CN108864315A - 含有来自假交替单胞菌cy01的外泌多糖的冷冻保护剂 - Google Patents

含有来自假交替单胞菌cy01的外泌多糖的冷冻保护剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种来自假交替单胞菌菌株CY01(KCTC 12867BP)(一种生存在极地地区的新型菌株)的外泌多糖，并且涉及一种含有所述外泌多糖的用于细胞冷冻保护的组合物。本发明的外泌多糖具有优异的冷冻保护细胞的能力，并且没有显示细胞毒性。因此，当以高浓度使用时，本发明的外泌多糖能可代替显示细胞毒性的传统冷冻保护剂。

Description

含有来自假交替单胞菌CY01的外泌多糖的冷冻保护剂
技术领域
本发明涉及一种源自假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)菌株CY01(即一种生存在极地地区的新型菌株)的外泌多糖(exopolysaccharide)，并且更具体地涉及一种源自假交替单胞菌菌株CY01的外泌多糖，并涉及一种含有所述外泌多糖的用于冷冻保护细胞的组合物。
背景技术
生存在海洋环境中的许多种细菌分泌被称为外泌多糖(EPS)的粘性胞外碳氢化合物聚合物。大多数由海洋细菌生成的EPS是由3或4种不同单糖组成的杂多糖，所述单糖可以是戊糖、己糖、氨基糖或糖醛酸并且以10个或更多个的组排列形成重复单元。EPS发挥使微生物远离寒冷环境的作用，并且由极地寒冷环境中的细菌分泌的EPS具有新的结构并且在许多情况下具有冷冻保护能力。
发现了从假交替单胞菌SM20310(北极细菌)和北极假交替单胞菌KOPRI 21653(南极细菌)分泌的EPS增强大肠杆菌(非极地地区的细菌)抗冻融循环的生存能力。因此，已经提出了来自这些细菌的EPS作为冷冻保护剂(CPA)的可用性(Liu,S.B.et al.Applied andEnvironmental Microbiology,79:224,2013；Kim,S.J.&Yim,J.H.,J.Microbiology,45:510,2007)。
冰的形成和生长在细胞水平上引起物理损伤，并且由于细胞外溶液浓度的增加，溶液中水的体积减少以引起渗透压休克。当生物物质在低于冷冻温度的温度储存时，这成为一个问题。
随着再生医学和器官移植的迅速发展，供体细胞、组织、器官和红细胞(RBC)的冷冻保存需求日益增加。通常，包装好的血液在4℃的添加液诸如ADSOL中储存42天，无需冷冻保存，并具有高溶血率。这个问题可以通过使用甘油作为冷冻保护剂来克服。然而，只有当向细胞中加入高浓度(40％w/v或更高)的甘油时，才能保持高回收红细胞的能力，并且细胞以非常缓慢的1℃/min的冷却速率冷却，并储存在-80℃。
然而，只有当甘油通过解冻后洗涤被稀释至1％或更少时才去除甘油的细胞毒性。为了克服甘油的这个缺点，一直在尝试使用其他冷冻保护剂，包括低分子糖，诸如海藻糖、蔗糖、葡萄糖、棉子糖、麦芽糖等。然而，由于诸如渗透压或氧化的问题，这种方法可能会影响红细胞的最终冷冻。为了简化解冻后复杂的洗涤过程，人们尝试使用非穿透添加剂诸如HES(羟乙基淀粉)、聚乙烯吡咯烷酮和葡聚糖代替甘油(Scott,K.L.et al.,Transfus.Med.Rev.,19:127,2005；Stolzing,A.et al.,Transfusion Apheresis Sci.,46:137,2012；E.P.Horn et al.,Anesth.Analg.,85:739,1997)。这种聚合物不能穿透细胞膜，并且仅存在于细胞膜外，因此在红细胞冷冻后的解冻过程中不需要复杂的洗涤过程。然而，对于红细胞的冷冻保存，需要高浓度(20％w/v或更高)的HES溶液，并且该高浓度导致高粘度，使得难以处理冷冻过程。
因此，本发明已经做了广泛的努力以发现细胞毒性小并且具有优异冷冻保护作用的非穿透的冷冻保护剂。因此，本发明的发明人发现了当在红细胞的冷冻保存过程中加入通过假交替单胞菌菌株CY 01(KCTC 12867BP)(即一种生存在南冰洋的新型菌株)生成的外泌多糖时，与其他冷冻保护剂(CPA)相比，它在相对低的浓度表现出优异的冷冻保护作用，并不显示细胞毒性，从而完成本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种源自假交替单胞菌菌株CY01(KCTC 12867BP)的外泌多糖，其具有冷冻保护细胞的能力，和一种用于生成所述外泌多糖的方法。
