CN105941390B - 一种牙髓或牙髓干细胞的冻存液及其冻存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种牙髓或牙髓干细胞的冻存液及其冻存方法。该冻存液包括DMSO、右旋糖酐和无血清培养基。采用本发明提供的冻存液能够显著提高牙髓干细胞的活力，增强牙髓干细胞的增殖能力。

Description

一种牙髓或牙髓干细胞的冻存液及其冻存方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种牙髓或牙髓干细胞的冻存液及其冻存方法。
背景技术
牙周炎是累及四种牙周支持组织(牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质)的慢性感染性疾病，往往引发牙周支持组织的炎性破坏。在35岁以后较为多见。常见病因为菌斑、牙石、创伤性咬合、食物嵌塞、不良修复体、口呼吸等。牙周炎具有四大特征，即牙周袋形成、袋壁的炎症、牙槽骨吸收、牙齿逐渐松动。严重的牙周炎会造成牙齿脱落，从而导致咀嚼功能低下而引起消化不良及胃肠病，影响全身心的健康。
治疗牙周炎的主要在于消除炎症，促进被破坏的牙周组织的再生，恢复牙齿的正常功能。临床常采用的牙周炎治疗方法包括：牙周基础治疗(洁治、刮治、根面平整)、牙周翻瓣术及牙周组织再生术。
牙周基础治疗：洁治，也称洁牙，俗称洗牙，其是预防和治疗牙病的一种方法。即用洁治器械清除龈上牙石、菌斑和牙面上附着的色素，并抛光牙面，是防止菌斑和牙石再沉积，防治牙周病的措施。在洁治时还应该将龈沟内与龈上牙石相连的一部分龈下牙石也一并清除掉。根据所用的器械不同，龈上洁治术分为手用器械洁治法和超声波洁牙机洁治法。对于牙龈炎患者，每6～12个月作一次洁治，可有效地维护牙周健康。龈下刮治术，即根面平整术，其是用手工的龈下刮治器械伸入牙周袋内去除附着于牙周袋内根面上和嵌入牙骨质内的龈下牙石和菌斑，并刮除牙根表面受到毒素污染的病变牙骨质，从而形成光滑、清洁的根面，使根面具有生物相容的表面，有利于牙周组织的附着和新生。根面平整术不应用于健康牙周部位，以免导致牙周附着丧失。
牙周翻瓣术：指采用不同的手术切口，将牙龈与下方的组织分离，形成牙龈组织瓣，暴露病变区的根面和牙槽骨，提供清创入路和可视性。刮除病变组织和菌斑牙石后，将牙龈瓣复位在合适的位置上并缝合，达到消除牙周袋或使牙周袋变浅的目的。
牙周组织再生术：在已经缺失的牙槽骨区植入人工骨，并覆盖专用的生物引导膜，使牙周膜上的细胞选择性地在根面上生长，从而达到牙周膜、牙槽骨和牙骨质的再生。通过这种骨植和生物膜的技术，恢复已经破坏的牙槽骨、牙龈及其他的牙周组织，完成牙齿的重新稳定。
以上方法无法修复损伤的牙周附着及牙槽组织，不能满足目前临床上对口腔颌面部组织缺损修复再生及功能、外形恢复的要求，其次牙周炎治疗通过抗生素来控制菌斑生长，进行全身和局部的药物治疗。但抗生素副作用较多，病原微生物也会产生耐药性。
牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是存在于牙齿牙髓组织中的一类具有自我更新、增殖能力强，及多向分化能力的间充质干细胞。牙髓干细胞具有多向分化的潜能，它除了能形成矿化结节能力的细胞外，经过不同细胞因子的诱导，还能够分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、神经等细胞系类型。据报道，牙髓干细胞在牙周炎治疗中可起到很好的修复作用，作用机制为：通过植入局部并分化为缺损细胞，分泌细胞因子，趋化干细胞到局部，抑制局部炎症，促进局部血管新生。
在牙髓干细胞的临床应用中涉及到牙髓干细胞的冻存技术，细胞冻存是将37℃生长培养的细胞，添加营养成分及防冻保护剂DMSO，通过逐渐降温的方式将细胞长期超低温冻存于液氮中的过程。当细胞迅速解冻到常温过程，依然可以恢复细胞的活性与保持良好的生物学特征。
