MX2007001515A - Vacuna para prevencion y tratamiento de infeccion de vih. - Google Patents

Abstract

Esta invencion se refiere a fusiones de polinucleotido y polipeptido VIH de Gag, Pol y Nef, los cuales son utiles en las vacunas y composiciones inmunogenicas. La invencion se refiere en particular a un polipeptido que comprende Nef o un fragmento inmunogenico del mismo, y p17 Gag y/o p24 Gag o fragmentos inmunogenicos de los mismos, en donde cuando tanto p17 como p24 Gag se presentan, existe al menos un antigeno VIH o fragmento inmunogenico entre ello. El polipeptido tambien puede comprender Pol o RT o un fragmento inmunogenico del mismo.

Description

VACUNA PARA PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DE INFECCIÓN DE VIH Campo de la invención La presente invención se refiere a construcciones de polipéptidos de VI H nuevos, a su uso en medicina, a composiciones farmacéuticas que las comprenden y a procedimientos para su fabricación. La invención también se refiere a polinucleótidos que codifican los polipéptidos. En particular, la invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden Nef de VI H-1 y Gag de VI H-1 o fragmentos de los mismos, y a polinucleótidos que los codifican . De forma más particular, la invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden proteínas Nef de VI H-1 , Pol de VI H-1 y Gag de VI H-1 o fragmentos de los mismos y a polinucleótidos que los codifican. El VI H-1 es la causa primaria del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) que está catalogado como uno de los principales problemas de salud en el mundo. Hay una necesidad de una vacuna para la prevención y/o tratamiento de la infección por VIH .

Antecedente de la invención El VIH-1 es un virus de ARN de la familia de los retrovirales. El genoma del VI H codifica al menos nueve proteínas que se dividen en tres clases: las proteínas estructurales principales Gag, Pol y Env, las proteínas regulatorias Tat y Rev, y las proteínas accesorias Vpu, Vpr, Vif y Nef. El genoma del VIH muestra la organización 5'L TR-gagpol-env-LTR3' de todos los restrovirus. La glicoproteína gp120 de envoltura del VI H es la proteína viral que se usa para la adhesión a la célula huésped. Esta adhesión está mediada por la unión de dos moléculas de superficie de las células T de ayuda y macrófagos, conocidos como CD4 y uno de los dos receptores de la quemoquina CCR-5 o CXCR-4. La proteína gp120 se expresa en primer lugar como una molécula precursoras mayor (gp160), que luego se escinde post-translacionalmente para dar gp120 y gp41 . La proteína gp120 está retenida sobre la superficie del virón mediante conexión a la molécula gp41 , que está insertada en la membrana viral. La proteína gp120 es la diana principal de los anticuerpo s de neutralización, pero desafortunadamente la mayoría de las regiones inmunogénicas de las proteínas (bucle V3) son también las partes más variables de la proteína. Por tanto, se cree que el uso de gp 120 (o su precursor gp 160) como un antígeno para vacuna para educir anticuerpos de neutralización va a ser de uso limitado para una vacuna ampliamente protectora. La proteína gp 120 también contiene epítopos que son reconocidos por linfocitos T citotóxicos (CTL). Estas células efectoras son capaces de eliminar las células infectadas con virus, y por tanto constituyen un segundo mecanismo inmunológico antiviral principal. Al contrario que las regiones diana de anticuerpos de neutralización algunos epítopos de CTL parecen ser conservados relativamente entre diferentes cepas de VI H. Por esta razón gp 120 Y gp 160 pueden ser componentes antigénicos útiles en vacunas que ayudan a educir respuestas inmunes mediadas por células (particularmente CTL). Proteínas de no envoltura de VIH -1 incluyen , por ejemplo, proteínas estructurales internas tales como los productos de genes gag y pol y otras proteínas no estructurales tales como Rev, Nef, Vif y Tat (Green y col. , New England J . Med, 324, 5, 308 Y siguientes (1991 ) y Bryant y col. (Ed . Pizzo) , Pediatr. Infect. Dis. J. , 1 1 , 5, 390 Y siguientes (1992). La Nef del VI H es una proteína temprana, esto es, es expresada pronto en infección y en ausencia de proteína estructural.

El gen de Nef codifica pronto una proteína del VI H accesoria que ha demostrado poseer varias actividades. Por ejemplo, se sabe que la proteína Nef provoca la baja regulación de CD4, receptor del VIH , y moléculas de clase 1 MHC de la superficie celular, aunque está en debate la importancia biológica de estas funciones. De forma adicional, Nef interactúa con la ruta de señal de las células T e induce un estado activo, que en cambio puede promover expresión génica más eficiente. Algunos aislados del VIH presentan mutaciones en esta región, lo que hace que no codifiquen proteína funcional y se vean seriamente comprometidos en su replicación y patogénesis in vivo. El gen de Gag se translada como una poliproteína precursora que se escinde mediante proteasa para dar productos que incluyen la proteína matriz (P17), la cápsida (P24), la nucleocápsida (p9), p6 Y dos péptidos espaciales, p2 y p 1 . El gen Gag da lugar a la proteína precursora Gag de 55 kilodalton (kD), también denominada p55, que se expresa a partir del ARNm viral no empalmado. Durante la translación el término N de p55 es miristoilado, activando su asociación con el aspecto citoplasmático de las membranas celulares. La poliproteína Gag asociada a la membrana recluta dos copias del ARN genómico viral con otras proteínas virales y celulares que activa la germinación de la partícula viral desde la superficie de una célula infectada. Tras la germinación se esciende la p55 mediante la proteasa codificada viralmente (un producto del gen de pol) durante el proceso de maduración viral en cuatro proteínas más pequeñas designadas MA (matriz [p17]), CA (cápsida [p24]), NC (nucleocápsida [p9]), y p6. Además de las 3 proteínas Gag principales, todos los precursores de Gag contienen otras regiones distintas, que se escinden y permanecen en el virión como péptidos de varios tamaños. Estas proteínas tienen diferentes papeles, por ejemplo, la proteína p2 tiene un papel propuesto en la regulación de la actividad de la proteasa y contribuye a la cronolog ía correcta del procesamiento proteolítico. El polipéptido p17 (MA) se deriva del extremo miristoilado, de terminal N de la p55. La mayoría de las moléculas de MA permanecen adheridas a la superficie interna de la bicapa lípida del virión, estabilizando la partícula. Se recluta un subconjunto de MA dentro de las capas más profundas del virión, donde comienza a formar parte del complejo que acompaña al ADN viral al núcleo. Estas moléculas de MA facilitan el transporte nuclear del genoma viral debido a que es reconocida una señal cariofilica en MA por parte de la maquinaria de importación nuclear celular. Este fenómeno permite al VI H infectar las células que no se dividen , una propiedad inusual para un retrovirus. La proteína p24 (CA) forma el núcleo cónico de las partículas virales. Se ha demostrado que la ciclofilina A interactúa con la región p24 de la p55 llevando a su incorporación a las partículas de VI H . La interacción entre Gag y ciclofilina A es esencial debido a que la disrupción de esta interacción por parte de la ciclosporina A inhibe la replicación viral. La región NC de Gag es responsable del reconocimiento específico de la denominada señal de empaquetamiento del VI H. La señal de empaquetamiento consiste en cuatro estructuras tallo-bucle localizadas cerca del extremo 5' del ARN viral, y es suficiente para mediar la incorporación de un ARN heterólogo en los viriones. de VIH-I. La NC se une a la señal de empaquetamiento a través de interacciones mediadas por dos motivos dedo de cinc. La NC también facilita la transcripción inversa. La región polipeptídica p6 media las interacciones entre p55 Gag y la proteína accesoria Vpr, llevando a la incorporación de Vpr en viriones de ensamblado. La región p6 también contiene un denominado dominio tardío que se requiere para la liberación eficiente de viriones de germinación desde una célula infectada.

El gen de Pol codifica dos proteínas que contienen las dos actividades necesitadas por el virus en la infección precoz, la R T Y la proteína integrasa necesarias para la integración del ADN viral en el ADN de la célula. El producto primario de Pol se escinde mediante la proteasa del virión para dar el péptido RT de terminal ami no que contiene necesariamente actividades para la síntesis de ADN (actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN y ADN así como también una función de ARNasa H) y proteína integrasa de terminal carboxi. La RT del VI H es un heterodímero de RT (p66) de longitud completa y un producto de escisión (p51 ) al que le falta el dominio de ARN asa H de terminal carboxi. R T es una de las proteínas más altamente conservadas codificada por el genoma retroviral. Dos actividades principales de R T son la ADN Pol y la ribonucleasa H . la actividad de ADN Pol de R Tusa ARN y ADN como templados de forma intercambiable y como todas las ADN polimerasas conocidas es incapaz de iniciar la síntesis de ADN de nuevo, pero requiere una molécula pre-existente para servir como un cebador (ARN). La actividad de la ARNasa H inherente en todas las proteínas RT juega el papel esencial, ya en la replicación, de eliminación del genoma de ARN cuando tiene lugar la síntesis de ADN . Degrada de forma selectiva el ARN de todas las moléculas híbridas ARN-ADN. Estructuralmente la polimerasa y la ribo H ocupan dominios no solapados, separados con la Pol cubriendo las dos terceras partes de los amino de la Pol .

La subunidad catalítica p66 está plegada en 5 subdominios distintos. El terminal amino 23 de estos tiene la parte con actividad de RT. El terminal carboxi de estos es el dominio ARNasa H . El documento WO 03/025003 describe construcciones de ADN que codifican p17/24 Gag, Nef y RT del VI H-I, en los que las secuencias de ADN pueden estar optimizadas con codón para parecerse a genes humanos altamente expresados. Estas construcciones son útiles en vacunas de ADN. Se han sugerido proteínas de fusión que contienen múltiples antígenos de VI H como candidatos a vacunas para VIH, por ejemplo, la fusión Nef-Tat como se describe en el documento WO 99/16884. Sin embargo, las proteínas de fusión no son de producción directa; puede haber dificultades en la expresión de las mismas debido a que no se corresponden con proteínas nativas. Puede haber dificultades a nivel de transcripción, o posteriormente. Estas tampoco son de formulación directa en una composición farmacéuticamente aceptable. De forma notable, la mayoría de los enfoques de vacunas para VI H que implican múltiples antígenos condensados conjuntamente, son enfoques de ADN o vector vivo más que proteínas de fusión de polipéptidos.

Breve Descripción de la invención La presente invención proporciona construcciones nuevas para uso en vacunas para la profilaxis y tratamiento de infecciones por VI H y SI DA.

En un aspecto la invención proporciona un polipéptido que comprende Nef o un fragmento inmunogénico de la misma, y p 17 Gag y/o p24 Gag o fragmentos inmunogénicos de las mismas, en el que cuando cuando ambas p 17 Y p24 Gag están presentes hayal menos un antígeno de VI H o fragmento inmunogénico entre ellas. En las construcciones y composiciones de acuerdo con la invención como se describen en esta invención, la Nef_s preferiblemente una Nef de longitud completa. En las construcciones de acuerdo con la invención la p 17 Gag y p24 Gag son preferiblemente p17 y p24 de longitud completa respectivamente. En una realización el polipéptido comprende tanto p17 como p24 Gag o fragmentos inmunogénicos de los mismos. En una construcción de este tipo el componente p24 Gag y el componente p 17 Gag están separados por al menos un antígeno de VI H adicional o fragmento inmunogénico, tal como Nef y/o RT o fragmentos inmunogénicos de las mismas. De forma alternativa p17 o p24 Gag se pueden proporcionar por separado. Así pues, la invención también proporciona una composición que comprende (i) un polipéptido que comprende Nef o un fragmento inmunogénico de la misma y p17 Gag o un fragmento inmunogénico de la misma, y (ii) p24 Gag o un fragmento inmunogénico de la misma; o (i) un polipéptido que comprende Nef o un fragmento inmunogénico de la misma y p24 Gag o un fragmento inmunogénico de la misma, y (ii) p17 Gag o un fragmento inmunogénico de la misma . En otra realización la construcción de polipéptido de acuerdo con la invención comprende además Polo un derivado de Pol tal como RT o un fragmento inmu nogénico de la misma . Fragmentos particulares de R T que son adecuados para uso en la invención son fragmentos en los que la RT está truncada en el término C , preferiblemente de modo que les falta el dominio ARNasa H de terminal ca rboxi. U n fragmento de este tipo al q ue le falta el dominio ARNasa H de terminal carboxi es el fragmento p51 descrito en esta ¡nvención . Preferiblemente la R T o fragmento inmunogénico en las proteínas de fusión descritas en esta invención es p66 RT o p51 RT.

El componente RT de_ la proteína de la proteína de fusión o composición de acuerdo con la invención comprende de forma opcional una mutación en la posición 592, o mutación equivalente en cepas distintas a HXB2 , de modo q ue la metionina . se elimina mediante mutación en otro residuo, por ejemplo, lisina . La finalidad de esta mutación es eliminar un lugar que si rve como un sitio de iniciación interno en los sistemas de expresión procarióticos. También el componente RT, o de forma alternativa , comprende una mutación para eliminar la actividad del enzima (transcriptasa inverso) . Así pues puede estar presente K231 en lugar de W. En las proteínas de fusión de acuerdo con la invención que comprenden p24 y RT, puede ser preferible que la p24 preceda a la RT en la construcción debido a q ue cuando los antígenos se expresan solos en E. coli se observa mejor expresión de p24 que de RT.

Construcciones preferidas de acuerdo con la invención incluyen las siguientes: 1. p24- R T- N ef- p 17 2. p24- RT* - Nef- p17 3. p24- p51RT- Nef- p17 4. p24 - p51RT* - Nef - p17 5. p17 - p51RT - Nef 6. p17 - p51RT* - Nef 7. Nef - p17 8. Nef - p17 con conector 9. pl7-Nef 10. pl7 - Nef con conector * representa mutación de metioninas92 en R T a lisina En otro aspecto la presente invención proporciona una proteína de fusión de antígenos de VIH que comprende al menos cuatro antígenos de VIH o fragmentos inmunogénicos, en los que cuatro antígenos o fragmentos son o se derivan de Nef, Pol y Gag.

