JP2004535829A - 臨床応用のための白血球分離採取法産物からの完全に成熟し、且つ安定した樹状細胞の生成 - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
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Abstract
本発明は、無菌の培養装置にて造血系前駆細胞を培養することを含んでなる成熟した且つ安定した樹状細胞又は未成熟な樹状細胞を産出する方法、前記方法に好適な装置及び樹状細胞の培養に好適である末梢血単核細胞の調製方法を提供する。
Description
【技術分野】
【0001】
本発明は、無菌培養装置において造血系前駆細胞を培養することを含んでなる成熟し、且つ安定した樹状細胞又は未成熟樹状細胞を産出する方法、前記方法に好適な装置、並びに樹状細胞を培養するのに好適である末梢血単核細胞を調製する方法を提供する。
【背景技術】
【0002】
関連技術の考察
樹状細胞(DC)は、抗原提示細胞の系を構成し、リンパ球と相互作用することによって免疫を制御する。ほとんどのDCは、骨髄由来であり、免疫刺激性である(Banchereau, J., Steinman, R.M., Nature 392, 245, (1998))。これら古典的なDCは、いくつかの方法で特殊化され、インビボでヘルパーT細胞及びキラーT細胞を感作する(「天然のアジュバント」)。最も重要なことに、末梢組織に存在する未成熟DCは、抗原を捕捉し、免疫原性のMHC−ペプチド複合体を産出する能力を備えている(「抗原処理の状態」)。炎症性サイトカイン(「危険」)のような成熟を誘導する刺激に応答して、これら未成熟DCは、接着分子及び共刺激分子をアップレギュレートすることにより、強力なT細胞刺激因子になり(「T細胞刺激の状態」)、同時に二次リンパ器官に移動して稀な抗原特異的T細胞を選択し、刺激する。組織又は血液から苦労して単離したDCは、試験管内で抗原を負荷し、成熟DCとして戻せば、インビボで免疫原性であることが判っている(Inaba, K. et al., J. Exp. Med., 178, 479, (1993); Inaba, K. et al., Int. Rev. Immunol., 6, 197, (1990); Hsu, F. J. et al., Nature Med., 2, 52, (1996))。これらのデータは、DCが、腫瘍や感染への免疫介在性の抵抗性に対して有効な免疫賦活剤であることを示唆している。
【0003】
造血系前駆細胞から大量に生体外でDCを生成する方法の開発は、そのようなDCを基にしたワクチン法をさらに詳細に探求するための前提条件である。GM−CSFがマウスの血液からDCを生成する鍵となるサイトカインであることが発見された(Inaba, K. et al., J. Exp. Med., 175, 1157, (1992))のに続いて、マウスの骨髄から(一次成熟)DCを生成するための簡単で、信頼性のある技術(Inaba, K. et al., J. Exp. Med., 176, 1693, (1992))が開発された。次いで、幾つかのグループが、そのようなDC子孫の注射は、腫瘍抗原を負荷すれば、マウスにおいてCD8+CTL介在性の腫瘍の緩解を誘導することを一様に実証した(Young, J. W., Inaba, K., J. Exp. Med., 183, 7, (1996); Schuler, G., Steinman, R. M., J. Exp. Med., 186, 1183, (1997)において概説)。ヒトのDCを生成する方法も練り上げられてはいるが、未だ、マウスのように標準化されてはいない。前駆細胞から生体外で生成されたDCはすでにヒトにワクチン接種し、疾患を治療するのに上手く使用されている(Bancherau, J. et al., Cell, 2001, 印刷中)。
【0004】
ヒトでは、GM−CSFとTNFαを鍵となるサイトカインとして用いて、稀な、増殖しているCD34+前駆細胞(Caux, C. et al., Nature, 360, 258, (1992); Siena, S. et al., Exp. Hematol., 23, 1463, (1995); WO 93/20185)、又はGM−CSFとIL−4(WO97/29182)の保護のもとで末梢血における頻度は高いが増殖していないCD14+前記細胞(単球)のいずれかからDCを生成することができる。1994年に導入されて以来(Sallusto, F., Lanzavecchia, A., J. Exp. Med., 179, 1109, (1994); Romani, N. et al., J. Exp. Med., 180, 83, (1994))、後者の方法が実験目的で広く使用されており、また、多数の理由においても、免疫療法について魅力的であると思われる。