CN108513973A - 一种免疫细胞的储存方法及细胞冻存液 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞保存技术领域，具体涉及一种免疫细胞的储存方法及细胞冻存液，包含以下步骤：首先，采集和收集外周血，其次，对外周血进行分离，再次，往其中加入细胞冻存液进行冻存；细胞冻存液按照体积百分比，包含以下组分细胞基础培养基、胎牛血清、二甲基亚砜。本发明的免疫细胞储存方法步骤简单、易于操作，且胎牛血清具有来源广泛，价格低廉的优点，有利于减少成本，便于推广使用；免疫细胞在细胞冻存液中冻存复苏后经过诱导培养的存活率在90％以上，免疫细胞的各项指标检测显示其功能保持完好，这表明细胞冻存液可以很好地保持免疫细胞的生理学功能，对于临床上的治疗具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种免疫细胞的储存方法及细胞冻存液。
背景技术
近年来，由于环境空气污染的日益严重、社会竞争的加剧和人们的生活压力不断增大使到人们的身心长期处于紧绷状态，严重影响了人们的身体健康，并且，绝大部分工薪一族长期缺乏锻炼导致身体素质也不断下降，身体抵抗力逐渐减弱；越来越多人的身体出现亚健康问题，越来越多人的身体出现内分泌失调、抵抗力下降等各种问题；而且，由于现在食品和化妆品中添加剂的违法添加和滥用、重金属含量和农残超标的情况依然相当严重，这些都对人们的身体健康有严重的损害，并导致了现在的肿瘤、癌症等疾病的发病率大大增加，并有年轻化的趋势。
传统的肿瘤和癌症的治疗，主要以放疗、化疗、手术为主；它们治疗的靶向目标是肿瘤细胞和组织；对一些良性肿瘤的治疗取得了不错的治疗效果，但是，对于一些恶性肿瘤或者的治疗效果却不太理想；对于一些免疫力较为低下的患者，也难以承受放疗、化疗等治疗所产生的副作用，限制了上述疗法的使用范围也影响了治疗效果。
免疫治疗是近年来治疗癌症和肿瘤的新兴的重要手段，在临床上与上述三种疗法对于肿瘤的治疗方向不同，免疫治疗是指针对机体低下或亢进的免疫状态，将自体的免疫细胞经体外刺激、培养、扩增然后回输来提高患者的免疫力，依靠自身免疫机能杀灭癌细胞和肿瘤组织；而且，免疫治疗作为目前新兴的治疗方法，它能够按照患者身体差异制备治疗药物和治疗方案，与现在的传统疗法相比，具有毒副作用较少，肿瘤针对性和特异性更强等优点，被认为是治疗肿瘤的新希望，目前已在一些肿瘤的治疗上取得了不错的效果，使人们恢复了健康。
免疫治疗中所用的人体免疫细胞的的免疫能力与人体健康状态息息相关，如果能将人体健康状态较好的免疫细胞保存下来，可以更好地用于抗肿瘤治疗，有利于取得更好的治疗效果；现在对于免疫细胞的有效的保存其活性的有效保存方法和冻存液还较少，急需有效的免疫细胞保存方法和细胞冻存液以保存免疫细胞。
发明内容
本发明目的在于提供一种免疫细胞的储存方法及细胞冻存液，本免疫细胞储存方法步骤简单、易于操作；尽管，目前，对于免疫细胞的培养保存主要都以自体血浆为主，而且，目前临床还是使用自体血清培养为主，对于异种血清和同种异体血浆的相关研究还较少；但是，自体血清数量有限，来源较少；而同种异体血清和异体血清来源广泛，更方便用于细胞储存，其中尤其作为异体血清的动物血清来源更为广泛，价格更为低廉，更适合作为将来用于免疫细胞培养储存使用。
本细胞冻存液能够很好地保护免疫细胞的各项性能，避免免疫细胞在冻存的过程中受到损伤，更好的起到保存免疫细胞的作用。
为了实现上述目标，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种免疫细胞冻存液，所述的免疫细胞冻存液按体积百分比包含以下组分：40％～75％1640培养基、20％～45％胎牛血清和8％～20％二甲基亚砜。