专利公开号为CN 103563888A的中国专利公开了一种牙髓干细胞的冻存方法，具体为：采集30岁以下完整无损的人或动物的牙齿，放置于4℃预冷的含双抗的无血清培养基中保存；用含双抗的生理盐水去除牙齿表面的污垢；配制牙髓冻存液：8％的人血白蛋白、10％的二甲基亚砜、5.1％的右旋糖酐-40和4.25％的葡萄糖。用无菌钳将牙齿根尖部分切开；至少切开一个小口即可，将牙齿放置在装有4℃预冷牙髓冻存液的冻存管中，使牙齿完全浸没于冻存液中。将冻存管放置在程序冻存盒中(装有异丙醇)；随后放置-80℃冰箱进行长期保存。
专利号为US20130217123的美国专利公开了一种牙髓干细胞的冻存方法，具体为：采集30岁以下完整无损的人或动物的牙齿，放置于4℃预冷的含双抗的无血清培养基中保存；用含双抗的生理盐水去除牙齿表面的污垢；配制牙髓冻存液：10％的二甲基亚砜、90％地塞米松。用无菌钳将牙齿根尖部分切开；至少切开一个小口即可，将牙齿放置在装有4℃预冷牙髓冻存液的冻存管中，使牙齿完全浸没于冻存液中。将冻存管放置在程序冻存盒中(装有异丙醇)；随后放置-80℃冰箱进行长期保存6个月。
但上述冻存液在细胞的冻存过程中还是会无法避免地对牙髓干细胞造成一定的损伤，无法保证干细胞的活力，细胞增值率较低，影响干细胞的临床利用。因此，需要开发一种能够更好地维持牙髓间充质干细胞活力的冻存液及其冻存方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种牙髓或牙髓干细胞的冻存液及其冻存方法。该冻存液能够显著提高牙髓干细胞的活力，增强牙髓干细胞的增殖能力。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种牙髓或牙髓干细胞的冻存液，包括DMSO、右旋糖酐和无血清培养基。
作为优选，冻存液中各组分用量为：DMSO的体积百分含量为5％～15％，右旋糖酐为0.005～0.02g/mL，无血清培养基补足。
在本发明提供的一些实施例中，冻存液中各组分用量为：DMSO的体积百分含量为10％，右旋糖酐为0.01g/mL，无血清培养基补足。
在本发明提供的另一些实施例中，冻存液中各组分用量为：DMSO的体积百分含量为5％，右旋糖酐为0.02g/mL，无血清培养基补足。
在本发明提供的另一些实施例中，冻存液中各组分用量为：DMSO的体积百分含量为15％，右旋糖酐为0.005g/mL，无血清培养基补足。
本发明还提供了一种牙髓或牙髓干细胞的冻存方法，采用本发明提供的冻存液冻存牙髓或牙髓干细胞；该冻存液包括DMSO、右旋糖酐和无血清培养基；作为优选，冻存液中各组分用量为：DMSO的体积百分含量为5％～15％，右旋糖酐为0.005～0.02g/mL，无血清培养基补足。
作为优选，冻存的温度为-80℃～-185℃。
作为优选，冻存方法具体为：去除牙齿根尖部分，将去除根尖的牙齿放置于预冷的冻存液中进行冻存。
作为优选，牙齿根尖部分为距根尖1～2mm范围内的牙齿组织。
作为优选，预冷的温度为0～5℃。
在本发明提供的一些实施例中，预冷的温度为4℃。
本发明提供了一种牙髓或牙髓干细胞的冻存液及其冻存方法。该冻存液包括DMSO、右旋糖酐和无血清培养基。本发明的有益效果为：采用本发明提供的冻存液能够显著提高牙髓干细胞的活力，增强牙髓干细胞的增殖能力。
附图说明
图1示试验组牙髓干细胞原代培养7天后细胞形态图，其中，a为40倍；b为100倍；
图2示试验组牙髓干细胞流式检测结果；其中图2-1、2-2、2-3为对照组流式鉴定结果，2-1示空白对照，2-2示CD59、HLA-DR的表达情况，2-3示CD90、CD45的表达情况；图2-4、2-5、2-6为样品组流式鉴定结果，2-4示空白对照，2-5示CD59、HLA-DR的表达情况，2-6示CD90、CD45的表达情况；
图3示试验组P3代牙髓干细胞诱导成骨分化鉴定结果；其中，3-1示未诱导组，3-2示诱导组；
