un fragmento o derivado inmunogénico
de la misma. Fragmentos particulares de RT que son adecuados para
uso en la invención son fragmentos en los que la RT está truncada
en el término C, preferiblemente de modo que les falta el dominio
ARNasa H de terminal carboxi. Un fragmento de este tipo al que le
falta el dominio ARNasa H de terminal carboxi es el fragmento p51
descrito en esta invención.
Preferiblemente la RT o fragmento inmunogénico
en las proteínas de fusión descritas en esta invención es p66 RT o
p51 RT.
El componente RT de la proteína de fusión o
composición de acuerdo con la invención comprende de forma opcional
una mutación en la posición 592, o mutación equivalente en cepas
distintas a HXB2, de modo que la metionina se elimina mediante
mutación en otro residuo, por ejemplo.
En las proteínas de fusión de acuerdo con la
invención que comprenden p24 y RT, puede ser preferible que la p24
preceda a la RT en la construcción debido a que cuando los antígenos
se expresan sólos en E. coli se observa mejor expresión de
p24 que de RT.
Construcciones preferidas de acuerdo con la
invención incluyen las siguientes:
- 1.
- p24 - RT - Nef - p17
- 2.
- p24 - RT* - Nef - p17
- 3.
- p24 - p51RT - Nef - p17
- 4.
- p24 - p51RT* - Nef - p17
\hskip0.5cm* representa mutación de metionina_{592} en RT a lisina
El conector incluido en las construcciones
enumeradas anteriormente puede ser cualquier secuencia de
aminoácidos corta para disminuir las interacciones potenciales
entre los dos partícipes de la fusión que los conecta. El conector
puede ser, por ejemplo, de 4 a 10 aminoácidos de longitud. Por
ejemplo, puede ser una secuencia de 6 aminoácidos tal como la
secuencia GSGGGP descrita en esta invención en los ejemplos.
En otro aspecto la presente invención
proporciona una proteína de fusión de antígenos de VIH que comprende
al menos cuatro antígenos de VIH o fragmentos inmunogénicos, en los
que cuatro antígenos o fragmentos son o se derivan de Nef, Pol y
Gag. En este aspecto Gag está presente como dos componentes
separados que están separados por al menos otro antígeno en la
fusión. Preferiblemente la Nef es Nef de longitud completa.
Preferiblemente la Pol es p66 o p51RT. Preferiblemente la Gag es
p17 y p24 Gag. Otros rasgos preferidos y propiedades de los
componentes del antígeno de la fusión en este aspecto de la
invención son como se describen en esta invención.
Realizaciones preferidas de este aspecto de la
invención son las cuatro fusiones de componentes que ya se
enumeraron anteriormente:
- 1.
- p24 - RT - Nef - p17
- 2.
- p24 - RT* - Nef - p17
- 3.
- p24 - p51RT - Nef - p17
- 4.
- p24 - p51RT* - Nef - p17
El término "derivado de" o "derivado"
respecto a los antígenos de VIH incluidos en la invención significa
que los antígenos pueden haber sido alterados de modo limitado en
comparación con sus contrapartes originales. Esto incluye
mutaciones puntuales que pueden cambiar las propiedades de la
proteína, por ejemplo, mediante la mejora de la expresión en
sistemas procarióticos o eliminación de actividad no deseable
incluyendo actividad del enzima no deseable. Las mutaciones
puntuales descritas en esta invención para la RT se diseñan para
alcanzar estos hechos. Sin embargo, los antígenos deben permanecer
suficientemente similares a los antígenos nativos de modo que
mantengan las propiedades antigénicas deseables en una vacuna y así
permanecer capaces de dar una respuesta inmune frente al antígeno
nativo. De lugar o no un derivado determinado una respuesta inmune
de este tipo se puede medir con un ensayo inmunológico adecuado tal
como ELISA (para respuestas de anticuerpos) o citometría de flujo
usando tintado adecuado para marcadores celulares y citoquinas (para
respuestas celulares).
Las construcciones polipeptídicas de antígenos
de VIH de acuerdo con la invención son capaces de ser expresadas en
sistemas in vitro incluyendo sistemas procarióticos tales
como E. coli. De forma ventajosa, estas se pueden purificar
mediante procedimientos de purificación convencionales.
Las fusiones descritas en esta invención son
preferiblemente solubles cuando se expresan en un sistema de
expresión seleccionado, esto es, están presentes en una cantidad
sustancial en el sobrenadante de un extracto bruto del sistema de
expresión. La presencia de la proteína de fusión en el extracto
bruto se puede medir mediante medios convencionales tales como
elución en un gel SDS, tintado con Coomassie y comprobación de la
banda apropiada mediante medida densitométrica. Las proteínas de
fusión de acuerdo con la invención son preferiblemente solubles al
menos en el 50%, más preferiblemente solubles al menos en el 70%, lo
más preferiblemente solubles en el 90% o más medido mediante las
técnicas descritas en esta invención en los ejemplos. Se conocen
técnicas para mejorar la solubilidad de las proteínas expresadas
recombinantemente, por ejemplo, en sistemas de expresión
procarióticos se mejora la solubilidad mediante disminución de la
temperatura a la que se induce la expresión génica.
Las proteínas de fusión descritas en esta
invención se pueden purificar. En particular se pueden purificar
mientras permanecen solubles o significativamente solubles.
Fragmentos inmunogénicos como se describen en
esta invención contendrán al menos un epítopo del antígeno y
mostrará antigenicidad por VIH y son capaces de dar una respuesta
inmune cuando estaban presentes en una construcción adecuada, tal
como por ejemplo cuando estaban condensados con otros antígenos de
VIH o se presentaba en un vehículo, siendo dirigida la respuesta
inmune contra el antígeno nativo. De forma típica los fragmentos
inmunogénicos contienen al menos 20, preferiblemente 50, más
preferiblemente 100 aminoácidos contiguos al antígeno de VIH.
La invención proporciona en un aspecto más
polinucleótidos que codifican los polipéptidos de acuerdo con la
invención.
Se pueden usar polinucleótidos de acuerdo con la
invención como vacunas de polinucleótidos. Los polinucleótidos
pueden estar presentes dentro de cualquiera de una variedad de
sistemas de liberación conocidos por los especialistas en la
técnica, incluyendo sistemas de expresión de ácido nucleico tales
como ADN plásmido, sistemas de expresión bacterianos y virales. Son
bien conocidas en la técnica numerosas técnicas de liberación de
genes, tales como las descritas por Rolland, Crit. Rev. Therap.
Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998 y referencias
citadas en ese documento. Sistemas de expresión de ácido nucleico
apropiados contienen las secuencias de ADN necesarias para la
expresión en el paciente (tal como un promotor adecuado y señal de
terminación). Cuando el sistema de expresión es un microorganismo
vivo recombinante, tal como un virus o bacteria, el gen de interés
se puede insertar dentro del genoma del virus recombinante vivo o
bacteria. La inoculación y la infección in vivo con este
vector vivo llevará a la expresión in vivo del antígeno e
inducción de respuestas inmunes. Virus y bacterias usadas para este
fin son, por ejemplo: poxvirus (por ejemplo, vaccinia, fowlpox,
canaripox, poxvirus modificados, por ejemplo, virus Ankara
modificado (MVA)), alfavirus (virus Sindbis, virus Semliki Forest,
virus de la encefalitis equina venezolana), flavivirus (virus de la
fiebre amarilla, virus del dengue, virus de la encefalitis
japonesa), adenovirus, virus adeno-asociados,
picornavirus (poliovirus, rinovirus), virus de herpes (virus
varicella zoster, etc), morbilivirus (e.g. rubeola), Listeria,
Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. Estos virus y bacterias
pueden ser virulentos, o ser atenuados de varias formas con el fin
de obtener vacunas vivas. Tales vacunas vivas también forman parte
de la invención.
Un vector de rubéola preferido para uso como un
vector vivo de acuerdo con la invención es la cepa de Schwartz o
una cepa derivada de la misma.
Un adenovirus preferido para uso como un vector
vivo es un adenovirus humano sero-prevalente
inferior tal como Ad5 o Ad35 o un adenovirus de origen no humano
tal como un adenovirus de primate no humano tal como un adenovirus
de simio. Tal adenovirus humanos sero-prevalentes
inferiores o similares tendrán menos de 60, de forma típica menos
del 50%, de sero-prevalencia en la población.
Preferiblemente, los vectores son defectivos en la replicación. De
forma típica estos virus contienen una deleción en E1 y se pueden
criar en líneas celulares que se transforman con un gen E1. Los
adenovirus de simio preferidos son virus aislados de chimpancés. En
particular C68 (también conocido como Pan9) (véase la patente de
Estados Unidos nº 6083716) y se prefieren para uso en la presente
invención Pan 5, 6 y Pan 7 (documento W0 03/046124). Estos vectores
se pueden manipular para insertar un polinucleótido heterólogo de
acuerdo con la invención de modo que se pueden expresar los
polipéptidos de acuerdo con la invención. El uso, formulación y
fabricación de tales vectores adenovirales recombinantes se
describe detalladamente en el documento WO 03/046142.
Por tanto, se puede proporcionar Nef, p17 y p24
Gag y RT de una vacuna preferida de acuerdo con la invención en
forma de un polinucleótido que codifica el polipéptido deseado.
Se pueden usar los polinucleótidos de acuerdo
con la invención para expresar los polipéptidos codificados en un
sistema de expresión seleccionado. Al menos uno de los antígenos de
VIH, por ejemplo, la RT, se puede codificar mediante una secuencia
optimizada con codón en el polinucleótido, esto quiere decir que la
secuencia ha sido optimizada para la expresión en un sistema de
expresión recombinante seleccionado tal como E. coli.
En otro aspecto la invención proporciona un
polipéptido p51 RT o derivado del mismo o un polinucleótido que lo
codifica, preferiblemente optimizado con codón para la expresión en
un sistema de expresión adecuado, en particular un sistema
procariótico tal como E. coli.
El polipéptido p51 RT o polinucleótido se puede
usar sólo, o en combinación con una construcción de polipéptido o
polinucleótido de acuerdo con la invención. Por tanto, en un aspecto
más la invención proporciona una composición que comprende (i) un
polipéptido que comprende Nef o un fragmento que contiene epítopo de
Nef y p17 Gag y/o p24 Gag, en los que cuando ambos p17 y p24 Gag
están presentes hay al menos un antígeno de VIH o fragmento
inmunogénico entre ellos y (ii) un polipéptido p51 RT. La invención
proporciona además polinucleótidos que codifican estos.
Preferiblemente Nef es Nef de longitud completa.
Preferiblemente p17 es p17 de longitud completa.
Los polipéptidos y polinucleótidos de acuerdo
con la invención se pueden combinar con otros antígenos o
polinucleótidos que codifican otros antígenos. En particular, esto
puede incluir proteínas env del VIH o fragmentos o derivados de las
mismas. Las formas preferidas de env son gp120, gp140 y gp160. La
env puede ser, por ejemplo, la proteína de envoltura descrita en el
documento WO 00/07631 de un clon de envoltura de clado B de
VIH-1 conocido como R2, o un fragmento o derivado
del mismo. Por tanto, la invención proporciona además una
composición que comprende cualquiera de los polipéptidos o
composiciones de polipéptido de acuerdo con la invención, junto con
una proteína env del VIH o fragmento o derivado de la misma. De
forma similar la invención proporciona una composición que
comprende un polinucleótido o polinucleótidos que codifican un
polipéptido o polipéptidos de acuerdo con la invención y un
polinucleótido que codifica una proteína env del VIH o fragmento o
derivado de la misma.
