CN1876684A

CN1876684A - 一系列可阻断il－6的创新多肽及其医疗应用

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Publication number: CN1876684A
Application number: CN 200610090787
Authority: CN
Inventors: 余波; 郑佳
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2006-06-30
Filing date: 2006-06-30
Publication date: 2006-12-13
Anticipated expiration: 2026-06-30
Also published as: CN100471873C

Abstract

本发明描述了一系列创新的可抑制IL－6的优化多肽蛋白，它们具有高度的生物活性、优异的稳定性、和良好的体内半衰期，可以在体内外高效结合IL－6，从而阻断IL－6的生物作用，可用于治疗多种癌症和自身免疫性疾病，也可用于针对IL－6的诊断试剂；本发明包括这些能抑制IL－6的优化多肽蛋白、及其编码重组DNA序列和表达载体、该重组蛋白的药物用途、含有该重组蛋白的药物及其制剂。

Description

一系列可阻断IL-6的创新多肽及其医疗应用

技术领域

本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体地说，涉及编码可结合IL-6并阻断其信号的创新多肽的DNA序列、其所编码的多肽蛋白、该多肽在医疗药物和诊断试剂上的应用。

背景技术

白细胞介素-6(Interleukin-6，简称为IL-6)是一种多功能的调节免疫和炎症反应的细胞因子，而且在很多人体疾病中起重要作用，包括各种感染、炎症、自身免疫性疾病、和多种癌症(Ishihara et al，Cytokine Growth Review，2002，13：357-368)。人体内IL-6的主要来源是单核细胞、成纤维细胞、内皮细胞，同时T细胞、B细胞、角质细胞、肾系膜细胞、和多种肿瘤细胞也都可以生成IL-6。IL-6的生理作用非常复杂，对B细胞、T细胞、骨髓干细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、蚀骨细胞等多种细胞的生长、分化、和成熟起重要的调节作用，同时对炎症反应在不同的条件下可以有促进、或抑制的作用。IL-6的促炎反应和别的促炎因了(如TNFα和IL-1)类似，可以引起发烧和急性期蛋白质(Acute phase protein)的生成，包括血清淀粉样蛋白A(Serum amyloid A)、C反应蛋白(C-reactiveprotein)、α1抗胰蛋白酶(α1 antitrypsin)、纤维酶原(Fibronogen)、触珠蛋白(Haptoglobulin)等，而IL-6抑制炎症反应的作用则是通过抑制促炎因了TNFα和IL-1的生成来达到的。

多项研究表明，IL-6的浓度在多种癌症、自身免疫性疾病、和其他疾病患者体内出现异常升高，而且IL-6的作用和这些疾病的症状程度有直接关系，因此阻断IL-6的作用是尝试治疗这些疾病的当然选择(Trikha et al，Clinical CancerResearch，2003，9：4653-4665)。IL-6的生物作用是通过和细胞膜表面的受体相结合，引发受体活化，从而把IL-6的信号由细胞外传递到细胞内。IL-6的受体是由二种蛋白IL-6R和GP130组成的二聚体，阻断IL-6信号传递的最有效方法是抑制IL-6与其受体的结合。目前已经有多种阻断IL-6或IL-6受体的抑制剂正在欧美进行癌症和多种自身免疫性疾病的临床试验，包括类风湿性关节炎(Rheumatoidarthritis)、系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus)、克隆病(Crohn’sDisease)、幼年型特发性关节炎(Juvenile idiopathic arthritis)等，而且日本在2005年已经批准了一个针对IL-6受体的单克隆抗体新药Actemra以用于治疗Castleman病(一种罕见的淋巴增殖性疾病)，因此开发阻断IL-6的抑制剂在医疗应用上拥有重要意义。

研究表明，一个氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述的重组多肽M123可以在体外有效地结合IL-6(Silverman et al，Nature Biotechnology，2005，23(12)：1556-1561)，但该多肽的生物活性和在人体内的稳定性均不足以满足医疗应用的需要，因此不能直接用于临床。

本发明对此多肽进行了改良，设计并建造了一系列的优化多肽，从而大大增加了其在体内外的稳定性和生物活性，并且具有更长的血清半衰期，从而能够在人体内更有效地中和IL-6，达到更好的抑制炎症反应的治疗效果。

本发明提供了三种不同的策略对M123进行了优化改良，分别得到了更加适合医疗应用的优化多肽。

第一，M123是个相对较小的多肽，只有共122个氨基酸，分子量为13.3kD，其在人体内血液中的半衰期预计很短。一种已知的延长M123体内半衰期的方法是将其连接一个多肽IG形成融合蛋白C326，IG的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述(Silverman et al，Nature Biotechnology，2005，23(12)：1556-1561)，由于IG具有结合人体免疫球蛋白的功能，因此可以大大提高C326在血液中的半衰期。因为融合蛋白C326中的M123和IG是二个完全不同的功能区域，各自必须具备稳定的结构才能保证该融合蛋白具有最佳的结构稳定性和生物活性，而C326中连接M123和IG的肽链SAPASEPPGSL没有经过优化选择，不能够保证M123和IG形成最佳的稳定结构，从而使得C326不具备最佳的稳定结构。为了提供一个包含IG和M123的最佳融合蛋白，本发明设计并建造了一个弹性结构的优化肽连接段G9连接于IG和M123之间，G9的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO.3所述，由于G9高度的结构弹性和可塑性，该融合蛋白具有优异的结构稳定性和生物活性，显著增加了其对IL-6的亲和力，大大提高了其医疗应用性。