本发明的另一个目的是提供一种分子量为1.0x 105至4.3x 105Da的外泌多糖，其通过源自菌株CY01的外泌多糖的水解获得，和一种用于生成所述外泌多糖的方法。
本发明的又一个目的是提供一种含有上述外泌多糖(p-CY01或p-CY01_LM)的用于冷冻保护细胞的组合物。
本发明的还一个目的是提供一种使用上述外泌多糖(p-CY01或p-CY01_LM)冷冻保护细胞的方法。
本发明进一步的目的是提供一种假交替单胞菌菌株CY01(KCTC 12867BP)，其生存在极地地区并且具有生成外泌多糖的能力。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供了一种外泌多糖(p-CY01)，其通过假交替单胞菌菌株CY01(KCTC 12867BP)生成，并且由葡萄糖和半乳糖组成。
本发明还提供了一种分子量为1.0x 105至4.3x 105Da的外泌多糖，其通过上述外泌多糖(p-CY01)的水解获得。
本发明还提供了一种含有上述外泌多糖(p-CY01或p-CY01_LM)的用于冷冻保护细胞的组合物。
本发明还提供了一种用于生成外泌多糖(p-CY01)的方法，所述外泌多糖通过假交替单胞菌菌株CY01(KCTC 12867BP)生成，并且由葡萄糖和半乳糖组成，所述方法包括以下步骤：(a)培养假交替单胞菌菌株CY01(KCTC 12867BP)以生成所述外泌多糖(p-CY01)；和(b)回收生成的外泌多糖(p-CY01)。
本发明还提供了一种用于生成分子量为1.0x 105至4.3x 105Da的外泌多糖(p-CY01_LM)的方法，所述方法包括外泌多糖(p-CY01)水解的步骤，所述外泌多糖通过假交替单胞菌菌株CY01(KCTC 12867BP)生成，并且由葡萄糖和半乳糖组成。
本发明还提供了一种使用上述外泌多糖(p-CY01或p-CY01_LM)冷冻保护细胞的方法。
本发明还提供了一种具有生成粘液外泌多糖能力的假交替单胞菌菌株CY01(KCTC12867BP)。
有益效果
本发明的外泌多糖在细胞冷冻保存过程中具有优异的冷冻保护细胞能力，并且不显示细胞毒性。因此，当以高浓度用于红细胞冷冻保护时，本发明的外泌多糖可代替显示细胞毒性并且需要复杂解冻过程的传统冷冻保护剂。因此，本发明的外泌多糖对血液的长期冷冻保护有效。
附图说明
图1显示10种分离菌株的EPS生成和冷冻保护效果。在图1中，白色条表示生成的EPS，黑色条表示EPS针对大肠杆菌(E.coli)的冷冻保护效果(％)。标准偏差(±SD)从3个独立实验获得。
图2显示使用CY01菌株的16S rRNA序列进行系统发生分析的结果。
图3显示源自CY01的EPS的色谱峰。具体地，图3A显示阴离子色谱的结果，和图3B显示凝胶过滤色谱的结果。
图4显示为分析通过凝胶过滤色谱获得的源自CY01的EPS级分的纯度进行HPLC的结果。
图5A显示通过GS/MS分析EPS的糖组分的结果，和图5B显示通过GC/MS分析EPS的糖组分的键合模式的结果。
图6A和6B显示通过p-CY01的低分子化获得的p-CY01_LM的1H和13C NMR谱。
图7A和7B显示通过低分子化获得的p-CY01_LM的2D-HSQC谱，和显示质子-碳相关性实验的结果，并且图7C、7D、7E和7F显示2D-TOCSY、2D-COSY、2D-HMBC和2D-NMR(600MHz)谱。
图8显示基于GC/MS和NMR分析结果分析p-CY01的主要结构的结果。
图9A显示通过酸分解处理获得的p-CY01和p-CY01_LM的尺寸排阻色谱的结果，和图9B显示p-CY01_LM溶液的流变特性的变化。#表示p-CY01，*表示p-CY01_LM。
图10A显示作为冷冻保存介质中p-CY01_LM浓度的函数的红细胞的溶血(％)；图10B显示为证实冷冻保存于2.5％p-CY01_LM溶液后解冻的红细胞的完整性而进行的显微镜观察的结果；图10C显示分析冷冻保存于PBS溶液后解冻的红细胞完整性的结果；和图10D显示长期冷冻保存于p-CY01_LM溶液后解冻的红细胞的溶血(％)。在图10中，黑色条表示冷冻保存于2.5％p-CY01_LM溶液后解冻的红细胞的溶血(％)，和白色条表示冷冻保存于PBS溶液后解冻的红细胞的溶血(％)。
图11显示冷冻保存于p-CY01_LM溶液的红细胞的溶血后测量ATP和2,3-DPG活性的结果。