La invención proporciona además procedimientos
de preparación de los polipéptidos descritos en esta invención, tal
procedimiento comprende la expresión de un polinucleótido que
codifica el polipéptido en un sistema de expresión adecuado, en
particular un sistema procariótico tal como E. coli y
reconversión del polipéptido expresado. Preferiblemente se induce
la expresión a una temperatura baja, que es una temperatura por
debajo de 37º, para promover la solubilidad del polipéptido.
La invención proporciona además un procedimiento
para la purificación de un polipéptido como se describe en esta
invención, tal procedimiento comprende:
- i).
- proporcionar una composición que comprende el polipéptido no purificado;
- ii).
- someter la composición a al menos dos etapas cromatográficas;
- iii).
- de forma opcional carboxiamidación del polipéptido;
- iv)
- llevar a cabo una etapa de intercambio en tampón para proporcionar la proteína en un tampón adecuado para una formulación farmacéutica.
La carboxiamidación se puede llevar a cabo entre
las dos etapas cromatográficas. La etapa de carboxiamidación se
puede llevar a cabo usando yodoacetamida.
En un ejemplo, el procedimiento de acuerdo con
la invención no usa más de dos etapas cromatográficas.
La invención proporciona además composiciones
farmacéuticas y composiciones inmunogénicas y vacunas que comprenden
los polipéptidos y polinucleótidos de acuerdo con la invención, en
combinación con un adyuvante o vehículo farmacéuticamente
aceptable.
Las vacunas de acuerdo con la invención se
pueden usar para inmunización profiláctica o terapéutica contra
VIH.
La invención proporciona además el uso de los
polipéptidos y composiciones de polipéptido y los polinucleótidos y
composiciones de polinucleótido como se describen en esta invención,
en la fabricación de una vacuna para inmunización profiláctica o
terapéutica contra VIH.
La vacuna de la presente invención contendrá una
cantidad inmunoprotectora o inmunoterapéutica del polipéptido y/o
antígenos de polinucleótido y se puede preparar mediante técnicas
convencionales.
La preparación de vacuna se describe en general
en New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller y
col., University Park Press, Baltimore, Maryland, EEUU 1978. La
encapsulación dentro de liposomas se describe, por ejemplo, por
parte de Fullerton, patente de Estados Unidos 4.235.877. La
conjugación de proteínas en macromoléculas se describe, por
ejemplo, por parte de Likhite, patente de Estados Unidos 4.372.945 y
por parte de Armor y col., patente de Estados Unidos 4.474.757.
La cantidad de proteína en la dosis de vacuna se
selecciona como una cantidad que induce una respuesta
inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos significativos en
vacunas típicas. Tal cantidad variará dependiendo de qué inmunógeno
específico se use y del régimen de vacunación que se seleccione. En
general se espera que cada dosis comprenda de 1 a 1000 \mug de
cada proteína, preferiblemente de 2 a 200 \mug, lo más
preferiblemente de 4 a 40 \mug de la fusión de polipéptido. Se
puede averiguar una cantidad óptima para una vacuna determinada
mediante estudios convencionales que incluyen la observación de
títulos de anticuerpo y otras respuestas inmunes en sujetos. Tras
una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir un refuerzo en
aproximadamente 4 semanas, y una segunda inmunización de refuerzo a
continuación.
Las proteínas de la presente invención están
preferiblemente adyuvadas en la formulación de vacuna de la
invención. Se describen adyuvantes en general en Vaccine Design -
the Subunit and Adjuvant Approach, editado por Powell and Newman,
Plenum Press, Nueva York, 1995.
Adyuvantes adecuados incluyen una sal de
aluminio tal como hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, pero
también pueden ser una sal de calcio, hierro o cinc, o pueden ser
una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados,
polisacáridos derivatizados catiónicamente o aniónicamente, o
polifosfazenos.
En la formulación de la invención se prefiere
que la composición adyuvante incluya una respuesta Th1 preferencial.
Sin embargo, se entenderá que no se excluyan otras respuestas,
incluyendo otras respuestas humorales.
Se genera una respuesta inmune a un antígeno a
través de la interacción del antígeno con las células del sistema
inmune. La respuesta inmune resultante se puede distinguir
ampliamente en dos categorías extremas, siendo respuestas inmunes
humorales o mediadas por células (caracterizadas tradicionalmente
por mecanismos efectores de anticuerpo y celulares de protección
respectivamente). Estas categorías de respuesta se han denominado
respuestas de tipo Th1 (respuesta mediada por célula), y respuestas
inmunes de tipo Th2 (respuestas humorales).
Las respuestas inmunes de tipo Th1 extremas se
pueden caracterizar por la generación de linfocitos T citotóxicos
restringidos por el haplotipo, específicos del antígeno, y
respuestas de células asesinas naturales. En ratones, las
respuestas de tipo Th1 se caracterizan frecuentemente por la
generación de anticuerpos del subtipo IgG2a, mientras que en el
humano estas corresponden a anticuerpos de tipo IgG1. Las respuestas
inmunes de tipo Th2 se caracterizan por la generación de un amplio
intervalo de isotipos de inmunoglobulina incluyendo en ratones
IgG1, IgA e IgM.
Se puede considerar que la fuerza impulsora
detrás del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunes son
las citoquinas, un número de mensajeros proteicos identificados que
sirven para ayudar a las células del sistema inmunológico y dirigir
la respuesta inmune eventual a una respuesta Th1 o Th2. Por tanto,
niveles elevados de citoquinas de tipo Th1 tienden a favorecer la
inducción de respuestas inmunes mediadas por células respecto al
antígeno administrado, mientras que niveles elevados de citoquinas
de tipo Th2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes
humorales respecto al antígeno.
Es importante recordar que la distinción de
respuestas inmunes de tipo Th1 y Th2 no es absoluta. En realidad un
individuo soportará una respuesta inmune que se describe que es
predominantemente Th1 o predominantemente Th2. Sin embargo, es
frecuentemente conveniente considerar las familias de citoquinas en
términos de lo descrito en clones de células T CD4+ve murinas por
parte de Mosmann y Coffman (Mosmann, T.R. and Coffman, R.L.
(1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine
secretion lead to different functional properties. Annual Review of
Immunology, 7, páginas 145 a 173). Tradicionalmente las
respuestas de tipo Th1 están asociadas con la producción de las
citoquinas INF-\gamma e IL-2 por
parte de linfocitos T. Otras citoquinas frecuentemente asociadas
directamente con la inducción de respuestas inmunes de tipo Th1 no
son producidas por células T, tales como IL-12. Por
el contrario las respuestas de tipo Th2 estás asociadas con la
secreción de IL-4, IL-5,
IL-6, IL-10 y factor de necrosis
tumoral \beta (TNF-\beta).
Se sabe que ciertos adyuvantes de vacuna son
particularmente adecuados para la estimulación de respuestas de
citoquina de tipo Th1 o Th2. Tradicionalmente los mejores
indicadores del equilibrio Th1 :Th2 de la respuesta inmune tras una
vacunación o infección incluye la medida directa de la producción de
citoquinas Th1 o Th2 por parte de linfocitos T in vitro tras
reestimulación con antígeno, y/o la medida de la relación IgG1:IgG2a
de respuestas de anticuerpo específicas de antígeno.
Por tanto, un adyuvante de tipo Th1 es uno que
estimula poblaciones de células T aisladas para producir altos
niveles de citoquinas de tipo Th1 cuando se
re-estimulan con antígeno in vitro, e induce
respuestas de inmunoglobulina específicas del antígeno asociadas
con isotipo de tipo Th1.
Inmunoestimulantes de tipo Th1 preferidos que se
pueden formular para producir adyuvantes adecuados para uso en la
presente invención incluyen los siguientes sin restringirse a
estos.
Monofosforil lípido A, en particular el
monofosforil lípido A
3-de-O-acilado
(3D-MPL), es un inmunoestimulante de tipo Th1
preferido para uso en la invención. 3D-MPL es un
adyuvante bien conocido fabricado por Ribi Immunochem, Montana.
Químicamente es suministrado frecuentemente como una mezcla de
monofosforil lípido A
3-de-O-acilado con
cadenas aciladas en 4, 5 ó 6. Se puede purificar y preparar mediante
los procedimientos dados a conocer en el documento GB 2122204B, tal
referencia también describe la preparación de difosforil lípido A, y
variantes 3-O-deaciladas del mismo.
Se han descrito otros lipopolisacáridos purificados y sintéticos
(documentos US 6.005.099 y EP 0729473 B1; Hilgers y col.,
1986, Int. Arch. Allergy. Immunol.,
79(4):392-6; Hilgers y col., 1987,
Immunology, 60(1):141-6; y EP 0549074 B1).
Una forma preferida de 3D-MPL es en la forma de una
formulación particulada que tiene un tamaño de particular pequeño
inferior a 0,2 \mum de diámetro, y su procedimiento de
fabricación se describe en el documento EP 0689454.
Las saponinas son también inmunoestimulantes Th1
preferidos de acuerdo con la invención. Las saponinas son
adyuvantes bien conocidos y se dan a conocer en:
Lacaille-Dubois, M y Wagner H. (1996. A review of
the biological and pharmacological activities of saponins.
Phytomedicine volumen 2, páginas 363-386). Por
ejemplo, se describen Quil A (derivado de la corteza del árbol
sudamericano Quillaja Saponaria Molina), y fracciones del mismo, en
el documento US 5.057.540 y en "Saponins as vaccine adjuvants",
Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12
(1-2):1-55; y en el documento EP
0362279 B1. Se han descrito saponinas hemolíticas QS21 y QS17
(fracciones de Quil A purificadas con HPLC) como potentes adyuvantes
sistémicos, y se describe el procedimiento de su producción en la
patente de Estados Unidos número 5.057.540 y en el documento EP
0362279 B1. También se describe en estas referencias el uso de QS7
(una fracción no hemolítica de Quil-A) que actúa
como un potente adyuvante para vacunas sistémicas. El uso de QS21
se describe además por parte de Kensil y col. (1991. J.
Immunology volumen 146, 431-437). Se conocen también
combinaciones de QS21 y polisorbato o ciclodextrina (documento WO
99/10008). Los sistemas adyuvantes particulados que comprenden
fracciones de QuilA, tales como QS21 y QS7 se describen en los
documentos WO 96/33739 y WO 96/11711. Un sistema de este tipo es
conocido como un Iscorn y puede contener una o más saponinas.
Otro inmunoestimulante preferido es un
oligonucleótido inmunoestimulatorio que contiene dinucleótidos CpG
no metilados ("CpG"). CpG es una abreviatura de motivos de
dinucleótido de citosin-guanosina presentes en ADN.
CpG es conocido en la técnica como un adyuvante cuando se
administra tanto por vía sistémica como mucosal (documentos WO
96/02555, EP 468520, Davis y col, J. Immunol, 1998,
160(2):870-876; McCluskie y Davis, J.
Immunol., 1998, 161 (9):4463-6). Históricamente
se observó que la fracción de ADN de BCG podría ejercer un efecto
anti-tumor. En otros estudios, se demostró que
oligonucleótidos sintéticos derivados de secuencias de genes de BCG
son capaces de inducir efectos inmunoestimulatorios (tanto in
vitro como in vivo). Los autores de estos estudios
concluyeron que ciertas secuencias palindrómicas, incluyendo un
motivo CG central, portaban esta actividad. El papel central del
motivo CG en la inmunoestimulación se elucidaba más tarde en una
publicación de Krieg, Nature 374, páginas 546 1995. Análisis
detallados han mostrado que el motivo CG tiene que estar en un
cierto contexto de secuencia, y que esas secuencias son comunes en
ADN bacteriano pero que son raras en ADN de vertebrados. La
secuencia inmunoestimulatoria es frecuentemente: Purina, Purina, C,
G, pirimidina, pirimidina; en la que el motivo CG no está metilado,
pero se conocen otras secuencias CpG no metiladas por ser
inmnoestimulatorias y se pueden usar en la presente invención.