第二，对蛋白质和多肽进行聚乙二醇修饰(PEGylation)是一种延长药物血清半衰期、及降低其免疫反应的有效方法(Harris et al，Nature Reviews DrugDiscovery，2003，2(3)：214-221)，其中常用的化学修饰方法是将聚乙二醇和多肽中唯一的一个自由的胱氨酸(Cystine)相结合，从而可以得到一个只在特定位置联接一个聚乙二醇分子的单一多肽分子。M123本身不包含自由的胱氨酸，因此本发明将人免疫球蛋白IgG1中的铰链(hinge region)N-端包含第一个胱氨酸的短肽链Hn，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所述，连接到M123的C-端，得到了一个包含M123和一个自由胱氨酸的多肽，从而可以在聚乙二醇修饰后进行医疗应用。

第三，利用人免疫球蛋白Fc区域形成融合蛋白是一种已经被证明行之有效的医疗应用多肽的策略，不但可以通过Fc区域二聚化提高其生物活性，而且因为免疫球蛋白血液中通常高达3星期的半衰期，大大延长该融合蛋白的血清半衰期(Chamow SM and Ashkenazi A，Antibody Fusion Proteins，1999，Wiley-Liss)。本发明将M123和人免疫球蛋白Fc形成了一个融合蛋白，并且在M123和Fc之间插入了一个弹性结构的优化肽连接段G9，该融合蛋白在哺乳动物细胞系统表达后二聚化，大大提高了对IL-6的亲和力，可达到更佳的治疗效果。

由此，本发明描述了一系列创新的可抑制IL-6的优化多肽蛋白，它们可以在体内外高效结合IL-6，从而阻断IL-6的生物作用，可用于治疗多种癌症和自身免疫性疾病，也可用于针对IL-6的诊断试剂。

发明内容

本发明目的之一是提供一系列全新的可结合IL-6的优化多肽蛋白，其在体内外都具有优良的稳定性和生物活性，并能阻断IL-6信号传递，从而抑制炎症的发展。

本发明目的之二是提供编码所述多肽的核苷酸序列。

本发明目的之三是提供含有编码所述多肽的核苷酸序列，其表达载体和由该载体转化的重组体，以及表达细胞。

本发明目的之四是提供该多肽作为抗炎药物在治疗类风湿性关节炎等自身免疫性疾病中的应用，还有包含上述多肽及可药用载体的药物组合物及其在治疗相关疾病中的应用。

本发明目的之五是提供该多肽作为针对IL-6的诊断试剂。

本发明描述的优化的融合蛋白质是通过常规的基因重组技术所建造，具体实验步骤如《分子克隆》第三版(Joseph Sambrook，科学出版社)及类似的实验手册所记载。

本发明的融合蛋白质，由可结合人免疫球蛋白的多肽IG和可结合IL-6的多肽M123构成，IG和M123之间由一个优化肽连接段相连，该肽连接段选自以下组：

a.Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly，表示为G9；

b.任何一个长度为4到30的氨基酸序列，其具有弹性结构并能增加融合蛋白的结构稳定性和生物活性。

本发明的融合蛋白质，还可以是，由多肽M123和一个多肽短链构成，该肽链选自以下组：

a.人免疫球蛋白IgG1中的铰链N-端肽链Hn，氨基酸序列为Asp Lys ThrHis Thr Cys；

b.任何一个包含自由胱氨酸、长度为4到30的氨基酸序列。

本发明的融合蛋白质，还可以是由多肽M123和人免疫球蛋白IgG1的Fc区域构成。

其中

1.结合IL-6的多肽M123，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。

2.结合人体免疫球蛋白的的多肽IG，氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO.2所述。

3.连接M123和IG的弹性肽连接段G9，氨基酸序列如序列表中SEQID NO.3所述。

4.人免疫球蛋白IgG1中的铰链(hinge region)N-端包含第一个胱氨酸的短肽链Hn，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所述。

5.人免疫球蛋白IgG1中的Fc区域，表示为Fc，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所述。