图4示试验组P3代牙髓干细胞诱导成脂分化鉴定结果；其中，4-1示未诱导组，4-2示诱导组。
具体实施方式
本发明公开了一种牙髓或牙髓干细胞的冻存液及其冻存方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的牙髓或牙髓干细胞的冻存液及其冻存方法中所用生物材料或试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
(一)牙髓的冻存
实验分为试验组和对照组：
1、试验组牙髓的冻存：采集30岁以下完整无损的人或动物的牙齿，放置于4℃预冷的含双抗的无血清培养基中保存；用含双抗的生理盐水去除牙齿表面的污垢；配制牙髓冻存液：10％(体积百分数)DMSO；1％(0.01g/mL)右旋糖酐；其余为无血清培养基；用无菌钳将牙齿根尖部分切开；至少切开一个小口即可，将牙齿放置在装有4℃预冷牙髓冻存液的冻存管中，使牙齿完全浸没于冻存液中。将冻存管放置在程序冻存盒中(装有异丙醇)；随后放置-80℃冰箱进行长期保存6个月。
2、对照组1牙髓的冻存(根据专利CN 103563888A的方法进行冻存)：
采集30岁以下完整无损的人或动物的牙齿，放置于4℃预冷的含双抗的无血清培养基中保存；用含双抗的生理盐水去除牙齿表面的污垢；配制牙髓冻存液：8％的人血白蛋白、10％的二甲基亚砜、5.1％的右旋糖酐-40和4.25％的葡萄糖。用无菌钳将牙齿根尖部分切开；至少切开一个小口即可，将牙齿放置在装有4℃预冷牙髓冻存液的冻存管中，使牙齿完全浸没于冻存液中。将冻存管放置在程序冻存盒中(装有异丙醇)；随后放置-80℃冰箱进行长期保存6个月。
3、对照组2牙髓的冻存(根据专利US20130217123的方法进行冻存)：
采集30岁以下完整无损的人或动物的牙齿，放置于4℃预冷的含双抗的无血清培养基中保存；用含双抗的生理盐水去除牙齿表面的污垢；配制牙髓冻存液：10％的二甲基亚砜、90％地塞米松。用无菌钳将牙齿根尖部分切开；至少切开一个小口即可，将牙齿放置在装有4℃预冷牙髓冻存液的冻存管中，使牙齿完全浸没于冻存液中。将冻存管放置在程序冻存盒中(装有异丙醇)；随后放置-80℃冰箱进行长期保存6个月。
(二)牙髓的复苏过程
将牙髓冻存管放置在37℃-40℃的水中进行快速解冻复苏；取出牙齿，放置在20-50体积的PBS中清洗牙齿2-3次后，迅速的将牙齿切开，取出牙髓(试验组与对照组取出的牙髓组织体积大小相同)，用0.3％的I型胶原酶与0.1％中性蛋白酶联合作用牙髓组织30-60min，随后以1000-1500rpm离心5-10min；收集细胞沉淀；用无血清培养基重悬；计算细胞总量及细胞活力，并按照2000细胞/cm2-10000细胞/cm2接种于培养皿或培养孔中，加入bFGF、FGF(终浓度均为10ng/mL)，放置CO2培养箱，以37℃、5％CO2、95％的湿度培养5-8天时间；待细胞汇合度达到80-90％左右；用0.125％胰蛋白酶消化细胞，随后以1000-1500rpm离心5-10min；收集细胞，进行扩增培养。
试验组培养的细胞形态见图1。
由图1可知，细胞为贴壁生长，呈现长梭状生长，符合干细胞形态特征。对照组细胞形态与试验组细胞形态相近，符合干细胞形态特征。
细胞总量及细胞活力数据见表1。
表1细胞总量及细胞活力数据
组别 试验组 对照组1 对照组2
细胞总量 15×104 12×104 13.5×104
细胞活力 85％ 72％ 76％
如表1可知，试验组所分离得到的牙髓干细胞总量与活力均高于对照组。
(三)流式细胞仪检测牙髓细胞表面标志
消化收集试验组细胞，计数后每管加入2×105细胞数，染色缓冲液洗1次，1000rpm离心5min；弃上清，用染色缓冲液吹打混匀细胞；加入CD45、CD59、CD90及HLA-DR抗体各2μL，并设一管为空白对照；在4℃下，避光反应15-20min；染色缓冲液洗一次，1000rpm离心5min；直接标记的细胞弃上清，避光加入500μL的上样缓冲液，混匀，用200目筛网过滤细胞样品，流式细胞仪检测细胞表面抗原。流式结果见图2。