En ciertas combinaciones combinaciones de los
seis nucleótidos está presente una secuencia palindrómica. Pueden
estar presentes en el mismo oligonucleótido varios de estos motivos,
bien como repeticiones de un motivo o una combinación de distintos
motivos. La presencia de una o varias de estas secuencias
inmunoestimulatorias que contienen oligonucleótidos puede activar
distintos subconjuntos inmunes, incluyendo células asesinas
naturales (que producen interferona \gamma y tienen actividad
citolítica) y macrófagos (Wooldrige y col. volumen 89 (número 8),
1977). Otras secuencias que contienen CpG no metilado que no tienen
esta secuencia de consenso se ha demostrado también ahora que son
inmunomodulatorias.
GpG cuando se formula en vacunas, se administra
por lo general en solución libre junto con antígeno libre
(documento WO 96/02555; McCluskie y Davis, véase anteriormente) o
conjuntado convalentemente con un antígeno (documento WO 98/16247),
o formularse con un vehículo tal como hidróxido de aluminio
((antígeno de superficie de la hepatitis) Davis y col. véase
anteriormente; Brazolot-Millan y col, Proc. Natl.
Acad. Sci, EEUU, 1998, 95(26),
15553-8).
Tales inmunoestimulantes como se describen
anteriormente, se pueden formular junto con vehículos, tales como
por ejemplo liposomas, emulsiones aceite en agua y o sales
metálicas, incluyendo sales de aluminio (tal como hidróxido de
aluminio). Por ejemplo, se puede formular 3D-MPL con
hidróxido de aluminio (documento EP 0689454) o en emulsiones aceite
en agua (documento WO 95/17210); se puede formular QS21 de forma
ventajosa con liposomas que contienen colesterol (documento WO
96/33739), emulsiones aceite en agua (documento WO 95/17210) o
alumbre (documento WO 98/15287); CpG se puede formular con alumbre
(Davis y col. véase anteriormente; Brazolot-Millan
véase anteriormente) o con otros vehículos catiónicos.
Se prefieren también combinaciones de
inmunoestimulantes, en particular una combinación de un monofosforil
lípido A y un derivado de saponina (documentos WO 94/00153; WO
95/17210; WO 96/33739; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241), más
particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL como
se describe en el documento WO 94/00153. De forma alternativa, una
combinación de CpG más una saponina tal como QS21 también forma un
adyuvante potente para uso en la presente invención. De forma
alternativa, la saponina se puede formular en un liposoma o en un
Iscorn y combinarse con un oligonucleótido inmunoestimulatorio.
Por tanto, sistemas adyuvantes adecuados
incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil lípido A,
preferiblemente 3D-MPL, junto con una sal de
aluminio. Un sistema mejorado incluye la combinación de un
monofosforil lípido A y un derivado de saponina, particularmente la
combinación de QS21 y 3D-MPL como se describió en el
documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica donde
el QS21 se desactiva en liposomas que contienen colesterol (DQ)
como se describe en el documento WO 96/33739. Esta combinación puede
comprender adicionalmente un oligonucleótido
inmunoestimulatorio.
Se describe una formulación adyuvante
particularmente potente que involucra QS21, 3D-MPL y
tocoferol en una emulsión aceite en agua en el documento WO
95/17210 y es otra formulación preferida para uso en la
invención.
Otra formulación preferida comprende un
oligonucleótido CpG sólo o junto con una sal de aluminio.
En un aspecto adicional de la presente invención
se proporciona un procedimiento para la fabricación de una
formulación de vacuna como se describe en esta invención, en el que
el procedimiento comprende mezcla de un polipéptido de acuerdo con
la invención con un adyuvante adecuado.
Las combinaciones adyuvantes particularmente
preferidas para uso en las formulaciones de acuerdo con la invención
son como sigue:
- i)
- 3D-MPL + QS21 en un liposoma
- ii)
- Alumbre + 3D-MPL
- iii)
- Alumbre + QS21 en a liposome + 3D-MPL
- iv)
- Alumbre + CpG
- v)
- 3D-MPL + QS21 + emulsión aceite en agua
- vi)
- CpG
La administración de la composición farmacéutica
puede tomar la forma de una o de más de una dosis individual, por
ejemplo, como dosis repetidas de la misma composición que contiene
polipéptido, o en un régimen de vacunación
"inducción-refuerzo" heterólogo. Un régimen
inducción-refuerzo heterólogo usa administración de
diferentes formas de vacuna en la inducción y el refuerzo, cada una
de las cuales puede incluir por sí misma dos o más
administraciones. La composición de inducción y la composición de
refuerzo tendrán al menos un antígeno en común, aunque no es
necesariamente una forma idéntica del antígeno, esta puede ser una
forma diferente del mismo antígeno.
Se pueden llevar a cabo inmunizaciones de
inducción refuerzo de acuerdo con la invención con una combinación
de proteína y formulaciones basadas en ADN. Una estrategia de este
tipo se considera que es efectiva en la inducción de amplias
respuestas inmunes. Vacunas de proteína adyuvadas inducen
principalmente anticuerpos y respuestas inmunes de células T de
ayuda, mientras la liberación de ADN como un plásmido o un vector
vivo induce fuertes respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL).
Por tanto, la combinación de proteína y vacunación con ADN
proporcionará una amplia variedad de respuestas inmunes. Esto es
particularmente relevante en el contexto de VIH, ya que se cree que
ambos anticuerpos de neutralización y CTL son importantes para la
defensa inmune contra VIH.
De acuerdo con la invención un calendario para
la vacunación puede comprender la administración secuencial
("inducción-refuerzo") o simultánea de
antígenos de de polipéptido y ADN que codifica los polipéptidos. El
ADN se puede liberar como ADN desnudo tal como ADN plásmido o en la
forma de un vector vivo recombinante, por ejemplo, un vector
poxvirus, un vector adenovirus, un vector de virus de la rubeola, o
cualquier otro vector vivo adecuado. Se pueden inyectar antígenos
de proteína una o varias veces seguido de una o varias
administraciones de ADN, se puede usar ADN en primer lugar durante
una o más administraciones seguidas de una o más inmunizaciones con
proteína.
Un ejemplo particular de inmunización por
inducción-refuerzo de acuerdo con la invención
incluye la inducción con ADN en la forma de un vector vivo
recombinante tal como un vector de poxvirus modificado, en la
inducción de respuestas inmunes amplias. Vacunas de proteína
adyuvadas induce fuertes respuestas de linfocitos T citotóxicos
(CTL). Por tanto, la combinación de proteína y vacunación con ADN
proporcionará una amplia variedad de respuestas inmunes. Esto es
particularmente relevante en el contexto de VIH, ya que se cree que
ambos anticuerpos de neutralización y CTL son importantes para la
defensa inmune contra VIH.
De acuerdo con la invención un calendario para
la vacunación puede comprender la administración secuencial
("inducción-refuerzo") o simultánea de
antígenos de de polipéptido y ADN que codifica los polipéptidos. El
ADN se puede liberar como ADN desnudo tal como ADN plásmido o en la
forma de un vector vivo recombinante, por ejemplo, un vector
poxvirus, un vector adenovirus, un vector de virus de la rubeola, o
cualquier otro vector vivo adecuado. Se pueden inyectar antígenos
de proteína una o varias veces seguido de una o varias
administraciones de ADN, se puede usar ADN en primer lugar durante
una o más administraciones seguidas de una o más inmunizaciones con
proteína.
Un ejemplo particular de inmunización por
inducción-refuerzo de acuerdo con la invención
incluye la inducción con ADN en la forma de un vector vivo
recombinante tal como un vector poxvirus modificado, por ejemplo,
virus Ankara modificado (MVA) o un alfavirus, por ejemplo, virus de
encefalitis equina venezolana, o un vector adenovirus, o un vector
de virus de la rubeola, seguido de refuerzo con una proteína,
preferiblemente una proteína adyuvada.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Por tanto la invención proporciona además un kit
farmacéutico que comprende:
- a)
- una composición que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable; y
- b)
- una composición que comprende un polinucleótido que codifica una o más de Nef o Gag o un fragmento o derivado inmunogénico de Nef o Gag que contiene un epítopo de Nef o Gag presente en el polipéptido de a), junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En una realización alternativa el kit
farmacéutico comprende:
- a)
- una composición que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, y
- b)
- una composición que comprende un polipéptido que comprende uno o más de Nef o Gag o un fragmento o derivado inmunogénico de Nef o Gag que contiene un epítopo de Nef o Gag presente en el polipéptido de a), junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Polipéptidos y polinucleótidos preferidos para
uso en un kit para inducción/refuerzo de acuerdo con la invención
son polipéptidos y polinucleótidos como se describen en esta
invención. Por tanto, el componente proteico de un enfoque
inducción/refuerzo de tipo proteína/ADN puede ser cualquiera de las
proteínas de fusión preferidas descritas en esta invención.
Igualmente, el componente ADN puede ser un polinucleótido que
codifica cualquiera de las proteínas preferidas.
Por tanto, por ejemplo, las fusiones p24 - RT -
Nef - p17, p24 - RT* - Nef - p17, p24 - p51RT - Nef - p17, p24 -
p51RT* - Nef - p17 se pueden proporcionar en un kit de inducción
refuerzo, productos tales como truncados. La adaptación de uso del
codón a la expresión de E. coli puede eliminar también las
secuencias de "desplazamiento de marco" putativas así como
también la terminación prematura y/o sitios de iniciación
internos.
El código de ADN tiene 4 letras (A, T, C y G) y
usa estas para deletrear tres letras "codones" que representan
los aminoácidos de las proteínas codificadas en un gen del
organismo. La secuencia lineal de codones a lo largo de la molécula
de ADN se translada en la secuencia lineal de aminoácidos en
la(s) proteína(s) codificadas por estos genes. El
código está altamente degenerado, con 61 codones que codifican para
los 20 aminoácidos naturales y 3 codones que representan señales
"de parada". Por tanto, la mayoría de los aminoácidos están
codificados por más de un codón - de hecho varios están codificados
por cuatro o más codones diferentes.
Donde esté disponible más de un codón para
codificar para un aminoácido dado, se ha observado que los patrones
de uso de codón de organismos son altamente no aleatorios.
Diferentes especies muestran una preferencia diferente en su
selección de codón y, además, la utilización de los codones puede
ser marcadamente diferente en una única especie entre genes que se
expresan a niveles superiores e inferiores. Esta preferencia es
diferente en virus, plantas, bacterias y células de mamíferos, y
algunas especies muestran una preferencia más fuerte lejos de una
selección de codón aleatoria que otros. Por ejemplo, los humanos y
otros mamíferos no son menos fuertemente preferidos que ciertas
bacterias o virus. Por estas razones, hay una probabilidad
significativa de que un gen viral de un virus de mamífero expresado
en E. coli, o un gen extraño o recombinante expresado en
células de mamífero tengan una distribución inapropiada de codones
para expresión eficiente. Se cree que la presencia en una secuencia
de ADN heteróloga de bucles de codones o una abundancia de codones
que se observan raramente en el huésped en cuya expresión se van a
producir, es predictiva de bajos niveles de expresión heteróloga en
ese huésped.
En los polinucleótidos de la presente invención
el modelo de uso del codón puede estar alterado del típico de virus
de inmunodeficiencia humana para representar más estrechamente la
preferencia codónica del organismo diana, por ejemplo E.
coli.
Hay una variedad de programas disponibles
públicamente útiles para la optimización con codón, por ejemplo
"CalcGene" (Hale y Thompson, Protein Expression and
Purification 12: 185-189 (1998).
Se expresaron proteínas gag p24 de (proteína
cápsida) y p17 (proteína matriz), la transcriptasa inversa y Nef de
VIH-1 en cepa B834 de E. coli. (B834 (DE3) es
un pariente auxótrofo de la metionina de BL21 (DE3)), bajo control
del promotor del bacteriófago T7 (sistema de expresión pET).