如图1所示，本发明提供的融合蛋白质有三种形式，

1.IL6BP-1：IG-G9-M123

2.IL6BP-2：M123-Hn

3.IL6BP-3：M123-G9-Fc

其中IL6BP-1和IL6BP-2可在细菌中表达，IL6BP-3可在哺乳动物细胞中表达：其编码DNA序列对应于序列表中的SEQ ID NO.6、7、8。

上述融合蛋白质及其编码DNA可通过常规的基因重组技术获得，然后分别克隆到载体中，所用载体可以是分子生物学所常用的质粒、病毒或DNA片段。载体序列中包括用于驱动基因表达的启动子、蛋白质翻译起始和终止信号。载体中有抗菌素抗性基因，以利于载体在宿主细胞，如细菌中繁殖。另外，载体中还可以包括真核细胞选择性基因，用于稳定转染宿主细胞株的选择。

由于M123和IG可以允许一定的氨基酸删除和变异，仍然保持其分别对IL-6和人免疫球蛋白的亲和力，所以本发明所涉及的优化多肽的氨基酸序列也可以有一定的变化，它们都属于本发明的范围。

上述优化多肽中的肽连接段G9的目的在于提供良好的弹性和可塑性，因此其氨基酸序列和长度都可以有一定的变化，也可以由一个完全随机的肽链文库中筛选而得，它们都属于本发明的范围。

上述优化多肽中的Fc来自人免疫球蛋白IgG1，也可以是亚型IgG2、IgG3、IgG4、或者人免疫球蛋白IgM和IgA，该免疫球蛋白Fc片段可以为Fc全长或部分Fc序列，如选自CH2片断、CH3片断或绞合区域片段，它们都属于本发明的范围。

在完成含编码上述优化多肽的DNA序列的质粒构建以后，即可用该重组载体转染或转化宿主细胞，表达相应的优化多肽。能够用于表达这些优化多肽的表达系统有多种，可以是原核细胞也可以是真核细胞，它们包括(但不限于)细菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞等。含有编码上述优化多肽的重组质粒可经转染进入宿主细胞，转染细胞的方法有多种，其中包括但不限于：电钻孔法(electroporation)、脂质体介导法、钙介导法等。

由于本发明中的优化多肽IL6BP-3的氨基酸序列中包括可糖基化的氨基酸，因此，哺乳动物细胞是其最佳的表达系统。可用于蛋白质大规模表达的哺乳动物细胞有多种，例如293细胞、CHO细胞、SP20细胞、NS0细胞、COS细胞、BHK细胞或PerC6细胞等，许多其他细胞也可用于这些蛋白质的表达和生产，因此都包括在本发明所能使用的细胞之列。一种较佳的表达方法是在已稳定转染的宿主细胞中对重组载体进行基因扩增，以提高相应重组融合蛋白的表达量，例如用含有二氢叶酸还原酶(DHFR)的重组载体稳定转染缺乏DHFR的宿主细胞后，可在细胞培养液中增加氨甲喋呤(MTX)的浓度以扩增重组载体在宿主细胞中的拷贝数量；又例如对表达谷氨酰胺合成酶(GS)的稳定转染宿主细胞，利用增加培养液中甲硫氨酸亚砜(MSX)的浓度可扩增重组载体的拷贝数量。

本发明还提供了含有本发明优化多肽和药用载体的药物组合物。该药物组合物可以按照制剂学常规技术制成各种形式的药物制剂，优选的是注射剂，最优选的是冷冻干燥注射剂。

本发明的药物组合物，其中还包括任何一种或几种其他的具有协同作用的抑制炎症反应的药物，所述组合物可以和其他治疗方法一起治疗自身免疫性\炎症性疾病。

本发明还包括，本发明的融合蛋白质在制备治疗癌症或自身免疫性疾病的药物中的应用。其中所述治疗癌症或自身免疫性疾病的药物是抑制炎症反应的药物。

本发明还包括，本发明的融合蛋白质在制备诊断癌症或自身免疫性疾病的试剂中的应用。所述融合蛋白质可以和其他诊断癌症或自身免疫性疾病的方法一起使用。

表1列举了ELISA实验中IL-6结合优化多肽的EC50。

	IL6BP1	IL6BP2	IL6BP3	C326
	IL6BP1	IL6BP2	IL6BP3	C326	EC50(nM)	6.4	6.9	3.9	13.3
标准偏差(nM)	0.7	0.7	0.4	2.0	EC50(nM)	6.4	6.9	3.9	13.3

表2列举了ELISA实验中优化多肽与IL-6竞争IL-6受体的EC50。

IL6BP1

IL6BP2

IL6BP3

C326

EC50(pM)	51.2	44.0	22.2	106.8
EC50(pM)	51.2	44.0	22.2	106.8	标准偏差(pM)	4.0	1.6	0.8	5.8