第一に、CD14+前駆細胞は豊富にあるので、ほとんどの場合、G−CSF(末梢血においてCD34+細胞及びさらに進んだ前駆細胞を増やすのに使用される)のようなサイトカインで患者を前処置する必要がない(Romani, N. et al., J. Immunol. Methods, 196, 137, (1996))。第二に、この方法で生成したDCはある程度均質であると思われ、未成熟な状態又は完全に分化した又は成熟した状態で産出することができる。第三に、FCS(ウシ胎児血清)のような非ヒトタンパク質を避けることができ、成熟刺激として自己単球で調整した培地を使用することによって完全に且つ不可逆性に成熟した且つ安定なDCを得ることができることが示された(Romani, N. et al., J. Immunol. Methods, 196, 137 (1996); Bender, A. et al., J. Immunol. Methods, 196, 121 (1996))。(感染性及び免疫原性のために)有害である可能性があり、標準化されていない(使用する特定のFCSバッチによって後代のDCの質は顕著に変化する)ので、FCSを回避することが望ましい。
【0005】
さらに、以下の特許/特許出願が樹状細胞の産出を開示している:
EP−A−0 922 758号は、マクロファージ又は樹状細胞のいずれかの特徴を発現する能力を有する多能性細胞に由来する未成熟樹状細胞からの成熟樹状細胞の産出を開示しており、前記方法は、IFNαを含む樹状細胞成熟因子に未成熟樹状細胞を接触させることを含んでなる。
EP−B−0 633930号は、
(a)ヒトCD34+造血系細胞を(i)GM−CSF、(ii)TNFαとIL−3、又は(iii)GM−CSFとTNF−αとともに培養し、それによってCD1a+造血系細胞の形成を誘導する工程;と
(b)前記培養から前記CD1a+ヒト樹状細胞を回収する工程
とを含んでなるヒト樹状細胞の産出を開示している。
WO 95/28479号は、末梢血細胞を単離すること、CD34抗原を発現する血液前駆細胞をそれから濃縮すること、及び造血系増殖因子とサイトカインとの組み合わせで前記細胞を増やすことを含んでなる樹状細胞の調製方法を開示している。
【0006】
成熟DCは多数の理由で免疫療法について未成熟なものに対して好ましいと思われる。成熟DCの後代細胞だけがM−CSF−Rを欠いており、M−CSFを除いた場合/その非存在下で相変わらず安定なままである(Romani, N. et al., J. Immunol. Methods, 196, 137 (1996))。成熟DCは、IL−10(Steinbrink, K. et al., J. Immunol., 159, 4772 (1997); Steinbrink, K. et al., (1998))又はVEGF(Gabrilovich et al., Nature Med., 2, 1096, (1996))のような(腫瘍由来の)阻害因子に抵抗性であるが、未成熟なものはそうではない。成熟DCはまた、インビトロで(Sallusto, F., Lanzavecchia, A., J. Exp. Med., 179, 1109 (1994); Romani, N. et al., J. Immunol. Methods, 196, 137 (1996); Bender, A. et al., Immunol, Methods, 196, 121 (1996); Reddy, A. et al., Blood, 90, 3640 (1997); Inaba et al., J. Exp. Med., 175, 1157 (1992); Inaba et al., J. Exp. Med., 176, 1693 (1992); Larsson, M. et al., J. Immunol., 165(3), 1182-90 (2000年8月1日); Jonuleit, H. et al., J. Exp. Med., 192(9):1213-22(2000年11月6日))及びインビボで(Dhodapkar, M.V. et al., J. Exp. Med., 193(2):233-8(2001年1月15日)及びJonuleit, H. et al., Int. J. Cancer., 93(2):243-51(2001年7月15日))T細胞反応を誘導するのに優れていることも明らかにされている。実際のところ、未成熟DCは、調節性T細胞を誘導することにより、インビトロで(Jonuleit, H. et al., J. Exp. Med., 192(9):1213-22(2000年11月6日))並びにインビボで(Dhodapkar, M.V. et al., J. Exp. Med., 193(2):233-8(2001年1月15日))トレランスを誘導することさえできる。従って、成熟DCは、トレランスを誘導するために免疫性、未成熟DCを誘導するのに好ましい。
【0007】