由图2可知，牙髓干细胞表面标志CD45(白细胞阳性)、HLA-DR(MHC-II类分子)为均呈现阴性，同时乳牙牙髓干细胞表面标记物CD59、CD90均呈现阳性。第三代牙髓干细胞细胞形态均一。
(四)P3代细胞诱导成骨分化鉴定
方法为：试验组细胞培养至第2代时，按照1×103细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基培养24h后，加入成骨诱导培养基进行诱导培养，每隔2-3天换液，28天后进行茜素红染色，结果见图3。
(五)P3代细胞诱导成脂分化鉴定
方法为：试验组细胞培养至第2代时，按照1×103细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基，24h后，加入成脂诱导培养基进行培养。成脂诱导培养基包括基础培养基DMEM、10％胎牛血清、0.5mM IBMX、1μM地塞米松、100μM吲哚美辛、5μg/mL胰岛素、2mmol/L谷氨酰胺等。每三天换液。二周后进行油红O染色，鉴定脂滴形成情况，结果见图4。
实施例2
(一)牙髓的冻存
实验分为试验组和对照组：
1、试验组牙髓的冻存：采集30岁以下完整无损的人或动物的牙齿，放置于4℃预冷的含双抗的无血清培养基中保存；用含双抗的生理盐水去除牙齿表面的污垢；配制牙髓冻存液：5％DMSO；2％(0.02g/mL)右旋糖酐；其余为无血清培养基；用无菌钳将牙齿根尖部分切开；至少切开一个小口即可，将牙齿放置在装有4℃预冷牙髓冻存液的冻存管中，使牙齿完全浸没于冻存液中。将冻存管放置在程序冻存盒中(装有异丙醇)；随后放置-80℃冰箱进行长期保存6个月。
2、对照组牙髓的冻存(根据专利CN 103563888A的方法进行冻存)：
采集30岁以下完整无损的人或动物的牙齿，放置于4℃预冷的含双抗的无血清培养基中保存；用含双抗的生理盐水去除牙齿表面的污垢；配制牙髓冻存液：8％的人血白蛋白、10％的二甲基亚砜、5.1％的右旋糖酐-40和4.25％的葡萄糖。用无菌钳将牙齿根尖部分切开；至少切开一个小口即可，将牙齿放置在装有4℃预冷牙髓冻存液的冻存管中，使牙齿完全浸没于冻存液中。将冻存管放置在程序冻存盒中(装有异丙醇)；随后放置-80℃冰箱进行长期保存6个月。
3、对照组2牙髓的冻存(根据专利US20130217123的方法进行冻存)：
采集30岁以下完整无损的人或动物的牙齿，放置于4℃预冷的含双抗的无血清培养基中保存；用含双抗的生理盐水去除牙齿表面的污垢；配制牙髓冻存液：10％的二甲基亚砜、90％地塞米松。用无菌钳将牙齿根尖部分切开；至少切开一个小口即可，将牙齿放置在装有4℃预冷牙髓冻存液的冻存管中，使牙齿完全浸没于冻存液中。将冻存管放置在程序冻存盒中(装有异丙醇)；随后放置-80℃冰箱进行长期保存6个月。
(二)牙髓的复苏过程
将牙髓冻存管放置在37℃-40℃的水中进行快速解冻复苏；取出牙齿，放置在20-50体积的PBS中清洗牙齿2-3次后，迅速的将牙齿切开，取出牙髓(试验组与对照组取出的牙髓组织体积大小相同)，用0.3％的I型胶原酶与0.1％中性蛋白酶联合作用牙髓组织30-60min，随后以1000-1500rpm离心5-10min；收集细胞沉淀；用无血清培养基重悬；计算细胞总量及细胞活力，并按照2000细胞/cm2-10000细胞/cm2接种于培养皿或培养孔中，加入bFGF、FGF(终浓度均为10ng/mL)，放置CO2培养箱，以37℃、5％CO2、95％的湿度培养5-8天时间；待细胞汇合度达到80-90％左右；用0.125％胰蛋白酶消化细胞，随后以1000-1500rpm离心5-10min；收集细胞，进行扩增培养。