序列表说明

1.SEQ ID NO.1：多肽M123

2.SEQ ID NO.2：多肽IG

3.SEQ ID NO.3：肽连接段G9

4.EQ ID NO.4：人免疫球蛋白IgG1中的铰链N-端肽链Hn

5.SEQ ID NO.5：人免疫球蛋白Fc

6.SEQ ID NO.6：IL6BP-1的编码DNA

7.SEQ ID NO.7：IL6BP-2的编码DNA

8.SEQ ID NO.8：IL6BP-3的编码DNA

9.SEQ ID NO.9：C326的编码DNA

附图说明

图1优化多肽示意图，描述了本发明中优化多肽IL6BP-1、IL6BP-2、和IL6BP-3的蛋白组成结构，其中结合IL-6的多肽表示为M123，结合人免疫球蛋白的多肽表示为IG，人免疫球蛋白Fc区域表示为Fc，优化肽连接段表示为G9，人免疫球蛋白IgG1中的铰链N-端肽链表示为Hn。

图2SDS-PAGE凝胶电泳中的多种优化多肽，显示了在本发明一较佳实施例中提纯后的优化多肽在SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺)凝胶电泳后、考马斯亮蓝染色的照片。其中第一条带是标准分子量的蛋白质、第二条带是提纯前的IL6BP-1(17.7kD)、第三条带是提纯的IL6BP-1、第四条带是提纯的IL6BP-2(13.8kD)、第五条带是提纯的IL6BP-3(双聚体，82.2kD)、第六条带是提纯的C326(18.2kD)。

图3优化多肽和IL-6的结合实验，显示了在本发明一较佳实施例中多种优化多肽与IL-6在体外结合的试验结果。

图4优化多肽阻断IL-6和其受体结合的实验，显示了在本发明一较佳实施例中多种优化多肽阻断IL-6与其受体相结合的试验结果。

具体实施方式

以下实施例对本发明所涉及的优化多肽构建、试验、和应用作了详细说明，但是本发明的内容及用途并不限制于实例的范围。

实施例1：克隆编码优化多肽的DNA序列及构建重组载体

本发明中多种优化多肽的编码DNA是通过聚合酶酶链反应(PCR)以不同的引物扩增而得。本优选实施例所构建的三种优化多肽的结构见附图1。

例1构建M123基因

编码M123的DNA片段是由一系列60bp或更短的DNA寡链核苷酸和PCR引物扩增合成而得。首先第一步由以下DNA寡链经变性、退火、和DNA聚合酶延伸得到DNA片段1(100bp)：

DNA寡链1：5’-TGTCTGCCGGACCAGTTCCGCTGTGGCAATGGCCAGTGT

ATTCCGCTGGATTGGGTGTGT-3’

DNA寡链2：5’-CCTCTTCATCCGAATCGTCCGGACAATCATTCACGCCA

TCACACACCCAATCCAGCGGAA-3’

第二步用类似方法由以下DNA寡链合成DNA片段2(100bp)：

DNA寡链3：5’-GGACGATTCGGATGAAGAGGGCTGTCCACCGCGTA

CCTGTGCGCCGAGCCAGTTCCAGTG-3’

DNA寡链4：5’-ATCGCACACCCAGCGCTGCGAAATGCAATAGCCGCT

GCCACACTGGAACTGGCTCGGCGC-3’

第三步以上述DNA片段1和2为模板，和以下引物进行拼接PCR(BridgePCR)扩增得到DNA片段3(200bp)：

引物1：5’-TGTCTGCCGGACCAGTTCCG-3’

引物2：5’-TCCTCACAATCATTCTCGCCATCGCACACCCAGCGCTGCG-3’

第四步用类似方法由以下DNA寡链合成DNA片段4(100bp)：

DNA寡链5：5’-GGCGAGAATGATTGTGAGGATGGCTCGGATGAGGCC

AACTGTGCAGGCTCCGTACCGACC-3’

DNA寡链6：5’-TGCAGCGGCCATTGCGGCACCGGAACTCATCCGACGG

ACAGGTCGGTACGGAGCCTGCAC-3’

第五步用类似方法由以下DNA寡链合成DNA片段5(97bp)：

DNA寡链7：5’-GTGCCGCAATGGCCGCTGCATTCCACGGGCATGGCG

TTGCGATGGCGTGAATGATTGTGC-3’

DNA寡链8：5’-CGTATGCTCTGTACAGTCTTCTTCATCCGAATTATCGG

CACAATCATTCACGCCATC-3’

第六步以上述DNA片段4和5为模板，和以下引物进行拼接PCR扩增得到DNA片段6(177bp)：

引物3：5’-GGCGAGAATGATTGTGAGGA-3’

引物4：5’-CGTATGCTCTGTACAGTCTT-3’

最后第七步以上述DNA片段3和6为模板，以引物1和4进行拼接PCR扩增得到编码M123的基因(357bp)，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO.1所述。

例2构建IG基因

编码IG的DNA片段是由以下二个DNA寡链核苷酸寡链经变性、退火、和DNA聚合酶延伸合成而得：

DNA寡链9：5’-TGTCACCCTACCGGCCAATTTCGTTGTCGGAGCAGCG

GCCGTTGCGTGTCACCGACCTGG-3’