图12A显示分析加入到冷冻保存介质中的各组分的红细胞保存能力的结果。在图12A中，ADSOL表示ADSOL溶液；"G+D"表示1％(w/v)甘油和DMSO；"p-CY01_LM"表示2.5％(w/v)p-CY01_LM溶液；和"G+D+p-CY01_LM"表示含有1％(w/v)甘油、1％(w/v)DMSO和2.5％(w/v)p-CY01_LM的溶液。*表示ADSOL中各组分的溶液。图12B显示为分析加入到冷冻保存介质中的各组分对冷冻保护红细胞的主要效果而进行的Plackett-Burman统计分析的结果，*表示统计差值等于或小于0.05。
图13显示p-CY01_LM溶液的DSC分析的结果。具体地，图13A显示含有1％甘油和1％DMSO的溶液的DSC分析结果，其是阴性对照；图13B显示含有1％甘油、1％DMSO和0.5％p-CY01_LM的溶液的DSC分析结果；和图13C显示含有1％甘油、1％DMSO和2.5％p-CY01_LM的溶液的DSC分析结果。
图14显示通过分析冰晶形状分析p-CY01_LM溶液的防冻能力的结果。具体地，图14A显示分析含有1％甘油和1％DMSO的溶液中的冰晶形状的结果；图14B显示分析含有1％甘油、1％DMSO和2.5％p-CY01_LM的ADSOL溶液(p-CY01_LM溶液)中的冰晶形状的结果；和图14C显示含有1％甘油、DMSO和2.5％HES的ADSOL溶液中的冰晶形状的结果。各实验组中的1至2指当冰晶种被冷却时冰晶形状变得更大。比例代表10μm。
图15表示当用显微镜观察冷冻和解冻过程时，通过分析红细胞的剩余形状和冰晶的形状分析p-CY01_LM的防冻能力的结果。具体地，图15A显示PBS中的红细胞的形状；图15B显示p-CY01_LM溶液中的红细胞的形状；和图15C显示含有1％甘油、DMSO和2.5％HES的ADSOL溶液中的红细胞的形状。红细胞的溶血图像在各步骤的5分钟后获得，并且比例代表20μm。
图16显示观察p-CY01_LM的冰再结晶抑制(IRI)活性的结果。具体地，图16A显示PBS的结果；图16B显示p-CY01_LM溶液的结果；和图16C表示含有1％甘油、DMSO和2.5％HES的ADSOL溶液的结果。比例代表100μm。
具体实施方式
在本发明中，从南极海水样品中分离生产外泌多糖的新型假交替单胞菌菌株CY01。发现由CY01菌株生成的外泌多糖在最初筛选期间具有针对大肠杆菌的冷冻保护作用。基于该结果，检查由CY01菌株生成的外泌多糖是否将可用作细胞冷冻保存期间的冷冻保护剂。为了具有适用于冷冻保存的物理特性，来自CY01的外泌多糖被酸部分分解以形成低分子外泌多糖，并且在红细胞冷冻保存期间加入低分子外泌多糖。结果是，显示了低分子外泌多糖表现出高防冻能力并且没有细胞毒性。
因此，一方面，本发明涉及一种外泌多糖，其通过假交替单胞菌菌株CY01(KCTC12867BP)生成，并且其由葡萄糖和半乳糖组成。
在本发明中，在从南极海水样品中分离的2,980株菌株中，分离了73株生成粘液外泌多糖的菌株，并且从其中选择了10株具有优异的生成外泌多糖能力的菌株。大肠杆菌细胞在0.2％(w/w)获自各菌株的粗制外泌多糖溶液中进行冻融循环，并且测量了大肠杆菌细胞的存活率。结果是，由10株菌株中的CY01菌株生成的粗制外泌多糖显示了最高的冷冻保护作用。
在本发明的实例中，在含有0.2％源自CY01菌株的粗制外泌多糖的溶液中的大肠杆菌细胞的存活率是88.16±2.92％，并且在含有0.2％源自其他菌株的粗制外泌多糖溶液中的大肠杆菌细胞的存活率是42.01±1.93％至67.28±4.32％。
在本发明中，来自CY01的外泌多糖中的葡萄糖和半乳糖的摩尔比可能约为3.4:1。
在本发明中，来自CY01的外泌多糖的糖基连接分析和NMR分析表明外泌多糖具有重复结构，其主要由4-连接的吡喃葡萄糖和6-连接的吡喃半乳糖组成，并且这些组分可以是形成主链的组分。
另一方面，本发明涉及分子量为1.0x 105至4.3x 105Da的外泌多糖，其通过上述外泌多糖的水解获得。
在本发明中，进行酸分解以便增加外泌多糖的溶解性，并降低外泌多糖的高粘度，这导致在外泌多糖用作冷冻保护剂期间难以处理和洗涤。
在本发明的实例中，源自CY01的外泌多糖(p-CY01)与0.1M的TFA一起在121℃加热1小时以获得酸分解的p-CY01(p-CY01_LM)。结果是，p-CY01的平均分子量大约是1.1x107Da，而被酸部分分解的p-CY01_LM的分子量是1.0x 105至4.3x 105Da。证实了外泌多糖粘度的降低和溶解性的增加取决于低分子p-CY01_LM溶液的流变特性的变化。
在又一方面，本发明涉及含有外泌多糖的用于冷冻保护细胞的组合物。