试验组培养的细胞形态与图1相近，细胞为贴壁生长，呈现长梭状生长，符合干细胞形态特征。对照组细胞形态与试验组细胞形态相近，符合干细胞形态特征。
细胞总量及细胞活力数据见表2。
表2细胞总量及细胞活力数据
组别 试验组 对照组1 对照组2
细胞总量 14.5×104 13×104 12×104
细胞活力 88％ 80％ 78％
如表2可知，试验组所分离得到的牙髓干细胞总量与活力均高于对照组。
(三)流式细胞仪检测牙髓细胞表面标志
消化收集试验组细胞，计数后每管加入2×105细胞数，染色缓冲液洗1次，1000rpm离心5min；弃上清，用染色缓冲液吹打混匀细胞；加入CD45、CD59、CD90及HLA-DR抗体各2μL，并设一管为空白对照；在4℃下，避光反应15-20min；染色缓冲液洗一次，1000rpm离心5min；直接标记的细胞弃上清，避光加入500μL的上样缓冲液，混匀，用200目筛网过滤细胞样品，流式细胞仪检测细胞表面抗原。流式结果与图2相近。
由流式结果可知，牙髓干细胞表面标志CD45(白细胞阳性)、HLA-DR(MHC-II类分子)为均呈现阴性，同时乳牙牙髓干细胞表面标记物CD59、CD90均呈现阳性。第三代牙髓干细胞细胞形态均一。
(四)P3代细胞诱导成骨分化鉴定
方法为：试验组细胞培养至第2代时，按照1×103细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基培养24h后，加入成骨诱导培养基进行诱导培养，每隔2-3天换液，28天后进行茜素红染色，结果与图3相近。
(五)P3代细胞诱导成脂分化鉴定
方法为：试验组细胞培养至第2代时，按照1×103细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基，24h后，加入成脂诱导培养基进行培养。成脂诱导培养基包括基础培养基DMEM、10％胎牛血清、0.5mM IBMX、1μM地塞米松、100μM吲哚美辛、5μg/mL胰岛素、2mmol/L谷氨酰胺等。每三天换液。二周后进行油红O染色，鉴定脂滴形成情况，结果与图4相近。
实施例3
(一)牙髓的冻存
实验分为试验组和对照组：
1、试验组牙髓的冻存：采集30岁以下完整无损的人或动物的牙齿，放置于4℃预冷的含双抗的无血清培养基中保存；用含双抗的生理盐水去除牙齿表面的污垢；配制牙髓冻存液：15％DMSO；0.5％(0.005g/mL)右旋糖酐；其余为无血清培养基；用无菌钳将牙齿根尖部分切开；至少切开一个小口即可，将牙齿放置在装有4℃预冷牙髓冻存液的冻存管中，使牙齿完全浸没于冻存液中。将冻存管放置在程序冻存盒中(装有异丙醇)；随后放置-80℃冰箱进行长期保存6个月。
2、对照组牙髓的冻存(根据专利CN 103563888A的方法进行冻存)：
采集30岁以下完整无损的人或动物的牙齿，放置于4℃预冷的含双抗的无血清培养基中保存；用含双抗的生理盐水去除牙齿表面的污垢；配制牙髓冻存液：8％的人血白蛋白、10％的二甲基亚砜、5.1％的右旋糖酐-40和4.25％的葡萄糖。用无菌钳将牙齿根尖部分切开；至少切开一个小口即可，将牙齿放置在装有4℃预冷牙髓冻存液的冻存管中，使牙齿完全浸没于冻存液中。将冻存管放置在程序冻存盒中(装有异丙醇)；随后放置-80℃冰箱进行长期保存6个月。
3、对照组2牙髓的冻存(根据专利US20130217123的方法进行冻存)：
采集30岁以下完整无损的人或动物的牙齿，放置于4℃预冷的含双抗的无血清培养基中保存；用含双抗的生理盐水去除牙齿表面的污垢；配制牙髓冻存液：10％的二甲基亚砜、90％地塞米松。用无菌钳将牙齿根尖部分切开；至少切开一个小口即可，将牙齿放置在装有4℃预冷牙髓冻存液的冻存管中，使牙齿完全浸没于冻存液中。将冻存管放置在程序冻存盒中(装有异丙醇)；随后放置-80℃冰箱进行长期保存6个月。
(二)牙髓的复苏过程