CD14+単球前駆細胞からDCを発生させる上記方法はさらに改変され、DCに基づいた更に大掛かりなワクチン接種試験を行うために臨床的に実用化されている(Thurner, B. et al., J. Immunological Methods 223, 1-15 (1999))。GMP(製品管理及び品質管理規則)指針に合わせて実施することができ、DCを生成するための複数回の採血の必要性を回避する再生可能なDC生成方法(ヒトにおけるDCに基づいたワクチン接種のアプローチには必須である)を提供するために、白血球分離採取法産物(出発集団としての繰り返し採血した新鮮血ではなく)からの完全に成熟したDCの再生可能な生成ができるような改変が導入された。特に前記方法では、出発集団としての白血球分離採取法産物とともに使用するために二工程法(GM−SF+IL−4で感作した後、単球で調整した培地で成熟させる)によってCD14+単球から成熟DCを生成した。幾つかの順応が必要であった。改変付着工程は、アフェレーシス単核細胞からCD14+DC前駆細胞を確実に濃縮するために必要であることが開示された。培養開始時でのGM−CSF+IL−4の添加は不利であることが判ったので、24時間遅らせた。アフェレーシス細胞からのDCの発生は、新鮮血やバフィコートからよりも速く、7日後に完了した。6日目に添加した単球で調整した培地によって、24時間後すでに完全に成熟し且つ安定したDC(≧85%がCD83+、p55/ファシン+、CD115/M−CSF−R−、CD86++のような特徴的な表現型を持つ不鮮明な、移動性の高い且つT細胞感作性の細胞)を生じた。成熟DCの後代細胞はサイトカインの非存在下でさらに1〜2日培養しても安定で且つ生きたままであり、IL−10の阻害作用に抵抗性であることが示された。PBMC(末梢血単核細胞)の凍結試料からDCを生成するために、又は後で使用するために成熟DC自体を凍結するために凍結条件が確立された。そのアプローチによって、互いに比較することができる正常なDCに基づいたワクチン接種試験を行うのに好適である多数の標準化されたDC(5〜10x108個の成熟CD83+DC/白血球分離採取)が得られる。
【0008】
アフェレーシス細胞を出発集団として使用すると、TNF−α自体は成熟への刺激に不十分であることも判明した。最近、炎症誘発性(pro-inflammatory)サイトカイン、TNF−α、IL−1−β、IL−6及びプロスタグランジンE2から成るカクテルによってMCMを模倣できることが示されている(Jonuleit, H. et al., Eur. J. Immunol., 27, 3135 (1997))。これらは、MCMの主要な構成成分である。また、TNF−α+プロスタグランジンE2の組み合わせ(Rieser, C. et al., J. Exp. Med., 186, 1603 (1997))はさらに変異が大きいが、このMCMはほとんどの場合、このカクテルと同じくらい有効であった。1%の自己血漿を補完したX−vivo15又は20培地が、最近、完全に成熟したDCの生成に推奨されている(Jonuleit, H. et al., Eur. J. Immunol., 27, 3135 (1997))。しかしながら、RPMI培地がさらに優れていることが判明した。興味深いことに、X−vivo培地で生成されるDCは、CD1a陰性又は弱陽性であるが、RPMI培地の使用によってCD1a分子を発現した完全に成熟したDCを生じる。出発集団としての白血球アフェレーシス産物とともに使用するための方法への適応によって、DCを生成するために繰り返し採血する必要性が未然に防がれ、それは、トゥルナー(Thurner, B. et al., J. Immunol. Methods 223, 1-15 (1999))によって確立された。一連のワクチン接種全体(≧5x108個の成熟CD83+DC/白血球分離採取)のためにDCを生成するのに一回きりの白血球分離採取で十分である。DCは、連続するワクチン接種のために凍結したPBMC試料から繰り返し生成されるか、又は最適な凍結プロトコールを用いて、後の使用に備えてアリコートに(in aliquots)凍結することができる大量のDCを得るために開始時にアフェレーシス産物全体を処理する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
しかしながら、上記方法における主要な欠点は、必要なDCの培養が一般に(大量の)開放系容器(ウエル又はフラスコ)で行われることである。種々の操作工程、すなわち、試薬を繰り返し添加又は除去することによって、全体の手順を制御された且つ無菌の条件下で処理することが困難になり、すなわち、GMP指針に準拠した製造方法は未だに利用可能ではない。しかしながら、そのようなGMP法は、産出されたDCが元来の提供者又はほかの受入者に戻すことが意図されている生体外のDCの増殖又は生成の手順(例えば、DCを基にしたワクチン接種処方計画の範囲内で)に対する重要な必要要件である。一方、2,3の論文が樹状細胞の産出における閉鎖系容器の使用を強調しているにすぎない(例えば、WO98/06826;Kowalski, K. L. et al., Blood, 88(10), suppl. 1, 111a (1996))。しかしながら、前記文献で利用される容器は、前記容器で産出されるDCの量に特定の制限を課す標準的な容器である。