Preferiblemente Gag está presente como dos componentes sepa rados q ue están separados por al menos otro antígeno en la fusión . Preferiblemente la Nef es Nef de longitud completa . Preferiblemente la Pol es p66 o p51 RT. Preferiblemente la Gag es pl7 y p24 Gag . Otros rasgos preferidos y propiedades de los componentes del antígeno de la fusión en este aspecto de la invención son como se describen en esta invención . Realizaciones preferidas de este aspecto de la invención son las cuatro fusiones de componentes que ya se enumeraron anteriormente: 1 . p24 -RT - Nef-pl7 2. p24-RT* -Nef-pl7 3. p24 - p51 RT - Nef - pl7 4. p24 - p51 RT* - Nef - pl7 Las construcciones polipeptídicas de antígenos de VI H de acuerdo con la invención son capaces de ser expresadas en sistemas in vitro incluyendo sistemas procarióticos tales como E. cofi. De forma ventajosa, estas se pueden purificar mediante proced imientos de purificación convencionales. Las fusiones descritas en esta invención son preferiblemente solubles cuando se expresan en un sistema de expresión seleccionado, esto es, están presentes en una cantidad sustancial en el sobrenadante de un extracto bruto del sistema de expresión . La presencia de la proteína de fusión en el extracto bruto se puede medir mediante medios convencionales tales como elución en u n gel SDS, tintado con Coomassie y comprobación de la banda apropiada mediante medida densitométrica. Las proteínas de fusión de acuerdo con la invención son preferiblemente solubles al menos en el 50%, más preferiblemente solubles al menos en el 70% , lo más preferiblemente solubles en el 90% o más medido mediante las técnicas descritas en esta invención en los ejemplos. Se conocen técnicas la solubilidad expresadas de las proteínas para mejorar recombinantemente, por ejemplo, en sistemas de expresión procarióticos se mejora la solubilidad mediante disminución de la temperatura a la que se induce la expresión génica. Las proteínas de fusión descritas en esta invención se pueden purificar. En particular se pueden purificar mientras permanecen solubles o significativamente solubles. Fragmentos inmunogénicos como se describen en esta invención contendrán al menos un epítopo del antígeno y mostrará antigenicidad por VIH. De forma típica los fragmentos inmunogénicos contienen al menos 20, preferiblemente 50, más preferiblemente 100 aminoácidos contiguos al antígeno de VIH. La invención proporciona en un aspecto más polinucleótidos que codifican los polipéptidos de acuerdo con la invención. Se pueden usar polinucleótidos de acuerdo con la invención como vacunas de polinucleótidos. Los polinucleótidos pueden estar presentes dentro de cualquiera de unavariedad de sistemas de liberación conocidos por los especialistas en la técnica , incluyendo sistemas de expresión de ácido nucleico tales como ADN plásmido, sistemas de expresión bacterianos y virales. Son bien conocidas en la técnica numerosas técnicas de liberación de genes, tales como las descritas por Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15: 143-198, 1998 Y referencias citadas en ese documento. Sistemas de expresión de ácido nucleico apropiados contienen las secuencias de ADN necesarias para la expresión en el paciente (tal como un promotor adecuado y señal de terminación). Cuando el sistema de expresión es un microorganismo vivo recombinante, tal como un virus o bacteria, el gen de interés se puede insertar dentro del genoma del virus recombinante vivo o bacteria. La inoculación y la infección . in vivo con este vector vivo llevará a la expresión in vivo del antígeno e inducción de respuestas inmunes. Virus y bacterias usadas para este fin son, por ejemplo: poxvirus (por ejemplo, vaccinia, fowlpox, canaripox, poxvirus modificados, por ejemplo, virus Ankara modificado (MV A)), alfavirus (virus Sindbis, virus Semliki Forest, virus de la encefalitis equina venezolana), flavivirus (virus de la fiebre amarilla, virus del dengue, virus de la encefalitis japonesa), adenovirus, virus adeno-asociados, picornavirus (poliovirus, rinovirus), virus de herpes (virus varicella zoster, etc), morbilivirus (e.g . rubéola), Listeria, Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. Estos virus y bacterias pueden ser virulentos, o ser atenuados de varias formas con el fin de obtener vacunas vivas. Tales vacunas vivas también forman parte de la invención. Un vector de rubéola preferido para uso como un vector vivo de acuerdo con la invención es la cepa de Schwartz o una cepa derivada de la misma. Un adenovirus preferido para uso como un vector vivo es un adenovirus humano seroprevalente inferior tal como Ad5 o Ad35 o un adenovirus no humano tal como un adenovuris de simio. Preferiblemente, los vectores son defectivos en la replicación. De forma típica estos virus contienen una deleción en E 1 Y se pueden criar en líneas celulares que se transforman con un gen El. Los adenovirus de simio preferidos son virus aislados de chimpancés. En particular C68 (también conocido como Pan9) (véase la patente de Estados Unidos n° 6083716) y se prefieren para uso en la presente invención Pan 5, 6 Y Pan 7 (documento WO 03/046124). Estos vectores se pueden manipular para insertar un polinucleótido heterólogo de acuerdo con la invención de modo que se pueden expresar los polipéptidos de acuerdo con la invención. El uso, formulación y fabricación de tales vectores adenovirales recombinantes se describe detalladamente en el documento WO 03/046142. Por tanto, se puede proporcionar Nef, p17 y p24 Gag y RT de una vacuna preferida de acuerdo con la invención en forma de un polinucleótido que codifica el polipéptido deseado. Se pueden usar los polinucleótidos de acuerdo con la invención para expresar los polipéptidos codificados en un sistema de expresión seleccionado. Al menos uno de los antígenos de VI H , por ejemplo, la RT, se puede codificar mediante una secuencia optimizada con codón en el polinucleótido, esto quiere decir que la secuencia ha sido optimizada para la expresión en un sistema de expresión recombinante seleccionado tal como E. co/i. En otro aspecto la invención proporciona un pol ipéptido p51 RT o un pol inucleótido que 10 codifica, preferibemente optimizado con codón para la expresión en un sistema de expresión adecuado, en particular un sistema procariótico tal como E. co/i. El polipéptido p51 R T o polinucleótido se puede usar sólo, o en combinación con una construcción de polipéptido o polinucleótido de acuerdo con la invención. Por tanto, en un aspecto más la invención proporciona una composición que comprende (i) un polipéptido que comprende Nef o un fragmento que contiene epítopo de Nef y p17 Gag y/o p24 Gag, en los que cuando ambos p17 y p24 Gag están presentes hayal menos un antígeno de VI H o fragmento inmunogénico entre ellos y (ii) un polipéptido p51 RT. La invención proporciona además polinucleótidos que codifican estos. De acuerdo con esta realización (i) se puede seleccionar entre, por ejemplo: 1 . Nef-p17 2. Nef - p17 con conector 3. p17-Nef 4. p1 7 - Nef con conector Preferiblemente Nef es Nef de longitud completa . Preferiblemente p 1 7 es p1 7 de long itud completa . Los polipéptidos y polinucleótidos de acuerdo con la invención se pueden combinar con otros antígenos o polinucleótidos q ue codifican otros antígenos. En particula r, esto puede incluir proteínas env del VI H o fragmentos que contienen un epítopo de env. Formas preferidas de env son pg 1 20, gp140 y gp 1 60. Por tanto, la invención proporciona además una composición que comprende cualquiera de los polipéptidos o composiciones de polipéptido de acuerdo con la invención , ju nto con una proteína env del VI H o fragmento de la misma q ue contiene un epítopo env. De forma similar la invención proporciona una composición que comprende un polinucleótido o polinucleótidos q ue codifican La invención proporciona además procedimientos de preparación de los polipéptidos descritos en esta invención , tal procedimiento comprende la expresión de un polinucleótido que codifica el polipéptido en una sistema de expresión adecuado, en particula r un sistema procariótico tal como E. coli y reconversión del polipéptido expresado. Preferiblemente se induce la expresión a una temperatura baja , q ue es una temperatura por debajo de 37° , para promover la solubilidad del polipéptido. La invención proporciona además composiciones inmunogénicas y vacunas que comprenden los polipéptidos y polinucleótidos de acuerdo con la invención , en combinación con un adyuvante o veh ícu lo farmacéuticamente aceptable. Las vacunas de acuerdo con la invención se pueden usa r para inmunización profiláctica o terapéutica contra VI H . La invención proporciona además el uso de los polipéptidos y composiciones de polipéptido y los polinucleótidos y composiciones de polinucleótido como se describen en esta invención, en la fabricación de una vacuna para inmunización profiláctica o terapéutica contra VI H. La vacuna de la presente invención contendrá una cantidad inmunoprotectora o inmunoterapéutica del polipéptido y/o antígenos de polinucleótido y se puede preparar mediante técnicas convencionales. La preparación de vacuna se describe en general en New Trends and Developments in Vaccines, editedo por Voller y col. , University Park Press, Baltimore, Maryland, EEUU 1978. La encapsulación dentro de liposomas se describe, por ejemplp, por parte de Fullerton, patente de Estados Unidos 4.235.877. La conjugación de proteínas en macromoléculas se describe, por ejemplo, por parte de Likhite, patente de Estados Unidos 4.372.945 Y por parte de Armor y col. , patente de Estados Unidos 4.474.757. La cantidad de proteína en la dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuestainmunoprotectora sin efectos sencundarios adversos significativos en vacunas típicas. Tal cantidad variará dependiendo de qué inmunógeno específico se use y del régimen de vacunación que se seleccione. En general se espera que cada dosis comprenda de 1 a 1 000 _g de cada proteína, preferiblemente de 2 a 200 _g, lo más preferiblemente de 4 a 40 _g de la fusión de polipéptido. Se puede averiguar una cantidad óptima para una vacuna determinada mediante estudios convencionales que incluyen la observación de títulos de anticuerpo y otras respuestas inmunes en sujetos. Tras una vacunación inicial , los sujetos pueden recibir un refuerzo en aproximadamente 4 semanas, y u na segunda inmu nización de refuerzo a contin uación . Las proteínas de la presente invención está n preferiblemente adyuvadas en la formulación de vacuna de la invención . Se describen adyuvantes en general en Vaccine Desig n - the Subunit and Adjuvant Approach , editado por Powell and Newman , Plenum Press, N ueva York, 1 995. Adyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio tal como hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, pero también pueden ser una sal de calcio, hierro o cinc, o pueden ser u na suspensión insoluble de tirosina acilada , o azúcares acilados, polisacáridos derivatizados catiónicamente o aniónicamente, o polifosfazenos. En la formulación de la invención se prefiere que la composición adyuvante incluya una respuesta Th 1 preferencial. Sin embargo, se entenderá que no se excluyan otras respuestas, incluyendo otras respuestas humorales. Se genera u na respuesta immune a un antígeno a través de la interacción del antígeno con las células del sistema i nmune. La respuesta inmune resultante se puede distinguir ampliamente en dos categorías extremas, siendo respuestas inmunes h umoral es o mediadas por células (caracterizadas trad icionalmente por mecanismos efectores de anticuerpo y celulares de protección respectivamente). Estas categorías de respuesta se han denominado respuestas de tipo Th 1 (respuesta mediada por célula), y respuestas inmunes de tipo Th2 (respuestas humoral es). Las respuestas inmunes de tipo Th 1 extremas se pueden caracterizar por la generación de linfocito s T citotóxicos restringidos por el haplotipo, específicos del antígeno, y respuestas de células asesinas naturales. En ratones, las respuestas de tipo Th1 se caracterizan frecuentemente por la generación de anticuerpo s del subtipo lgG2a, mientras que en el humano estas corresponden a anticuerpos de tipo IgG 1 . Las respuestas inmunes de tipo Th2 se caracterizan por la generación de un amplio intervalo de isotipos de inmunoglobulina incluyendo en ratones IgG 1 , IgA e IgM. Se puede considerar que la fuerza impulsora detras del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunes son las citoquinas, un número de mensajeros proteico s identificados que sirven para ayudar a las células del sistema inmunológico y dirigir la respuesta inmune eventual a una respuesta Th 1 o Th2. Por tanto, niveles elevados de citoquinas de tipo Th 1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células respecto al antígeno administrado, mientras que niveles elevados de citoquinas de tipo Th2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales respecto al antígeno. Es importante recordar que la distinción de respuestas inmunes de tipo Th 1 y Th2 no es absoluta. En realidad un individuo soportará una respuesta inmune que se describe que es predominantemente Th 1 o predominantemente Th2. Sin embargo, es frecuentemente conveniente considerar las familias de citoquinas en términos de lo descrito en clones de células T CD4+ve murinas por parte de Mosmann y Coffman (Mosmann, TR. and Coffman, R. L. (1989) THl and TH2 Gel/s: different patterns oflymphokine secretion lead to different lunctional properties. Annual Review 01 Imm uno logy, 7, páginas 145 a 173). Tradicionalmente las respuestas de tipo Th1 están asociadas con la producción de las citoquinas IN F-y e IL-2 por parte de linfocitos T. Otras citoquinas frecuentemente asociadas directamente con la inducción de respuestas inmunes de tipo Th 1 no son producidas por células T, tales como I L-12. Por el contrario las respuestas de tipo Th2 estás asociadas con la secreción de IL-4, I L- 5, I L-6, IL-10 y factor de necrosis tumaral _(TN F-_). Se sabe que ciertos adyuvantes de vacuna son particularmente adecuados para la estimulación de respuestas de cito quina de tipo Th1 o Th2. Tradicionalmente los mejores indicadores del equilibrio Thl :Th2 de la respuesta immune tras una vacunación o infección incluye la medida directa de la producción de citoquinas Th1 o Th2 por parte de linfocítos T in vitro tras reestimulación con antígeno, y/o la medida de la relación IgG 1 :lgG2a de respuestas de anticuerpo específicas de antígeno. Por tanto, un adyuvante de tipo Th 1 es uno que estimula poblaciones de células T aisladas para producer altos niveles de citoquinas de tipo Th 1 cuando se re-estimulan con antígeno in vitro, e induce respuestas de inmunoglobulina específicas del antígeno asociadas con isotipo de tipo Th 1 . Inmunoestimulantes de tipo Th1 preferidos que se pueden formular para producer adyuvantes adecuados para uso en la presente invención ¡ncluyen elevados los siguientes y no se restringen a estos. Monofosforillípido A, en particular el monofosforillípido A 3-de-O-acilado (3D-MPL), es un inmunoestimulante de tipo Th 1 preferido para uso en la ¡nvención . 3D-MPL es un adyuvante bien conocido fabricado por Ribi Immunochem, Montana. Químicamente es suministrado frecuentemente como una mezcla de monofosforillípido A 3-de-O-acilado con cadenas aciladas en 4, 5 ó 6. Se puede purificar y preparar mediante los procedimientos dados a conocer en el documento GB 2122204B, tal referencia también describe la preparación de difosforillípido A, y variants 3-0-deaciladas del mismo. Se han descrito otros lipopolisacárdios purificados y sintéticos (documentos US 6.005.099 y EP 0729473 B1 ; Hilgers y col., 1986, Int.ArchAllergy. lmmunol., 79(4):392-6; Hilgers y col., 1987, Immunology, 60(1 ): 141 -6; y EP 0549074 B1 ). Una forma preferida de 3DMPL es en la forma de una formulación particulada que tiene un tamaño de particular pequeño inferior a 0,2 jJ .m de diámetro, y su procedimiento de fabricación se describe en el documento EP 0689454. Las saponinas son también inmunoestimulantes Th 1 preferidos de acuerdo con la invención . Las saponinas son adyuvantes bien conocidos y se dan a. conocer en: LacailleDubois, M Y Wagner H . (1996. A review ofthe biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine volumen 2, páginas 363-386). Por ejemplo, se describen Quil A (derivado de la corteza del árbol sudamericano Quillaja Saponaria Molina), y fracciones del mismo, en el documento US 5.057.540 y en "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55; y en el documento EP 0362279 B 1. Se han descrito saponinas hemolíticas QS21 y QS 17 (fracciones de Quil A purificadas con HPLC) como potentes adyuvantes sistémicos, y se describe el procedimiento de su producción en la patente de Estados Unidos número 5.057.540 y en el documento EP 0362279 B1. También se describe en estas referencias el uso de QS7 (una fracción no hemolítica de Quil-A) que actúa como un potente adyuvante para vacunas sistémicas. El uso de QS21 se describe además por parte de Kensil y col. (1991. J. Immunology volumen 146, 431-437). Se conocen también combinaciones de QS21 y polisorbato o ciclodextrina (documento WO 99/10008). Los sistemas adyuvantes particulados que comprenden fracciones de QuilA, tales como QS21 y QS7 se describen en los documentos WO 96/33739 y WO 96/11711. Otro inmunoestimulante prefedrido es un oligonucleótido inmunoestimulatorio que contiene dinucleótidos CpG no metilados ("CpG"). CpG es una abreviatura de motivos de dinucleótido de citosin-guanosina presentes en ADN. CpG es conocido en la técnica como un adyuvante cuando se adminitra tanto por vía sistémica como mucosal (documentos WO 96/02555, EP 468520, Davis y col., J.lmmunol, 1998, 160(2):870-876; McCIuskie y Davis, J.lmmunol., 1998, 161 (9):4463-6). Históricamente se observó que la fracción de ADN de BCG podría ejercer un efecto anti-tumor. En otros estudios, se demostró que oligonucleótidos sintéticos derivados de secuencias de gene s de BCG son capaces de inducir efectos inmunoestimulatorios (tanto in vitro como in vivo). Los autores de estos estudios concluyeron que ciertas secuencias palindrómicas, incluyendo un motivo CG central, portaban esta actividad. El papel central del motivo CG en la ¡nmunoestimulación se elucidaba más tarde en una publicación de Krieg, Nature 374, páginas 546 1995. Análisis detallados han mostrado que el motivo CG tiene que estar en un cierto contexto de secuencia, y que esas secuencias son comunes en ADN bacteriano pero que son raras en ADN de vertebrados. La secuencia inmunoestimulatoria es frecuentemente: Purina, Purina, C, G, pirimidina, pirimidina; en la que el motivo CG no está metilado, pero se conocen otras secuencias CpG no metiladas por ser inmnoestimulatorias y se pueden usar en la presente invención. En ciertas combinaciones combinaciones de los seis nucleótidos está presente una secuencia palindrómica. Pueden estar presentes en el mismo oligonucleótido varios de estos motivos, bien como repeticiones de un motivo o una combinación de distintos motivos. La presencia de una o varias de estas secuencias inmunoestimulatorias que contienen oligonucleótidos puede activar distintos subconjuntos inmunes, incluyendo células asesinas naturales (que producen interferona y y tienen actividad citolítica) y macrófagos (Wooldrige y col. volumen 89 (número 8), 1977). Otras secuencias que contienen CpG no metilado que no tienen esta secuencia de consenso se ha demostrado también ahora que son inmunomodulatorias. GpG cuando se formula en vacunas, se administra por lo general en solución libre junto con antígeno libre (documento WO 96/02555; McCIuskie y Davis, véase anteriormente) o conjuntado convalentemente con un antígeno (documento WO 98/16247), o formularse con un vehículo tal como hidróxido de aluminio ((antígeno de superficie de la hepatitis) Davis y col. véase anteriormente; Brazolot-Millan y col., Proc. Nati. AcadSci., EEU U , 1998,95(26), 15553-8). Tales inmunoestimulantes como se describen anteriormente, se pueden formular junto con vehículos, tales como por ejemplo liposomas, emulsiones aceite en agua y o sales metálicas, incluyendo sales de aluminio (tal como hidróxido de aluminio). Por ejemplo, se puede formular 3D-MPL con hidróxido de aluminio (documento EP 0689454) o en emulsiones aceite en agua (documento WO 95/17210); se puede formular QS21 de forma ventajosa con liposomas que contienen colesterol (documento WO 96/33739), emulsiones aceite en agua (documento WO 95/17210) o alumbre (documento WO 98/15287); CpG se puede formular con alumbre (Davis y col. véase anteriormente; Brazolot-Millan véase anteriormente) o con otros veh ículos catiónicos.