DNA寡链10：5’-ACAGTTTTCTTCATCCGAGTTGTCGCCACAGTCATTAT

CGCCATCGCACACCCAGGTCGGTGACACGCAAC-3’

所得的编码IG的基因(111bp)，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所述。

例3构建IL6BP-1基因及重组载体

IL6BP-1由IG和M123融合而成，二者之间为肽连接段G9。

包含IG的PCR片段(168bp)是以上述IG基因为模板和如下引物扩增而得：

引物5：5’-GAGATATACATATGTGTCACCCTACCGGCCAATTTCG-3’

引物6：5’-TCCACCTCCGCCACCTCCGCCTCCACCACAGTTTTC

TTCATCCGAG-3’

包含M123的PCR片段(394bp)是以上述M123基因为模板和如下引物扩增而得：

引物7：5’-GGCGGAGGTGGCGGAGGTGGATGTCTGCCGGACCAGTTC

CGG-3’

引物8：5’-GGTGGTGCTCGAGCTACGTATGCTCTGTACAGTCTTC-3’

然后IG-G9-M123的融合片段(541bp)是以上述IG和M123的PCR片段为模板，由引物5和8拼接PCR扩增所得。编码IL6BP-1的DNA克隆由该PCR片段的NdeI和XhoI酶切产物(519bp)插入到载体质粒pET24b(Novagen公司)的NdeI和XhoI酶切点所得。该重组质粒利用T7启动子来表达IL6BP-1，并包含醌那霉素(Kinamycin)抗性基因以利于在细菌中的繁殖。将编码IL6BP-1的重组质粒转染E.coli(DH5α)后加入LB培养基培养过夜，由Qiagen质粒提取试剂盒提取质粒后进行酶切及测序鉴定，所获得的编码IL6BP-1的DNA序列如SEQ IDNO.6所述。

例4构建IL6BP-2基因及重组载体

编码IL6BP-2的DNA是以上述M123基因为模板和如下引物扩增而得：

引物9：5’-GAGATATACATATGTGTCTGCCGGACCAGTTCCG-3’

引物10：5’-GGTGGTGCTCGAGCTAGCATGTGTGAGTTTTGTCCG

TATGCTCTGTACAGTCTTC-3’

将所得PCR片段(405bp)的NdeI和XhoI酶切产物(383bp)插入到载体质粒pET24b的NdeI和XhoI酶切点，转染E.coli(DH5α)后即可获得编码IL6BP-2的重组质粒，所获得的编码IL6BP-2的DNA序列如SEQ ID NO.7所述。

例5构建IL6BP-3基因及重组载体

IL6BP-3由M123和人免疫球蛋白IgG1 Fc区域融合而成，二者之间为肽连接段G9，其N端包含了人α-乳球蛋白(alpha-lactalbumin)的信号肽以保证其细胞外的分泌。IL6BP-3的建造是通过拼接PCR的方法构造而得。

其中包含M123的PCR片段(462bp)是首先以上述M123基因为模板，和引物11和12扩增得到424bp的DNA片段，然后以该DNA片段为模板，以引物13和12扩增而到：

引物11：5’-TCTGCTCCTGGTTGGCATCCTATTCCATGCCACCCAGGCCT

GTCTGCCGGACCAGTTCCG-3’

引物12：5’-TCCACCTCCGCCACCTCCGCCTCCACCCGTATGCTC

TGTACAGTCTTC-3’

引物13：5’-CCTCGAGAATTCGCAACCACCATGATGTCCTTTGTCTCTCT

GCTCCTGGTTGGCATCC-3’

其中包含Fc的PCR片段(722bp)是从人淋巴结cDNA(BD Clontech公司)为模板和如下引物扩增而得：

引物14：5’-GAGGTGGCGGAGGTGGAGACAAAACTCACACATGCCC

ACC-3’

引物15：5’-AAGGGAATCTAGAGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACA

GGGAG-3’

编码IL6BP-3的DNA是以上述462bp和722bp的PCR片段为模板，以引物13和15扩增而得(1167bp)。将其EcoRI和NotI酶切产物(1141bp)插入到载体质粒pCI-neo(Promega公司)的EcoRI和NotI酶切点后，转染E.coli(DH5α)即可获得编码IL6BP-3的重组质粒，所获得的编码IL6BP-3的DNA序列如SEQ IDNO.8所述。该重组质粒利用CMV启动子来表达IL6BP-3，并包含SV40的多聚腺苷酸(PolyA)序列以保证其最佳的表达量。该重组质粒还包含氨苄青霉素(Ampicillin)抗性基因以利于在细菌中的繁殖，和新霉素(Neomycin)抗性基因以用于稳定转染哺乳细胞的选择。

例6构建C326基因及重组载体

编码C326的cDNA是以包含IG和M123的PCR片段为模板拼接PCR扩增所得。其中包含1G的PCR片段(151bp)是以上述IG基因为模板、以引物5和16扩增而得：

引物16：5’-CCCGGCGGCTCCGATGCCGGTGCGCTACAGTTTTC

TTCATCCGAG-3’