Estos se expresaron como una proteína de fusión
simple que contiene la secuencia completa de las cuatro proteínas.
La secuencia que codifica p24 madura proviene del clon molecular de
BH10 del VIH-1, secuencia p17 madura y gen de RT de
HXB2 y gen de Nef de aislado de BRU.
Tras inducción, las células recombinantes
expresaron niveles significativos de la fusión
p24-RT-Nef-p17 que
ascendieron hasta el 10% de la proteína total.
Cuando se cultivaron células e indujeron a 22ºC,
la proteína de fusión
p24-RT-Nef-p17 se
confinó principalmente en la fracción soluble de los lisados
bacterianos (incluso tras congelación/descongelación). Cuando se
cultivaron a 30ºC, en torno al 30% de la proteína recombinante
estaba asociada con la fracción insoluble.
La proteína de fusión
p24-RT-Nef-p17 está
hecha de hasta 1136 aminoácidos con una masa molecular de
aproximadamente 129 kDa. La proteína de longitud completa migra
hasta aproximadamente 130 kDa en gel SDS. La proteína tiene un
punto isoeléctrico teórico (pI) de 7,96 basado en su secuencia de
aminoácidos, confirmado por electroforesis en gel 2D.
Detalles del plásmido recombinante:
- nombre:
- pRIT15436 (o nombre de laboratorio pET28b/p24-RT-Nef-p17)
- vector huésped:
- pET28b replicón: colE1
- selección:
- kanamycin
- promotor:
- T7
- inserción:
- gen de fusión de p24-RT-Nef-p17.
\vskip1.000000\baselineskip
Detalles de la proteína recombinante:
Proteína de fusión
p24-RT-Nef-p17: 1136
aminoácidos
Término N - p24: 232a.a. - bisagra:2a.a. - RT:
562a.a. - bisagra:2a.a. - Nef: 206a.a. - P17: 132a.a. - Término
C
\global\parskip1.000000\baselineskip
La secuencia p24 está en negrita
La secuencia de Nef está subrayada
Cajas: nucleótidos introducidos mediante
construcción genética
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de P24: aminoácidos
1-232 (en negrita)
Secuencia de RT: aminoácidos
235-795
Secuencia de Nef: aminoácidos
798-1002
Secuencia de P17: aminoácidos
1005-1136
Cajas: aminoácidos introducidos mediante
construcción genética
K (Lisine): en lugar de triptópano (W). Mutación
introducida para eliminar la actividad enzimática.
\vskip1.000000\baselineskip
Expresión de la proteína
recombinante:
En el plásmido pET, el gen diana
(p24-RT-Nef-p17)
está bajo control del promotor del bacteriófago T7 fuerte. Este
promotor no es reconocido por la ARN polimerasa de E. coli y
es dependiente de una fuente de T7 ARN polimerasa en la célula
huésped. La célula huésped B834 (DE3) contiene una copia cromosomal
del gen de T7 ARN polimerasa bajo control de lacUV5 y la expresión
es inducida por la adición de IPTG al cultivo bacteriano.
Se cultivaron los pre-cultivos,
en matraces de agitación, a 37ºC hasta fase
semi-logarítmica (A620:0,6) y luego se almacenaron
a 4ºC durante la noche (para evitar cultivos en fase estacionaria).
Se cultivaron los cultivos en medio LBT suplementado con glucosa al
1% y 50 \mug/ml de canamicina. La adición de glucosa al medio de
crecimiento tiene la ventaja de reducir la expresión de proteína
recombinante basal (evitando la depresión mediada por AMPc del
promotor lacUV5).
\newpage
Se usaron diez ml de cultivos almacenados
durante la noche a 4ºC para inocular 200 ml de medio LBT (sin
glucosa) que contiene canamicina. Se cultivaron los cultivos a 30ºC
y 22ºC y cuando la densidad óptica (OD) a 620 alcanzó 0,6, se
añadió IPTG (1 mM final). Se incubaron los cultivos durante 3, 5 y
18 horas (durante la noche). Se recogieron muestras antes y después
de 3, 5 y 18 horas de inducción.
La preparación del extracto fue como sigue:
Se suspendieron agregados celulares en tampón*
de ruptura (a una densidad óptica (O.D.) teórica de 10) y se
trituró mediante cuatro pasadas en prensa francesa (a 20.000 psi o
1250 bar). Se centrifugaron los extractos brutos (T) a 20.000 g
durante 30 minutos para separar las fracciones solubles (S) e
insolubles (P).
- *Tampón de ruptura:
- Tris-HCL 50 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, DTT + cóctel de inhibidores de proteasa 1 mM (completo/Boerhinger).
\vskip1.000000\baselineskip
Análisis por SDS-PAGE y
Transferencia western:
Se experimentaron fracciones correspondientes a
agregado insoluble (P), sobrenadante (S) y extracto bruto (T) en
SDS-PAGE al 10% en condiciones reductoras. Se
detectó p24-RT-Nef -p17 recombinante
mediante tintado con azul de Coomassie en Transferencia western
(WB).
- Tintado con Coomassie:
- la proteína p24-RT-Nef-p17 aparece como:
- \quad
- una banda a \pm 130 kDa (ajustando con PM calculado)
- PM teórico:
- 128,970 Daltons
- PM aparente:
- 130 kDa
\vskip1.000000\baselineskip
Análisis por Transferencia western:
- Reactivos =
- - anticuerpo monoclonal para RT (p66/p51)
- \quad
- Adquirido a ABI (Advanced Biotechnologies) dilución: 1/5000
- \quad
- - Anticuerpo anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina dilución: 1/7500
- Nivel de expresión:
- - banda específica de p24-RT-Nef-p17 muy fuerte tras inducción de 20 horas a 22ºC, {}\hskip0.1cm representando hasta el 10% de la proteína total (véase figura 1A).
\vskip1.000000\baselineskip
"Solubilidad" de la proteína
recombinante:
Extractos celulares "frescos" (fracciones
T,S,P): con crecimiento/inducción a 22ºC/20 horas, casi toda la
proteína de fusión
p24-RT-Nef-p17 se
recupera en la fracción soluble del extracto celular (figura 1A).
Con crecimiento/inducción a 30ºC/20 horas, se asocia
aproximadamente el 30% de la proteína
p24-RT-Nef-p17 con
la fracción insoluble (figura 1A).
\vskip1.000000\baselineskip
"Congelación/descongelación" (fracciones
S2, P2):
La fracción soluble (S1) (inducción de 20 horas
a 22ºC) se conservó a -20ºC. Se congeló y se centrifugó a 20.000
g/30 minutos: S2 y P2 (resuspendidas en volumen 1/10).
Tampón de ruptura con DTT: casi toda la proteína
de fusión
p24-RT-Nef-p17
permanece soluble (sólo precipitó de 1 a 5%) (véase figura 1B)
Tampón de ruptura sin DTT: de 85 a 90 % de
p24-RT-Nef-p17
permanece soluble (figura 1B)
\vskip1.000000\baselineskip
Figuras:
Figura 1A - Tintado de Coomassie y transferencia
western.
Figura 1B - ensayo de solubilidad de
p24-RT-Nef-p17
La proteína F4 se purificó usando el
procedimiento de purificación I en el ejemplo 7.
Las condiciones de crecimiento celular y de
inducción y preparación de extractos celulares para los ejemplos
que siguen son como se describe en el ejemplo 1 a menos que se
especifiquen otras condiciones (por ejemplo, temperatura,
composición del tampón de ruptura).
\vskip1.000000\baselineskip
Se optimiza con codón la siguiente secuencia de
polinucleótidos de modo que el uso del codón se asemeja al uso del
codón en un gen ampliamente expresado en E. coli. La
secuencia de aminoácidos es idéntica a la dada anteriormente para
F4 no optimizado con codón.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de p24 está en negrita
La secuencia de Nef está subrayada
Cajas: nucleótidos introducidos mediante
construcción genética
Los procedimientos usados en relación con F4 no
optimizado con codón se aplicaron para la secuencia optimizada con
codón.
\newpage
Detalles del plásmido recombinante:
- nombre:
- pRIT15513 (nombre de laboratorio: pET28b/p24-RT-Nef -p17)
- vector huésped:
- pET28b
- replicón:
- colE1
- selección:
- canamicina
- promotor:
- T7
- inserción:
- gen de fusión p24-RT-Nef-p17, optimizado con codón
Se expresó el gen optimizado con codón de F4 en
células de E. coli BLR(DE3), un derivado de recA^{-}
de la cepa B834(DE3). La mutación de RecA evita la
producción putativa de fagos lambda.
Se cultivaron pre-cultivos, en
matraces de agitación, a 37ºC hasta fase
semi-logarítmica (A_{620}:0,6) y se almacenaron
luego a 4ºC durante la noche (para evitar cultivos en fase
estacionaria).
Se cultivaron cultivos en medio LBT suplementado
con glucosa al 1% y canamicina 50 \mug/ml. La adición de glucosa
al medio de crecimiento tiene la ventaja de reducir la expresión de
proteína recombinante basal (evitando depresión mediada por AMPc
del promotor lacUV5).
Se usaron diez ml de cultivos almacenados
durante la noche a 4ºC para inocular 200 ml de medio LBT (sin
glucosa) que contiene canamicina. Se cultivaron cultivos a 37ºC y
cuando la densidad óptica (OD) a 260 alcanzó 0,6, se añadió IPTG (1
mM final). Se incubaron cultivos durante 19 horas más (durante la
noche), a 22ºC. Se recogieron muestras antes y a las 19 horas de la
inducción.
\vskip1.000000\baselineskip
Se resuspendieron agregados de células en tampón
de muestra (a una densidad óptica (OD) teórica de 10), se hirvió y
se cargaron directamente en SDS-PAGE.
\vskip1.000000\baselineskip
Análisis SDS-PAGE y
Transferencia western:
Se experimentaron muestras de extractos brutos
en SDS-PAGE al 10% en condiciones reductoras.
Se detecta proteína recombinante
p24-RT-Nef-p17
mediante tintado con azul de Coomassie (figura 2) y en Transferencia
western.
Tintado con Coomassie: la proteína
p24-RT-Nef-p17
aparece como: una banda a \pm 130 kDa (ajustada con PM
calculado)
- PM teórico:
- 128.967 Daltons
- PM aparente:
- 130 kDa
\vskip1.000000\baselineskip
Análisis Transferencia western:
- Reactivos =
- - Anti RT policlonal de conejo (PO3L16 de conejo) dilución: 1/10.000
- \quad
- - Anti Nef-Tat policlonal de conejo (388 de conejo) dilución 1/10.000
- \quad
- - Anticuerpo anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina dilución: 1/7500
Tras inducción a 22ºC durante 19 horas, las
células recombinantes BLR(DE3) expresaron la fusión F4 a un
nivel muy alto que varía de 10 a 15% de la proteína total.
En comparación con F4 del gen nativo, el perfil
de producto recombinante de F4 del gen optimizado con codón se
encuentra ligeramente simplificado. La principal banda relacionada
con F4 a 60 kDa desapareció, así como también bandas menores por
debajo (véase la figura 2). En comparación con la cepa recombinante
B834(DE3) que expresa F4, la cepa BLR(DE3) que
produce F4co tiene las siguientes ventajas: mayor producción de
proteína de longitud completa F4, modelo de banda menos complejo
del producto recombinante.
\vskip1.000000\baselineskip
La región RT/p66 entre los aminoácidos
428-448 es susceptible para las proteasas de E.
coli. La construcción de P51 termina en Leu 427 dando lugar a
la eliminación del dominio ARNasa H (véase alineación de la
secuencia de RT en la figura 3).