在本发明的实例中，含有p-CY01_LM和冷冻保护剂的红细胞样品在不控制冷却速率的情况下(立即冷却至-80℃)被冷冻并且保存在-80℃。红细胞样品在40℃在水浴中快速解冻。解冻后，p-CY01_LM作为冷冻保护剂的功能通过红细胞溶血测定和光学显微镜分析来分析。由于p-CY01_LM的浓度增加，溶血(％)降低。在2.5％至4.0％的p-CY01_LM浓度，出现9.08±0.37％至5.64±0.96％的百分比溶血，并且使用3.5％p-CY01_LM显示了最低溶血(5.40％)。换言之，显示出，在2.5％至4.0％的p-CY01_LM浓度，90％的RBC在解冻后显示了完整性(图7A)。
在本发明的实例中，被冷冻保存的材料可以是细菌、真菌、动物细胞、植物细胞、红细胞、血小板、精母细胞、卵母细胞、组织、器官等。
本发明的组合物可保护构成组织和器官的细胞免受冷冻。
本发明的用于冷冻保护细胞的组合物可含有甘油和/或DMSO。
在本发明的另一个实例中，检查了p-CY01_LM是否将代替甘油作为长期冷冻保存的冷冻保护剂，并且快速冷却至-80℃并保存在含有2.5％(w/v)p-CY01_LM、1％(v/v)甘油和1％(v/v)DMSO的ADSOL(以下，称为p-CY01_LM溶液)中1小时的红细胞的百分比溶血是6.09±0.64％，并且保存5个月后的百分比溶血是7.24±2.15％，这表示保存5个月期间，百分比溶血几乎没有或没有变化(图7D)。
还一方面，本发明涉及用于生成外泌多糖的方法，所述外泌多糖通过假交替单胞菌菌株CY01(KCTC 12867BP)生成并且其由葡萄糖和半乳糖组成，所述方法包括以下步骤：(a)培养假交替单胞菌菌株CY01(KCTC 12867BP)以生成所述外泌多糖(p-CY01)；和(b)回收生成的外泌多糖。
进一步的方面，本发明涉及用于生成分子量为1.0x 105至4.3x 105Da的外泌多糖的方法，所述方法包括外泌多糖水解的步骤，所述外泌多糖通过假交替单胞菌菌株CY01(KCTC 12867BP)生成并且其由葡萄糖和半乳糖组成。
在本发明中，水解可以是弱酸分解。
在本发明中，水解步骤可以进一步包括进行热处理。
又进一步的方面，本发明还涉及使用上述外泌多糖冷冻保存细胞的方法。
在本发明中，冷冻可以是快速冷冻，其具有范围10℃/min至196℃/min的冷冻速率。
还进一步的方面，本发明还还涉及具有生成粘液外泌多糖能力的假交替单胞菌菌株CY01(KCTC 12867BP)。假交替单胞菌菌株CY01(KCTC12867BP)可能生存在南极洲。
通过使用CY01菌株的16S rRNA序列的系统发生分析，本发明的CY01菌株被分类为大量存在于南极洲的假交替单胞菌菌株(图2)。CY01菌株显示了与居珊瑚假交替单胞菌(Pseudoalteromonas paragorgicola)KMM 3548T(99.52％)、生黑色腐败假交替单胞菌(P.nigrifaciens)NCIIMB 8614T(99.51％)和噬琼脂假交替单胞菌(P.agarivorans)KMM255T(99.38％)高度同源。
实施例
以下，将参考实施例进一步详细描述本发明。对本领域普通技术人员显而易见的是，这些实施例仅用作说明目的，并不被解释为限制本发明的范围。
实施例1：筛选并鉴定生成具有冷冻保护能力的外泌多糖的菌株
从南极海水样品中分离的2,980株菌株在15℃使用S-ZoBell(pH 7.0)琼脂平板(由本发明的发明人制造的)培养3天，并且分离了73株生成粘液外泌多糖的菌株。为了测量由分离的菌株生成的外泌多糖的量，将菌株在15℃使用S-ZoBell(pH 7.0)液体培养基培养3天，并且提取并冻干外泌多糖，然后测量其净重。冷冻保护能力通过将大肠杆菌细胞在0.2％(w/w)获自各菌株的粗制外泌多糖溶液中进行冻融循环，然后测量大肠杆菌细胞的存活率来测量。
在分离的菌株中，10株菌株生成1g/L或更多的粗制外泌多糖(EPS)，并且由这些菌株生成的粗制外泌多糖的量的范围是1.04±0.18g/L至2.04±0.13g/L。在10株菌株中，RosPo13菌株显示了最高外泌多糖产量(2.04g/L)，并且由CY01菌株生成的粗制外泌多糖显示了最高冷冻保护能力(图1)。
含有0.2％源自CY01菌株的粗制外泌多糖的溶液中的大肠杆菌细胞的存活率是88.16±2.92％，并且含有0.2％源自其他菌株的粗制外泌多糖的溶液中的大肠杆菌细胞的存活率是42.01±1.93％至67.28±4.32％。
