CN109792984A - 一种用于细胞体外培养的细胞冻存培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于细胞体外培养的细胞冻存培养基及其应用。该细胞冻存培养基由胎牛血清、二甲基亚砜和纤维蛋白原组成。本发明通过实验证明将纤维蛋白原添加到现有的细胞冻存液中，能够显著降低细胞冻存损伤，显著提高冻存细胞存活率，如显著提高淋巴细胞的冻存存活率。本发明可用于哺乳动物细胞如哺乳动物淋巴细胞的体外培养中，可用于药物先导化合物筛选、药效评价和重组蛋白类药物的生产中。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域中一种用于细胞体外培养的细胞冻存培养基及其应用。
背景技术
在药品研发和生产中，体外细胞培养是进行药物先导化合物筛选、药效评价和生产重组蛋白类药物所必需的技术。在细胞体外培养技术体系中，细胞冻存是长期保存细胞必不可少的方法。
目前细胞冻存常用的细胞冻存液是含5％-15％甘油或二甲基亚砜的牛血清，甘油和二甲基亚砜作为保护剂可以降低细胞冻存液的凝固点，同时通过慢冻快融的冻存复苏操作，可以减少细胞内冰晶形成和细胞的损伤，达到较好的细胞冻存效果(American Journalof Physiology,1984,247,C125-C142)。一般经过冻存的细胞，细胞存活率可以达到70-80％以上。但是对于离体培养存活困难的免疫细胞，尤其是淋巴细胞，对于细胞冻存中的损伤更为敏感，细胞经过冻存后存活率往往只能达到50％。在肿瘤免疫治疗中，经过遗传学改造的淋巴细胞极为珍贵，为了进一步提高冻存淋巴细胞的存活率，有必要进一步改进细胞冻存，特别是细胞冻存液配方。
纤维蛋白原是人体和动物血浆中的重要成份，在血液凝固过程中，发挥血小板之间的连接作用，并且在凝血酶的作用下，变成纤维蛋白加固血栓的形成，促进止血或病理性血栓形成。在血液凝固后的血清中，一般没有纤维蛋白原存在。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高冻存细胞(如淋巴细胞)的存活率。
为了解决上述技术问题，本发明提供了细胞冻存培养基。
本发明所提供的细胞冻存培养基，由胎牛血清、二甲基亚砜和纤维蛋白原组成。
上述细胞冻存培养基中，所述纤维蛋白原在所述细胞冻存培养基中的含量可为0.5-10.0mg/ml。
上述细胞冻存培养基中，所述纤维蛋白原在所述细胞冻存培养基中的含量可为1.0-5.0mg/ml。
上述细胞冻存培养基中，所述胎牛血清和所述二甲基亚砜的体积比可为9:1。
上述细胞冻存培养基中的胎牛血清、二甲基亚砜和纤维蛋白原可分别独立包装，也可混合在一起。
上述细胞冻存培养基中，所述细胞冻存培养基可为细胞冻存液或用于细胞冻存的组合物。
上述细胞冻存培养基中，所述细胞可为哺乳动物细胞、哺乳动物免疫细胞或哺乳动物淋巴细胞。
纤维蛋白原在制备细胞冻存培养基中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述细胞冻存培养基含有纤维蛋白原。
上述应用中，所述细胞冻存培养基可为上述细胞冻存培养基。
纤维蛋白原或上述细胞冻存培养基在提高冻存细胞存活率中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述细胞可为哺乳动物细胞、哺乳动物免疫细胞或哺乳动物淋巴细胞。
上文中，所述纤维蛋白原可为哺乳动物来源的纤维蛋白原，如来自人血浆的纤维蛋白原。
本发明经过广泛的筛选，发现将纤维蛋白原添加到现有的细胞冻存液中，能够显著降低细胞冻存损伤，显著提高冻存细胞的存活率，如显著提高淋巴细胞的冻存存活率。本发明可用于哺乳动物细胞如哺乳动物淋巴细胞的体外培养中，本发明可用于药物先导化合物筛选、药效评价和重组蛋白类药物的生产中。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
动物：雄性BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
试剂：胎牛血清(货号：35-076-CV)，购自美国Corning公司；下述实施例中的纤维蛋白原为来自人血浆的纤维蛋白原(Fibrinogen from human plasma)(货号：F3879)、二甲基亚砜(货号：V900090)、白蛋白(货号：A9731)、转铁蛋白(货号：T0665)、C反应蛋白(货号：C1617)、铜蓝蛋白(货号：C4519)、卵清蛋白(货号：A5503)、乳清蛋白(货号：L-045)和硫酸鱼精蛋白(货号：P4380)，购自美国Sigma-Aldrich公司；RPMI1640培养基(货号：11875-093)，购自美国Thermo Fisher公司；红细胞裂解液(货号：CC051)，购自中科迈晨科技有限公司；重组小鼠白细胞介素-2(货号：212-12-5)，购自美国Peprotech公司；细胞凋亡检测试剂盒(货号：640932)，购自美国Biolegend公司；其它化学试剂，购自北京化工厂。