包含M123的PCR片段(400bp)是以上述M123基因为模板、以引物8和17扩增而得：

引物17：5’-CCGGCATCGGAGCCGCCGGGCTCGCTGTGTCTGCC

GGACCAGTTCCG-3’

最后包含C326的PCR片段(531bp)是以上述包含IG和M123的PCR片段为模板，由引物5和8拼接PCR扩增所得。编码C326的DNA克隆由该PCR片段的NdeI和XhoI酶切产物(509bp)插入到载体质粒pET24b(Novagen公司)的NdeI和XhoI酶切点所得。转染E.coli(DH5α)后即可获得编码C326的重组质粒，其DNA序列如SEQ ID NO.9所述。

实施例2：优化多肽在细胞中的表达和提纯

优化多肽IL6BP-1和IL6BP-2可在原核细胞内大量表达，提纯后具有优异的稳定性和生物活性，而IL6BP-3是和人免疫球蛋白Fc区域的融合蛋白，其肽链需要得到糖基化修饰，因此，哺乳动物细胞是其最佳的表达系统。

IL6BP-1、IL6BP-2、和C326的表达和提纯

分别将编码IL6BP-1、IL6BP-2、和C326的重组质粒转染至大肠杆菌BL21(DE3)GOLD(Stratagene公司)后，在培养基2xYT中、37℃条件下、摇晃培养至OD600为0.6，加入IPTG至500μM后继续培养三个小时以表达该优化多肽。细胞离心沉淀分离后，均匀打散于5倍的TBS-Ca(10mM Tris，pH 7.5，150mM NaCl，1mM CaCl₂)缓冲液中后，在80℃的水浴中裂解细胞15分钟，离心沉淀后，上清液中优化多肽的比例可高达60％，然后通过二步离子交换层析柱的方法可提纯至99％以上。第一步是DEAE-Sepharose层析柱(Amersham公司)，第二步是Q-Sepharose层析柱(Amersham公司)，二步层析均是利用100mM-1M的NaCl梯度洗脱，洗脱液中还包含10mM Tris，pH 7.5，和1mM CaCl₂。纯化后的蛋白可用A280吸收法确定浓度，并可置-20℃长期储存，其SDS-PAGE凝胶电泳显示于图3。

IL6BP-3的表达和提纯

将编码IL6BP-3的重组高纯度质粒利用Lipofectamine 2000质粒转染药盒(Invitrogen公司)导入CHOS细胞(Invitrogen公司)中，在无血清培养液CHOSSFMII(Invitrogen公司)中培养二天后加入新酶素，用有限密度稀释法进行克隆培养，大约14天后挑取新酶素抗性克隆进行细胞的扩大培养并在液氮中冷冻收藏。稳定转染后的CHOS细胞可在转鼓培养瓶中培养生产IL6BP-3，其浓度可用ELISA法定量确定。

包含IL6BP-3的细胞培养液可采取葡萄球菌A蛋白亲和层析的方法进行纯化。将蛋白A-Sepharose层析柱以PBS缓冲液洗以平衡后，以2毫升/分钟的速度将超滤器浓缩过的培养液上样，用PBS缓冲液洗直至未结合的蛋白全被洗脱(以A280进行监测)，然后用100mM的柠檬酸(PH 3)洗脱结合蛋白，立刻以足够多的2M Tris进行中和。纯化后的融合蛋白可用ELISA法或A280吸收法确定浓度，并可置-20℃长期储存，其SDS-PAGE凝胶电泳显示于图3。

实施例3：优化多肽与IL-6的体外结合实验

本发明利用生物素(Biotin)标记的IL-6(R&D Systems公司)来检测优化多肽和IL-6的直接结合，以及其阻断IL-6和IL-6受体的结合，从而达到抑制IL-6的生物活性的目的。所有的实验中均以C326为参照，以比较优化多肽和C326的生物活性。

IL6BP-1、IL6BP-2、和IL6BP-3与IL-6的ELISA结合实验

在本实验中，以每孔100μl的30nM的优化多肽IL6BP-1、IL6BP-2、IL6BP-3、或C326为底物直接加样至ELISA板孔底部，然后加入不同浓度的Biotin-IL-6温育后，再加酶结合物Streptavidin-HRP以检测结合的IL-6，最后加TMB显色，比色仪测量的结果原始实验结果在图3中显示，其中优化多肽与IL-6的结合度和信号强度成正比，经Prism4软件(GraphPad公司)Sigmoidal非线性拟合后所得到的EC50及其标准偏差在表1中显示。C326可以有效地和IL-6直接结合，其EC50在本实验中为13.3nM，而IL6BP-1和IL6BP-2的EC50分别为6.4nM和6.9nM，表示这二种优化多肽对IL-6的亲和力比C326提高了一倍。同时IL6BP-3是二聚体，其EC50为3.9nM，更加显著地增高了对IL-6的亲和力。