También se eliminaron las secuencias "que
desplazan el marco de lectura" de E. coli putativas en la
secuencia de gen nativo de RT (mediante optimización con codón del
gen p51).
Diseño/construcción del gen sintético
p51:
La secuencia del gen p51 sintético se diseñó de
acuerdo con el uso de codón en E. coli. Por tanto, este se
optimizó con codón de modo que el uso de codón se asemeja al uso de
codón en un gen altamente expresado en E. coli. Se construyó
el gen sintético como sigue: se ensamblaron 32 oligonucleótidos en
una PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de etapa única. En
una segunda PCR se amplificó el ensamblaje de longitud completa
usando los cebadores de extremo y el producto de PCR resultante se
clonó en plásmido intermedio pGEM-T. Tras
corrección de errores puntuales introducidos durante la síntesis del
gen, el gen sintético p51 se clonó en plásmido de expresión pET29a.
Este plásmido recombinante se usó para transformar células B834
(DE3).
Cajas: aminoácidos introducidos mediante
construcción genética
Cajas: aminoácidos introducidas mediante
construcción genética.
K (Lisina): en lugar de triptófano (W). Mutación
introducida para eliminar la actividad del enzima.
\vskip1.000000\baselineskip
433 AA, PM: 50,3 kDa, IP: 9,08
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluaron el nivel de expresión de P51 y
solubilidad de proteína recombinante, en paralelo con la cepa de
producción RT/p66.
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones de inducción: se
cultivaron/inducieron células a 37ºC (+IPTG 1 mM), durante 5 horas.
Tampón de ruptura: Tris/HCl 50 mM, pH:7,5, EDTA 1 mM, +/- DTT
1 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
- Reactivos:
- - anti RT policlonal de conejo (PO3L16 de conejo) (dilución: 1/10.000)
- \quad
- - anticuerpo anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina (dilución: 1/7500)
Se experimentaron fracciones celulares
correspondientes a extractos brutos (T), agregados insolubles (P) y
sobrenadante (S) en SDS-PAGE al 10% en condiciones
reductoras.
Como se ilustró en el gel tintado con Coomassie
y Transferencia western (figura 4) se observó una expresión muy
alta de P51 (de 15 a 20% de la proteína total), mayor que la
observada para P66.
Para ambas proteínas p51 y p66 (después de 5
horas de inducción a 37ºC), el 80% de los productos recombinantes
se recuperaron en la fracción soluble (S1) de extractos celulares
(véase la figura 4). Cuando se expresaron a 30ºC, se asociaron el
99% de proteínas recombinantes con la fracción soluble (datos no
mostrados).
El modelo de Transferencia western para p51 fue
multibanda, pero menos complejo que el observado para P66.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo de solubilidad:
congelación/descongelación de la fracción soluble (S1) (inducción de
5 horas, 37ºC) preparada en condiciones reductoras (tampón de
ruptura con DTT) y no reductoras. Tras descongelación se
centrifugaron las muestras de S1 a 20.000 g/30 minutos, generando
S2 y P2 (p2 se resuspende en volumen 1/10).
Después de la congelación/descongelación de
fracciones solubles (S1), preparadas en condiciones reductoras, así
como en condiciones no reductoras, se recuperan aún el 99% de p51 y
p66 en la fracción soluble (S2). Sólo se encuentra un 1% en el
precipitado (P2). Esto se muestra en la figura 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyeron proteínas de fusión dobles con y
sin conectores. Los conectores ayudaron a disminuir las
interacciones potenciales entre los dos partícipes de la fusión y
son como siguen:
Se amplificó el gen de fusión
Nef-p17 mediante PCR a partir del plásmido
recombinante de F4. El producto de PCR se clonó en el vector de
clonación pGEM-T intermedio y a continuación en el
vector de expresión pET29a.
Se amplificó el gen de Nef mediante PCR a partir
del plásmido recombinante de F4. Se clonó el producto de PCR en el
vector de clonación pGEM-T intermedio y a
continuación en el vector de expresión pET28b/p17, como un terminal
C en la fusión de marco con el gen p17.
Se insertó un fragmento de ADN de 18 bp que
codifica para el conector hexapeptídico (GSGGGP) entre los
partícipes de la fusión Nef y p17, mediante mutagénesis dirigida al
sitio (usando el "Sistema de mutagénesis dirigida al sitio
GeneTailor", Invitrogen).
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Secuencia de nucleótido de
Nef-p17
Caja: aminoácidos introducidos mediante
construcción genética.
\newpage
La secuencia Nef está en negrita. Secuencia de
nucleótidos de P17-Nef:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Caja: aminoácidos introducidos mediante
construcción genética.
\newpage
La secuencia de p17 está en negrita. Secuencia
de nucleótidos de
Nef-conector-p17:
\vskip1.000000\baselineskip
Nef-conector-p17
(NPL)
Conector hexapeptídico
Caja: aminoácidos introducidos mediante
construcción genética
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de nucleótido de
P17-conector-Nef:
\vskip1.000000\baselineskip
P17-conector-Nef
(PLN)
Conector hexapeptídico
Caja: aminoácidos introducidos mediante
construcción genética.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cuatro cepas recombinantes se indujeron a
30ºC durante 3 horas, en paralelo con cepas que producen F4 y Nef.
Se prepararon extractos brutos y se analizaron mediante gel tintado
con Coomassie y Transferencia westernting.
\vskip1.000000\baselineskip
- Reactivos:
- - anti RT policlonal de conejo (PO3L16 de conejo) (dilución: 1/10.000)
- \quad
- - anticuerpo anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina (dilución: 1/7500)
Como se ilustra en la figura 6, las fusiones
Nef-p17 y p17-Nef, con y sin
conector, se expresan a un alto nivel (10% de las proteínas
totales).
En el Transferencia western: las cuatro
construcciones de fusión dobles presentan un modelo
multi-banda, pero menos complejo que el observado
para F4. Cuando se expresan sólas, las proteínas Nef y p17 presentan
patrones de banda simples.
Se analizaron adicionalmente cepas que expresan
fusiones Nef-p17 (NP) y p17-Nef (PN)
sin péptido conector (ensayos de solubilidad, véase a
continuación).
\newpage
Se indujeron proteínas Nef-p17
and p17-Nef en paralelo con cepas que producen F4 y
Nef.
Condiciones de inducción:
crecimiento/indución de células a 30ºC (+IPTG 1 mM), durante 3
horas.
Tampón de ruptura: Tris/HCl 50 mM pH: 8,
NaCl 50 mM, EDTA 1 mM
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon extractos celulares (en
condiciones no reductoras) y fracciones que corresponden a extractos
brutos (T), agregado insoluble (P) y se analizaron los
sobrenadantes (S1) en gel tintado con Coomassie y Transferencia
western.
Como se ilustra en la figura 7 en gel tintado
con Coomassie y Transferencia western, casi todas las
Nef-p17, p17-Nef, así como también
proteínas Nef se recuperan en la fracción soluble (S) de extractos
celulares. Para la construcción F4: del 5 a 10% de proteína
recombinante ya se recuperaba en la fracción de agregado.
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las construcciones de fusión dobles
ensayadas son altamente expresadas ( > 10% de proteína total).
Las proteínas de fusión P17-Nef y
Nef-p17 son más solubles que F4. Ambas presentan un
modelo de WB menos complejo.
\vskip1.000000\baselineskip
F4* es una versión mutada de la fusión F4
(p24-RT/p66-Nef-p17)
donde se sustituye la metionina en la posición 592 por una lisina.
Esta metionina es un sitio de "inicio" transcripcional interno
putativo, ya que soportó secuenciación del terminal N llevada a
cabo en una muestra de eluído en Q-sepharosa del
experimento de purificación de F4. Incluso, la banda pequeña
relacionada con F4 principal a 62 kDa presente en la muestra eluída
en Q comienza en la metionina 592.
La metionina se reemplaza por una lisina:
RMR \rightarrow RKR. El motivo RKR está
presente de forma natural en secuencias de RT de clado A.
Se evaluó el impacto de esta mutación en
epítopos CD4-CD8:
- -
- se pierde un epítopo CTL de HLA-A3 (A* 3002), pero están presentes otros 9 epítopos HLA-A3 en la secuencia de RT.
- -
- no se identificó epítopo de ayuda en esta región.
\vskip1.000000\baselineskip
- 1136 AA, 129 kDa, IP: 8,07
La secuencia de p24 está en negrita
La secuencia de Nef está subrayada
Cajas: nucleótidos introducidos mediante
construcción genética
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.850000\baselineskip
Se indujo cepa recombinante F4* a 22ºC durante
18 horas, en paralelo con la construcción no mutada F4. Se
prepararon extractos brutos y se analizaron mediante gel tintado con
Coomassie y Transferencia westernting.
Como se ilustra en la figura 8, se expresó F4*
en un alto nivel (10% de proteína total), ligeramente mayor en
comparación con F4 y desapareció la banda a 62 kDa pequeña.
- Reactivos:
- - anti p24 pool 3 Mabs (JC13.1, JC16.1, IG8.1.1)(dilución 1/5000)
- \quad
- - anti RT policlonal de conejo (O3L16 de conejo) (dilución: 1/10 000)
- \quad
- - anti Nef-Tat policlonal de conejo (388 de conejo) (dilución: 1/10 000)
- \quad
- - anticuerpo anticonejo conjugado con fosfatasa alcalina (dilución: 1/7500)
- \quad
- - anticuerpo antiratón conjugado con fosfatasa alcalina (dilución: 1/7500)
F3 (p17-p51-Nef)
y F3* (p17-p51*-Nef) en las que el sitio de
iniciación de metionina interno putativo es reemplazado por
lisina.
Se podrían usar las fusiones F3 y F3* en
combinación con p24.
F3: Se excitó la secuencia que codifica p51
(como fragmento de ADN ScaI y StuI) a partir de plásmido de
expresión pET29a/p51 y se ligó en plásmido
pET28b/p17-Nef, en el sitio StuI (localizado entre
p17 y el gen de Nef), como una fusión en marco con secuencias de
p17 y Nef. La construcción de fusión resultante
p17-p51-Nef se denomina F3.
F3*: Se consiguió mutación del sitio de
iniciación de metionina interno putativo usando el "sistema de
mutagénesis dirigida al sitio Gene Tailor" (Invitrogen),
generando la construcción F3*.
Se usaron plásmidos F3 y F3* para transformar
células B834 (DE3).
- 770 AA, 88.5 kDa, IP:8,58
P17: secuencia en negrita
P51: secuencia en letras mayúsculas
Nef: secuencia en letras minúsculas
Cajas: nucleótidos introducidos mediante
construcción genética
\newpage
Se evaluaron el nivel de expresión de F3 y las
solubilidades de proteína recombinante en paralelo con cepas de
producción de
(p24-p66-Nef-p17) de
F4 y p17-Nef (F2).
Condiciones de inducción: crecimiento de
células a 37ºC/inducidas a 30ºC (+IPTG 1 mM), durante 3 horas.