Se prefieren también combinaciones de inmunoestimulantes, en particular una combinación de un monofosforil lípido A y un derivado de saponina (documentos WO 94/00153; WO 95/17210; WO 96/33739; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/1 1241 ), más particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL como se describe en el documento WO 94/00153. De forma alternativa, una combinación de CpG más una saponina tal como QS21 también fomra un adyuvante potente para uso en la presente invención. Por tanto, sistemas adyuvantes adecuados incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforillípido A, preferiblemente 3D-MPL, junto con una sal de aluminio. Un sistema mejorado incluye la combinación de un monofosforillípido A y un derivado de saponina, particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL como se describió en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica donde el QS21 se desactiva en liposomas que contienen colesterol (DQ) como se describe en el documento WO 96/33739. Se describe una formulación adyuvante particularmente potente que involucra QS21 , 3DMPL y tocoferol en una emulsión aceite en agua en el documento WO 95/17210 y es otra formulación preferida para uso en la invención. Otra formulación preferida comprende un oligonucleótido CpG sólo o junto con una sal de aluminio. En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un procedimiento para la fabricación de una formulación de vacuna como se describe en esta invención , en el que el procedimiento comprende mezcla de un polipéptido de acuerdo con la invención con un adyuvante adecuado. Las combinaciones adyuvantes particularmente preferidas para uso -en las formulaciones de acuerdo con la invención son como sigue: i) 3D-M PL + QS21 en DQ ¡i) Alumbre + 3D-M PL iii) Alumbre + QS21 en DQ + 3D-MPL iv) Alumbre + CpG 3D-MPL + QS21 en DQ + emulsión aceite v) en agua vi) CpG La administración de la composición farmacéutica puede tomar la forma de una o de más de una dosis individual, por ejemplo, como dosis repetidas de la misma composición que contiene polipéptido, o en un régimen de vacunación "inducción-refuerzo" heterólogo. Un régimen inducción-refuerzo heterólogo usa administración de diferentes formas de vacuna en la inducción y el refuerzo, cada una de las cuales puede incluir por sí misma dos o más administraciones. La composición de inducción y la composición de refuerzo tendrán al menos un antígeno en común, aunque no es necesariamente una forma idéntica del antígeno, esta puede ser una forma diferente del mismo antígeno.

Se pueden llevar a cabo inmunizaciones de ind ucción refuerzo de acuerdo con la invención con una combinación de proteína y formulaciones basadas en ADN . U na estrategia de este tipo se considera q ue es efectiva en la inducción de amplias respuestas inmunes. Vacunas de proteína adyuvadas inducen principalmente anticuerpos y respuestas inmunes de células T de ayuda, mientras la liberación de ADN como un plásmido o un vector vivo induce fuertes respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) . Por tanto, la combinación de proteína y vacunación con ADN proporcionará una amplia variedad de respuestas inm unes. Esto es particularmente relevante en el contexto de VI H , ya que se cree que ambos anticuerpo s de neutralización y CTL son importantes para la defensa inmune contra VI H . De acuerdo con la invención un calendario para la vacunación puede comprender la administración secuencial ("inducción-refuerzo") o simultánea de antígenos de de polipéptido y ADN que codifica los polipéptidos. El ADN se puede liberar como ADN desnudo tal como ADN plásmido o en la forma de un vector vivo recombinante, por ejemplo, u n vector poxvirus , un vector adenovirus, un vector de virus de la rubéola , o cualq uier otro vector vivo adecuado. Se pueden inyectar antígenos de proteína una o varias veces seg uido de una o varias admin istraciones de ADN , se puede usar ADN en primer lugar du rante una o más administraciones seguidas de u na o más inmunizaciones con prote ína . Un ejemplo particular de inmunización por inducción-refuerzo de acuerdo con la invención incluye la inducción con ADN en la forma de u n vector vivo recombinante tal como un vector de poxvirus modificado, por ejemplo, virus Ankara modificado (MV A) o un alfavirus, por ejemplo, virus de encefalitis eq uina venezolana , o u n vector adenovirus, o un vector de virus de la rubéola , seg uido de refuerzo con una proteína , preferiblemente una proteína adyuvada . Por tanto la invención proporciona además un kit farmacéutico que comprende: a) una composición que comprende un polipéptído que comprende Nef o un fragmento inmunogénico de la misma y p 1 7 y/o p24 Gag o un fragmento inmunogén ico de la misma, en la q ue cuando ambas p 1 7 Y p24 Gag están presentes hayal menos un antígeno de VI H o fragmento inmunogénico del mismo entre ellas, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable; y b) una composición que comprende un polinucleótido que codifica una o más de Nef o Gag o u n fragmento inmu nogén ico de Nef o Gag que contiene un epítopo de Nef o Gag presente en el polipéptido de a), junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable . Preferiblemente el polipéptido de a) comprende además RT o un fragmento inmunogénico de la misma tal como p51 RT. En una realización alternativa el kit farmacéutico comprende: a) una composición q ue comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende Nef o un fragmento inmunogénico de la misma y p 1 7 y/o p24 Gag o un fragmento inmunogénico de la misma, en la que cuando ambas p 17 Y p24 Gag están presentes hayal menos un antígeno de VIH o fragmento inmunogénico entre ellas, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, y c) una composición que comprende un polinucleótido que comprende uno o más de Nef o Gag o un fragmento inmunogénico de Nef o Gag que contiene un epítopo de Nef o Gag presente en el polipéptido de a), junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente el polinucleótido de a) codifica un polipéptido que comprende además RT o un fragmento inmunogénico del mismo tal como p51 RT. Polipéptidos y polinucleótidos preferidos para uso en un kit para inducción/refuerzo de acuerdo con la invención son polipéptidos y polinucleótidos como se describen en esta invención. Por tanto, el componente proteico de un enfoque inducción/refuerzo de tipo proteína ! ADN puede ser cualquiera de las proteínas de fusión preferidas descritas en esta invención. Igualmente, el componente ADN puede ser un polinucleótido que codifica cualquiera de las proteínas preferidas. Por tanto, por ejemplo, las fusiones p24 - RT - Nef - p17, p24 - RT* - Nef - p17, p24p51 RT - Nef - p17, p24 - p51 RT* - Nef - p17, p17 - p51 RT - Nef o p17 - p51 RT* Nef o cualquiera de las fusiones p17- Nef como se describen en esta invención se pueden proporcionar en un kit de inducción refuerzo en el que la composición de inducción comprende la proteína de fusión y la composición de refuerzo comprende un polinucleótido que codifica la proteína de fusión, o la composición de inducción comprende el polinucleótido y la composición de refuerzo comprende la proteína de fusión. Ambas composición de inducción y composición de refuerzo pueden ser liberadas en más de una dosis. Además las dosis de inducción y de refuerzo iniciales pueden ser seguidas de otras dosis adicionales que pueden ser alteradas para dar lugar, por ejemplo, a una inducción por ADN plásmido / refuerzo de proteína / otra dosis de ADN plásmido / otra dosis de proteína. Por optimización con codón se entiende que la secuencia de polinucleótido se optimiza para parecerse al uso del codón de genes en el sistema de expresión deseado, por ejemplo, un sistema procariótico tal como E. coli. En particular, el uso del codón en la secuencia se optimiza para parecerse al de los genes de E. coli altamente expresados. La finalidad de la optimización con codón para expresión en un sistema recombinante de acuerdo con la invención es doble: mejorar los niveles de expresión del producto recombinante y hacer los productos de expresión más homogéneos (obtener un modelo de expresión más homogéneo). Mejor homogeneidad significa que hay pocos productos de expresión irrelevantes tales como truncados. La adaptación de uso del codón a la expresión de E. coli puede eliminar también las secuencias de "desplazamiento de marco" putativas así como también la terminación prematura y/o sitios de iniciación internos. El código de ADN tiene 4 letras (A, T, e y G) Y usa estas para deletrear tres letras "codones" que representan los aminoácidos de las proteínas codificadas en un gen del organismo. La secuencia lineal de codones a lo largo de la molécula de ADN se translada en la secuencia lineal de aminoácidos en la(s) proteína(s) codificadas por estos genes. El código está altamente degenerado, con 61 codones que codifican para los 20 aminoácidos naturales y 3 codones que representan señales "de parada". Por tanto, la mayoría de los aminoácidos están cod ificados por más de un codón -de hecho varios están cod ificados por cuatro o más codones diferentes. Donde esté disponible más de un codón para codificar para un aminoácido dado, se ha observado que los patrones de uso de codón de organismos son altamente no aleatorios. Diferentes especies muestran una preferencia diferente en su selección de codón y, además, la utilización de los codones puede ser marcadamente diferente en una única especie entre genes que se expresan a niveles superiores e inferiores. Esta preferencia es diferente en virus, plantas, bacterias y células de mamíferos, y algunas especies muestran una preferencia más fuerte lejos de una selección de codón aleatoria que otros. Por ejemplo, los humanos y otros mamíferos no son menos fuertemente preferidos que ciertas bacterias o virus. Por estas razones, hay una probabilidad significativa de que un gen viral de un virus de mamífero expresado en E. coli , o un gen extraño o recombinante expresado en células de mamífero tendrán una distribución inapropiada de codones para expresión eficiente. Se cree que la presencia en una secuencia de ADN heteróloga de bucles de codones o una abundancia de codones que se observan raramente en el huésped en cuya expresión se van a producir, es predictiva de bajos niveles de expresión heteróloga en ese huésped .