通过使用CY01菌株的16S rRNA序列的系统发生分析，CY01菌株被分类为大量存在于南极的假交替单胞菌菌株(图2)。CY01菌株显示了与居珊瑚假交替单胞菌(Pseudoalteromonas paragorgicola)KMM 3548T(99.52％)、生黑色腐败假交替单胞菌(P.nigrifaciens)NCIIMB 8614T(99.51％)和噬琼脂假交替单胞菌(P.agarivorans)KMM255T(99.38％)高度同源。
实施例2：源自CY01菌株的外泌多糖的纯化和纯化的外泌多糖的表征
外泌多糖通过乙醇沉淀和使用蛋白酶处理去除蛋白质而从CY01菌株的培养物中分离。获得的粗制外泌多糖使用DEAE-交联琼脂糖柱进行阴离子色谱，从而获得含有外泌多糖的级分(图3A)。获得的外泌多糖级分通过交联琼脂糖4B-凝胶过滤色谱柱(图3B)纯化以获得单一级分。级分中的外泌多糖浓度通过蒽酮-硫酸测定在OD630测量。
获得的级分经过HPLC(Agilent,USA)。HPLC使用5μl的外泌多糖级分溶液在蒸馏水(0.1％w/w)中以0.4ml/min的流速进行，并且使用RI(折射指数,Agilent,USA)检测器进行检测。
结果是，如图4所示，检测到单峰。通过尺寸排阻色谱纯化的外泌多糖的分子量使用RI测量，并且结果是，显示了外泌多糖的平均分子量约为1.1x107Da。来自CY01菌株的纯化的EPS被称为“p-CY01”。
使用GC/MS，分析外泌多糖的糖组分。分析使用Clarus 500(Perkin-Elmer,USA)和质量选择检测器以电子碰撞电离模式进行。
结果是，如图5A所示，p-CY01由葡萄糖和半乳糖组成，并且葡萄糖是p-CY01中的主要糖组分。此外，p-CY01中的葡萄糖:半乳糖的摩尔比约为3.4:1。
如图5B和下表1所示，p-CY01的糖基连接分析的结果表示p-CY01主要由4-连接的吡喃葡萄糖和6-连接的吡喃半乳糖组成。作为次要峰，检测到末端连接的吡喃半乳糖、末端连接的吡喃葡萄糖、3,4-连接的吡喃葡萄糖和4,6-连接的吡喃半乳糖。
表1：分析源自CY01菌株的外泌多糖p-CY01的糖基连接组分
甲基化的糖 Rt(min) 摩尔比 连接的模式
2,3,4,6-Me4-Galp 16.08 0.02 1Gal(T)α
2,3,4,6-Me4-Glcp 17.04 0.01 1Glc(T)α
2,3,4-Me3-Galp 20.35 0.35 1Gal6
2,3,6-Me3-Glcp 20.6 1 1Glc4
2,6-Me2-Glcp 23.33 0.03 1Glc3,4
2,3-Me2-Galp 25.11 0.02 1Gal4,6
对于p-CYO1，用于确定结构的1D和2D NMR实验使用Bruker AVANCE(600MHz)光谱仪进行。样品在25℃测量，1H NMR在600MHz测量，并且13C NMR在150MHz测量。
通过NMR分析，多聚吡喃葡萄糖和多聚吡喃半乳糖的典型峰形从p-CY01的1H和13CNMR谱(图6A和6B)可见。具体地，观察到p-CY01主要由→4)-β-D-Glcp-(1→和→6)-α-D-Galp-(1→的重复单元组成，并且其他侧链的峰相对小或与主要重复单元的峰重叠。此外，从2D-HSQC谱(图7A和B)，观察到质子-碳相关性，但是从2D-TOCSY、2D-COSY、2D-HMBC和2D-NMR(600MHz)，几乎不可能观察到除作为主要组分的吡喃葡萄糖和吡喃半乳糖的相关性之外的不寻常信息(图7C至7F)。采取糖基连接分析结果和NMR谱分析结果，确定p-CY01的主要结构(图8)。从分析结果可见，p-CY01具有主要由4-连接的吡喃葡萄糖和6-连接的吡喃半乳糖组成的重复结构，并且III的[→4)-β-D-Glcp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→]n的连接结构和II的[→6)-α-D-Galp-(1→6)-α-D-Galp-(1→]n的连接结构彼此重复连接以形成主链。此外，显示了p-CY01具有少量I的T-α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1,4→的连接结构作为主链的侧链结构。
实施例3：分析水解后的外泌多糖的分子量和流变特性的变化
因为外泌多糖的高粘度和低溶解性可能干扰外泌多糖在生物工业中的应用，所以由于分解造成的聚合物的平均分子量降低可降低粘度并增加溶解性。近来，当卵母细胞和红细胞使用高浓度PVA冷冻保存时，缺点在于由于溶液的高粘度而不容易操作，并且需要进行洗涤(Deller,RC et al.,Nat.Commun.,5:3244,doi:10.1038/ncomms4244,2014)。