【0010】
最後に、樹状細胞の実際の培養に先立つ工程、すなわち、患者からの好適な造血系前駆細胞の単離を円滑にするという一般的な必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
以下に特定する方法及び装置によって上記課題は解決した。特に、本発明は
(1)GMP(製品管理及び品質管理規則)指針に従って、成熟し且つ安定した樹状細胞又は未成熟の樹状細胞を産出する方法であって、該方法は少なくとも1つの樹状細胞分化/成熟因子の存在下で無菌の培養装置において造血系前駆細胞を培養することを含んでなり、前記培養装置は増殖領域を形成する拡張された内部表面を有し、それによって細胞が表面に付着する閉鎖系容器を含んでなる方法;
(2)増殖領域を形成する拡張された内部表面を有する閉鎖系容器を含んでなり、成熟し且つ安定した樹状細胞を産出するのに使用するための装置;及び
(3)樹状細胞の培養に好適である末梢血単核細胞を白血球分離採取法産物から調製する方法であって、水又は塩化アンモニウム水溶液の添加によって白血球分離採取法産物において赤血球(及び顆粒球の一部)を溶解することを含んでなる前記方法
を提供する。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、細胞は、容器の拡張された内部表面に付着する。容器の内部表面を拡張するために、容器は、主要な小部屋を含有してもよく、及び/又は、重合体材料などからできた粒子、例えば、ビーズ、球体、螺旋体、スポンジ様構造体、羊毛様構造体又は網様構造体、三次元網などで満たされてもよい。複数のこれら粒子によって、容器の表面積が拡張され、それによって細胞は、これら粒子の表面に付着する。
【0013】
本発明によれば、該粒子はいかなる三次元構造を有することもできる。例えば、ナイロン、羊毛、レイティング(ratings)、螺旋体、スポンジ様構造体などを使用することができる。
【0014】
本発明の好ましい実施形態によれば、容器は少なくとも2つの流状連通試験槽を含み、それによって各試験槽が増殖領域を規定する。この種の容器は、多数の試験槽に容器を分離する1以上の分離壁を有する。本発明によれば、試験槽は流状に接続する。従って、唯一の主入口開口部を持ち、それを介して培養されるべき細胞を含有する流体を挿入することができる装置を提供することができる。好ましくは、流状に連通する手段を介して、流体は試験槽の間に規則正しく分割される。
【0015】
好ましくは、容器が連通状態において保持されなければならない方法において連通手段は、試験槽の間に配置される。この状態においてのみ、容器の流体は試験槽間に均等に分配される。容器が培養状態又は培養位置に保持されれば、試験槽は互いに流状に連通しないので、流体は、この状態では一方の試験槽からもう1つの試験槽に流れることはない。
【発明を実施するための最良の形態】
【0016】
図1〜7を参照して、本発明の実施形態(1)の方法にも好適である本発明の実施形態(2)の培養装置について以下説明する。図1及び図2は、成熟した且つ安定した樹状細胞又は未成熟の樹状細胞を産出するのに使用することができる装置の第1の好ましい実施形態を示す。示された装置は、図2に示すように積み重ねが可能である、積み重ね可能な盆状の手段10を含む。各盆状の手段10は、底部12及び底部12を取り囲む側壁14を有する。1つの盆状手段10をもう1つの盆状手段10の上に積み重ねることによって、底部12がさらに上部の役目をするので、図2に示すように2つの盆状手段10を積み重ねることによって試験槽16が形成される。最上の盆状手段10は、最上の盆状手段10の底部12の下にある試験槽16の蓋を形成する。
【0017】
各盆状手段10は、隣接する試験槽16に接続するための少なくとも1つの手段18を有する。示された好ましい実施形態の範囲内では、各盆状手段10は隣接する試験槽16の流状接続のために2つの手段18を含む。流状接続のための手段18は好ましくは、円筒状の中空の突起として形成される。言い換えれば、流状接続のための手段18はパイプ又は管として形成される。これら管のそれぞれは、底部12の底表面22から離れて配置される開口部20を有する。開口部20の反対側にて、各管は、底部12の面に配置される第2の開口部24を有する。この第2の開口部24は隣接する試験槽16に対して開口する。
【0018】