仪器：3111二氧化碳培养箱，购自美国Thermo Electron公司；CKX41倒置光学显微镜，购自日本Olympus公司；FACSCantoⅡ流式细胞仪，购自美国BD公司。
以下将结合实施例对发明作进一步说明，但并不限制本发明的范围。
实施例1、利用含有纤维蛋白原的细胞冻存液冻存哺乳动物淋巴细胞
1.制备小鼠脾脏淋巴细胞
通过颈椎脱臼处死BALB/c小鼠，75％乙醇溶液浸泡5分钟，然后在超净工作台无菌取小鼠脾脏，在滴加磷酸盐缓冲液(PBS)的同时，利用5ml注射器内芯研磨制备脾脏细胞悬液，并利用40μm孔径无菌尼龙滤网过滤细胞制备单细胞悬液；250g离心5分钟后，弃去上清，然后加入10ml红细胞裂解液裂解红细胞，再经过离心和RPMI 1640培养基洗涤，得到小鼠脾脏淋巴细胞。
2.制备细胞冻存液
本实施例提供了7种细胞冻存液，这7种细胞冻存液分别为0mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液(对照细胞冻存液)、0.25mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液、0.50mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液、1.00mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液、2.50mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液、5.00mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液和10.00mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液。
0mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液(对照细胞冻存液)由胎牛血清和二甲基亚砜组成。该0mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液中，胎牛血清和二甲基亚砜的体积比为9:1。
0.25mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液由胎牛血清、二甲基亚砜和纤维蛋白原组成。该0.25mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液中，胎牛血清和二甲基亚砜的体积比为9:1，纤维蛋白原的含量为0.25mg/ml。
0.50mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液由胎牛血清、二甲基亚砜和纤维蛋白原组成。该0.50mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液中，胎牛血清和二甲基亚砜的体积比为9:1，纤维蛋白原的含量为0.50mg/ml。
1.00mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液由胎牛血清、二甲基亚砜和纤维蛋白原组成。该1.00mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液中，胎牛血清和二甲基亚砜的体积比为9:1，纤维蛋白原的含量为1.00mg/ml。
2.50mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液由胎牛血清、二甲基亚砜和纤维蛋白原组成。该2.50mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液中，胎牛血清和二甲基亚砜的体积比为9:1，纤维蛋白原的含量为2.50mg/ml。
5.00mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液由胎牛血清、二甲基亚砜和纤维蛋白原组成。该5.00mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液中，胎牛血清和二甲基亚砜的体积比为9:1，纤维蛋白原的含量为5.00mg/ml。
10.00mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液由胎牛血清、二甲基亚砜和纤维蛋白原组成。该10.00mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液中，胎牛血清和二甲基亚砜的体积比为9:1，纤维蛋白原的含量为10.00mg/ml。
3.利用细胞冻存液冻存小鼠脾脏淋巴细胞