En los polinucleótidos de la presente invención el modelo de uso del codón puede estar alterado del típico de virus de inmunodeficiencia humana para representar más estrechamente la preferencia codónica del organismo diana, por ejemplo E. coli. Hay una variedad de programas disponibles públicamente útiles para la optimización con codón, por ejemplo "CalcGene" (Hale y Thompson, Protein Expression and Purification 12: 185-189 (1998).

EJEMPLOS Ejemplo 1 : Construcción, expresión y purificación de F4 de fusión p24 - RT - Nef - p17 del VIH-I Se expresaron proteínas gag p24 de (proteína cápsida) y p17 (proteína matriz), la transcriptasa inversa y Nef de VIH-1 en cepa B834 de E.coli. (B834 (DE3) es un pariente auxótrofo de la metionina de BL21 (DE3» , bajo control del promotor del bacteriófago T7 (sistema de expresión pET). Estos se expresaron como una proteína de fusión simple que contiene la secuencia completa de las cuatro proteínas. La secuencia que codifca p24 madura proviene del clon molecular de BH 10 del VI H-1 , secuencia p17 madura y gen de RT de HXB2 y gen de Nef de aislado de BRD. Tras inducción, las células B 1849 expresaron niveles significativos de la fusión p24-RT-Nef-p17 que ascendieron hasta eh 0% de la proteína total. Cuando se cultivaron células e indujeron a 22° C, la proteína de fusión p24-RT-Nef-p17 se confinó principalmente en la fracción soluble de los lisados bacterianos (incluso tras congelación/descongelación). Cuando se cultivaron a 30° C, en tomo al 30% de la proteína recombinante estaba asociada con la fracción insoluble. La proteína de fusión p24-RT-Nef-p17 está hecha de hasta 1 136 aminoácidos con una masa molecular de aproximadamente 129 kDa. La proteína de longitud completa migra hasta aproximadadamente 130 kDa en gel SDS. La proteína tiene un punto isoeléctrico teórico (pl) de 7,96 basado en su secuencia de aminoácidos, confirmado por electroforesis en gel2D.

Detalles del plásmido recombinante: nombre: pRIT15436 (o nombre de laboratorio pET28b/p24-RT-Nef-p17 ) vector huésped: pET28b replicón: colE1 selección: canamlcma promotor: inserción: T7 gen de.fusión de p24-RT-Nef-p17. Detalles de la proteína recombinante: Proteína de fusión p24-RT-Nef-p17: 1136 aminoácidos Término N - p24 : 232a. a . - bisag ra :2a . a . - RT: 562a . a . bisagra :2a . a . - Nef: 206a . a . - P17: I 32a.a. - Término e Secuencias de nucleótidos y aminoácidos Secuencia de nucleótidos atggttatcgtgcagaacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaact ttaaatgcatgggtaaaagtagtagaagagaaggctttoagcocagaagtaataccoatg ttttcagcattatcagaaggagccaccccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtg gggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaagagaccatcaatgaggaagctgcagaa tgggatagagtacatccagtgcatgcagggcctattgcaccaggccagatgagagaacca aggggaagtgacatagcaggaactactagtacccttcaggaacaaataggatggatgaca aataatccacctatcccagtaggagaaatttataaaagatggataatcctgggattaaat aaaatagtaagaatgtatagccctaccagcattctggacataagacaaggaccaaaagaa ccttttagagactatgtagaccggttctataaaactctaagagccgagcaagcttcacag gaggtaaaaaattggatgacagaaaccttgttggtccaaaatgcgaacccagattgtaag actattttaaaagcattgggaecagcggctacactagaagaaatgatgacagcatgtcag ggag aqqaggacccggcca t aaqgcaagagt t t t g 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aminoácidos MVIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSA SEGATP QDLNTMLNTVGGHQAA QM KETINEEAAE DRVHPVHAGPIAPGQMREP RGSDIAGTTST QEQIGWMTNNPPIPVGEIYKRWII G NKIVRMYSPTS ILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCK TILKALGPAAT EEMMTACQGVGGPGHKARVL_GPISPIETVSVKLKPG MDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKK KDSTKWRKLVDFRE4NKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAY FSVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNV PQGWKGSPAIFQSSMT KILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLT TPDKKHQKEPPFLIMGYE HPDKWTVQP I VLPEKDSWTVN D IQKLVGKLN WASQIYPGIKVRQ CKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVH GVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQ TYQIYQEPFKN KTGKYARMRGAHTNDV KQLTEAVQKITTESIVI GKTPKFKLPIQKET ET TEYWQAT IPEWE FVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETFYVDGAANRETKLGKAG VTNRGRQK VVTLTDTTNQKTELQAIY ALQDSGLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDQSES ELVNQIIEQLIKKEKVYLA VPAHKGIGGNEQVDKLVSAGIRK_GGK SKSSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAA CAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQ RRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFG CYKLVPVEPDKVE EANKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFK N_GARASVLSGGELDR EKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAV NPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKD TKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY Secuencia de P24: aminoácidos 1 -232 (en neg rita) Secuencia de RT: aminoácidos 235-795 Secuencia de Nef: aminoácidos 798-1 002 Secuencia de P1 7: aminoácidos 1005-1 136 Cajas: aminoácidos introducidos mediante genética K (Lisine) : en luga r de triptópano (W). introducida para eliminar la actividad enzimática.

Expresión de la proteína recombinante: En el plásmido pET, el gen Diana (p24-RT-Nef-p1 7) está bajo control del promotor del bacteriófago T7 fuerte. Este promotor no es reconocido por la ARN polimerasa de E.coli y es dependiente de u na fuente de T7 AR N polimerasa en la célula huésped . La célula h uésped B834 (DE3) contiene u na copia cromosomal del gen de T7 ARN polimerasa bajo control de lacUV5 y la expresión es inducida por la adición de I PTG al cu ltivo bacteriano. Se cultivaron los pre-cultivos, en matraces de agitación , a 37° C hasta fase semllogarítmica (A620:0,6) y luego se almacenaron a 4° C durante la noche (para evitar cultivos en fase estacionaria). Se cultivaron los cultivos en medio LBT suplementado con glucosa al 1 % Y 50 /-lg/ml de canamicina. La adición de glucosa al medio de crecimiento tiene la ventaja de reducir la expresión de proteína recombinante basal (evitando la depresión mediada por AM Pc del promotor lacUV5) . Se usaron diez m l de cultivos almacenados durante la noche a 4° C para inocular 200 m l de medio LBT (sin glucosa) q ue contiene canamicina. Se cultivaron los cultivos a 30° C y 22° C y cuando la densidad óptica (OD) a 620 alcanzó 0,6, se añadió I PTG (ImM final) .

Se incubaron los cultivos durante 3, 5 Y 1 8 horas (du rante la noche). Se recogieron muestras antes y después de 3, 5 Y 1 8 horas de inducción . La preparación del extracto fue corno sigue: Se suspendieron agregados celulares en tampón* de ruptura (a una densidad óptica (O . D.) teórica de 1 0) y se trituró mediante cuatro pasadas en prensa francesa (a 20.000 psi o 1250 bar) . Se centrifugaron los extractos brutos (T) a 20.000g d urante 30 minutos para separar las fracciones sol ubles (S) e insolubles (P). *Tampón de ruptu ra: Tris-HCL 50 mM pH 8 ,0, EDTA 1 mM , DTT + cóctel de in hibidores de proteasa I mM (completo/Boerhinger) .

Análisis por SDS-P AG E y Transferencia western : Se experimentaron fracciones correspondientes a ag regado insoluble (P), sobrenadante (S) Y extracto bruto (T) en SDS-PAGE al 10% en condiciones reductoras. Se detectó p24RT-Nef -p17 recombinante mediante tintado con azul de Coomassie en Transferencia western (WB). Tintado con Coomassie: la proteína p24-RT-Nef-p17 aparece como: una banda a::!: 130 kDa (ajustando con PM calculado) PM teórico: 128,970 Daltons PM aparente: 130 kDa Análisis por Transferencia western: Reactivos = - anticuerpo monoclonal para RT (p66/p51) Adquirido a ABI (Advanced Biotechnologies) _di1ución: 1/5000 - Anticuerpo anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalino dilución: 1/7500 Nivel de expresión: - banda específica de p24-RT-Nef-p17 muy fuerte tras inducción de 20 horas a 22° C, represetando hasta el 10% de la proteína total (véase figura 1). "Solubilidad" de la proteína recombinante: Extractos celulares "frescos" (fracciones T,S,P): con crecimiento/inducción a 22° C/20 horas, casi toda la proteína de fusión p24-RT-Nef-p17 se recupera en la fracción soluble del extracto celular (figura IA). Con crecimiento/inducción a 30° C/20 horas, se asocia aproximadamente el 30% de la proteína p24-RT- Nef-p17 con la fracción insoluble (figura 1 ). "Congelación/descongelación" (fracciones S2, P2): La fracción soluble (S 1 ) (inducción de 20 horas a 22° C) se conservó a-20° C. Se congeló y se centrifugó a 20.000g/30 minutos: S2 y P2 (re suspendidas en volumen 1 /10) Tampón de ruptura con DTT: casi toda la proteína de fusión p24-RT-Nef-p17 permanece soluble (sólo precipitó de 1 a 5 %) (véase figura 2) Tampón de ruptura sin DTT: de 85 a 90 % de p24-RT-Nef-p17 permanece soluble (figura 2) Figuras: I Figura 1 A- Tintado de Coomassie y western blot Figura 1 B - ensayo de solubilidad -p24-RT-Nef-p17 La proteína F4 se purificó utilizando el método de purificación 1 en el Ejemplo 7. Las condiciones de crecimiento cellular y de inducción y preparación de extractos celulares para los ejemplos que siguen son como se describe en el ejemplo 1 a menos que se especifiquen otras condiciones (por ejemplo, temperatura, composición del tampón de ruptura).

Ejemplo 2: Construcción y expresión de P51 RT (RT optimizada con codón, truncada) La región RT/p66 entre los aminoácidos 428-448 es susceptible para las proteasas de E.coli. La construcción de P51 termina en Leu 427 dando lugar a la eliminación del dominio ARNasa H (véase alineación de la secuencia de RT en la figura 3). También se eliminaron las secuencias "que desplazan el marco de lectura" de E. coli putativas en la secuencia de gen nativo de RT (mediante optimización con codón del gen p51 ).

Diseño/construcción del gen sintético p51 .. La secuencia del gen p51 sintético se diseñó de acuerdo con el uso de codón en E. cofi, con la ayuda del programa "SynGene". Se construyó el gen sintético como sigue: se ensamblaron 32 oligonucleótidos en una PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de etapa única. En una segunda PCR se amplificó el ensamblaje de longitud completa usando los cebadores de extremo y el producto de PCR resultante se clonó en plásmido intermedio pGEM- T. Tras corrección de errores puntuales introducidos durante la síntesis del gen, el gen sintético p51 se clonó en plásmido de expresión pET29a. Este plásmido recombinante se usó para transformar células B834 (DE3).

Características de la proteína recombinante: Secuencia de aminoácido: M_PISPIETVSVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPY NTPVFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQ GIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDA F SVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNP DIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLR GLTTPDKKHQKEPPFLIMGYELHP DKWTVQPIVLPEKDS TVNDIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKA TEVIPLT EEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQ TYQIYQEPFKNLKTGKYAR MRGAHTNDVKQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPE EF VNTPPLVK[ RPASI Ca j as : Aminoácidos introducidas mediante construcción genética .

K (Lisina) : en lugar de triptófano ( ) . Mutación introducida para eliminar la actividad del enzima.

Longitud, peso molecular, punto isoeléctrico (IP): 433 AA, PM: 50,3 kDa" IP: 9,08 Expresión de p51 en células B834(DE3): Se evaluaron el nivel de expresión de P5I y solubilidad de proteína recombinante, en paralelo con la cepa de producción RT/p66. Nivel de expresión de p51: Condiciones de inducción: se cultivaron/inducieron células a 37° C (+IPTG ImM), durante 5 horas. Tampón de ruptura: Tris/HC150 mM, pH:7,5, EDTA ImM, +/- DTT ImM Análisis Transferencia western: Reactivos: - anti RTpoliclonal de conejo (P03LI6 de conejo) (dilución: 1/10.000) - anticuerpo anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalino (dilución: 1/7500) Se experimentaron fracciones celulares correspondientes a extractos brutos (T), agregados insolubles (P) y sobrenadante (S) en SDS-P AGE al 10% en condiciones reductoras. Como se ilustró en el gel tintado con Coomassie y Transferencia western (figura 4) se observó una expresión muy alta de P51 (de 15 a 20% de la proteína total), mayor que la observada para P66. Para ambas proteínas p51 y p66 (después de 5 horas de inducción a 37° C), el 80% de los productos recombinantes se recuperaron en la fracción soluble (S 1 ) de extractos celulare.