Tampones de ruptura:
F4: Tris/HCl 50 mM pH:8,0, NaCl 50 mM, EDTA 1
mM, +/- DTT 1 mM
F2: Tris/HCl 50 mM pH:8,0, NaCl 50 mM, EDTA 1
mM, sin DTT
F3: Tris/HCl 50 mM pH:7,5, NaCl 50 mM, EDTA 1
mM, +/- DTT 1 mM
- anti RT policlonal de conejo (PO3L16 de
conejo) (dilución: 1/10 000)
- anti Nef-Tat policlonal de
conejo (388 de conejo) (dilución 1/10 000)
- anticuerpo anti-conejo
conjugado con fosfatasa alcalina (dilución: 1/7500)
Se analizaron las fracciones celulares
correspondientes a extractos brutos (T), agregados insolubles (P) y
sobrenadante (S) en SDS-PAGE al 10% en condiciones
reductoras. Como se ilustra en la figura 9, la proteína de fusión
F3 se expresa en un alto nivel (10% de proteína total). Casi toda la
F3 se recupera en la fracción soluble (S) de extractos celulares,
aunque de 5 a 10% de producto F4 está ya asociado con la fracción de
agregado. El modelo de WB es simplificado en comparación con
F4.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se indujo la cepa recombinante F3* a 37ºC
durante 3 horas, construída en paralelo con F3 no mutada. Se
prepararon los extractos celulares brutos y se analizaron mediante
gel tintado con Coomassie y Transferencia westernting. Como se
ilustra en la figura 10, se expresa la proteína de fusión F3* en un
nivel muy alto (de 10 a 20% de proteína total). Hubo un modelo de
WB simplificado en comparación con F3; había desaparecido una banda
muy decaída a +/- 32 kDa (detectado sólo por WB).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó RT/p51 en la construcción de fusión F4
(en lugar de RT/p66).
- F4(p51) = p24-p51-Nef-p17
F4(p51)* =
p24-p51*-Nef-p17 -
F4(p51) mutado: sitio de iniciación de metionina interno
putativo (presente en la parte de RT) reemplazado por lisina, para
simplificar adicionalmente el modelo del antígeno.
F4(p51): Se amplificó la secuencia
que codifica p51 mediante PCR a partir del plásmido de expresión
pET29a/p51. Se incorporaron sitios de restricción dentro de los
cebadores de PCR (NdeI y StuI en el extremo 5'. AvrII en el extremo
3' de la secuencia de codificación). Se clonó el producto de PCR en
plásmido intermedio pGem-T y se secuenció. Se
restringió el plásmido intermedio pGem-T/p51
mediante NdeI y AvrII y se ligó el fragmento p51 en el plásmido de
expresión
pET28b/p24-RT/p66-Nef-p17
restringido por NdeI y NheI (dando lugar a la escisión de la
secuencia de RT/p66). La ligadura se llevó a cabo mediante mediante
combinación de reacciones de digestión a concentraciones
apropiadas, en presencia de ligasa de ADN de T4. Se usó el producto
de ligadura para transformar las células DH5\alpha de E.
coli. Se confirmó la verificación de la inserción de p51 dentro
del marco de lectura translacional correcto (en lugar de RT/p66 en
la fusión f4) mediante secuenciación de ADN. La construcción de
fusión resultante
p24-RT/p51-Nef-p17
se denominó F4(p51).
F4(p51)*: Se consiguió la mutación
del sitio de iniciación de la metionina interno putativo (presente
en RT/p51) con "sistema de mutagénesis dirigido al sitio
GeneTailor" (Invitrogen), generando la construcción
F4(p51)*.
Se usaron plásmidos de expresión F4(p51)
y F4(p51)* para transformar las células B834(DE3).
- 1005 AA, 114.5 kDa, IP: 8,47
Se evaluaron el nivel de expresión de
F4(p51) y la solubilidad de la proteína recombinante en
paralelo con la cepa que expresa F4.
Condiciones de inducción: crecimiento de
células a 37ºC/inducido a 22ºC (+IPTG 1 mM), durante 19 horas.
Tampón de ruptura: Tris/HCl 50 mM pH:7,5,
EDTA 1 mM, DTT 1 mM
- anti RT policlonal de conejo (PO3L16 de
conejo) (dilución: 1/10 000)
- anti Nef-Tat policlonal de
conejo (388 de conejo) (dilución 1/10 000)
- anticuerpo anti-conejo
conjugado con fosfatasa alcalina (dilución: 1/7500)
Se analizaron fracciones celulares
correspondientes a extractos brutos (T), agregado insoluble (P) y
sobrenadante (S) en SDS-PAGE en condiciones de
reducción del 10%.
Como se ilustra en la figura 11, se expresa
F4(p51) a un alto nivel (10% de proteína total), similar a
F4. Casi toda la F4(p51) se recupera en la fracción soluble
(S) de extractos celulares. Tras detección con un reactivo
anti-Nef-tat reagent, el modelo de
WB para F4(p51) mostró ser simplificado (reducción de
productos truncados por debajo de +/- 60 kDa).
Se indujo la cepa recombinante F4(p51)* a
22ºC durante 18 horas, en paralelo con la construcción no mutada
F4(p51), F4 y F4*. Se prepararon extractos celulares brutos y
se analizaron mediante gel tintado con Coomassie y Transferencia
westernting. Como se ilustra en la figura 12 se observó alta
expresión de fusiones F4(p51) y F4(p51)*,
representando al menos el 10% de la proteína total. Patrón de WB:
reducción de productos truncados por debajo de +/- 60 kDa. Además,
para la construcción F4(p51)*, ha desaparecido la banda de 47
kDa (debido al sitio de inicio interno).
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína de fusión F4, que comprende los 4
antígenos de VIH-1
p24-RT-Nef-p17, se
purificó a partir de homogeneizado de células de E. coli de
acuerdo con el procedimiento de purificación I, que comprende las
siguientes etapas principales:
- \blacksquare
- Precipitación de F4 con sulfato de amonio
- \blacksquare
- Cromatografía de intercambio de cationes en SO3 Fractogel (modo positivo)
- \blacksquare
- Cromatografía de interacción hidrófoba en octil-Sepharosa (modo positivo)
- \blacksquare
- Cromatografía de intercambio aniónico en Q-sepharosa FF (modo positivo)
- \blacksquare
- Cromatografía de filtración en gel Superdex 200 en presencia de SDS
- \blacksquare
- Diálisis y concentración
De forma adicional, se purificaron la proteína
de fusión F4(p51)* (RT reemplazada por p51 optimizado con
codón que porta una mutación adicional Met592Lys) y la proteína F4*
(F4 que porta una mutación Met592Lys adicional) usando el mismo
procedimiento de purificación I.
\vskip1.000000\baselineskip
- \blacksquare
- Se determinó la proteína total usando el ensayo de Lowry. Antes de la medida de la concentración de proteína se dializan todas las muestras durante la noche frente a PBS, se usó SDS al 0,1% para eliminar las sustancias que interfieren (urea, DTT). Se usó BSA (Pierce) como patrón.
\vskip1.000000\baselineskip
- \blacksquare
- Se prepararon muestras en tampón de muestra para SDS-PAGE en condiciones no reductoras (+/- \beta-mercaptoetanol) y se calentó durante 5 minutos a 95ºC.
- \blacksquare
- Se separaron las proteínas en geles SDS-poliacrilamida de 4 a 20% a 200 V durante 75 minutos usando geles de Tris-glicina de Novex pre-fundidos o geles Criterion (Bio-Rad), de un 1 mm de grosor.
- \blacksquare
- Se visualizaron las proteínas con azul de Coomassie R250.
- \blacksquare
- Para las transferencias western (WB), se transfirieron las proteínas desde el gel SDS a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad) a 4ºC durante 1,5 horas a 100 V o durante la noche a 30 V.
- \blacksquare
- Se detectó F4 usando anticuerpos monoclonales contra los distintos antígenos, anti-p24, anti-Nef-Tat, anti-RT (a veces se usó una mezcla de anti-p24 y anti Nef-Tat para detectar un número máximo de bandas de proteína).
- \blacksquare
- Se unieron anticuerpos anti-ratón o anti-conejo conjugados con fosfatasa alcalina a los anticuerpos primarios y se visualizaron bandas de proteínas usando BCIP y NBT como los sustratos.
\newpage
- \blacksquare
- Se separaron 5 \mug de proteína (Lowry) mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa como anteriormente.
- \blacksquare
- Se detectaron proteínas de célula huésped residuales usando anticuerpos de anti -E. coli policlonales. Se visualizaron bandas de proteína con la reacción de fosfatasa alcalina como anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento I comprende una precipitación
con sulfato de amonio y cuatro etapas cromatográficas:
- \blacksquare
- Se homogeneizaron células de E. coli en tampón Tris 50 mM a pH 8,0 en presencia de DTT 10 mM, PMSF 1 mM, EDTA 1 mM a una densidad óptica a 50 (\sim360 ml). Se aplicaron 2 pasadas Rannie a 1000 bar.
- \blacksquare
- Se eliminaron mediante centrifugación a 14400 x g durante 20 minutos células detríticas y el material insoluble.
- \blacksquare
- Se añadió sulfato de amonio (AS) desde una solución stock 3,8M al sobrenadante clarificado hasta una concentración final de 1,2M. Se precipitaron proteínas durante \sim2 horas a temperatura ambiente (RT) y luego se agregan mediante centrifugación (10 minutos a 14400 x g). Se resuspendió el agregado en urea 8M, DTT 10 mM en tampón fosfato 10 mM a pH 7,0.
- \blacksquare
- Se capturó el antígeno en una columna de SO3 Fractogel (Merck) en presencia de urea 8M y DTT 10 mM a pH 7,0 en tampón fosfato. Se lavó la columna para eluir la proteína no unida seguido de una etapa de pre-elución con NaCl 170 mM para eliminar las proteínas de célula huésped unidas (HCP). Se eluyó luego F4 con NaCl 460 mM, urea 8M, DTT 10 mM en tampón fosfato a pH 7,0.
- \blacksquare
- El eluído en SO3 se diluyó dos veces con tampón fosfato 10 mM, pH 7, y se cargó en una columna de octil-Sepharosa (Amersham Biosciences) en presencia de urea 4 M, DTT 1 mM, NaCl 230 mM en tampón fosfato a pH 7,0. Tras una etapa de lavado (tampón de equilibrado) se eluyó F4 unido con urea 8 M, DTT 1 mM en tampón Tris 25 mM a pH 8,0.
- \blacksquare
- Se diluyó el eluido en octilo y se ajustó a pH 9,0 y se unió luego F4 a una columna de Q-sepharosa (Amersham Bioscience) en presencia de urea 8M a pH 9,0 (Tris 25 mM). Se lavó por arrastre la proteína no unida (urea 8M, Tris 25 mM a pH 9,0) y una etapa de pre-elución (NaCl 90 mM en urea 8M, Tris 25 mM, pH 9,0) eliminó las HCP y los productos de degradación de F4. Se desorbió F4 de la columna con NaCl 200 mM, urea 8M en tampón Tris a pH 9,0.
- \blacksquare
- Se salpicó una alícuota de eluído en Q con SDS al 1% y se dializó frente a tampón PBS que contiene SDS al 0,1% y DTT 1 mM para eliminar la urea antes de inyectar la muestra en la columna de filtración en gel (Superdex 200 de calidad para preparación, dos columnas de 16 x 60 cm conectadas en serie). Se reunieron las fracciones relevantes tras análisis SDS-PAGE en proceso.
- \blacksquare
- Se dializaron las muestras dos veces a temperatura ambiente en membranas de diálisis (corte a 12-14 kDa) durante la noche frente a 1 l de arginina 0,5M, Tris 10 mM, glutationa 5 mM, pH 8,5.
Las etapas de purificación secuenciales se
muestran en el flujograma siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los tampones contienen DTT 1 mM si no es
especifica de otra forma.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 13 muestra el gel SDS y la
transferencia western de
anti-p24/anti-Nef-Tat
de las fracciones que contienen F4 recogidas durante la
purificación de F4.