优选地，所述的免疫细胞冻存液按体积百分比包含以下组分：45％～65％1640培养基、25％～40％胎牛血清和10％～20％二甲基亚砜。
更优选地，所述的免疫细胞冻存液按体积百分比包含以下组分：50％～60％1640培养基、25％～35％胎牛血清和10％～15％二甲基亚砜。
优选地，所述的细胞冻存液的配制顺序为：首先，将一定比例的1640培养基和胎牛血清混合，摇匀，然后将所需体积的二甲基亚砜一滴一滴加入配好的1640-胎牛血清混合培养基中，边滴边摇，让三者充分混合，得到所需培养基。
一种免疫细胞培养方法，包含以下步骤：
S1.通过常规无菌操作抽取新鲜外周血(PBMC)，并将上述外周血与1640培养基进行对倍稀释摇匀，形成稀释液，再将稀释液与适量的淋巴细胞分离液混合；
S2.随后将上述混合液进行离心，使其形成分层，离心完成后，吸取白膜层中的单个核细胞，再补充适量的1640培养基，并打匀；
S3.将上述溶液进行离心，离心结束后，弃上清液，保留沉淀，并加入适量的1640培养基，并摇匀；
S4.随后将上述溶液进行离心，弃上清液，再次保留沉淀，并加入适量的1640培养基，并摇匀，并离心；
S5.离心结束后，弃上清液；往细胞沉淀中补充适量的1640培养基，摇匀；再吸取细胞悬浮液并用台盼蓝染料进行染色和计数；
S6.按照1*107/ml的细胞冻存密度，将外周血单个核细胞分装到冻存管当中，再往里加入权利要求1-2任一项所述的细胞冻存液，并摇匀；
S7.将冻存管放到程序冻存盒中降温，并在-80℃超低冰箱过夜；随后，再将冻存管转入液氮罐中冻存。
优选地，所述的离心要求为：
S2步骤的离心要求为2000rpm，20～22min，22℃，上下加速度均调为0；
S3步骤的离心要求为1500rpm，8～12min，4℃，上下加速度均调为9；
S4步骤的离心要求为1000rpm，3～7min，4℃，上下加速度均调为9；
优选地，所述的S1步骤中的外周血和培养基的稀释液与淋巴细胞分离液混合要求为将外周血与培养基的稀释液添加到淋巴细胞分离液中，添加时需将稀释液缓慢匀速滴加到淋巴细胞分离液之上，确保稀释液和淋巴细胞分离液形成明显分层。
更优选地，所述的稀释液和细胞分离液形成的分层，上层为血液稀释液，下层为淋巴细胞分离液。
优选地，所述的一种免疫细胞储存方法，还包括以下步骤：将复苏后的细胞悬液加入到装有一定体积的1640完全培养基的离心管中，1000rpm，10min，4℃离心计数，并按一定密度钟板或培养瓶，以培养细胞因子诱导的杀伤细胞和树突状细胞。
更优选地，所述的一种免疫细胞储存方法，还包括以下步骤：将复苏后的细胞悬液加入到装有一定体积的1640完全培养基的离心管中，1000rpm，10min，4℃离心计数，并按一定密度钟板或培养瓶，以培养树突状细胞。
优选地，所述的树突状细胞培养基为1640培养基、胎牛血清、谷氨酰胺、人类重组细胞因子、IL-4和TNF-α。
优选地，所述的人类重组细胞因子为GM-CSF。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
一种免疫细胞冻存液以体积百分比计，包含以下组分：41％1640培养基、22％胎牛血清和8％二甲基亚砜。
一种免疫细胞的储存方法，包含以下步骤：
S1.通过常规无菌操作抽取新鲜外周血(PBMC)，并将上述外周血与1640培养基进行对倍稀释摇匀，形成稀释液，再将5-9ml的稀释液与15ml的淋巴细胞分离液混合，上层为血液稀释液，下层为淋巴细胞分离液；