図2は、培養状態又は培養位置での装置を示す。この水平位置では、流体は、底表面22に配置され、それによって細胞は底表面22に付着する。従って、盆状手段10全体及び少なくとも底部12は、ポリカーボネート、ポリスチレン及びポリオレフィン類を含むが、これらに限定されないプラスチック材から作製される。もう1つの方法として、細胞が底表面22に付着するように、底部12の前記材料を、好適な付着介在手段、例えば、Ig(免疫グロブリン)被覆(IgG被覆を含む)、又は単球の表面分子(CD14、CD16を含む)に対する抗体で被覆するように被覆することができる。
【0019】
示された培養状態では、各試験槽16は、流体が管18の開口部20より高くなるレベルまで満たすとよい。記載される方法について示される装置を使用することによって、流体のレベルはさらにはるかに低くなる。流体の厚さは約3mmである。
【0020】
示された試験槽16の流状接続については、管18が底に配置されるように、図2に示す装置を90°回転する(図1)。従って、流体26は、管18を介して試験槽16間に均等に分配される。
【0021】
一番下の盆状手段10の管18の開口部24は蓋28により閉鎖される。培養に使用されない最上の盆状手段10は、管18に挿入された管状部30を有する。管状部30の一方は、管状部30の開口部を無菌的に閉鎖する蓋32により閉鎖される。蓋32は、管30から剥ぎ取ることができるストライプ34に接続される。図2に示すように、他方の管状部はすでに開口しており、すなわち、蓋32は外されていた。従って、主入口開口部36を形成する管状部30の開口部36を介して流体を試験槽16に充填することができる。主開口部36を介してどの試験槽にも流体が充填される。流体が充填される一方で、装置をすでに培養状態に保持することができる。流体の入口開口部及び/又は出口開口部として各管状部30を使用することができる。培養状態では各試験槽16における流体の上の領域は気体で満たされる。例えば、試験槽16を介して、5%CO2の空気をポンプで送ることによりこの気体を交換することができる。
【0022】
図3に示すように、接続のために、1つ、又は好ましくは2つのフィルター128を手段18に接続することができる。フィルター128は空気供給のために提供され、そのためにフィルターは漏出耐性である。接続のための追加の手段18又は接続のための2つの手段18の1つと共に(図1及び図2)、注入/排出装置130を接続する。装置130は、好ましくはPVCからできた管状アダプタ又は三方コック132を提供する。アダプタ132を介してチュービング140によってバッグ134、136、138の1つを接続することができる。チュービング140には、管140の1つを閉鎖する/開放するための締め具142又はそのほかの種類の開閉装置が提供され、すなわち、図1及び図2に示されるような装置にバッグ134,136,138の1つを接続する、又は接続を断つ。バッグ134,136,138の代わりに、培地を貯蔵する又は回収するためのそのほかの種類の試験槽様の手段を提供することができる。
【0023】
上記バッグ134,136,138は、例えば、PBMC、培地又は非付着性分画(NAF/廃棄物)を含有してもよい。装填の設定では、PBMCを含有するバッグ134を熱シールによって装置130のPVCチュービングに接続する。次いで、それぞれの締め具142を開放して細胞(例えば、完全培地240mlにおける約120x106個)を二重トレイのセルファクトリに移す。慎重に均衡化した後、セルファクトリを37℃及び5%CO2のインキュベータに入れる。1時間後、装置130のPVCチュービングを介してNAF/廃棄物バッグ138に非付着性分画(NAF)を移す。セルファクトリを(例えば、純粋な培地1640にて)洗浄する。その後、培地(例えば、240mlの完全培地)を添加し、両トレイ上に均等に分配する。システムを開放することなく、熱シールによって各バッグ136は、常に接続され、接続を断たれる。
【0024】
セルファクトリの養分補給設定では、培地を含有するバッグ136が熱シールによってPVCチュービング130に接続され、内容物がセルファクトリに移される。セルファクトリの成熟設定では、成熟刺激を含有するバッグ136が熱シールによってPVCチュービング130に接続され、内容物がセルファクトリに移される。セルファクトリの回収設定では、各バッグ138が熱シールによってPVCチュービング130に接続される。穏やかに再浮遊した後、システムを開放することなく、非付着性細胞をDCバッグ138の中に移す。次いでセルファクトリを培地で満たし、ゆるやかに付着した細胞を移動させ、第2のDCバッグに回収をもする。次いで双方のDCバッグをシステムとの接続から外す。
【0025】
図4及び図5に示す第2の実施形態は、分離壁40,42,44及び46を有し、そのために、示された実施形態においてこれら分離壁40,42,44、46が、3つの試験槽49,50及び52(図5)を形成する、ビン状容器である。試験槽の数はさらに多くてもよい。上の試験槽49は、図5では水平である底部42と側壁40及び44とを有する盆状手段でできている。底部42は表面48を有し、本発明の方法に従って細胞がその上に付着する。図5に示されるように培養状態又は培養位置において流体が試験槽49の内側に保持されるように、底部42は、容器の全高に伸びる側壁54及び56に密封可能に接続される。側壁40及び44も密封可能に壁54及び56に接続される。上の壁48に近接して、各側壁40,44は、それぞれ開口部60及び62を有する。