IL6BP-1、IL6BP-2、和IL6BP-3阻断IL-6和IL-6受体的结合实验

IL-6的受体是由IL-6R和GP130组成的，为了检验本发明的优化多肽是否能有效地阻断IL-6和其受体的结合，从而抑制IL-6的信号传递，本实验首先以每孔100μl的30nM IL-6R(R&D Systems公司)为底物加样至ELISA板孔底部，然后加入2nM的GP130(R&D Systems公司)、1nM的Biotin-IL-6、和不同浓度的优化多肽共同温育，最后加酶结合物Streptavidin-HRP以检测结合的IL-6，TMB显色后的原始实验结果显示于图4，经Prism4软件Sigmoidal非线性拟合后所得到的EC50及其标准偏差在表2中显示。由于本实验测量的是优化多肽和IL-6受体对IL-6的相互竞争，因此优化多肽与IL-6的结合度和信号强度成反比。C326阻断IL-6与其受体相结合的EC50为106.8pM，而IL6BP-1、IL6BP-2、和IL6BP-3的EC50分别为51.2pM、44.0pM、和22.2pM。此结果和上述优化多肽和IL-6直接结合的实验结果保持一致，IL6BP-1和IL6BP-2这二种优化多肽对IL-6的亲和力比C326提高了大约一倍，IL6BP-3则比C326提高了大约5倍。

综上所述，本发明所提供的优化多肽IL6BP-1、IL6BP-2、和IL6BP-3具有优良的结构稳定性和生物活性、显著地提高了对IL-6的亲和性、并能有效地阻断IL-6和其受体的结合，大大提高了它们在医疗应用和诊断试剂的可用性。

实施例4：IL6BP-1注射剂

按制剂学常规技术将IL6BP-1和药物可接受的载体混合，冷冻干燥。

实施例5：IL6BP-2注射剂

实施例6：IL6BP-3注射剂

序列表

<110>余波

<120>一系列可阻断IL-6的创新多肽及其医疗应用

<160>9

<210>1

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Cys Leu Pro Asp Gln Phe Arg Cys Gly Asn Gly Gln Cys Ile Pro Leu

1 5 10 15

Asp Trp Val Cys Asp Gly Val Asn Asp Cys Pro Asp Asp Ser Asp Glu

20 25 30

Glu Gly Cys Pro Pro Arg Thr Cys Ala Pro Ser Gln Phe Gln Cys Gly

35 40 45

Ser Gly Tyr Cys Ile Ser Gln Arg Trp Val Cys Asp Gly Glu Asn Asp

50 55 60

Cys Glu Asp Gly Ser Asp Glu Ala Asn Cys Ala Gly Ser Val Pro Thr

65 70 75 80

Cys Pro Ser Asp Glu Phe Arg Cys Arg Asn Gly Arg Cys Ile Pro Arg

85 90 95

Ala Trp Arg Cys Asp Gly Val Asn Asp Cys Ala Asp Asn Ser Asp Glu

100 105 110

Glu Asp Cys Thr Glu His Thr

115 119

<210>2

<211>37

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Cys His Pro Thr Gly Gln Phe Arg Cys Arg Ser Ser Gly Arg Cys Val Ser Pro

1 5 10 15

Thr Trp Val Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys Gly Asp Asn Ser Asp Glu Glu Asn