Cuando se expresaron a 30° C, se asociaron el 99% de proteínas recombinantes con la fracción soluble (datos no mostrados). El modelo de Transferencia western para p51 fue multibanda, pero menos complejo que el observado para P66. Ensayo de solubilidad Ensayo de solubilidad: Congelación/descongelación de la fracción soluble (SI) (inducción de 5 horas, 37° C) preparada en condiciones reductoras (tampón de ruptura con DTT) y no reductoras. Tras descongelación se centrifugaron las muestas de SI a 20.000g/30 minutos, generando S2 y P2 (p2 se resuspende en volumen 1/10). Después de la congelación/descongelación de fracciones solubles (S 1 ), preparadas en condiciones reductoras, así como en condiciones no red uctoras, se recuperan aún el 99% de p51 y p66 en la fracción soluble (S2). Sólo se encuentra u n 1 % en el precipitado (P2) .

Ejem plo 3: Construcción y expresión de p1 7-Nef y Nef-p1 7 con o sin conector Se construyeron proteínas de fusión dobles con y sin conectores. Los conectores ayudaron a disminutir las interacciones potenciales entre los dos partícipes de la fusión y son como siguen : Nef-IGSGGG PI-P 1 7 v p1 7-IGSGGG PI-Nef Construcción de plásm idos recom binantes : . Vector de expresión pET29a/Nef-p1 7: Se amplificó el gen de fusión Nef-p1 7 mediante PCR a partir del plásmido recombinante de F4. . El producto de PCR se donó en el vector de donación pGEM- T intermedio y a continuación en el vector de expresión pET29a. . Vector de expresión pET28b/p17-Nef: Se amplificó el gen de Nef mediante PCR a partir del plásmido recombinante de F4. Se donó el producto de PC R en el vector de donación pGEM- T intermedio y a continuación en el vector de expresión pET28b/p 1 7, como un terminal C en la fusión de marco con el gen p 1 7. . Vector de expresión pET29a/Nef-conector-p1 7 y pET28b/p1 7-conector-Nef: Se insertó un frag mento de ADN de 1 8 bp que codifica pa ra el conector hexapeptídico (GSGGGP) entre los partícipes de la fusión Nef y p17, mediante mutagénesis dirigida al sitio (usando el "Sistema de mutagénesis dirigida al sitio GeneTailor", Invitrogen).

Características de la proteína recombinante: . Longitud, peso molecular, punto isoeléctrico (IP) Nef-p17 (denominado NP): 340 AA, PM: 38,5 kDa, IP:7,48 Nef-IGSGGGPI-P17 (denominado NLP): 346 AA, PM:38,9 kDa, IP: 7,48 p17-Nef(denominado PN): 342 AA, PM: 38,7 kDa, IP: 7,19 p17-IGSGGGpl-Nef (denominado PLN): 348 AA, PM: 39, 1k Da, IP: 7,19 Secuencias de aminoácido: Nef-p17 (NP) MGGK SKSSVVG PTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGA1TSSNTAATNAACA LEA QEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGL1HSQRRQD1LDLW1YHTQGY FPDWQN TPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVEEANKGENTSLLHPVS HGMDDPEREV LEWRFDSR A HHVARELHPEYFKNC_GARASVLSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLK HIVWASRE ERFAVNPGLLETSEGCRQILGQ QPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRI EIKDTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY Caja: aminoácidos introducidos mediante construcción genética. La secuencia Nef está en negrita.

P17-Nef (PN) MGARASVLSGGELDRWEK1RLRPGGKKKYKLKH1V ASRELERFAVNPGLLETSEGCRQ1 LGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQR1E1KDTKEALDK1EEEQNKSKKKAQQAAA DTGHSNQVSQ_GGKWSKSSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAIT SSNTAATNAACAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMT KAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQ RRQDILDLWIYHTQGYFPD QNYTPGPGVRYPLTFGWCY VPVEPDKVEEANKGENTSL LHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC Caja: aminoácidos introducidos mediante construcción genética. La secuencia de p 17 está en negrita.

Expresión comparativa de Nef-p17, fusiones p17-Nef, con y sin conectores: Las cuatro cepas recombinantes se indujeron a 30° C durante 3 horas, en paralelo con cepas que producen F 4 Y N ef. Se prepararon extractos brutos y se analizaron mediante gel tintado con Coomassie y Transferencia westernting .

Análisis Transferencia western: Reactivos: anti RTpoliclonal de conejo (P03L 16 de conejo) (dilución: 1/10.000) - anticuerpo anti-conejo cojungado con fosfatasa alcalina (dilución: 1/7500) Como se ilustra en la figura 5, las fusiones Nef-p1 7 y p1 7-Nef, con y sin conector, se expresan a u n alto nivel ( 1 0% de las proteínas totales) . En el Tra nsferencia westem : las cuatro construcciones de fusión dobles presenta un modelo multi-banda , pero menos complejo que el observado para F4. Cuando se expresan solas, las proteínas Nefy p17 presentan patrones de banda simples. Se analizaron adicionalmente cepas que expresan fusiones Nef-p17 (N P) y p17-Nef (PN) sin péptido conectar (ensayos de solubilidad, véase a continuación), Ensayo de solubilidad de Nef-p17 y p17-Nef: Se indujeron proteínas Nef-p17 and p17-Nef en paralelo con cepas que producen F4 y Nef. Condiciones de inducción: crecimiento/indución de células a 30" C (+IPTG 1 mM), durante 3 horas. Tampón de ruptura: Tris/HCI50 mMpH:8, NaCI50 mM, EDTA 1 mM Extractos celulares frescos: Se prepararon extractos celulares (en condiciones no reductoras) y fracciones que corresponden a extractos brutos (T), agregado insoluble (P) y se analizaron los sobrenadantes (S 1 ) en gel tintado con Coomassie y Transferencia westem. Como se ilustra en la figura 6 en gel tintado con Coomassie y Transferencia westem, casi todas las Nef-p17, p17-Nef, así como también proteínas Nef se recuperan en la fracción soluble (S) de extractos celulares. Para la construcción F4: del 5 a 10% de proteína recombinante ya se recuperaba en la fracción de agregado. Conclusiones: Todas las construcciones de fusión dobles ensayadas son altamente expresadas ( > 10% de proteína total). Las proteínas de fusión P17-Nef y Nef-p17 son más solubles que F4. Ambas presentan un modelo de WB menos complejo. Ejemplo 4: Construcción y expresión de p24-RT*-Nef-pl7 (F4*) F4* es una versión mutada de la fusión F4 (p24-RT/p66-Nef-p17) donde se sustituye la metionina en la posición 592 por una lisina. Esta metionina es un sitio de "inicio" transcripcional interno putativo, ya que soportó secuenciación del terminal N llevada a cabo en una muestra de eluído en Q-sepharosa del experimento de purificación de F4. Incluso, la banda pequeña relacionada con F4 principal a 62 kDa presente en la muestra eluída en Q comienza en la metionina 592. La metionina se reemplaza por una lisina: RMR RKR. El motivo RKR está presente de forma natural en secuencias de R T de ciado A. Se evaluó el impacto de esta mutación en epítopos CD4-CD8: Se pierde un epítopo CTL de HLA-A3 (A * 3002), pero están presentes otros 9 epítopos HLA-A3 en la secuencia de RT. No se identificó epítopo de ayuda en esta región.

Características de proteína recombinante: Término N - Ip24: 232a.a. l-lbisaqra:2a.a.l- /RT: 562a .a.1 bisaqra:2a.a.l- ef: 206a.a.l- /1 >17: 132a.a.1 - Término e . Longitud, peso molecular, punto isoeléctrico (IP): 1 136 AA, 129 kDa, I P: 8,07 . Secuencia de nucleótidos: atggttatcgtgcagaacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaact ttaaatgcatgggtaaaagtagtagaagagaaggctttcagcccagaagtaatacccatg ttttcagca tatcagaaggagccaccccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtg gggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaagagaccatcaatgaggaagctgcagaa tgggatagagtacatccagtgcatgcagggcctattgcaccaggccagatgagagaacca aggggaagtgacatagcaggaactactagtacccttcaggaacaaataggatggatgaca aataatccacotatoccagtaggagaaatttataaaagatggataatcctgggattaaat aaaatagtaagaatgtatagccctaccagcattctggacataagacaaggaccaaaagaa ccttttagagactatgtagaccggttctataaaactctaagagccgagcaagcttcacag gaggtaaaaaattggatgacagaaaccttgttggtccaaaatgcgaaoccagattgtaag actattttaaaagcattgggaccagcggc-tacactaqaagaaatgatgacagcatgtcag gga taggagq acccggcca aa gcaaqagt tt t atat ggcccca t t age ect a t tgagactgtgtcagtaaaattaaagccaggaatggatggcccaaaagttaaacaatggcc at gacagaagaaaaaataaaagcattagtagaaatttgtacagagatggaaaaggaagg gaaaatttcaaaaattgggcctgaaaatccatacaatactccagtatttgccataaagaa aaaagacagtactaaatggagaaaattagtagatttcagagaacttaataagagaactca agact ctgggaagttcaattaggaataccacatcccgcagggttaaaaaagaaaaaatc agtaacagtactggatgtgggtgatgcatatttttcagttcccttagatgaagacttcag gaaatatactgcatttaccatacctagtataaacaatgagacaccagggattagatatca gtacaatgtgcttccacagggatggaaaggatcaccagcaatattccaaagtagcatgac aaaaatcttagagccttttagaaaacaaaatccagacatagttatctatcaatacatgga tgatttgtatgtaggatctgacttagaaatagggcagcatagaacaaaaatagaggagct gagacaacatctgttgaggtggggact accacaccagacaaaaaacatcagaaagaacc tccattccttaaaatgggttatgaactccatcctgataaatggacagtacagcctatagt gctgccagaaaaagacagctggactgtcaatgacatacagaagttagtggggaaattgaa ttgggcaagtcagatt acccagggattaaagtaaggcaattatgtaaactccttagagg aaccaaagcactaacagaagtaataccactaacagaagaagcagagctagaactggcaga aaacagagaga tctaaaagaaccagtacatggagtgtattatgacccatcaaaagactt aatagcagaaatacagaagcaggggcaaggccaatggacatatcaaatttatcaagagcc atttaaaaatctgaaaacaggaaaatatgcacgtaaacgcggtgcccacactaatgatgt aaaacaattaacagaggcagtgcaaaaaataaccacagaaagcatagtaatatggggaaa gactcctaaatttaaactgccca acaaaaggaaacatgggaaacatggtggacagagta ttggcaagccacctggattcctgagtgggagtttgttaatacccctcctttagtgaaatt atggtaccagttagagaaagaacccatagtaggagcagaaaccttctatgtagatggggc agctaacagggagactaaattaggaaaagcaggatatgttactaatagaggaagacaaaa agttgtcaccctaactgacacaacaaatcagaagactgagttacaa caatttatctagc t tgcaggattcgggattagaagtaaacatagtaacagactcacaatatgcattaggaat ca tcaagcacaaccagatcaaagtgaatcagagt agtcaatcaaataatagagcagtt aataaaaaagqaaaaqqtctatctqqcatgqgtaccaqcacacaaaggaattqqagqaaa tgaacaagtaga taaa t t a t cag t ge t ggaa tcaggaaagtgc talqcta tqlqqtqqca aqtgqtcaaaaaqtaqtqtqgttgqatqqcctactgtaagqqaaaqaatgaqacqaqctq aqccagcagcaqatgqqqtqqqaqcaqcatctcqaqacctqqaaaaacatqqaqcaatca caaqtagcaatacaqcaqctaccaatqctgcttgtgcctqgctagaaqcacaaqaqqaqq aqqaqgtggqttttccaqtcacacctcaqqtacctttaaqaccaatqact tacaagqcagctqtaqatcttagccactttttaaaaqaaaaqqggqqactqqaaqggcta attcactcccaacqaaqacaaqatatccttgatctqtqqatcta cea caca caá ggetac 11 ce ctqattqqcaqaactacacaccaqqqccaqgqgtca gata teca ctgacctttqqa tqqtqctacaaqctaqt ccaqttqagccaqataaqqtaqaaqaqqccaataaaggagag aacaccagcttq tacaccctgtgagcctqcatqqaatqqatqaccctqaqaqaqaaqtq ttaqagtgqaqqtttqacaqccgcctaqcatttcatcacqtqqcccqaqaqctqcatccg ga tac t t caaqaactqc qqcc a t qqq t qcqaqagcgt ca t a t t aaqcqqqggaqa attagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaa acatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttaga aacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatc agaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggat agagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaa gaaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaatta ctaa La secuencia de p24 está en negrita La secuencia de Nef está subrayada Cajas: nucleótidos introducidos genética mediante construcción . Secuencia de aminoácidos MVIVQNIQGQMVHQAISPRTLNA VKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATP QDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAE DRVHPVHAGPIAPGQMREP RGSDIAGTTSTLQEQIG MTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRM SPTS ILDIRQGPKEPFRD VDRFYKTLRAEQASQEVKN MTETLLVQNANPDCK TILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVL GPISPIETVSVKLKPG DGPKVKQWPLTEEK1KALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKK DSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAG KKKKSVTVLDVGDAY FSVP DEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMT KILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSD EIGQHRTKIEELRQHLLRWG T TPDKKHQKEPPF IMGYELHPD WTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLN WASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIP TEEAELELAENREILKEPVH illi% GVYYDPS DLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNL TG YARIRGAHTNDV QLTEAVQ ITTESIVIWG TPKFKLPIQKETWET WTEY QAT IPEWE FVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTNRGRQK VVTLTDTTNQKTELQAIYLALQDSGLEVNIV DSQYALGIIQAQPDQSES ELVNQIIEQ IKKEKVYLAWVPAHKGIGGNEQVDKLVSAGIRK_GG WSKSSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAA CAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQ RRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYK VPVEPDKVE EANKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREVLE RFDSRLAFHHVARELHPE FK NC_GARASVLSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELE FAV NPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTG?EELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKD T EALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY Secuencia de P24: aminoácidos 1 -232 (en negrita) Secuencia de RT: aminoácidos 235-795 Secuencia de Nef: aminoácidos 798-1002 Secuencia de P17: aminoácidos 1005-1 136 Caj as: aminoácidos introducidos mediante construcción ica K (Lisina) 1 : en lugar de triptófano (W). Mutación introducida para eliminar la actividad del enzima. Expresión de F4* en células B834(DE3): Se indujo cepa recombinante F4* a 22° C durante 18 horas, en paralelo con la construcción no mutada F4. Se prepararon extractos brutos y se analizaron mediante gel tintado con Coomassie y Transferencia westernting . Como se ilustra en la figura 7, se expresó F4* en un alto nivel ( 1 0% de proteína total) , ligeramente mayor en comparación con F4 y desapareció la banda a 62 kDa pequeña . Análisis Transfgrencia western: Reactivos: - antip24 pool 3 Mabs (JC13. 1, JC 16. 1, /G8. 1. 1)(dilución 1/5000) - anti RTpoliclonal de conejo (03L/6 de conejo) (dilución: 1/10000) - anti Nef- Tat policlonal de conejo (388 de conejo) (dilución n 1/10000) - anticuerpo anticonejo conjugado con fosfatasa alcalino (dilución: 1/7500) - anticuerpo antiratón conjugado con fosfatasa alcalino (dilución: 1/7500) Ejem plo 5: Construcción y expresión de F3 y F3* (F3 m utado) F3 (p1 7-p51 -Net) y F3* (p1 7-p51 *-Net) en las que el sitio de iniciación de metionina interno putativo es reemplazado por lisina . Se podrían usar las fusiones F3 y F3* en combinación con p24. Construcción de plásmidos recombinantes: F3: Se excitó la secuencia que codifica p51 (como fragmento de ADN Sea l y Stu l) a partir de plásmido de expresión pET29a/p51 y se ligó en plásmido pET28b/p 1 7-Nef, en el sitio Stu l (localizado entre p 1 7 y el gen de Net), como una fusión en marco con secuencias de p17 y Nef. La construcción de fusión resultante p17-p51-Nef se denomina 5F3. F3 *: Se consiguió mutación del sitio de iniciación de metionina int-emo putativo usando el "sistema de mutagénesis dirigida al sitio Gene Tailor" (Invitrogen), generando la construcción F3 * . Se usaron plásmidos F3 y F3* para transformar células B834 (DE3).