【0026】
中間試験槽60も、側壁54及び56に密封可能に接続される底部42及び側壁40を有する。側壁40の反対側に、中間試験槽50は、開口していない側壁46を有する。従って、側壁46は、底部42、上の試験槽49の側壁44及び側壁54及び56に密封可能に接続される。さらに、中間試験槽50は、底部42に密封可能に接続され、中間試験槽50に開口する開口部66を有する管状突起64を有する。開口部66の反対側に、管64は、下の試験槽52に向かって開口する、底部42の面における第2の開口部68を有する。
【0027】
側壁70、底壁72及び側壁70に対向する側壁74によって下の試験槽52の境界が形成される。側壁70は、底壁72から上壁58まで伸びている。
【0028】
側壁74の範囲内で開口部76が形成される。開口部76は蓋80(図5)で閉じられる管状突起78を有する。蓋80の範囲内で、空気が容器に入ることができるように疎水性フィルタ82が配置される。
【0029】
同一量の流体26で試験槽49,50及び52を満たすために、矢印80の方向で管状突起78及び開口部76を介して流体が試験槽に充填されるように、図4に示すようにビン状装置を保持する。この連通状態で装置が保持されれば、破線の矢印によって図5で示されるように流体は試験槽の中を流れる。先ず最初に、下の試験槽52において矢印84の方向に流体は流れる。下の試験槽52から、側壁44における開口部62を介して上の試験槽48と下の試験槽52を接続する水路89において矢印86の方向に流体は流れる。水路89は側壁70と対向する側壁46及び44とからできている。さらに、中間試験槽50において管64及び開口部66を介して矢印88の方向に流体は流れる。試験槽49、50、52が同一量の流体で均等に満たされれば、流体が平坦な底部42及び72の上で均等に分配されるように、ビン状装置を図5に示す位置に回転する。本発明の図1〜5に基づいた好適な無菌培養装置はヌンク(Nunc)セルファクトリ及びヌンクトリプルフラスコである。
【0030】
本発明のさらなる実施形態では、容器の拡張された内部表面(22、48)は、1以上の規則正しい又は不規則な形状の構造体又は粒子によって形成され、それによって、細胞は容器の内部表面及び/又は前記粒子の表面に付着する。好適な構造体及び粒子は、上述のようなビーズ、球体、螺旋体、巻き上げたホイル又はフィルム、スポンジ状、羊毛状又は網状の構造体、三次元の網などである。
【0031】
成熟した且つ安定した樹状細胞を産出するための連続又は非連続の流体灌流法において前述した本発明の2つの好ましい実施形態を使用することもできる。このためには、管状部(30)(図2)及び管状突起28(図5)を柔軟性のある管などに接続することができる。それぞれ試験槽16及び49、50、52において流体をポンプで動かせるように、柔軟性のある管をペリスタポンプ又はもう1つの流体輸送用装置に接続する。
【0032】
試験槽の中で流体を分配するために、特に、細胞が付着する底表面22、48の上で流体を分配するために、装置を移動させるか、又は傾けることができる。
【0033】
第3の好ましい実施形態(図6)によれば、培地は柔軟性のある管90を介してポンプで運ばれる。管90は2つの試験槽92に分離する。試験槽92の内側で、細胞は、これら試験槽の表面又は試験槽92の内側に配置された粒子に付着する。流体は、矢印94の方向に連続的に又は非連続的に運ばれる。2つの試験槽は、流体が試験槽92を通過した後、再び管90に接続される。試験槽92を介して流体を運ぶために、ポンプ96、特に、ペリスタポンプが使用される。
【0034】
各試験槽92は底表面98を有する。底表面98の反対側には、空気透過性の表面100が施される。これら表面100は空気透過性ではあるが、流体は透過しない。表面100を介して気体は試験槽92を通り抜け、中間の気体試験槽102に入ることができ、逆もできる。気体を供給し、気体試験槽102から分散されるように、各気体試験槽102は、それぞれ共通の入口開口部104及び出口開口部106に接続される。図5に示す実施形態は、特に非連続的な流体供給に使用することができる。
【0035】
もう1つの好ましい実施形態(図7)は、2以上の試験槽124に流体を連続して供給するのに使用される。各試験槽124は、例えば、波状構造の使用によって拡張された表面を有する底表面107を有する。2つの試験槽124は、共通の柔軟性のある管126に接続される。矢印108の方向で試験槽124に培地を供給するために、ポンプ110、特にペリスタポンプが使用される。矢印112の方向で試験槽124を流れ出て柔軟性のある管126に入る培地は、気体交換装置114に運ばれる。気体交換装置の範囲内で、管は、気体透過性且つ液体非透過性の表面116を有する。表面116を介して、柔軟性のある管126と気体交換装置114との間で気体が交換される。従って、気体交換装置は、入口開口部118及び出口開口部120を有する。