S2.随后将上述混合液进行离心(2000rpm，20min，22℃，上下加速度均调为0)，使其形成分层，离心完成后，吸取白膜层中的单个核细胞，再补充适量的1640培养基，并打匀；
S3.将上述溶液进行离心(1500rpm，10min，4℃，上下加速度均调为9)，离心结束后，弃上清液，保留沉淀，并加入适量的1640培养基，并摇匀；
S4.随后将上述溶液进行离心(1000rpm，5min，4℃，上下加速度均调为9)，弃上清液，再次保留沉淀，并加入适量的1640培养基，并摇匀，并离心；
S5.离心结束后，弃上清液；往细胞沉淀中补充适量的1640培养基，摇匀；再吸取细胞悬浮液并用台盼蓝染料进行染色和计数；
S6.按照1*107/ml的细胞冻存密度，将外周血单个核细胞分装到冻存管当中，再往里加入权利要求1-2任一项所述的细胞冻存液，并摇匀；
S7.将冻存管放到程序冻存盒中降温，并在-80℃超低冰箱过夜；随后，再将冻存管转入液氮罐中冻存。
实施例2
一种免疫细胞冻存液按体积百分比计，包含以下组分：75％1640培养基、40％胎牛血清和17％二甲基亚砜。
一种免疫细胞的储存方法，包含以下步骤：
S1.通过常规无菌操作抽取新鲜外周血(PBMC)，并将上述外周血与1640培养基进行对倍稀释摇匀，形成稀释液，再将9ml的稀释液与15ml的淋巴细胞分离液混合，上层为血液稀释液，下层为淋巴细胞分离液；
S2.随后将上述混合液进行离心(2000rpm，21min，22℃，上下加速度均调为0)，使其形成分层，离心完成后，吸取白膜层中的单个核细胞，再补充适量的1640培养基，并打匀；
S3.将上述溶液进行离心(1500rpm，8min，4℃，上下加速度均调为9)，离心结束后，弃上清液，保留沉淀，并加入适量的1640培养基，并摇匀；
S4.随后将上述溶液进行离心(1000rpm，3min，4℃，上下加速度均调为9)，弃上清液，再次保留沉淀，并加入适量的1640培养基，并摇匀，并离心；
S5.离心结束后，弃上清液；往细胞沉淀中补充适量的1640培养基，摇匀；再吸取细胞悬浮液并用台盼蓝染料进行染色和计数；
S6.按照1*107/ml的细胞冻存密度，将外周血单个核细胞分装到冻存管当中，再往里加入权利要求1-2任一项所述的细胞冻存液，并摇匀；
S7.将冻存管放到程序冻存盒中降温，并在-80℃超低冰箱过夜；随后，再将冻存管转入液氮罐中冻存。
实施例3
一种免疫细胞冻存液，按体积百分比计，包含以下组分：56％1640培养基、32％胎牛血清和12％二甲基亚砜。
一种免疫细胞的储存方法，包含以下步骤：
S1.通过常规无菌操作抽取新鲜外周血(PBMC)，并将上述外周血与1640培养基进行对倍稀释摇匀，形成稀释液，再将7ml的稀释液与15ml的淋巴细胞分离液混合，上层为血液稀释液，下层为淋巴细胞分离液；
S2.随后将上述混合液进行离心(2000rpm，22min，22℃，上下加速度均调为0)，使其形成分层，离心完成后，吸取白膜层中的单个核细胞，再补充适量的1640培养基，并打匀；
S3.将上述溶液进行离心(1500rpm，12min，4℃，上下加速度均调为9)，离心结束后，弃上清液，保留沉淀，并加入适量的1640培养基，并摇匀；
S4.随后将上述溶液进行离心(1000rpm，6min，4℃，上下加速度均调为9)，弃上清液，再次保留沉淀，并加入适量的1640培养基，并摇匀，并离心；
S5.离心结束后，弃上清液；往细胞沉淀中补充适量的1640培养基，摇匀；再吸取细胞悬浮液并用台盼蓝染料进行染色和计数；
S6.按照1*107/ml的细胞冻存密度，将外周血单个核细胞分装到冻存管当中，再往里加入权利要求1-2任一项所述的细胞冻存液，并摇匀；
S7.将冻存管放到程序冻存盒中降温，并在-80℃超低冰箱过夜；随后，再将冻存管转入液氮罐中冻存。