在该实施例中，为了克服所述聚合物的缺点，本发明的p-CY01的分子量通过弱酸分解来调节。p-CY01与0.1M的TFA(三氟乙酸)一起在121℃加热1小时以获得酸分解的p-CY01，并且进行凝胶渗透色谱(GPC)。结果是，没有使用TFA处理的p-CY01在19min至25min从GPC柱洗脱，并且在p-CY01使用TFA热处理的情况下，主峰在33min和37min被洗脱，并且还在51min被洗脱(图9A)。在33min和37min的高分子量峰是由p-CY01的部分分解产生的级分，并且在51min出现的峰是由p-CY01的分解产生的单糖。p-CY01的平均分子量约为1.1x 107Da，而由酸部分分解的p-CY01_LM的分子量为1.0x 105至4.3x105Da。
测量低分子量p-CY01(p-CY01_LM)溶液的流变特性的变化。
流变特性通过布氏粘度计(Brookfield viscometer)使用转子S18测量，并且测量在不同剪切速率的p-CY01、PBS和p-CY01_LM溶液(0.2％、2.5％和5.0％,w/v)的剪切应力。
结果是，如图9B所示，在0.2％p-CY01溶液的情况下，当剪切速率增加时，剪切应力增加，但是在p-CY01_LM溶液的情况下，剪切应力在高剪切速率不增加。这表明p-CY01_LM的粘度显著降低。这种粘度的降低归因于p-CY01分子量的变化。由于外泌多糖被分解和解聚，粘度降低且溶解性增加。
实施例4：p-CY01_LM中的人红细胞(RBC)的冷冻保存
红细胞可以在4℃在ADSOL中保存32天。当红细胞在Haemonetics ACP215中去甘油并保存在ADSOL中时，这些细胞可以在4℃保存3天，同时具有小于1％的溶血率。甘油是胞内冷冻保护剂，并且为了防止红细胞溶血，解冻后，甘油的最终浓度应当通过洗涤降至1％。
由FDA批准DMSO用作人血小板和红细胞的冷冻保护剂。因此，在以下使用p-CY01_LM的冷冻保存实验中，甘油与DMSO一起使用，并且ADSOL用作代替PBS的冷冻保存缓冲液。
在临床实践中，当使用高浓度(40％)甘油以低冷却速率(1℃/min)冷却红细胞并保存在-80℃或液氮中时，可出现高红细胞恢复。此外，外泌多糖冷冻保护剂(PVP,HES)需要物理冷冻并保存在液氮中。
在该实施例中，红细胞样品在没有控制冷却速率的情况下(立即冷却至-80℃)冷冻并保存在-80℃。红细胞样品在40℃在水浴中快速解冻。解冻后，样品的溶血通过都氏测定(Drabkin's assay)定量。
p-CY01_LM作为冷冻保护剂的功能通过红细胞溶血测定和光学显微镜分析来分析。
如图10A可见，当p-CY01_LM的浓度增加时，溶血(％)降低。在2.5％至4.0％的p-CY01_LM浓度，出现9.08±0.37％至5.64±0.96％的百分比溶血，并且使用3.5％p-CY01_LM显示了最低溶血(5.40％)。换言之，显示了，在2.5％至4.0％的p-CY01_LM浓度，解冻后90％的RBC显示了完整性。美国血库协会的标准要求80％的即时存活率(小于20％的溶血)并且要求70％的血细胞应当存活24小时。
含有2.5％(w/v)p-CY01_LM、1％(v/v)甘油和1％(v/v)DMSO的ADSOL溶液显示了9.08±0.37％的百分比溶血(90.92％的解冻后的红细胞完整性)(图10A和10B)，并且PBS显示了92.48±6.49％的百分比溶血(7.52％的解冻后的红细胞完整性)(图10A和10C)。
因此，选择2.5％p-CY01_LM作为红细胞的冷冻保存的最佳浓度。
检查p-CY01_LM是否将代替甘油作为长期冷冻保存的冷冻保护剂。如图10D所示，被快速冷却至-80℃并保存在含有2.5％(w/v)p-CY01_LM、1％(v/v)甘油和1％(v/v)DMSO的ADSOL(以下，称为p-CY01_LM溶液)中1小时的红细胞的百分比溶血是6.09±0.64％，并且保存5个月后的百分比溶血是7.24±2.15％，这表明在保存5个月期间几乎没有或没有百分比溶血的变化。
此外，在室温保存在p-CY01_LM溶液中1小时的红细胞的百分比溶血被保持在小于2％(超过98％的红细胞完整性)，这表明细胞毒性或溶血在冷冻保存期间没有发生。
实施例5：测量使用p-CY01_LM冷冻的红细胞的生物化学特性
红细胞的ATP水平使得能够确定红细胞膜的凹形是否将被保持和红细胞膜的动力学是否将增加。测量ATP水平和控制血红蛋白氧亲和力的2,3-DPG(2,3-二磷酸甘油酸)以确定红细胞的细胞功能和治疗有效性。