Características de proteína recombinante: Término N Ip17: 134a.a.1 - lbisaqra:2a.a.1 - IP511P51 *: 426a.a.1 - lbisagra:2a.a.1 - ¡Nef:1 O6a.a.1 Término e Longitud, peso molecular, punto isoeléctrico (IP) 770 AA, 88.5 kDa, IP:8,58 Secuencia de nucleótidos (para F3*) atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcgg 60 ttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggag 120 ctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaata 180 ctgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaact tagat cattatataat 2 0 acagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagct 300 ttaqacaaqatagaggaaqaqcaaaacaaaagtaagaaaaaaqcacaqcaaqcaqcaqct 360 9 ac ac aggac ac age aa t caggtcagc caaaa t t ac e t cg aclaggac tlGGTCCGA TCTCT 20 CCGATAGAAACAG TTCGGTCAAGCTTAAACCAGGGATGGATGGTCCAAAGGTCAAGCAG 80 TGGCCGCTAACGGAAGAGAAGAT AAGGCGCTCG AGAGATTTGTACTGAAATGGAGAAG 5 0 GAAGGCAAGATAAGCAAGATCGGGCCAGAGAACCCGTACAATACACCGGTATTTGCAATA 600 AAGAAGAAGGATTCAACAAAATGGCGAAAGCTTGTAGATTTTAGGGAACTAAACAAGCGA 660 ACCCAAGACTTTTGGGAAGTCCAACTAGGTATCCCACATCCAGCCGGTCTAAAGAAGAAG 720 AAATCGGTCACAGTCCTGGATGTAGGAGACGCA ATT TAG GTACCGCT GATGAGGAC 780 TTCCGAAAGTATACTGCGTTTACTATACCGAGCATAAACAATGAAACGCCAGGCATTCGC 8<10 TATCAGTACAACGTGCTCCCGCAGGGCTGGAAGGGGTCTCCGGCGATATTTCAGAGCTCT 900 ATGACAAAAATACTTGAACCATTCCGAAAGCAGAATCCGGATATTGTAATT ACCAATAC 960 ATGGACGATCTCTATGTGGGCTCGGATCTAGAAATTGGGCAGCATCGCACTAAGATTGAG 1020 GAACTGAGGCAACATCTGCTTCGATGGGGCCTCACTACTCCCGACAAGAAGCACCAGAAG 1080 GAGCCGCCGT CCTAAAGATGGGCTACGAGCTTCATCCGGACAAGTGGACAGTACAGCCG 1140 ATAGT GCT GC C CGAAAAG GA T C GGAC C GTAAATGATATT CAGAAACTAGT C GGCAAG 1200 CTTAACTGGGCCTCTCAGATTTACCCAGGCATTAAGGTCCGACAGCTTTGCAAGCTACTG 1260 AGGGGAACTAAGGCTCTAACAGAGGTCATCCCATTAACGGAGGAAGCAGAGCTTGAGCTG 1320 GCAGAGAATCGCGAAAT CTTAAGGAGCCGGTGCACAGGGTATACTACGACCCCTCCAAG 1380 GACC T A AGC CGAGAT CCAGAAGCAGGGGCAGGGCCAAT GGACGTACCADATATAT CAÁ 1 0 GAACCGTTTAAGAATCTGAAGACTGGGAAGTACGCGCGCAAACGAGGGGCTCATACTAAT 1500 GAT G AAAGCAAC T ACGGAAG CAGTACAAAAGATTAC ACTGAGT CTATT GTGATATGG 1560 GGCAAGACCCCAAAGTTCAAGCTGCCCATACAGAAGGAAACATGGGAAACATGGTGGACT 1620 GAATATTGGCAAGCTACCTGGATTCCAGAATGGGAATTTGTCAACACGCCGCCGCTGGTA 1680 AAAcT aqqcct TG gt ggcaaq t q t caaaaag t aq tg t q 11 ga t gcc t a c t q t a 1740 agggaaagaatgagacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagac 1800 ctggaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcc 1860 tggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtaccttta 1920 agaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaagggggga 1980 ctggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccac 20 0 acacaaggct act tccctgattggcagaactacacaccagggccaggggt caga tat cea 2100 ctgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggcc 2160 aataaaggagagaacaccagct gttacaccctgtgagcct catggaatggatgaccct 2220 gagagagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccga 2280 gagctgcatccggagtacttcaagaactgctaa 2213 P17: secuencia en negrita P51 : secuencia en letras mayúsculas Nef: secuencia en lestras minúsculas Cajas: nucleótidos introducidos genética mediante construcción .Secuencia de aminoácidos (para F3) MGARASVLSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQI LGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEI DTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAA DTGHSNQVSQ_GPISPIETVSVKLKPGMDGPKVKQWP TEEKIKALVEICTEMEK 60 EG ISKIGPENPYNTPVFAIKKKDSTKWRKLVDFRE NKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKK 120 SVTVLDVGDAYFSVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGW GSPAIFQss 180 MTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDD YVGSDLEIGQHRT IEELRQHLLRWGLTTPDK HQK 2 0 EPPFL_GYELHPD TVQPIVLPEKDSWTVNDIQK VG LN ASQIYPGIKVRQLCKLL 20 RGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDL1AEIQKQGQGQ TYQIYQ 80 EPFKNLKTGKYARBRGAHTNDVKQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWT 540 EYWQAT IPEWEFVNTPPLV _GGKW?KSSVVG PTVRERMRRAEPAADGVGAASRD600 EKHGAITSSNTAATNAACAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGG660 LEGLIHSQRRQDI DLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFG CYKLVPVEPD VEEA 720 NKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSR AFHHVARELHPEYFKNC 770 Secuencia de P17: aminoácidos 1 -134 (en negrita) Secuencia de P51 : aminoácidos 137-562 Secuencia de Nef: aminoácidos 565-770 Cajas: aminoácidos introducidos mediante construcción genética lugar de triptófano (W). Mutación para eliminar la actividad del enzima. Expresión de F3 en células B834(DE3): Se evaluaron el nivel de expresión de F3 y las solubilidades de proteína recombinante en paralelo con cepas de producción de (p24-p66-Nef-pl7) de F4 y pl7-Nef (F2). Condiciones de inducción : crecimiento de células a 37° C / inducidas a 30° C (+IPTG 1 mM), durante 3 horas. Tampones de ruptura: F4: Tris/HC150 mMpH :8,0, NaCI50 mM , EDTA 1 mM , +/- DTT 1 mM F2: Tris/HC150 mMpH:8,0, NaCI50 mM, EDTA 1mM, sin DTT F3: Tris/HCI50 mMpH:7,5, NaCI 50 mM, EDTA 1 mM, +/- DTT 1 mM Análisis Transferencia western: reactivos - anti RTpoliclonal de conejo (PO3L16 de conejo) (dilución: 1/10000) - anti Nef-Tat policlonal de conejo (388 de conejo) (dilución 1/10000) - anticuerpo anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalino (dilución: 1/7500) Extractos celulares "frescos" Se analizaron las fracciones celulares correspondientes a extractos brutos (T), agregados insolubles (P) y sobrenadante (S) en SDS-P AGE al 10% en condiciones reductoras. Como se ilustra en la figura 9, la proteína de fusión F3 se expresa en un alto nivel (10% de proteína total). Casi toda la F3 se recupera en la fracción soluble (S) de extractos celulares, aunque de 5 a 10% de producto F4 está ya asociado con la fracción de agregado. El modelo de WB es simplificado en comparación con F4.