【0036】
細胞が管126や気体交換装置114にポンプで運ばれるのを防ぐために、試験槽124を傾けて、細胞がその重量により試験槽104の範囲内に留まるようにすることができる。
【0037】
容器(装置)の試験槽及び/又は試験槽の内部での規則正しい又は不規則な形状の粒子及び構造体は好ましくは、25〜10000cm2の、好ましくは500〜5000cm2の有効表面、すなわち、容器の内側表面の増殖面積を提供する。本発明に従って、その面積はプラスチック、好ましくは、ポリカーボネート、ポリスチレン又はポリオレフィンから作られる。本発明の好ましい実施形態では、容器の内側表面、好ましくは、盆状手段10及び規則正しい又は不規則な形状の構造体又は粒子の表面を含む内側表面の増殖領域は、付着介在性作用物(単球を付着させる作用剤を含む)で被覆される。好適な付着介在性作用物は、Ig被覆(IgG被覆を含むがこれに限定されない)、細胞表面タンパク質に対する抗体による被覆(抗CD14又は抗CD16抗体による被覆を含むが、これに限定されない)、接着分子(E−セレクチン及びP−セレクチンのようなセレクチン及び/又はVCAM−1のような免疫グロブリンスーパーファミリーの一員を含むが、これらに限定されない)による被覆、などである。
【0038】
実施形態(1)の成熟及び未成熟の樹状細胞の生成、すなわち、前駆細胞の培養は、公知の方法に類似して行われる。好適な前駆細胞は、多能性細胞、樹状細胞前駆細胞又は未成熟の樹状細胞であり、好ましくは、前記造血系前駆細胞は、
(i)CD14+単核細胞(単球)、CD34+細胞、又は血液から直接得られる、及び/又は
(ii)白血球分離採取法産物、懸濁分離(エルトリエーション)プロトコール、末梢で採取した血液又は骨髄に由来する樹状細胞前駆細胞である。
例えば、前駆細胞は(及びDCも)、その全体を本願に引用するトゥルナー(Thurner, B. et al., J. Immunol. Methods 223, 1-15 (1999))が開示した方法に従って白血球分離採取法産物から入手可能である。もう1つの方法としては、以下でさらに定義する本発明の実施形態(3)の方法によって白血球分離採取法産物から前記先駆細胞を単離することができる。培養は好ましくは以下の工程によって行われる。
(i)末梢血単核細胞を培養試験槽に適用し、試験槽の内側表面にそれらを付着させる工程、
(ii)非付着性細胞を除くために試験槽を洗浄する工程、
(iii)少なくとも1種の樹状細胞分化/成熟因子の存在下で培養培地にて付着性細胞を培養する工程、及び任意で
(iv)さらなる分化/成熟因子を培養培地に添加する工程、及び又は
(v)培養培地を除き、付着性細胞を洗浄し、工程(iii)と同一の又は異なった樹状細胞成熟因子を含む培養培地で付着性細胞を培養する工程。
【0039】
本発明の実施形態(1)の好ましい方式では、培養は、以下を含む。
(i)(有効な)増殖領域のcm2当たり3x105〜4x106個の前駆細胞を負荷すること、及び/又は
(ii)増殖領域が、十分に、好ましくは1〜5mmの培養培地で覆われるように培養領域cm2当たり0.01〜3ml、好ましくは0.1〜0.5mlの培養培地を加えること。特に、ヌンクトリプルフラスコ(500cm2の増殖領域を有する)には、20〜200mlの培養培地で150〜2000x106個の細胞を加え、ヌンクのセルファクトリ(2つ重ね:1200cm2の増殖領域を有する)には、100〜400mlの培養培地にて360〜4800x106個の細胞を加える。
【0040】
好適な分化因子は、GM−CSFとIL−4、IL−13、IL−5又はIFN−αとの混合物である。本発明の方法に好適な樹状細胞成熟因子には、MCM、IL−1β、IL−6、TNF−α、PGE2、INF−α、リポ多糖類及びそのほかの菌体産物(例えば、MPL(モノホスホリル脂質A)及びリポタイコ酸)、ホスホリルコリン、カルシウムイオノフォア、ホルボールエステル(例えば、PMA)、熱ショックタンパク質、ヌクレオチド類(例えば、ATP)、リポペプチド、トールライク受容体に対する人工リガンド、二本鎖RNA(ポリI:C)、免疫刺激性DNA配列、CD40リガンドなどが挙げられるが、これらに限定されない。最も好適な成熟因子は、IL−1β、IL−6、TNFα及びPGE2の混合物である。
【0041】
本発明の実施形態(3)の方法では、水による細胞溶解を行うのであれば、
(a)20〜30℃にて5〜30秒間、細胞溶解を行うこと;及び/又は
(b)白血球分離採取法産物と水の容積比が20:1〜2:1であることが好ましい。
【0042】
一方、塩化アンモニウム水溶液で細胞溶解を行うならば
(a)添加溶液における塩化アンモニウムの濃度が0.5〜5%(w/w)、好ましくは1〜3%(w/w)であること;及び/又は
(b)25〜50℃にて5〜20分間、細胞溶解を行うこと;及び/又は