测量作为阳性对照组的新鲜红细胞的ATP和2,3-DPG活性，并且测量作为测试组的在-80℃冷冻保存在p-CY01_LM溶液中1小时的红细胞溶血产物的ATP和2,3-DPG活性。
结果是，如图11所示，冷冻保存在p-CY01_LM溶液中的红细胞显示了ATP活性与阳性对照组几乎没有或没有差异。冷冻保存在p-CY01_LM溶液中的红细胞的ATP活性是2.50±0.06μmol/gHb至2.26±0.19μmol/gHb，并且作为阴性对照组的冷冻保存在PBS中的红细胞的ATP活性大大降低至0.18±0.02μmol/gHb。2,3-DPG的浓度在新鲜红细胞中是4.26±0.24μmol/gHb，在冷冻保存在p-CY01_LM溶液中的红细胞中是3.98±0.47μmol/gHb，并且在冷冻保存在PBS的红细胞中是0.78±0.92μmol/gHb。
ATP活性和2,3-DPG浓度在新鲜红细胞和冷冻保存在p-CY01_LM溶液中的红细胞之间没有显著差异。
实施例6：检查主要的冷冻保护添加剂并分析对红细胞的冷冻保存的主要效果
为了分析每种冷冻保护剂对红细胞冷冻保存的效果，基于红细胞的百分比溶血测量每种ADSOL单独，含有1％(w/v)甘油和1％(w/v)DMSO(G+D)的溶液，2.5％(w/v)p-CY01_LM溶液，和含有1％(w/v)甘油、1％(w/v)DMSO和2.5％(w/v)p-CY01_LM(G+D+p-CY01_LM)的溶液的红细胞冷冻保存能力。
结果是，如图12A所示，含有1％(v/v)甘油和DMSO的溶液中的红细胞的百分比溶血是76.29±2.95％，这与阴性对照PBS或ADSOL中的溶血百分比没有很大不同。此外，含有2.5％(w/v)p-CY01_LM的溶液单独显示了显著低的18.73±1.86％的红细胞溶血。此外，含有1％(w/v)甘油、1％(w/v)DMSO和2.5％(w/v)p-CY01_LM的溶液显示了9.43±2.16％的百分比溶血，这表明该溶液表现出最佳冷冻保护效果。
使用Packett-Burman法，计算每种冷冻保护组分对红细胞的冷冻保存的的主要效果值。
如图12B和下表2所示，1％甘油、1％DMSO、ADSOL和2.5％(w/v)p-CY01_LM对红细胞的冷冻保存显示了积极的主要效果值。甘油的主要效果值为2.32，DMSO为2.62，ADSOL为5.82，和p-CY01_LM为51.69，这表明即使用于红细胞冷冻保存的p-CY01_LM浓度仅为甘油或DMSO浓度的2.5倍，p-CY01_LM对红细胞冷冻保存的主要效果是甘油或DMSO的至少19倍。ADSOL和p-CY01_LM的P值为0.05或以下，这与甘油或DMSO相比是显著的。
表2：使用Plackett-Burman设计的冷冻保护组分的统计分析
变量 效果 S.E. t-统计量 P值
甘油 2.321 0.9096 1.28 0.224
DMSO 2.621 0.9096 1.44 0.173
ADSOL 5.826 0.9096 3.20 0.007
p-CY01_LM 51.694 0.9096 28.41 0.000
实施例7：p-CY01_LM的差示扫描量热法(DSC)分析
进行冷却和解冻的p-CY01_LM溶液的DSC分析(图13)。将各样品以40℃/min的速率从+5℃冷却至-78℃，并且以2℃/min的速率解冻。
对含有1％甘油和1％DMSO的溶液(图13A)和含有1％甘油、1％DMSO和0.5至2.5％p-CY01_LM的溶液(图13B和13C)，进行DSC分析。当使用作为阴性对照的含有低浓度(小于1％)的甘油和DMSO的溶液时，焓(ΔH(J/g))的变化是212.0±3.8(J/g)，其显著低于现有技术中使用高浓度(10-40％)的甘油和DMSO时发生的冷冻保护机制，这表明溶液不起减少冷冻过程中形成的冰量的作用(表3)。含有1％甘油和1％DMSO的溶液的过冷却点是-14.2℃，并且含有1％甘油、1％DMSO和0.5％p-CY01_LM的溶液的过冷却点是-13.9℃，并且含有1％甘油、1％DMSO和2.5％p-CY01_LM的溶液的过冷却点是-32.1℃。下表3显示作为冷冻和解冻温度函数的各测试组的焓的变化。冷冻和解冻温度在含有1％甘油、1％DMSO和2.5％p-CY01_LM的溶液的情况下显著降低，并且焓ΔH(J/g)的变化显著降低至52.81±8.7(J/g)(表3)。该现象指在冻融循环过程中可以形成冰的水的总量减少。此外，该现象是p-CY01_LM的防冻机制。