1.免疫细胞(树突状细胞)的存活率、得率和纯度
免疫细胞(树突状细胞)存活率＝d8天收获活细胞总数/d8天收获细胞总数*100％
免疫细胞(树突状细胞)得率＝d8收获免疫细胞总数/d0天种入外周血单个核细胞总数*100％
免疫细胞(树突状细胞)纯度＝d8天收获免疫细胞总数/d8天收获细胞总数*100％
使用台盼蓝排斥试验进行分别对冻存0.25、4、8和12个月的4个时间段8批细胞进行计数，免疫细胞(树突状细胞)的冻存和复苏情况如表1所示。
表1免疫细胞(树突状细胞)的冻存和复苏
从上表可以看出，本实施例采用的免疫细胞保存方法和细胞冻存液对于免疫细胞(树突状细胞)的冻存液较好的冻存效果，在0.25个月、4月、8个月时冻存细胞(树突状细胞)的复苏存活率均在90％以上，一年以上免疫细胞(树突状细胞)复苏存活率在85％以上；这表明本免疫细胞储存方法和细胞冻存液具有良好的免疫细胞保存作用，适宜用于相关免疫细胞的储存。
2.树突状细胞表型和捕获能力检测的情况
取实施例1-3培养的树突状细胞，3个实施例，每个实施例各取2组树突状细胞，对它们的表型和抗原捕获能力进行检测，检测情况如表2所示。
表2树突状细胞的表型和抗原能力捕获情况
从上表中可以看出树突状细胞的表型和捕获抗原能力等均符合相关要求，这表明上述实施例中免疫细胞储存方法和细胞冻存液均符合免疫细胞培养储存的相关要求，可以用于免疫细胞的保存。
3.对树突状细胞培养过程中的微生物状况进行检测
对树突状细胞培养过程中相关的微生物状况进行检测，以检测树突状细胞是否安全合格符合相关的微生物指标要求，相关结果如表3所示。
表3树突状细胞培养过程中的微生物情况
表3中的相关微生物检测数据显示在树突状细胞培养过程中未受到微生物污染，保持了较好的细胞培养环境，并且树突状细胞的安全情况合格符合相关的微生物指标要求。
4.冻存时间对微生物指标的影响
对冻存15天、1个月和3个月、6个月和8个月树突状细胞，分别进行各项微生物指标和可见异物进行检测，检测结果如表4所示
表4冻存时间对微生物指标的影响
| 冻存时间 | 细菌 | 支原体 | 真菌 | 内毒素 | 可见异物 |
| 15天 | 无 | 无 | 无 | 小于0.5EU/ml | 无可见异物 |
| 1个月 | 无 | 无 | 无 | 小于0.5EU/ml | 无可见异物 |
| 3个月 | 无 | 无 | 无 | 小于0.5EU/ml | 无可见异物 |
| 6个月 | 无 | 无 | 无 | 小于0.5EU/ml | 无可见异物 |
| 8个月 | 无 | 无 | 无 | 小于0.5EU/ml | 无可见异物 |
表4数据显示，实施例中的免疫细胞储存方法和细胞冻存液对于树突状细胞的保存起到了很好的效果，树突状细胞在经过长时间冻存后，复苏时各项微生物指标均符合要求。
5.对树突状细胞的表型性、得率和纯度的影响
参考相关文献的统计方法，将树突状细胞的存活率定义为收获的活的总细胞数/收获的总细胞数*100％；树突状细胞的纯度和得率，则以树突状细胞成熟分子树突状83+细胞作为树突状细胞的标记，即树突状细胞得率为收获树突状细胞时树突状83+细胞总数/d0天种入细胞总数*100％，树突状细胞纯度为收获树突状细胞时树突状83+细胞总数/收获树突状细胞时细胞总数*100％；本试验从上述3个实施例中各取2组冻存的PBMC培养至第9天的树突状细胞与新鲜的PBMC培养至第9天的树突状细胞的存活率、纯度和得率等相关指标进行检测分析，相关检测数据如表5、表6所示。
表5冻存PBMC细胞的存活率、得率和纯度
表6新鲜PBMC细胞的存活率、得率和纯度