按照如下方法分别用步骤2的7种细胞冻存液分别冻存步骤1的小鼠脾脏淋巴细胞：
将细胞冻存液加入步骤1的小鼠脾脏淋巴细胞中，重悬细胞，并调整浓度至1000万个细胞/ml，得到由细胞冻存液和小鼠脾脏淋巴细胞组成的混合物；再将该细胞冻存液和小鼠脾脏淋巴细胞组成的混合物转移到2ml冻存管中，每管1ml细胞冻存液和小鼠脾脏淋巴细胞组成的混合物，放入4℃冰箱放置20分钟，-20℃冰箱放置20分钟，-70℃冰箱放置20分钟，然后转移到液氮中冻存3天。实验设三次重复，每次重复每个处理设3个冻存管。
4.冻存结果
液氮中冻存3天后从液氮中取出冻存管，在37℃水浴中迅速化冻，然后离心去除细胞冻存液并利用RPMI 1640培养基洗涤细胞；利用RPMI 1640完全培养基调整细胞浓度至100万个细胞/ml，接种到24孔无菌组织培养板中，1ml/孔，再添加白细胞介素-2至终浓度为10ng/ml，37℃细胞培养箱孵育3小时；收集细胞到2ml离心管中，离心去除培养基后，利用凋亡检测缓冲液重悬细胞，按照细胞凋亡检测试剂盒说明加入FITC-Annexin V和PI染色，最后利用流式细胞仪检测细胞存活率。
流式细胞分析结果表明，与0mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液(对照细胞冻存液)相比，0.50mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液、1.00mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液、2.50mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液、5.00mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液和10.00mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液均能高显著提高小鼠脾脏淋巴细胞的存活率(表1)。说明纤维蛋白原加入对照细胞冻存液中在很大浓度范围内都能够提高脾脏淋巴细胞冻存后的存活率，当纤维蛋白原达到1.00mg/ml至5.00mg/ml浓度时，能够最大程度提高冻存细胞存活率。
表1.用7种细胞冻存液冻存小鼠脾脏淋巴细胞的细胞存活率
| 细胞冻存液 | 细胞存活率(％) |
| 0mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液 | 53.6±2.5# |
| 0.25mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液 | 57.3±2.3# |
| 0.50mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液 | 65.4±3.1*# |
| 1.00mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液 | 81.2±1.8* |
| 2.50mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液 | 83.2±2.7* |
| 5.00mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液 | 82.3±1.9* |
| 10.00mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液 | 75.4±3.4*# |
注：细胞存活率由平均值±标准差表示，利用One way ANOVA和Dunnett’s posthoc test进行统计分析。*P<0.05vs0mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液；#P<0.05vs 2.50mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液。
实施例2、含纤维蛋白原的细胞冻存液对冻存不同时间细胞的存活率的影响
1.制备小鼠脾脏淋巴细胞
通过颈椎脱臼处死BALB/c小鼠，75％乙醇溶液浸泡5分钟，然后在超净工作台无菌取小鼠脾脏，在滴加磷酸盐缓冲液(PBS)的同时，利用5ml注射器内芯研磨制备脾脏细胞悬液，并利用40μm孔径无菌尼龙滤网过滤细胞制备单细胞悬液；250g离心5分钟后，弃去上清，然后加入10ml红细胞裂解液裂解红细胞，再经过离心和RPMI 1640培养基洗涤，得到小鼠脾脏淋巴细胞。
2.制备细胞冻存液
本实施例提供了2种细胞冻存液，这2种细胞冻存液分别为0mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液(对照细胞冻存液)和2.50mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液。
0mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液(对照细胞冻存液)由胎牛血清和二甲基亚砜组成。该0mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液中，胎牛血清和二甲基亚砜的体积比为9:1。
2.50mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液由胎牛血清、二甲基亚砜和纤维蛋白原组成。该2.50mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液中，胎牛血清和二甲基亚砜的体积比为9:1，纤维蛋白原的含量为2.50mg/ml。
3.利用细胞冻存液冻存小鼠脾脏淋巴细胞
按照如下方法分别用步骤2的2种细胞冻存液分别冻存步骤1的小鼠脾脏淋巴细胞1周、1月、2月、4月和8月：
将细胞冻存液加入步骤1的小鼠脾脏淋巴细胞中，重悬细胞，并调整浓度至1000万个细胞/ml，得到由细胞冻存液和小鼠脾脏淋巴细胞组成的混合物；再将该细胞冻存液和小鼠脾脏淋巴细胞组成的混合物转移到2ml冻存管中，每管1ml细胞冻存液和小鼠脾脏淋巴细胞组成的混合物，放入4℃冰箱放置20分钟，-20℃冰箱放置20分钟，-70℃冰箱放置20分钟，然后转移到液氮中分别冻存1周、1月、2月、4月和8月。实验设三次重复，每次重复每个处理设3个冻存管。
4.冻存结果
在液氮中分别冻存1周、1月、2月、4月和8月后从液氮中取出细胞，在37℃水浴中迅速化冻，然后离心去除细胞冻存液并利用RPMI 1640培养基洗涤细胞；利用RPMI1640完全培养基调整细胞浓度至100万个细胞/ml，接种到24孔无菌组织培养板中，1ml/孔，再添加白细胞介素-2至终浓度为10ng/ml，37℃细胞培养箱孵育3小时；收集细胞到2ml离心管中，离心去除培养基后，利用凋亡检测缓冲液重悬细胞，按照细胞凋亡检测试剂盒说明加入FITC-Annexin V和PI染色，最后利用流式细胞仪检测细胞存活率。
流式细胞分析结果表明，与0mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液(对照细胞冻存液)相比，2.50mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液在各种冻存时间都能够显著提高脾脏淋巴细胞冻存后的存活率(表2)，进一步验证了纤维蛋白原在细胞冻存液中防止细胞冻存损伤的重要作用。
表2.用2种细胞冻存液冻存小鼠脾脏淋巴细胞不同时间的细胞存活率
| 冻存时间 | 对照细胞冻存液的细胞存活率(％) | 2.50mg/ml纤维蛋白原细胞冻存液的细胞存活率(％) |
| 1周 | 54.6±1.5 | 83.6±3.5* |
| 1月 | 55.3±2.1 | 84.3±1.3* |
| 2月 | 52.4±3.3 | 79.3±1.9* |
| 4月 | 46.4±3.1 | 75.6±2.3* |
| 8月 | 41.4±1.9 | 73.0±2.8* |
注：细胞存活率由平均值±标准差表示，利用Student’s t test进行统计分析。*P<0.05vs对照细胞冻存液。
实施例3、各种蛋白成份配制的细胞冻存液对冻存细胞存活率的影响
1.制备小鼠脾脏淋巴细胞
通过颈椎脱臼处死BALB/c小鼠，75％乙醇溶液浸泡5分钟，然后在超净工作台无菌取小鼠脾脏，在滴加磷酸盐缓冲液(PBS)的同时，利用5ml注射器内芯研磨制备脾脏细胞悬液，并利用40μm孔径无菌尼龙滤网过滤细胞制备单细胞悬液；250g离心5分钟后，弃去上清，然后加入10ml红细胞裂解液裂解红细胞，再经过离心和RPMI 1640培养基洗涤，得到小鼠脾脏淋巴细胞。
2.制备细胞冻存液
本实施例提供了9种细胞冻存液，这9种细胞冻存液分别为对照细胞冻存液、白蛋白细胞冻存液、纤维蛋白原细胞冻存液、转铁蛋白细胞冻存液、C反应蛋白细胞冻存液、铜蓝蛋白细胞冻存液、卵清蛋白细胞冻存液、乳清蛋白细胞冻存液和硫酸鱼精蛋白细胞冻存液。
对照细胞冻存液由胎牛血清和二甲基亚砜组成。该对照细胞冻存液中，胎牛血清和二甲基亚砜的体积比为9:1。
白蛋白细胞冻存液由胎牛血清、二甲基亚砜和白蛋白组成。该白蛋白细胞冻存液中，胎牛血清和二甲基亚砜的体积比为9:1，白蛋白的含量为5.0mg/ml。
纤维蛋白原细胞冻存液由胎牛血清、二甲基亚砜和纤维蛋白原组成。该纤维蛋白原细胞冻存液中，胎牛血清和二甲基亚砜的体积比为9:1，纤维蛋白原的含量为5.0mg/ml。
转铁蛋白细胞冻存液由胎牛血清、二甲基亚砜和转铁蛋白组成。该转铁蛋白细胞冻存液中，胎牛血清和二甲基亚砜的体积比为9:1，转铁蛋白的含量为5.0mg/ml。
C反应蛋白细胞冻存液由胎牛血清、二甲基亚砜和C反应蛋白组成。该C反应蛋白细胞冻存液中，胎牛血清和二甲基亚砜的体积比为9:1，C反应蛋白的含量为5.0mg/ml。