20 25 30 35

Cys

37

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5 9

<210>4

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

Asp Lys Thr His Thr Cys

1 5 6

<210>5

<211>226

<212>PRT

<213>人工序列

<400>5

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

1 5 10 15

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30 35

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

40 45 50

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

55 60 65 70

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

75 80 85

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

90 95 100 105

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

110 115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

145 150 155 160

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

180 185 190 195

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

200 205 210 215

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro G1y Lys

220 225 226

<210>6

<211>501

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

1 atgtgtcacc ctaccggcca atttagatgc cgcagtagcg gcagatgcgt ttcaccgacc

61 tgggtttgcg acggcgataa tgattgtggg gacaactcgg atgaagaaaa ctgtggtgga

121 ggcggaggtg gcggaggtgg atgtctgccg gaccagttcc ggtgcggcaa cggccaatgc

181 attccactgg actgggtttg cgacggcgtt aatgattgtc cggacgactc ggatgaagaa

241 ggctgtccac cgcgtacgtg tgcgccgagc cagttccagt gcggcagcgg ctactgcatt

301 tcacagcgct gggtttgcga cggcgaaaat gattgtgagg acggctcgga tgaagcaaac

361 tgtgcaggct ccgtacctac gtgtccgtcg gacgagttcc ggtgcagaaa cggccgctgc

421 attccacggg cctggcgttg cgacggcgta aatgattgtg cggacaactc ggatgaagaa

481 gactgtacag agcatacgta g

<210>7

<211>381

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

1 atgtgtctgc cggaccagtt ccggtgcggc aacggccaat gcattccact ggactgggtt

61 tgcgacggcg ttaatgattg tccggacgac tcggatgaag aaggctgtcc accgcgtacg

121 tgtgcgccga gccagttcca gtgcggcagc ggctactgca tttcacagcg ctgggtttgc

181 gacggcgaaa atgattgtga ggacggctcg gatgaagcaa actgtgcagg ctccgtacct

241 acgtgtccgt cggacgagtt ccggtgcaga aacggccgct gcattccacg ggcctggcgt

301 tgcgacggcg taaatgattg tgcggacaac tcggatgaag aagactgtac agagcatacg

361 gacaaaactc acacatgcta g

<210>8

<211>1125

<212>PRT

<213>人工序列

<400>8

1 atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggcctgt

61 ctgccggacc agttccggtg cggcaacggc caatgcattc cactggactg ggtttgcgac

121 ggcgttaatg attgtccgga cgactcggat gaagaaggct gtccaccgcg tacgtgtgcg

181 ccgagccagt tccagtgcgg cagcggctac tgcatttcac agcgctgggt ttgcgacggc

241 gaaaatgatt gtgaggacgg ctcggatgaa gcaaactgtg caggctccgt acctacgtgt

301 ccgtcggacg agttccggtg cagaaacggc cgctgcattc cacgggcctg gcgttgcgac

361 ggcgtaaatg attgtgcgga caactcggat gaagaagact gtacagagca tacgggtgga

421 ggcggaggtg gcggaggtgg agacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa

481 ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc

541 tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc

601 aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag

661 gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg

721 ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag

781 aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca

841 tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat

901 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc

961 acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct atagcaagct caccgtggac

1021 aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac

1081 aaccactata cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatga

<210>9

<211>507

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

1 atgtgtcacc ctaccggcca atttcgttgt cggagcagcg gccgttgcgt gtcaccgacc

61 tgggtgtgcg atggcgataa tgactgtggc gacaactcgg atgaagaaaa ctgtagcgca

121 ccggcatcgg agccgccggg ctcgctgtgt ctgccggacc agttccgctg tggcaatggc

181 cagtgtattc cgctggattg ggtgtgtgat ggcgtgaatg attgtccgga cgattcggat

241 gaagagggct gtccaccgcg tacctgtgcg ccgagccagt tccagtgtgg cagcggctat

301 tgcatttcgc agcgctgggt gtgcgatggc gagaatgatt gtgaggatgg ctcggatgag

361 gccaactgtg caggctccgt accgacctgt ccgtcggatg agttccggtg ccgcaatggc

421 cgctgcattc cacgggcatg gcgttgcgat ggcgtgaatg attgtgccga taattcggat

481 gaagaagact gtacagagca tacgtag

Claims

1.一种融合蛋白质，由可结合人免疫球蛋白的多肽IG和可结合IL-6的多肽M123构成，IG和M123之间由一个优化肽连接段相连，该肽连接段选自以下组：

a.Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly，表示为G9；

2.一种融合蛋白质，由多肽M123和一个多肽短链构成，该肽链选自以下组：

b.任何一个包含自由胱氨酸、长度为4到30的氨基酸序列。

3.一种融合蛋白质，由多肽M123和人免疫球蛋白IgG1的Fc区域构成。

4.如权利要求1所述的融合蛋白质，为IL6BP-1：IG-G9-M123。

5.如权利要求2所述的融合蛋白质，为IL6BP-2：M123-Hn。

6.如权利要求3所述的融合蛋白质，为IL6BP-3：M123-G9-Fc。

7.编码权利要求4、5、6的融合蛋白质的重组DNA，其DNA序列见序列表中的SEQ ID NO.6、7、8。

8.包含权利要求7所述重组DNA的重组载体，该载体选自质粒、病毒或DNA片段。

9.包含权利要求8所述重组载体的重组体，其中宿主细胞是原核细胞或真核细胞，包括应用了DHFR/MTX或GS/MSX基因扩增系统的宿主细胞。

10.权利要求1-6中任一项所述融合蛋白质在制备治疗癌症或自身免疫性疾病的药物中的应用。

11.如权利要求10的应用，其中所述治疗癌症或自身免疫性疾病的药物是抑制炎症反应的药物。

12.一种药物组合物，包括如权利要求1-6中任一项所述融合蛋白质及药学上可接受的载体。

13.权利要求12所述的组合物，是注射剂、粉针剂、冷冻干燥剂或鼻腔喷雾剂。

14.如权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，还包括任何一种或几种其他的具有协同作用的治疗癌症或抑制炎症反应的药物，所述组合物可以和其他治疗方法一起使用，所述其他治疗方法选自化学疗法、反射疗法、基因疗法。

15.权利要求1-6中任一项所述融合蛋白质在制备诊断癌症或自身免疫性疾病的试剂中的应用。

16.如权利要求14的应用，所述融合蛋白质可以和其他诊断癌症或自身免疫性疾病的方法一起使用。