Expresión de F3* en células B834(DE3): Se indujo la cepa recombinante F3* a 37° C durante 3 horas, construida en paralelo con F3 no mutada. Se prepararon los extractos celulares brutos y se analizaron mediante gel tintado con Coomassie y Transferencia westernting. Como se ilustra en la figura 10, se expresa la proteína de fusión F3 * en un nivel muy alto (de lOa 20% de proteína total). Hubo un modelo de WB simplificado en comparación con F3; hubía desaparecido una banda muy decaída a +/- 32 kDa (detectado sólo por WB). Ejemplo 6: Construcción y expresión de F4(p51 ) y F4(p51 )* Se usó RT/p51 en la construcción de fusión F4 (en lugar de RT/p66). F4(p51 ) = p24-p51 -Nef-p17 F4(p51 )* = p24-p51 *-Nef-p17 - F4(p51 ) mutado: sitio de iniciación de metionina interno putativo (presente en la parte de R T) reemplazado con lisina, para simplificar adicionalmente el modelo del antígeno. Construcción de plásmidos recombinantes: F4(p51 ): Se amplificó la secuencia que codifica p51 mediante PCR a partir del plásmido de expresión pET29a1 p51 . Se incorporaron sitios de restricción dentro de los cebadores de PCR (Ndel y Stul en el extremo 5'. Avrl l en el extremo 3' de la secuencia de codificación). Se donó el producto de PCR en plásmido intermedio pGem- T y se secuenció. Se restringió el plásmido intermedio pGem-T/p51 mediante Ndel y Avrl l y se ligó el fragmento p51 en el plásmido de expresión pET28b/p24-RT/p66-Nef-p17 restringido por Ndel y Nhel (dando lugar a la escisión de la secuencia de RT/p66). La ligadura se llevó a cabo mediante mediante combinación de reacciones de digestión a concentraciones apropiadas, en presencia de ligasa de ADN de T4. Se usó el producto de ligadura para transformar las células DH5a de E.coli. Se confirmó la verificación de la inserción de p51 dentro del marco de lectura translacional correcto (en lugar de RT/p66 en la fusión f4) mediante secuenciación de ADN . La construcción de fusión resultante p24-RT/p51 -Nef-p17 se denominó F4(p51). F4(p51)*: Se consiguió la mutación del sitio de iniciación de la metionina interno putativo (presente en RT/p51) con "sistema de mutagénesis dirigido al sitio GeneTailor " (Invitrogen), generando la construcción F4(p51)*. Se usaron plásmidos de expresión F4(p51) y F4(p51)* para transformar las células B834(DE3). Características de proteínas recombinantes: Término Nlp24: 232a.a.l-lbisa2ra:4a.a.l-lp51151 *: 426a.a.l-!bisabra:3a.a.l-INef: 206a. a. I Ibisa2ra:2a.a. !p17: 132a.a.1 - Término e .Longitud, peso molecular, punto isoeléctrico (IP): 1005 AA, 114.5 kDa, IP: 8,47 Secuencia de nucleótidos (para F4(p51)*) Atggttatcgtgcagaacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaact Ttaaatgcatgggtaaaagtagtagaagagaaggctttcagcccagaagtaatacccatg Ttttcagcattatcagaaggagccaccccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtg Gggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaagagacca caatgaggaagctgcagaa Tgggatagagtacatccagtgcatgcagggcctattgcaccaggccagatgagagaacca Aggggaagtgacatagcaggaactactagtacccttcaggaacaaataggatggatgaca Aataatccacctatcccagtaggagaaatttataaaagatggataatcctgggattaaat Aaaatagtaagaatgtatagccctaccagcattctggacataagacaaggaccaaaagaa Ccttttagagactatgtagaccggttctataaaactctaagagccgagcaagcttcacag Gaggtaaaaaattggatgacagaaaccttgttggtccaaaatgcgaacccagattgtaag 600 Actattttaaaa cattqqqaccaqcqqctacactaqaaqaaatqatqacaqcatqtcaq 660 GgaqtaqqaggacccqqccataaqgcaagagttttglcATATGaggcctpGTCCGATCTCT 720 CCGATAGAAACAGTTTCGGTCAAGCTTAAACCAGGGATGGATGGTCCAAAGGTCAAGCAG 780 TGGCCGCTAACGGAAGAGAAGATTAAGGCGCTCGTAGAGATTTGTACTGAAATGGAGAAG 8 0 GAAGGCAAGATAAGCAAGATCGGGCCAGAGAACCCGTACAATACACCGGTATTTGCAAT 900 AAGAAGAAGGATTCAACAAAATGGCGAAAGCTTGTAGATTTTAGGGAACTAAACAAGCGA 960 AC C CAAGACT TT T GGGAAGT CCAACTAGGTATCC CACATCCAGC CGGT CTAAAGAAGAAG 1020 AAATCGGTCACAGTCCTGGATGTAGGAGACGCATATTTTAGTGTACCGCTTGATGAGGAC 1080 TTCCGAAAGTATACTGCGTTTACTATACCGAGCATAAACAATGAAACGCCAGGCATTCGC 1140 TATCAGTACAACGTGCTCCCGCAGGGC GGAAGGGGTCTCCGGCGATATTTCAGAGCTCT 1200 ATGACAAAAATACTTGAACCATTCCGAAAGCAGAATCCGGATATTGTAATTTACCAATAC 1260 ATGGACGATCTCTATGTGGGCTCGGATCTAGAAATTGGGCAGCATCGCACTAAGATTGAG 1320 GAACTGAGGCAACATCTGCTTCGATGGGGCCTCACTACTCCCGACAAGAAGCACCAGAAG 1380 GAGCCGCCGTTCCTAAAGATGGGCTACGAGCTTCATCCGGACAAGTGGACAGTACAGCCG 1440 ATAGT G CT GC CC GAAAAG GATT C TTGGAC C GTAAAT GATATT CAGAAACTAG C GGCAAG 1500 CTTAACTGGGCCTCTCAGATTTACCCAGGCATTAAGGTCCGACAGCTTTGCAAGCTACTG 1560 AGGGGAACTAAGGCTCTAACAGAGGTCATCCCATTAACGGAGGAAGCAGAGCTTGAGCTG 1620 GCAGAGAA CGCGAAATTCTTAAGGAGCCGGTGCACAGGGTATACTACGACCCCTCCAAG 1680 GACCTTATAGC CGAGAT C CAGAAGCAG GGGCAGGGCCAAT GGACG ACCAGATATAT CAÁ 1740 GAAC CGTT TAAGAAT CT GAAGACT GGGAAGTACG C GCG CAAACGAGGGGCT CATACTAAT 1800 GATGTAAAGCAACTTACGGAAGCAGTACAAAAGATTACTACTGAGTCTATTGTGATATGG 1860 GGCAAGACCCCAAAGTTCAAGCTGCCCATACAGAAGGAAACATGGGAAACATGGTGGACT 1920 GAATATTGGCAAGCTACCTGGATTCCAGAATGGGAATTTGTCAACACGCCGCCGCTGGTA 1980 AAACT qccctaGCT TGqq t qq ca a q t q q t ca a a aa q t a q t q t 11 gg a t g c c t a c t 2040 Gtaa ggaaagaatgagacgagctgagccagcagca atggggt ggagcagcatctcga 2100 Gacctggaaaaaca ggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgt 2160 Gcctggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacct 2220 Ttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaagggg 2280 Ggactggaagggc aattcactcccaacgaaga aagatatccttgatctgtggatctac 2340 Caca ca caá ggctacttccctgattggcaga acta caca cea gggccaggggtcagatat 2400 Ccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagag 2460 Gccaataaaggagagaacaccagcttgtt acaece tgtgagcctgcatggaatggatgac 2520 Cctgagagagaagtgttagagtggaggt tgacagccgcctagcatttcatcacgtggcc 2580 cqaqaqctqca t ccggag t a ct t caagaac t qc GGCC TGGGTGCGAGAGCGTCAGTA 2640 TTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAA 2700 AAATATAAATTAAAACATA AGTATGGGC AGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAAT 2760 CCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCC 2820 CT T CAGACAGGAT CAGAAGAAC TTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACC CTCTATT GT 2880 GT GCAT CAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAG CTTTAGACAAGATAGAGGAAGAG 2940 CAAAACAAAAGTAAGAAAAAAGCACAGCAAGCAGCAGCTGACACAGGACAC GCAATCAG 3000 GTCAGCCAAAATTACtaa 3018 5P24: secuencia en negrita P51 : secuencia en letras mayúsculas Nef: secuencia en letras minúsculas P17: secuencia subrayada Cajas: nucleótidos introducidos genética mediante construcción Secuencia-_e aminoácidos (para F4(p51 )*) MVIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAF?PEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTV GGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTBTLQEQIG MT NNPPIPVGEIYKRWIILG NKIVRMYSPTSI DIRQGP EPFRDYVDRFYKTLRAEQASQ EVKNWMTETLLVQNA PDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKAR_GPIS PIETVSVK KPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAI KKKDSTKWRK VDFRE NKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDED FRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQY MDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFL_GYELHPDK TVQP IVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELEL AENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQ QGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYAR1RGAHTN DV QLTEAVQ ITTES I VI WGK P FKL P I Q ET ET WWTE Y QATWI PEWEFVNT PPLVK _GGK S SSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAAC A LEAQEEEEVG PVTPQVPLRPMTYKAAVD SHF KEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIY HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVEEANKGENTSLLHPVSLHGMDD PEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC_GARASVLSGGELDRWEKIRLRPGGKK KYK KHIVWASRE ERFAVNPG ETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVAT YC VHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY P24: P51: Nef: P17: aminoácidos aminoácidos aminoácidos aminoácidos en lugar de triptófano (W). Mutación introducida para eliminar la actividad del enzima.

Expresión de F4(p51) en células B834(DE3): Se evaluaron el nivel de expresión de F4(p51) y la solubilidad de la proteína recombinante en paralelo con la cepa que expresa F4. Condiciones de inducción: crecimiento de células a 37° C/inducido a 22° C (+IPTG 1 mM), durante 19 horas. Tampón de rUTItura: Tris/HC150 mMpH:7,5, EDTA 1 mM, DTT 1 mM Análisis Transferencia western: - anti RTpoliclonal de conejo (PO3L16 de conejo) (dilución: 1/10000) - anti Nef-Tat policlonal de conejo (388 de conejo) (dilución 1/10 000) -anticuerpo anti-conejo conjugado confosfatasa alcalina (dilución: 1/7500) reactivos Se analizaron fracciones celulares correspondientes a extractos brutos (T), agregado insoluble (P) y sobrenadante (S) en SDS-PAGE en condicones de reducción del 10%. Como se ilustra en la figura 11 , se expresa F4(p5l) a un alto nivel (10% de proteína total), similar a F4. Casi toda la F4(p5l) se recupera en la fracción soluble (S) de extractos celulares. Tras detección con un re activo anti-Nef-tat reagent, el modelo de WB para F4(p5l) mostró ser simplificado (reducción de productos truncados por debajo de +/- 60kDa).

Expresión de F4(p51 )* en células B834(DE3): Se indujo la cepa recombinante F4(p5l)* a 22° C durante 18 horas, en paralelo con la construcción no mutada F 4(p5l), F 4 Y F 4 *. Se prepararon extractos celulares brutos y se analizaron mediante gel tintado con Coomassie y Transferencia westernting. Como se ilustra en la figura 1 1 se observó alta expresión de fusiones F4(p5l) Y F4(P5I)*, representando al menos el 10% de la proteína total. Patrón de WB: reducción de productos truncados por debajo de +/-60kDa. Además, para la construcción F4(p5l)*, ha desaparecido la banda de 47kDa (debido al sitio de inicio interno).

Ejemplo 7: Purificación de F4 y F4(p51 )* La proteína de fusión F4, que comprende los 4 antígenos de VI H-1 p24-RT-Nef-p17 (cepa RB-B1884), se purificó a partir de homogeneizado de células de E. coli de acuerdo con el esquema de purificación , que comprende las siguientes etapas principales: . Precipitación de F4 con sulfato de amonio . Cromatografía de intercambio de cationes en S03 Fractogel (modo positivo) . Cromatografía en octil-Sepharosa (modo positivo) . Cromatografía de intercambio aniónico en Q-sepharosa FF (modo positivo) . Cromatografía de filtración en gel Superdex 200 en presencia de SDS . Diálisis y concentración De forma adicional , se pu rificó la proteína de fusión F4(P51 )* (RT reemplazada por p51 optimizado con codón que porta una mutación adicional Met592Lys, cepa B 1 933) usando el mismo procedimiento de purificación .

Cuantificación de la proteína . Se determinó la proteína total usando el ensayo de Lowry. Antes de la medida de la concentración de proteína se dializan todas las muestras d urante la noche frente a PBS, se usó SDS al 0, 1 % para eliminar las sustancias que interfieren (urea, DTT) . Se usó BSA (Pierce) como patrón . SDS-P AGE y transferencia western . Se prepararon muestras en tampón de muestra para SDS-P AGE en condiciones de no reductoras (+/- p-mercaptoetanol) y se calentó durante 5 min utos a 95° C. . Se separaron las proteínas en geles SDS-poliacrilamida de 4 a 20% a 200 V du rante 75 minutos usando geles de Tris-glicina de Novex pre-fundidos o geles Criterion (Bio-Rad) , de un 1 mm de grosor. . Se visualizaron las proteínas con azu l de Coomassie R250. Para los transferencia westems (WB) , se transfirieron las proteínas desde el gel SDS a membranes de nitroceulosa (Bio-Rad) a 4° C d urante 1 ,5 horas a 1 00 V o d urante la noche a 30 V.

Se detectó F4 usando anticuerpo s monoclonales contra los distintos antígenos, anti p24, anti-Nef-Tat, anti-RT (a veces se usó una mezcla de anti-p24 y anti Nef-Tat para detectar un número máximo de bandas de proteína). Se unieron anticuerpos anti-ratón o anti-conejo conjungados con fosfatasa alcalina a los anticuerpos primaries y se visualizaron bandas de proteínas usando BCI P y NBT como los sustratos. Transferencia western de anti-E. coli o Se separaron 5 llg de proteína (Lowry) mediante SDS-P AGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa como anteriormente. Se detectaron proteínas de célula huésped residuales usando anticuerpo s de anti -E. coli policlonales (a-EC-20031351 ). Se visualizaron bandas de proteína con la reacción de fosfatasa alcalina como anteriormente.

El procedimiento de purificación El procedimiento 1 comprende una precipitación con sulfato de amonio y cuatro etapas cromatográficas: Se homogenizaron células de E.coli (cepa B 1884) en tampón Tris 50 mM a pH 8,0 en presencia de DTT 10 mM , PMSF 1 mM, EDT A 1 mM a una densida óptica a 50 (-360 ml). Se aplicaron 2 pasadas Rannie a 1000 bar. Se eliminaron mediante centrifugación a 14400 x g durante 20 minutos células detríticas y el material insoluble. Se añadió sulfato de amonio (AS) desde una solución stock 3,8M al sobrenadante clarificado hasta una concentración final de 1 ,2M . Se precipitaron proteínas durante -2 horas a temperatura ambiente (RT) y luego se agregan mediante centrifugación (10 minutos a 14400 x g). Se re suspendió el agregado en urea 8M , DTT 1 0 m M en tampón fosfato 1 0 mM a pH 7,0. Se capturó el antígeno en una columna de S03 Fractogel catiónica en presencia de urea 8M y DTT 1 0 mM a pH 7,0 en tampón fosfato. Se lavó la columna para eluir la proteína no unida seguido de una etapa de pre-elución con NaCI 1 70 mM para eliminar las proteínas de célula huésped unidas (HCP) . Se eluyó luego F4 con NaCI 460 mM , urea 8M , DTT 1 0 mM en tampón fosfato a pH 7,0. El elu ído en S03 se diluyó dos veces y se cargó en una columna de octil-Sepharosa (cromatografía de interacción hidrófoba) en presencia de u rea 4 M , DTT 1 mM , NaCI 230 mM en tampón fosfato a pH 7,0. Tras una etapa de lavado (tampón de equilibrado) se eluyó F4 unido con urea 8 M , DTT 1 m M en tampón Tris 25 mM a pH 8,0. Se diluyó el eluido en octilo y se ajustó a pH 9,0 Y se unió luego F4 a una columna de Q-sepharosa aniónica en presencia de u rea 8M a pH 9,0 (Tris 25 mM). Se lavó por arrastre la proteína no unida (urea 8M , Tris 25 mM a pH 9,0) Y una etapa de pre-elución (NaCI 90 mM en urea 8M , Tris 25 mM , pH 9,0) eliminó las HCP y los productos de degradación de F4. Se desorbió F4 de la columna con NaCI 200 mM , urea 8M en tampón Tris a pH 9,0. Se salpicó una al ícuota de elu ído en Q con SDS al 1 % Y se dializó frente a tampón PBS que contiene SDS al 0, 1 % Y DTT 1 mM para eliminar la urea antes de inyectar la muestra en la columna de filtración en gel (Superdex 200 de calidad para preparación, dos columnas de 16 x 60 cm conectadas en serie). Se reunieron las fracciones relevantes tras análisis SDS-P AGE en proceso. Se dializaron las muestras a temperatura ambiente en membranas de diálisis (corte a 12-14 kDa) durante la noche frente a 2 xii de arginina 0,5M , Tris 10 mM , glutationa 5 mM , pH 8,5. Las etapas de purificación secuenciales se muestran en el flujograma siguiente.

Resultados de la purificación de F4 Seguimiento purificación de SDS-P AGE/Transferencia western del procedimiento de La figura 12 muestra el gel SDS y el transferencia westem de anti-p24/anti-Nef-Tat de las fracciones que contienen F4 recogidas durante la purificación de F4. El horno gene izado de E. coli se muestra en la figura 12, carril 2, estimando que F4 representa aproximadamente el 10% de las proteínas totales (barridos de densidad de geles SDS tintados con azul de Coomassie). Tras centrifugación se recuperó la fracción soluble de F4 en el sobrenadante clarificado (carril 3). La etapa de precipitación con sulfato de amonio eliminó muchas impurezas (carril 4) y redujo la carga proteica para la etapa cromatográfica subsiguiente. De forma adicional, se usó urea 8M para resuspender los complejos disociados precipitados de F4 con HCP y permitió tanto la captura completa de F4 como la elución cuantitativa desde la resina S03. El eluído en S03 mostrado en la carril 5 estaba enriquecido considerablemente en F4 pero el modelo heterogéneo permaneció principalmente invariable. La columna de octil-Sepharosa hidrófoba eliminó principalmente las HCP de bajo peso molecular (LMW) y los productos de degradación de F4 (carril 6), con lo que se simplifica el modelo de F4. La cromatografía en Q-sepharosa simplificó adicionalmente el modelo de F4 y eliminó muchas impurezas (carril 7). De hecho, no se detectaron proteínas de célula huésped en el eluído en Q mediante análisis transferencia westem de anti-E. coli (figura 2, carril 7). La columna de Superdex 200 separó los productos de degradación de F4 de bajo peso molecular (LMW) del F4 de longitud completa mejorando la homogeneidad de F4 en el eluído de Superdex 200 (carril 8). Se realizó un transferencia westem de anti-E. coli de las mismas fracciones recogidas durante la purificación de F4. La ausencia de bandas visibles en el transferencia westem de anti-E. coli indicó contaminación por HCP por debajo del 1 % en el eluído en Q y en el eluído en Superdex.