由上述两表中对比可以看出，利用本免疫细胞保存方法和细胞冻存液，进行冻存后的PBMC较新鲜的PBMC的树突状细胞的存活率和得率，都有所下降，但影响不大，仍然高于判别标准，符合临床使用要求，且冻存的PBMC的树突状细胞的纯度较新鲜的PBMC明显升高；纯度更好，这表明本实施的免疫细胞储存方法和细胞冻存液符合要求。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种免疫细胞冻存液，其特征在于，所述的免疫细胞冻存液按体积百分比包含以下组分：40％～75％1640培养基、20％～45％胎牛血清和8％～20％二甲基亚砜。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述的免疫细胞冻存液按体积百分比包含以下组分：45％～65％1640培养基、25％～40％胎牛血清和10％～20％二甲基亚砜。
3.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述的细胞冻存液的配制顺序为：首先，将一定比例的1640培养基和胎牛血清混合，摇匀，然后将所需体积的二甲基亚砜一滴一滴加入配好的1640-胎牛血清混合培养基中，边滴边摇，让三者充分混合，得到所需培养基。
4.一种免疫细胞储存方法，其特征在于，包含以下步骤：
S1.通过常规无菌操作抽取新鲜外周血，并将上述外周血与1640培养基进行对倍稀释摇匀，形成稀释液，再将稀释液与适量的淋巴细胞分离液混合；
S2.随后将上述混合液进行离心，使其形成分层，离心完成后，吸取白膜层中的单个核细胞，再补充适量的1640培养基，并打匀；
S3.将上述溶液进行离心，离心结束后，弃上清液，保留沉淀，并加入适量的1640培养基，并摇匀；
S4.随后将上述溶液进行离心，弃上清液，再次保留沉淀，并加入适量的1640培养基，并摇匀，并离心；
S5.离心结束后，弃上清液；往细胞沉淀中补充适量的1640培养基，摇匀；再吸取细胞悬浮液并用台盼蓝染料进行染色和计数；
S6.按照1*107/ml的细胞冻存密度，将外周血单个核细胞分装到冻存管当中，再往里加入权利要求1-2任一项所述的细胞冻存液，并摇匀；
S7.将冻存管放到程序冻存盒中降温，并在-80℃超低冰箱过夜；随后，再将冻存管转入液氮罐中冻存。
5.根据权利要求4所述的一种免疫细胞储存方法，其特征在于，所述的离心要求为：
S2步骤的离心要求为2000rpm，20～22min，22℃，上下加速度均调为0；
S3步骤的离心要求为1500rpm，8～12min，4℃，上下加速度均调为9；
S4步骤的离心要求为1000rpm，3～7min，4℃，上下加速度均调为9。
6.根据权利要求4所述的一种免疫细胞储存方法，其特征在于，所述的S1步骤中的外周血和培养基的稀释液与淋巴细胞分离液混合要求为将外周血与培养基的稀释液添加到淋巴细胞分离液中，添加时需将稀释液缓慢匀速滴加到淋巴细胞分离液之上，确保稀释液和淋巴细胞分离液形成明显分层。
7.根据权利要求4所述的一种免疫细胞储存方法，其特征在于，还包括以下步骤：将复苏后的细胞悬液加入到装有一定体积的1640完全培养基的离心管中，1000rpm，10min，4℃离心计数，并按一定密度钟板或培养瓶，以培养细胞因子诱导的杀伤细胞和树突状细胞。
8.根据权利要求7所述的一种免疫细胞储存方法，其特征在于，所述的树突状细胞培养基为1640培养基、胎牛血清、谷氨酰胺、人类重组细胞因子、IL-4和TNF-α。
9.根据权利要求8所述的一种免疫细胞储存方法，其特征在于，所述的人类重组细胞因子为GM-CSF。
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