El homogeneizado de E. coli se muestra en
la figura 3, carril 2, estimando que F4 representa aproximadamente
el 10% de las proteínas totales (barridos de densidad de geles SDS
tintados con azul de Coomassie). Tras centrifugación se recuperó la
fracción soluble de F4 en el sobrenadante clarificado (carril 3). La
etapa de precipitación con sulfato de amonio eliminó muchas
impurezas (carril 4) y redujo la carga proteica para la etapa
cromatográfica subsiguiente. De forma adicional, se usó urea 8M
para resuspender los complejos disociados precipitados de F4 con
HCP y permitió tanto la captura completa de F4 como la elución
cuantitativa desde la resina SO3. El eluído en SO3 mostrado en la
carril 5 estaba enriquecido considerablemente en F4 pero el modelo
heterogéneo permaneció principalmente invariable. La columna de
octil-Sepharosa hidrófoba eliminó principalmente las
HCP de bajo peso molecular (LMW) y los productos de degradación de
F4 (carril 6), con lo que se simplifica el modelo de F4. La
cromatografía en Q-sepharosa simplificó
adicionalmente el modelo de F4 y eliminó muchas impurezas (carril
7). Se obtuvo pureza final en términos de E. coli tras esta
etapa. De hecho, no se detectaron proteínas de célula huésped en el
eluído en Q mediante análisis transferencia western de anti-E.
coli. La F4 purificada producida de esta forma se designó como
F4Q. La columna de Superdex 200 separó los productos de degradación
de F4 de bajo peso molecular (LMW) del F4 de longitud completa
mejorando la homogeneidad de F4 en el eluído de Superdex 200
(carril 8). El término F4S se puede usar para designar a F4
purificada de acuerdo con el esquema completo del procedimiento
I.
Se realizó una transferencia western de
anti-E. coli de las mismas fracciones recogidas durante la
purificación de F4. La ausencia de bandas visibles en la
transferencia western de anti-E. coli indicó contaminación
por HCP por debajo del 1% en el eluído en Q y en el eluído en
Superdex.
\vskip1.000000\baselineskip
La recuperación de F4 en cada etapa del
procedimiento de purificación se estimó a partir de análisis por
SDS-PAGE y transferencia western. Para estimar la
recuperación de F4 en geles SDS, los volúmenes de muestra cargados
en los geles SDS correspondían a los volúmenes de las distintas
fracciones recogidas durante la purificación.
La tabla 1 muestra la recuperación de proteína
en las fracciones que contienen F4.
La tabla muestra la cantidad de proteína en el
homogeneizado y el material soluble, incluyendo F4, recuperado en
el sobrenadante tras la etapa de clarificación. La etapa de
precipitación con sulfato de amonio (AS) eliminó una gran cantidad
de HCP y sólo se observó una ligera pérdida de F4 en el gel SDS. La
cromatografía en SO3 eliminó adicionalmente muchas impurezas y el
gel SDS indicó una gran recuperación de F4. Por el contrario, las
recuperaciones de proteína de \sim50% medida con las columnas de
octil-Sepharosa y Q-sepharosa se
acompañaron también de pérdidas de F4. La recuperación de proteína
tras la cromatografía de filtración en gel fue de aproximadamente
el 50%. El gel SDS muestra que se eliminaron muchas bandas de
proteína LMW (bandas de degradación de F4), reduciendo
concomitantemente la recuperación de F4.
\vskip1.000000\baselineskip
La tabla 1 anterior muestra que se podría
obtener aproximadamente 36 mg de F4 purificada a partir de 360 ml
de homogeneizado a una densidad óptica (OD) de 50. Por tanto, 1 l de
homogeneizado a densidad óptica (OD) de 50 debería dar
aproximadamente 100 mg de F4 purificada. Debido a que se alcanzaron
densidades ópticas de 70-90 durante el
procedimiento de fermentación, el rendimiento por litro de fermento
estaría, de acuerdo con lo anterior, en el intervalo de 140 a 180
mg de F4.
\vskip1.000000\baselineskip
Se purificó la construcción de fusión
F4(p51)* usando el procedimiento de purificación I descrito
anteriormente sin modificaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 14 muestra los análisis en gel SDS y
transferencia western con
anti-p24/anti-Nef-Tat
de las fracciones que contienen F4(p51)* recogidas durante
la purificación de F4(p51*).
El gel SDS y el transferencia western demuestran
que la proteína de fusión F4(p51)* se comporta globalmente
de forma similar a F4 en la etapa de precipitación con sulfato de
amonio así como también durante las etapas cromatográficas.
F4(p51)* purificada presentaba un modelo de heterogeneidad
similar a F4 purificada.
Una transferencia western de anti E. coli
indicó que la contaminación con HCP estaba por debajo del 1% tanto
en el eluído en Q como en el eluído en Superdex.
\newpage
Se perdieron aproximadamente el 25% de
F4(p51)* en la fracción insoluble del homogeneizado. De forma
adicional, debido a que el procedimiento de purificación no estaba
adaptado a esta proteína, se observaron pérdidas en las etapas
cromatográficas. Por lo tanto se redujo la recuperación global de
F4(p51)* en aproximadamente 25 mg por litro de homogeneizado
(densidad óptica, OD, 50). Extrapolado a 1 litro de cultivo a
densidad óptica (OD) de 177, el rendimiento estaría, de acuerdo con
lo anterior, en el intervalo de 85 mg de F4(p51)*.
\vskip1.000000\baselineskip
La construcción de fusión F4* se purificó usando
el procedimiento de purificación I descrito anteriormente sin
modificaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 15 muestra el gel SDS y transferencia
western con
anti-p24/anti-Nef-Tat
de las fracciones que contienen F4* recogidas durante la
purificación de F4*.
Como con F4(p51)* también se puede
señalar que F4* se comportó globalmente de forma bastante similar a
F4 durante el procedimiento de purificación. Se recuperó la
proteína en las fracciones esperadas como se muestra en el gel SDS
y transferencia western. Una transferencia western de anti-E.
coli demostró también la eliminación de la mayor parte de HCP
ya después de la columna de Q-sepharosa.
\vskip1.000000\baselineskip
La recuperación global fue de aproximadamente 17
mg de F4* purificada obtenida a partir de 465 mg de homogeneizado
de densidad óptica (OD) 50. Extrapolado a un 1 l de cultivo a
densidad óptica (OD) de 140, el rendimiento estaría, de acuerdo con
lo anterior, en el intervalo de 100 mg de F4*.
En resumen, se purificaron las tres proteínas de
fusión F4, F4(p51)* y F4* usando el procedimiento de
purificación I. El gel SDS en la figura 16 compara las tres
proteínas purificadas mostrando el distinto nivel de heterogeneidad
de las construcciones después de la etapa de
Q-sepharosa y después de la eliminación de bandas
de LMW (bajo peso molecular) mediante la columna de Superdex
200.
\vskip1.000000\baselineskip
Se desarrolló también un procedimiento de
purificación simplificado, el procedimiento II en comparación con
el procedimiento I. El procedimiento II consiste únicamente en 2
etapas cromatográficas y diálisis/diafiltración final para
intercambio de tampón. De forma reseñable, se introduce una columna
cromatográfica CM hyperZ (BioSepra) para reemplazar la etapa de
clarificación, la precipitación con sulfato de amonio y la
cromatografía en SO3 del procedimiento I (ejemplo 7). El
procedimiento II se usó para purificar tanto F4 como F4 optimizada
con codón completo ("F4co"). Para F4co, se desarrollaron dos
formas distintas del procedimiento II, una que involucra la
carboxiamidación y otra que no. La finalidad de la etapa de
carboxiamidación era evitar la agregación por oxidación de la
proteína. Esta carboxiamidación se lleva a cabo tras la primera
etapa cromatográfica (CM hyperZ).
- \blacksquare
- Se homogeneizaron células de E. coli (que expresan F4 o F4co) en tampón Tris 50 mM a pH 8,0 en presencia de DTT 10 mM, a una densidad óptica (OD) de 90. Se aplicaron 2 pasadas por equipo Rannie a 1000 bar.
- \blacksquare
- Se añadió urea 8M al homogeneizado antes de aplicación a la resina CM hyperZ (BioSepra) equilibrada con urea 8M en tampón fosfato a pH 7. Se realizó la captura del antígeno en un modo discontinuo. Se empaquetó luego la resina en una columna, se lavaron por arrastre las proteínas no unidas con el tampón de equilibrado y se eliminaron las proteínas de célula huésped unidas (HCP) mediante una etapa de pre-elución con NaCl 120 mM. Se eluyó luego F4co con NaCl 360 mM, urea 8M, DTT 10 mM en tampón fosfato a pH 7,0.
- \blacksquare
- Para controlar la agregación por oxidación de la proteína de fusión, se pueden carboxiamidar los grupos cisteína de F4co con yodoacetamida. Por tanto, se añade opcionalmente yodoacetamida 50 mM al eluído en CM hyperZ y se realizó la carboxiamidación durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
- \blacksquare
- El eluído en CM hyperZ se diluyó luego de forma adecuada (aproximadamente de 5 a 8 veces) y se ajustó a pH 9,0. Se unió luego F4co o F4coca a una columna de Q-sepharosa (Amersham Bioscience) en presencia de urea 8M en tampón Tris a pH 9,0. Se lavó por arrastre la proteína no unida con tampón de equilibrado y una etapa de pre-elución con NaCl 90 mM (sólo con proteína no carboxiamidada) en el mismo tampón eliminó la HCP unida. Se desorbió la F4co de la columna con NaCl 200 mM, urea 8M en tampón Tris a pH 9,0.
- \blacksquare
- Se dializaron muestras dos veces a temperatura ambiente en membranas de diálisis (corte 12-14 kDa) durante la noche frente a 1 l de arginina 0,5M, tampón Tris 10 mM, glutationa 10 mM (añadido sólo a la proteína no carboxiamidada), pH 8,5. De forma alternativa, se consiguió el intercambio de tampón mediante diafiltración frente a 10 volúmenes de muestra del mismo tampón usando una membrana de flujo tangencial con corte a 30 o 50 kDa.
- \blacksquare
- Finalmente, se filtró el producto dializado en condiciones de esterilidad a través de una membrana de 0,22 \mum.
Se muestran las etapas de purificación
secuenciales en el flujograma siguiente.
Todos los tampones contenían DTT si F4co no
estaba carboxiamidada y glutationa en el volumen purificado. Se
omitieron agentes reductores una vez que la proteína estaba
carboxiamidada. *NaCl - para F4co esto fue NaCl 200 mM, para
elución de F4coca elution fue mediante gradiente de NaCl. Esta etapa
se puede optimizar adicionalmente para F4coca mediante
pre-elución con NaCl 60 mM y eluyendo con NaC 100
mM; y para F4co mediante elución con NaCl 100 mM (no se necesita
etapa de pre-elución).
La figura 17 muestra un gel SDS de fracciones
que contienen F4 recogidas durante la purificación de F4co y la
purificación de F4co carboxiamidado ("F4coca").
La resina CM hyperZ capturó completamente F4co
del homogeneizado bruto (carril 1) en presencia de urea 8M y se
alcanzó elución cuantitativa con NaCl 360 mM. El eluído en CM hyperZ
mostrado en la carril 2 estaba enriquecido considerablemente en
F4co. Después de dilución apropiada y ajuste de la muestra a pH 9,
se unió F4co o F4coca a una columna de Q-sepharosa.
Se eluyó luego de forma específica F4co o F4coca con NaCl 200 mM
como se muestra en la carril 3. Esta cromatografía no eliminó sólo
las proteínas de célula huésped que quedan sino también el ADN y
endotoxinas. Para llevar el material purificado a un tampón
compatible con la formulación, el eluído de
Q-sepharosa se dializó frente a tampón Tris 10 mM,
arginina 0,5 M, glutationa 10 mM pH 8,5 en una membrana de diálisis
con corte a 12-14 kDa. Se omitió la glutationa con
la proteína carboxiamidada.
La purificación de F4co y F4coca dio
aproximadamente 500 mg de material purificado por l de cultivo de
densidad óptica (OD) 130. Este estaba en un intervalo similar al
observado previamente con el F4 no optimizado con codón.