将牙髓冻存管放置在37℃-40℃的水中进行快速解冻复苏；取出牙齿，放置在20-50体积的PBS中清洗牙齿2-3次后，迅速的将牙齿切开，取出牙髓(试验组与对照组取出的牙髓组织体积大小相同)，用0.3％的I型胶原酶与0.1％中性蛋白酶联合作用牙髓组织30-60min，随后以1000-1500rpm离心5-10min；收集细胞沉淀；用无血清培养基重悬；计算细胞总量及细胞活力，并按照2000细胞/cm2-10000细胞/cm2接种于培养皿或培养孔中，加入bFGF、FGF(终浓度均为10ng/mL)，放置CO2培养箱，以37℃、5％CO2、95％的湿度培养5-8天时间；待细胞汇合度达到80-90％左右；用0.125％胰蛋白酶消化细胞，随后以1000-1500rpm离心5-10min；收集细胞，进行扩增培养。
试验组培养的细胞形态与图1相近，细胞为贴壁生长，呈现长梭状生长，符合干细胞形态特征。对照组细胞形态与试验组细胞形态相近，符合干细胞形态特征。
细胞总量及细胞活力数据见表3。
表3细胞总量及细胞活力数据
组别 试验组 对照组1 对照组2
细胞总量 17×104 14×104 13.5×104
细胞活力 85.5％ 82％ 77.6％
如表3可知，试验组所分离得到的牙髓干细胞总量与活力均高于对照组。
(三)流式细胞仪检测牙髓细胞表面标志
消化收集试验组细胞，计数后每管加入2×105细胞数，染色缓冲液洗1次，1000rpm离心5min；弃上清，用染色缓冲液吹打混匀细胞；加入CD45、CD59、CD90及HLA-DR抗体各2μL，并设一管为空白对照；在4℃下，避光反应15-20min；染色缓冲液洗一次，1000rpm离心5min；直接标记的细胞弃上清，避光加入500μL的上样缓冲液，混匀，用200目筛网过滤细胞样品，流式细胞仪检测细胞表面抗原。流式结果与图2相近。
由流式结果可知，牙髓干细胞表面标志CD45(白细胞阳性)、HLA-DR(MHC-II类分子)为均呈现阴性，同时乳牙牙髓干细胞表面标记物CD59、CD90均呈现阳性。第三代牙髓干细胞细胞形态均一。
(四)P3代细胞诱导成骨分化鉴定
方法为：试验组细胞培养至第2代时，按照1×103细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基培养24h后，加入成骨诱导培养基进行诱导培养，每隔2-3天换液，28天后进行茜素红染色，结果与图3相近。
(五)P3代细胞诱导成脂分化鉴定
方法为：试验组细胞培养至第2代时，按照1×103细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基，24h后，加入成脂诱导培养基进行培养。成脂诱导培养基包括基础培养基DMEM、10％胎牛血清、0.5mM IBMX、1μM地塞米松、100μM吲哚美辛、5μg/mL胰岛素、2mmol/L谷氨酰胺等。每三天换液。二周后进行油红O染色，鉴定脂滴形成情况，结果与图4相近。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种牙髓或牙髓干细胞的冻存液，其特征在于，包括DMSO、右旋糖酐和无血清培养基；
所述冻存液中各组分用量为：DMSO的体积百分含量为15％，右旋糖酐为0.005g/mL，无血清培养基补足。
2.一种牙髓或牙髓干细胞的冻存方法，其特征在于，采用如权利要求1所述冻存液冻存牙髓或牙髓干细胞。
3.根据权利要求2所述的冻存方法，其特征在于，所述冻存的温度为-80℃～-185℃。
4.根据权利要求2所述的冻存方法，其特征在于，所述冻存方法具体为：去除牙齿根尖部分，将去除根尖的牙齿放置于预冷的所述冻存液中进行冻存。
5.根据权利要求4所述的冻存方法，其特征在于，所述牙齿根尖部分为距根尖1～2mm范围内的牙齿组织。
6.根据权利要求4所述的冻存方法，其特征在于，所述预冷的温度为0～5℃。
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