铜蓝蛋白细胞冻存液由胎牛血清、二甲基亚砜和铜蓝蛋白组成。该铜蓝蛋白细胞冻存液中，胎牛血清和二甲基亚砜的体积比为9:1，铜蓝蛋白的含量为5.0mg/ml。
卵清蛋白细胞冻存液由胎牛血清、二甲基亚砜和卵清蛋白组成。该卵清蛋白细胞冻存液中，胎牛血清和二甲基亚砜的体积比为9:1，卵清蛋白的含量为5.0mg/ml。
乳清蛋白细胞冻存液由胎牛血清、二甲基亚砜和乳清蛋白组成。该乳清蛋白细胞冻存液中，胎牛血清和二甲基亚砜的体积比为9:1，乳清蛋白的含量为5.0mg/ml。
硫酸鱼精蛋白细胞冻存液由胎牛血清、二甲基亚砜和硫酸鱼精蛋白组成。该硫酸鱼精蛋白细胞冻存液中，胎牛血清和二甲基亚砜的体积比为9:1，硫酸鱼精蛋白的含量为5.0mg/ml。
3.利用细胞冻存液冻存小鼠脾脏淋巴细胞
按照如下方法分别用步骤2的9种细胞冻存液分别冻存步骤1的小鼠脾脏淋巴细胞：
将细胞冻存液加入步骤1的小鼠脾脏淋巴细胞中，重悬细胞，并调整浓度至1000万个细胞/ml，得到由细胞冻存液和小鼠脾脏淋巴细胞组成的混合物；再将该细胞冻存液和小鼠脾脏淋巴细胞组成的混合物转移到2ml冻存管中，每管1ml细胞冻存液和小鼠脾脏淋巴细胞组成的混合物，放入4℃冰箱放置20分钟，-20℃冰箱放置20分钟，-70℃冰箱放置20分钟，然后转移到液氮中冻存3天。实验设三次重复，每次重复每个处理设3个冻存管。
4.冻存结果
液氮中冻存3天后从液氮中取出冻存管，在37℃水浴中迅速化冻，然后离心去除细胞冻存液并利用RPMI 1640培养基洗涤细胞；利用RPMI 1640完全培养基调整细胞浓度至100万个细胞/ml，接种到24孔无菌组织培养板中，1ml/孔，再添加白细胞介素-2至终浓度为10ng/ml，37℃细胞培养箱孵育3小时；收集细胞到2ml离心管中，离心去除培养基后，利用凋亡检测缓冲液重悬细胞，按照细胞凋亡检测试剂盒说明加入FITC-Annexin V和PI染色，最后利用流式细胞仪检测细胞存活率。
流式细胞分析结果表明，与对照细胞冻存液相比，纤维蛋白原细胞冻存液能够显著提高脾脏淋巴细胞冻存后的存活率，而白蛋白细胞冻存液、转铁蛋白细胞冻存液、C反应蛋白细胞冻存液、铜蓝蛋白细胞冻存液、卵清蛋白细胞冻存液、乳清蛋白细胞冻存液和硫酸鱼精蛋白细胞冻存液均不能显著提高脾脏淋巴细胞冻存后的存活率(表3)。说明纤维蛋白原能够显著提高脾脏淋巴细胞冻存后的存活率。
表3.9种细胞冻存液对冻存细胞存活率的影响
| 细胞冻存液 | 细胞存活率(％) |
| 对照细胞冻存液 | 53.9±2.7 |
| 白蛋白细胞冻存液 | 52.6±2.3 |
| 纤维蛋白原细胞冻存液 | 82.5±2.3* |
| 转铁蛋白细胞冻存液 | 53.7±2.5 |
| C反应蛋白细胞冻存液 | 55.3±3.8 |
| 铜蓝蛋白细胞冻存液 | 53.1±3.1 |
| 卵清蛋白细胞冻存液 | 54.3±2.4 |
| 乳清蛋白细胞冻存液 | 53.3±2.7 |
| 硫酸鱼精蛋白细胞冻存液 | 52.3±2.9 |
注：细胞存活率由平均值±标准差表示，利用One way ANOVA和Dunnett’s posthoc test进行统计分析。*P<0.05vs对照细胞冻存液。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.细胞冻存培养基，其特征在于：所述细胞冻存培养基由胎牛血清、二甲基亚砜和纤维蛋白原组成。
2.根据权利要求1所述的细胞冻存培养基，其特征在于：所述纤维蛋白原在所述细胞冻存培养基中的含量为0.50-10.00mg/ml。
3.根据权利要求2所述的细胞冻存培养基，其特征在于：所述纤维蛋白原在所述细胞冻存培养基中的含量为1.00-5.00mg/ml。
4.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的细胞冻存培养基，其特征在于：所述细胞冻存培养基中，所述胎牛血清和所述二甲基亚砜的体积比为9:1。
5.根据权利要求1-4中任一权利要求所述的细胞冻存培养基，其特征在于：所述细胞冻存培养基为细胞冻存液或用于细胞冻存的组合物。
6.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的细胞冻存培养基，其特征在于：所述细胞为哺乳动物细胞、哺乳动物免疫细胞或哺乳动物淋巴细胞。
7.纤维蛋白原在制备细胞冻存培养基中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述细胞冻存培养基为权利要求1-6中任一权利要求所述的细胞冻存培养基。
9.纤维蛋白原或权利要求1-5中任一权利要求所述的细胞冻存培养基在提高冻存细胞存活率中的应用。
10.根据权利要求7-9中任一权利要求所述的应用，其特征在于：所述细胞为哺乳动物细胞、哺乳动物免疫细胞或哺乳动物淋巴细胞。
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