Recuperación de F4 y proteína La recuperación de F4 a cada etapa del procedimiento de purificación se estimó a partir de análisis por SDS-P AGE y transferencia westem. Para estimar la recuperación de F4 en geles SDS, los volúmenes de muestra cargados en los geles SDS correspondían a los volúmenes de las distintas fracciones recogidas durante la purificación. La tabla 1 muestra la .recuperación de proteína en las fracciones que contienen F4. Tabla 1 : recuperación de proteína en las fracciones positivas de F4 recogidas durante el procedimiento de purificación (360 ml de homogeneizado). Se determinó la concentración de proteína con el ensayo Lowry.

La tabla muestra la cantidad de proteína en el homogeneizado y el material soluble, incluyendo F4, recuperado en el sobrenadante tras la etapa de clarificación. La etapa de precipitación con sulfato de amonio (AS) eliminó una gran cantidad de HCP y sólo se observó una ligera pérdida de F4 en el gel SDS. La cromatografia en S03 eliminó adicionalmente muchas impurezas y el gel SDS indicó una gran recuperación de F4. Por el contrario, las recuperaciones de proteína de _50% medida con las columnas de octil-Sepharosa y Q-sepharosa se acompañaron también de pérdidas de F4. Esto se podría explicar mediante la eliminación de las bandas de degración F4 asociadas a pérdida de producto. La recuperación de proteína tras la cromatografía de filtración en gel fue de aproximadamente el 50%. El gel SDS muestra que se eliminaron muchas bandas de proteína LMW (bandas de degradación de F4), reduciendo concomitantemente la recuperación de F4.

Rendimiento en F4 La tabla 1 anterior muestra que se podría obtener aproximadamente 36 mg de F4 purificada a partir de 360 ml de homogeneizado a una densidad óptica (OD) de 50. Por tanto, 1 1 de homogeneizado a densidad óptica (OD) de 50 debería dar aproximadamente 100 mg de F4 purificada. Debido a que se alcanzaron densidades ópticas de 70 - 90 durante el procedimiento de fermentación, el rendimiento por litro de fermento estaría, de acuerdo con lo anterior, en el intervalo de 140 a 180 mg de F4.

Resultados de la purificación de F4(p51 )* Se purificó la construcción de fusión F4(p51 )* usando el procedimiento de purificación 1 descrito anteriormente sin modificaciones. Seguimiento pu rificación SDS-P AGE/Transferencia western del procedimiento La figu ra 1 3 muesrtra los análisis en gel SDS y transferencia western con anti-p24/antiNef-Tat de las fracciones que contienen F4(p51 )* recogidas durante la pu rificación de F4. El gel SDS y el transferencia western demuestran que la proteína de fusión F4(p51 )* se comporta globalmente de forma similar a F4 en la etapa de precipitación con sulfato de amonio así como también durante las etapas cromatográficas . F4(p51 )* purificada presentaba un modelo de heterogeneidad similar a F4 purificada . Una transferencia westem de anti E. coli indicó que la contaminación con HCP estaba por debajo del 1 % tanto en el elu ído en Q como en el elu ído en Superdex.

Rendimiento Se perdieron aproximadamente el 25% de F4(P5I)* en la fracción insoluble del homogeneizado, De forma adicional, debido a que el procedimiento de purificación no estaba adaptado a esta_prote ína , se observaron pérdidas en las etapas cromatog ráficas. Por lo tanto se red ujo la recuperación global de F4(p51 )* en aproximadamente 25 mg por litro de homogeneizado (densidad óptica, OD, 50). Los resultados mostraron que el modelo de proteína inicialmente bastante heterogéneo se podría simplicar; la proteína F4 de longitud completa purificada representó aproximadamente 90% en gel SDS, Las impurezas estaban por debajo del 1 % en transferencia westem de anti-E. coli. El rendimiento era aproximadamente 100 mg de proteína por litro de horno gene izado (densidad óptica, OD), 50).

La construcción de fusión F4(p51 )* se purificó también con éxito usando el mismo procedimiento de purificación. F 4(p51 )* purificada presentaba un modelo similar en gel SDS en comparación con F4.

Secuencias de nucleótidos adicionales que codifican las secuencias de aminoácidos dadas en los ejemplos son como siguen: Secuencia de nucleótido de P51 'RT at aqtactlqqtccqatctctccqataqaaacagtttcgqtcaaqcttaaaccagggatg gatg tccaaaggtcaagcagtggccgctaacggaagagaagattaaggcgctcgtagag atttgtactgaaatggagaaggaaggcaagataagcaagatcgggccagagaacccgtac aatacaccggtatttgcaataaagaagaaggattcaacaaaatggcgaaagcttgtagat tttagggaactaaacaagcgaacccaagacttttgggaagtccaactaggtatcccacat ccagccggtctaaagaagaagaaatcggtcacagtcctggatgtaggagacgcatatttt agtgtaccgcttgatgaggacttccgaaagtatact cgtttactataccgagcataaac aatgaaacgccaggcattcgctatcagtacaac tgctcccgcagggctggaaggggtct ccggcgatatttcagagctctatgacaaaaatacttgaaccattccgaaagcagaatccg gatattgtaat accaatacatggacgatctctatgtgggctcggatctagaaattggg cagcatcgcactaagattgaggaactgaggcaacatctgcttcgatggggcctcactact cccgacaagaagcaccagaaggagccgccgttcctaaagatgggctacgagcttcatccg gacaagtggacagtacagccgatagtgctgcccgaaaaggattcttggaccgtaaatgat attcagaaactagtcggcaagcttaactgggcctctcagatttacccaggcattaaggtc cgacagctttgcaagct act gagggga act aaggct ctaa caga gg tea tcccattaacg gaggaagcagagcttgagctggcagagaatcgcgaaattcttaaggagccggtgcacggg gtatactacgacccctccaaggaccttatagccgagatccagaagcaggggcagggccaa tggacgtaccagatatatcaagaaccgtttaagaatctgaagactgggaagtacgcgcgc atgcgaggggctcatactaatgatgtaaagcaacttacggaagcagtacaaaagattact actgagtctattgtgatatggggcaagaccccaaagttcaagctgcccatacagaaggaa acatqqqaaacatqqtqqactqaatattqqcaaqctacctqqattccaqaatqqqaattt gt caacacgccgccgct gg t aaaact aggcctqctaq taa Cajas: aminoácidos introducidos mediante construcción genética Nef-conector-p17 (NLP) MGGKWSK?SVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRD EKHGAITSSNTAATNAACAWLEA QEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDI D WIYHTQGY FPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVEEANKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREV LE RFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC_SGGGPMGARASVLSGGELDR EKIRLRPGGK KKYKLKHIV ASRELERFAVNPG LETSEGCRQI GQLQPSLQTGSEELRS YNTVATLY CVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY Conectar hexapeptídico Caja: aminoácidos introducidos mediante construcción genética Secuencia de nucleótidos de Nef-p17 Atgggtggcaagtggtcaaaaa tagtgtggttggatggcctactg aagggaaagaatg Agacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctggaaaaacat Ggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcctggctagaagca Caagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgact Tacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggcta Attcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctac Ttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttgga Tggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagag Aacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagagagaagtg Ttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccg Gagtacttcaagaactgcaggcctatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaa Ttagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaa ".Catatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaa Acatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatca Gaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggata Gaga aaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaag Aaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattac Taa Secuencia de nucleótidos de Nef-conector-p17: Atgggtggcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaaagaatg Agacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctggaaaaacat Ggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcctggctagaagca Caagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgact Tacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggcta Attcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctac Ttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttgga Tggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagag Aacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagagagaagtg Ttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccg Gagtacttcaagaactgcaggcctggatccggtggcggccctatgggtgcgagagcgtca Gtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagg ggaaag Aaa aaa tata 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Gaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgacttacaa gcagct Gtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaa Cgaagacaagatatccttgatotgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattgg Cagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttggatggtgctacaag Ctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagagaacaccagcttg Ttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagagagaagtgttagagtggagg Tttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccggagtacttcaag Aactgctaa P17-conector-Nef (PLN) MGARASV SGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQI LGQLQPS QTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAA DTGHSNQVSQ ylLDRPpSGGGPMGGKWSKSSVVGWPTVRERMRRAEPAAD VGAASRDLE KHGAITSSNTAATNAACAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLE GLIHSQRRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVEEANK GENTSLLHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC Conectar hexapeptídico Caja: aminoácidos introducidos mediante construcción genética Secuencia de nucleótido de P17-conector-Nef: Atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcgg Ttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggag Ctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaata Ctgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataat Acagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagct Ttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagcaagcagcagct Gacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattacctcgacaggcctggatccggtggc Ggtcctatgggtggcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaa Agaatgagacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctggaa Aaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcctggcta Gaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagacca At acttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaagggggg act ggaa Gggctaattcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaa Ggctacttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggt caga tat cea ctgacc Tttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaa Ggagagaacaccagcttgt acaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagaga 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Claims (9)

REIVI NDICACION ES 1 . Un polipéptido que comprende Nef o un fragmento inmunogénico de la misma , y p17 Gag y/o p24 Gag o fragmentos inmunogénicos de las mismas, en el q ue cuando ambas p 1 7 Y p24 Gag están presentes hay al menos un antígeno de VI H o fragmento inmunogénico entre ellas. 2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 q ue comprende además RT o un fragmento inmunogénico de las mismas. 3. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó la reivindicación 2 , en el que RT o fragmento inmunogénico es un fragmento en el que RT está truncada en el término e tal que le falta el dominio ARNasa H de terminal carboxi. 4. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3 , en el que el fragmento de RT es el fragmento p51 . 5. El polipéptido de acuerdo con algu na de las reivindicaciones 2 a 4, en el que RT comprende una mutación en la posición 592 para reemplazar la metionina por otro residuo, por ejemplo, lisina. 6. El polipéptido de acuerdo con alguna de las reivind icaciones 1 a 4, en el q ue la Nef es Nef de longitud completa. 7. U n polipéptido seleccionado entre uno de los siguientes:

1 . p24 - R T - N ef - p 1 7 2. p24 - RT* - Nef - p1 7 3. p24 - p51 RT - Nef - p1 7 4. p24 - p51 RT* - Nef - p 1 7 5. p17 - p51RT - Nef 6. p17 - p51RT* - Nef 7. Nef - p17 8. Nef - p17 con conector 9. pl7-Nef 10. pl7 - Nef con conector * representa mutación de metioninaS92 en R T a lisina 11. Una composición que comprende (i) un polipéptido que comprende Nef o un fragmento inmunogénico de la misma y p 17 Gag o un fragmento inmunogénico de la misma, y (ii) p24 Gag o un fragmento inmunogénico; o (i) un polipéptido que comprende Nef o un fragmento inmunogénico de la misma y p24 Gag o un fragmento do inmunogénico de la misma, y (ii) p 17 Gag o un fragmento inmunogénico de la misma. 12. La composición de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende además RT o un fragmento inmunogénico de la misma. 13. Una composición que comprende (i) un polipéptido que comprende Nef o un fragmento inmunogénico de la misma y p17 Gag y/o p24 Gag o fragmentos inmunogénicos de las mismas, en la que cuando ambas p 17 Y p24 Gag están presentes hayal menos un antígeno de HIV o fragmento inmunogénico entre ellas y /ii) un polipéptido p51 RT. 14. Una composición de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 11 a 13, en la que (i) se selecciona de 1. p24 -RT - Nef-pl7

2. p24-RT* -Nef-pl7

3. p24 - p51 RT - Nef - pl7

4. p24 - p51 RT* - Nef - pl7 1

5. Una composición de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 12 a 14, en la que la RT o fragmento inmunogénico de la misma es un fragmento en el que RT está truncada en el término e de modo que le falta el dominio ARNasa H de terminal carboxi. 1

6. La composición de acuerdo con la reivindicación 15, en la que el fragmento de RT es el fragmento p51 . 1

7. La composición de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 1 1 a 16, en la que la RT comprende una mutación en la posición 592 tal que la metionina se reemplaza por otro residuo, por ejemplo, lisina. 1

8. La composición de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 1 1 a 17, en la que la Nef es Nef de longitud completa. 1

9. Un polipéptido que es una fusión de antígenos de VI H que comprende al menos cuatro antígenos de VIH o fragmentos inmunogénicos, en el que los cuatro antígenos o fragmentos son o se derivan de Nef, Pol y Gag. 20. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 19, en el que la Gag está presente como dos componentes por separado q ue se separan mediante al menos otro antígeno en la fusión . 21 . El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 9 ó 20, en el que Nef es Nef de longitud completa. 22. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 19 ó 21 , en el que Pol es p66 o p51 RT. 23. El polipéptido de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 19 a 22, en el que Gag es p17 y p24 Gag. 24. Un polinucleótido o polinucleótidos que codifica un polipéptido o composición de polipéptidos o proteína de fusión de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 1 a 23. 25. Un polipéptido p51 RT que lo codifica, preferiblemente optimizado con codón para expresión en E. co/i. 26. Un polipéptide codificado por el polinucleótido de acuerdo con la reivindicació 10 27. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido o polinucleótido o composición de polipéptidos o polinucleótidos de acuerdo con cualquier reivindicación previa, junto con un vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable. 28. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 27, en la que el adyuvante es un adyuvante que induce Thl tal como QS21 o 3D-MPL o una combinación de QS2I y 3D-MPL.