Como se describió anteriormente, se han
desarrollado dos procedimientos de purificación distintos (I y II)
para purificar las distintas construcciones de F4. La figura 18
compara los distintos volúmenes purificados que se
obtuvieron.
obtuvieron.
El gel SDS en la figura 18 ilustra claramente el
distinto modelo de las dos diferentes proteínas, F4 y F4co.
Mientras que F4 presentaba varias bandas (LMW) gruesas de peso
molecular bajo, sólo las bandas finas fueron visibles con la F4co
optimizada con codón. El procedimiento I y procedimiento II dan
lugar a un modelo para F4co muy similar. El análisis de
transferencia western de anti-E. coli confirmó la pureza de
las proteínas purificadas indicando contaminación con proteína de
célula huésped por debajo del 1% en todas las preparaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación de adyuvante
1B
Para preparar la formulación adyuvante 1B, se
seca en vacío una mezcla de lípido (tal como fosfatidilcolina bien
de yema de huevo o sintética) y colesterol y 3 D-MPL
en disolvente orgánico (o de forma alternativa en una corriente de
gas inerte). Se añade luego una solución acuosa (tal como solución
salina tamponada con fosfato), y se agita el recipiente hasta que
todo el lípido está en suspensión. Se microfluidiza luego esta
suspensión hasta que el tamaño del liposoma se reduzca hasta
aproximadamente 100 nm, y luego se filtra en condiciones de
esterilidad a través de un filtro de 0,2 \mum. Se podría
reemplazar esta etapa por extrusión o ultrasonidos.
De forma típica la relación de
colesterol:fosfatidilcolina es 1:4 (en relación peso/peso), y se
añade la solución acuosa para dar una concentración en colesterol
final de 5 a 50 mg/ml.
Los liposomas tienen un tamaño definido de 100
nm y se designan como SUV (para vesículas unilamelares pequeñas).
Si esta solución se congela y se descongela repetidamente las
vesículas se condensan para formar estructuras multilamelares
grandes (MLV) de tamaño que varía de 500 nm a 15 \mum.
Los liposomas son estables por sí mismos en el
tiempo y no tienen capacidad fusogénica.
Se añade QS21 en solución acuosa a los liposomas
para alcanzar concentraciones finales de 3 D-MPL y
QS21 de 100 \mug/ml.
Formulación
2A
La preparación de la emulsión aceite en agua se
puede realizar siguiendo el protocolo que se describe en el
documento WO 95/17210. La emulsión contiene en detalle: escualeno al
5%, tocoferol al 5%, tween 80 al 2,0%; el tamaño de partícula es
180 nm.
Se disuelve Tween 80 en solución salina
tamponada con fosfato (PBS) para dar una solución al 2% en PBS. Para
proporcionar 100 ml se agitan 5 g de emulsión doblemente
concentrada de DL alfatocoferol y 5 ml de escualeno para mezclar
completamente. Se añade 90 ml de solución PBS/Tween y se mezcla
completamente. Se pasa luego la emulsión resultante a través de una
jeringuilla y se microfluidiza finalmente usando un equipo
microfluidics M110S. Las gotas de aceite resultante tienen un
tamaño de aproximadamente 180 nm.
La emulsión en volumen estéril se añade a PBS
para alcanzar una concentración final de 500 \mul de emulsión por
ml (en relación volumen/volumen). Se añade luego 3
D-MPL para alcanzar una concentración final de 100
\mug. Se añade luego QS21 para alcanzar una concentración final de
100 \mug por ml. Entre cada adición de componente se agita el
producto intermedio durante 5 minutos.
F4Q no optimizado con codón, purificado de
acuerdo con el procedimiento de purificación I, se diluyó en un
tampón de fosfato/arginina pH 6,8. Se mezcló la dilución con dos
adyuvantes concentrados diferentes (adyuvantes 2A y 1B) con el fin
de obtener una formulación final de 40 \mug/dosis de 500 \mul de
F4 en presencia de 290 (para adyuvante 2A) - 300 (para adyuvante
1B) mM de argnina, 50 \mug de MPL y 50 \mug de QS21. Se
inyectaron en ratones 100 \mul de cada formulación.
Se realizaron estudios de inmunogenicidad en
ratones para evaluar las respuestas inmunes celulares y humorales a
los cuatro antígenos encontrados dentro de F4 (p24, p17, RT y
Nef).
Debido a la complejidad del antígeno F4, se
inmunizaron dos veces ocho cepas de ratón, cada una con un
antecedente genético diferente, en el día 0 y día 21 con 8 \mug
de proteína F4 adyuvantada preparada como se describió
anteriormente, en un volumen de 100 \mul. Se recogieron muestras
de suero y bazo 14 días tras la última inmunización (día 35) para
análisis de las respuestas humorales y celulares en cada uno de los
cuatro componentes de F4 (p24, p17, RT y Nef), así como también
F4.
Se caracterizaron las respuestas a anticuerpo
totales mediante ELISA específico para p24, p17, RT, Nef y F4. La
siguiente tabla, tabla 2, resume donde se observaron respuestas
humorales específicas del antígeno en cada cepa. Los resultados
indican la presencia o ausencia de anticuerpos en comparación con
animales de control inmunizados con adyuvante sólo. Los resultados
presentados son una compilación de dos experimentos separados pero
idénticos. En la tabla, 2A se refiere al antígeno formulado con
3D-MPL y QS21 en una emulsión aceite en agua y 1B
se refiere a antígeno formulado con 3D-MPL, QS21 y
liposomas que contienen colesterol.
Los ratones OF1 dieron respuestas de anticuerpo
para los cuatro componentes de F4. Las respuestas observadas se
muestran en la figura 19. +/- indica que la respuesta observada era
débil o sólo se observó con uno de los dos adyuvantes. Por ejemplo,
respuestas de p17 a ratones B6D2F1: +/- general con +2A y -1B
significa que hay una respuesta con 2A (no débil) y ninguna con 1B.
Respuestas p17 en ratones Balb/c: - general, con un +/- 2A y un -
1B, aquí el +/- significa que la respuesta con adyuvante 2A era
débil.
Se caracterizaron respuestas celulares mediante
tintado por citometría de flujo para expresión de CD4 y CD8,
IFN\gamma y IL-2 (tintado de citoquina
intracelular para expresión de IFN\gamma y IL-2),
siguiendo reestimulación de células de bazo con péptidos
específicos p24, p17, RT o Nef, usando colecciones de librerías de
péptidos de 15 mers con solapamiento de 11 mer. Las respuestas de
CD4 fueron la respuesta celular dominante observada. La siguiente
tabla, tabla 3, resume dónde se observaron las respuestas de
CD4+IL-2+ específicas del antígeno para cada cepa
de ratón. De nuevo, esto se muestra como presencia o ausencia de una
respuesta.
Ratones DBA dieron respuestas de CD4 a los
cuatro componentes de F4. Las respuestas de
CD4+IL-2+ y
CD4+IFN\gamma+ observadas para esta cepa de ratón se muestran en la figura 20.
CD4+IFN\gamma+ observadas para esta cepa de ratón se muestran en la figura 20.
En resumen, F4 formulada en cualquiera de las
dos formulaciones de adyuvante es capaz de promover respuestas
humorales y celulares a p24, p17, RT y Nef. Esto demuestra que cada
región de F4 es inmunogénica en una situación in vivo.
Claims (23)
1. Un polipéptido que comprende Nef o un
fragmento o derivado inmunogénico de la misma, p17 Gag y p24 Gag o
fragmentos o derivados inmunogénicos de las mismas, en el que hay al
menos un antígeno de VIH o fragmento inmunogénico entre p17 Gag y
Gag, comprendiendo adicionalmente el polipéptido RT o un fragmento o
derivado inmunogénico de la misma, en el que los fragmentos o
derivados inmunogénicos son capaces de aumentar una respuesta
inmune frente al antígeno nativo.
2. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 1 que comprende además Pol o un fragmento o derivado
inmunogénico de la misma, en el que el fragmento o derivado
inmunogénico es capaz de aumentar toda respuesta inmune frente al
antígeno nativo.
3. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 1 ó la reivindicación 2, en el que RT o fragmento
inmunogénico es un fragmento en el que RT está truncada en el
término C tal que le falta el dominio ARNasa H de terminal
carboxi.
4. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que el fragmento de RT es el fragmento
p51.
5. El polipéptido de acuerdo con alguna de las
reivindicaciones 2 a 4, en el que RT comprende una mutación en la
posición 592 para reemplazar la metionina por otro residuo, por
ejemplo, lisina.
6. El polipéptido de acuerdo con alguna de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la Nef es Nef de longitud
completa.
7. Un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 1, seleccionado entre uno de los siguientes:
- 1.
- p24 Gag - RT - Nef - p17 Gag
- 2.
- p24 Gag - RT* - Nef - p17 Gag
- 3.
- p24 Gag - p51RT - Nef - p17 Gag
- 4.
- p24 Gag - p51RT* - Nef - p17 Gag
en los que * representa mutación de
metionina_{592} en RT a lisina
8. Un procedimiento para la purificación de un
polipéptido de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 1 a 7,
tal procedimiento comprende:
- i)
- proporcionar una composición que comprende el polipéptido no purificado;
- ii)
- someter la composición a al menos dos etapas cromatográficas;
- iii)
- de forma opcional carboxiamidación del polipéptido;
- iv)
- llevar a cabo una etapa de intercambio en tampón para proporcionar la proteína en un tampón adecuado para una formulación farmacéutica.
9. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que no hay más de dos etapas
cromatográficas.
10. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que la
carboxiamidación se lleva a cabo entre las dos etapas
cromatográficas.
11. Una composición que comprende polipéptido de
acuerdo con la reivindicación 1.
12. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que la RT o fragmento inmunogénico de la
misma es un fragmento en el que RT está truncada en el término C de
modo que le falta el dominio ARNasa H de terminal carboxi.
13. La composición de acuerdo con la
reivindicación 12, en la que el fragmento de RT es el fragmento
p51.
14. La composición de acuerdo con alguna de las
reivindicaciones 11 a 1, en la que la RT comprende una mutación en
la posición 592 tal que la metionina se reemplaza por otro residuo,
por ejemplo, lisina.
15. La composición de acuerdo con alguna de las
reivindicaciones 11 a 14, en la que la Nef es Nef de longitud
completa.
16. Un polinucleótido o polinucleótidos que
codifica un polipéptido o composición de polipéptidos de acuerdo
con alguna de las reivindicaciones 1 a 7 y 11 a 15.
\newpage
17. Una composición farmacéutica que comprende
un polipéptido o polinucleótido o composición de polipéptidos o
polinucleótidos de acuerdo con cualquier reivindicación previa o un
polipéptido purificado de acuerdo con cualquier reivindicación
previa, junto con un vehículo o adyuvante farmacéuticamente
aceptable.
18. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 17, en la que el adyuvante es un adyuvante que
induce Th1 tal como QS21 o 3D-MPL o una combinación
de QS21 y 3D-MPL.
19. Un kit farmacéutico que comprende:
- a)
- una composición que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable; y
- b)
- una composición que comprende un polinucleótido que codifica una o más de Nef o Gag o un fragmento o derivado inmunogénico de Nef o Gag que contiene un epítopo de Nef o Gag presente en el polipéptido de a), junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, en el que el fragmento o derivado inmunogénico es capaz de aumentar una respuesta inmune frente al antígeno nativo.
20. Un kit farmacéutico que comprende:
- a)
- una composición que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, y
- b)
- una composición que comprende un polipéptido que comprende uno o más de Nef o Gag o un fragmento o derivado inmunogénico de Nef o Gag que contiene un epítopo de Nef o Gag presente en el polipéptido de a), junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, en el que el fragmento o derivado inmunogénico es capaz de aumentar una respuesta inmune frente al antígeno nativo.
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