表3：p-CY01_LM溶液的差示扫描量热法(DSC)分析
αG和βD表示甘油和DMSO，并且所有实验在溶解于ADSOL后进行。±SD通过三次重复实验获得。
实施例8：p-CY01_LM溶液的冰形成抑制
通过冷冻过程中冰晶生长抑制的分析，分析p-CY01_LM的防冻能力。
如图14所示，p-CY01_LM溶液(含有1％甘油、DMSO和2.5％p-CY01_LM的ADSOL)中的冰晶种的生长(图14B1)随着温度降低而被抑制，并且因此，冰晶种以六角星的形式生长(图14B2)。该现象在防冻蛋白质中频繁出现，并且是p-CY01_LM的防冻机制。然而，在对照(含有1％甘油和DMSO的ADSOL)和HES溶液(含有1％甘油、DMSO和2.5％HES的ADSOL)中，冰晶种的生长没有被抑制，并且因此冰晶种生长为圆形或扁平的冰晶(图14A1-A2和C1-C2)，这表明没有观察到冰晶生长抑制的防冻效果。此外，阴性对照水的过冷却点是-15.9℃，而p-CY01_LM溶液的过冷却点如上表3所示是-30.5℃。该结果表明p-CY01_LM具有防冻效果。
实施例9：冷冻和解冻过程中红细胞的实时冷冻显微镜观察
使用冰再结晶抑制(IRI)测定，分析解冻过程中的冰晶大小。在冰再结晶抑制剂的存在下，解冻期间再结晶的冰晶的大小将不会大大增加。因此，在该实施例中，红细胞和冰晶在红细胞的冷冻和解冻过程中使用冷冻显微镜成像。具体地，红细胞在每种含有2.5％p-CY01_LM的ADSOL溶液和含有2.5％(v/v)HES的ADSOL溶液中以25℃/min的速率冷却至-40℃。样品的温度以25℃/min的速率升高至-6℃，然后将样品拍照，同时使样品静置5分钟。
图15显示在2.5％p-CY01_LM的存在或不存在下再结晶后红细胞和冰晶的图像。显示了，在2.5％p-CY01_LM的存在下(图15B)，再结晶的冰晶大小显著小于PBS(图15A)或含有2.5％HES的溶液(图15C)中的再结晶的冰晶大小。具体地，在红细胞完全解冻后，观察到红细胞的形状保持完整(图15A4、B4和C4)。
这样的结果通过测量p-CY01_LM的IRI活性再次证实。具体地，使具有小于10μm的直径的多核冰晶圆(ice wafer)在6℃生长30分钟，然后比较冰晶的大小与对照(PBS)的冰晶大小。
如图16所示，PBS(图16A)、2.5％(w/v)p-CY01_LM(图16B)和2.5％(v/v)HES(图16C)的测量结果表明含有p-CY01_LM的溶液在相同浓度显示了不同IRI活性，并且因此抑制冰再结晶，但是HES没有显示对冰再结晶的特别抑制作用。
尽管已经参考具体特征详细地描述了本发明，对本领域技术人员显而易见的是，本说明书仅用作优选的实施方案，并且不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将通过所附权利要求及其等同物来定义。
[微生物保藏]
保藏单位：韩国生命工学研究院(Korea Research Institute of Bioscienceand Biotechnology)
登录号：KCTC 12867BP
保藏日期：2015年7月15日。

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1.一种外泌多糖，其通过假交替单胞菌菌株CY01(KCTC 12867BP)生成，并且由葡萄糖和半乳糖组成。
2.权利要求1的外泌多糖，其中葡萄糖和半乳糖的摩尔比约为3.4:1。
3.一种分子量为1.0x105至4.3x105Da的外泌多糖，其通过权利要求1的外泌多糖的水解获得。
4.一种用于冷冻保护细胞的组合物，其含有权利要求1或权利要求3的外泌多糖。
5.权利要求4的组合物，其进一步包含甘油或DMSO。
6.一种用于生成权利要求1的外泌多糖的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)培养假交替单胞菌菌株CY01(KCTC 12867BP)以生成所述外泌多糖；和
(b)回收生成的外泌多糖。
7.一种用于生成权利要求3的分子量为1.0x105至4.3x105Da的外泌多糖的方法，所述方法包括水解权利要求1的外泌多糖的步骤。
8.一种使用权利要求1或权利要求3的外泌多糖冷冻保护细胞的方法。
9.一种假交替单胞菌菌株CY01(KCTC 12867BP)，其具有生成粘液外泌多糖的能力。
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