(c)白血球分離採取法産物と塩化アンモニウムの容積比が20:1〜2:1であることが好ましい。
【0043】
上記方法は、さらに、反応を停止する工程及び/又は溶解産物を洗浄する工程及び/又は溶解産物を好適な培養培地(血漿又はタンパク質を含まない)又は塩溶液(例えば、やや低張の塩溶液)に浮遊させる工程を含んでもよい。
【0044】
特に、水による細胞溶解では、白血球分離採取法産物を50ml試験管(試験管当たり10ml)に入れ、遠心する(4℃にて1100rpmで12分間)。上清を捨て、20mlのアクアデスト(5〜30ml)を沈殿物に加え、それを再浮遊させ、20秒間(5〜30秒間)ボルテックスで撹拌し、30mlの完全培地で、好ましくは800U/mlのGM−CSFを補完して満たす。次いで、トゥルナー(Thurner, B. et al., J. Immunol. Methods 223, 1-15 (1999))により記載されたように懸濁液を洗浄する。細胞溶解はさらに大きな容器、例えば、白血球分離採取用バッグに入れた白血球分離採取法産物で行うことができ、それを遠心する(4℃にて1100rpmで12分間)。上清を捨て、50mlのアクアデストを加え、沈殿物を再浮遊し、20秒(5〜30秒)後、150mlの完全培地で満たし、上記のような洗浄工程に進む。
【0045】
塩化アンモニウムによる細胞溶解では、白血球分離採取法産物を50ml試験管(試験管当たり10ml)に入れ、遠心する(4℃にて1100rpmで12分間)。上清を捨てる。800U/mlのGM−CSFを補完した10mlの完全培地に沈殿物を再浮遊し、10ml(5〜20ml)の1.6%NH4Clを加える。懸濁液をよく振り、温水槽(37℃)に10(5〜15)分間入れ、上記のように洗浄工程に進む。上述の水による細胞溶解のように、この場合も、細胞溶解手順をさらに大きな容器で行うことができる。
【0046】
以下の非限定的な実施例によって本発明をさらに説明する。
【0047】
実施例
材料及び方法
臨床応用のためにDCを生成するのに開発されたプロトコールで採用した試薬及び材料はすべて、エンドトキシンを含まず、利用可能な限り、ほとんどは、GMP(製品管理及び品質管理規則)の品質であった。
【0048】
装置: 微生物学的に安全な実験台(ヘレウス(Heraeus), HERA safe HS 12/2);遠心分離機(ヘレウス、メガヒュージ2、ORS);インキュベータ(ヘレウス、サイトパーム2);−80℃のフリーザ(National Lab, Profimaster EPF);−20℃のフリーザ(Liebherr, GS 1382);冷蔵庫 レイブヘール(Liebherr) KB1001(Liebherr, ベルリン);透過型光学顕微鏡(Leica, DMLS);反射型光学顕微鏡(Leica, DMIL);ピペッティング補助 ピペットエイド(Drummond);ピペット, エッペンドルフリファレンス(Eppendorf);ノイバウエル(Neubauer)血球計算盤(スーペリアー・マリエンフェルド(Superior Marienfeld))
プラスチック材料
50mlの試験管、γ線照射による無菌の円錐底ポリプロピレン製試験管(コーニングコースター、製品番号430829);15mlの試験管、γ線照射による無菌の円錐底ポリプロピレン製試験管、1包装当たり25本(コーニングコースター、製品番号25315−15);γ線照射による無菌の、個別包装したピロゲンを含まない使い捨てのピペット(コーニングコースター、製品番号4485/1ml、4486/2ml、4487/5ml、4488/10ml、4489/25ml);無菌個別包装のピペットチップ(Biozym、Safeseal−Tips、製品番号790011/10μl、790101/100μl、791001/1000μl);無菌、エンドトキシンを含まない、個別包装の使い捨て滅菌フィルタ、0.22mm(ミリポア、ミレックス−GS、製品番号SBGS025SB);細胞培養用の表面を持つ培養ディッシュ、NUNCLON(登録商標)表面製品[ヌンクセルファクトリ、2つずつ重ねた、個別包装、独自包装、γ線照射により無菌、エンドトキシンを含まない(ヌンク、製品番号167695);細胞培養用ジャー、ヌンクトリプルフラスコ、γ線照射により無菌、エンドトキシンを含まない(ヌンク、製品番号1328867又は132913);細胞培養用6穴プレート、個別包装、オプティルクス(Optilux)表面、γ線照射により無菌、エンドトキシンを含まない(ファルコン/ベクトンディッキンソン、製品番号3046);空気フィルタ ミディサート(Midisart)2000(ザルトリウス、製品番号17805−G);凍結用試験管、無菌、エンドトキシンを含まない(ヌンク、ヌンククライオチューブバイアル、製品番号375418/1.8ml、337516/4.5ml);カニューレ:ステリカム(Stericam)0.9x70mm 20Gx2 4/5ルア、薄壁使い捨てカニューレ(ブラウン、製品番号04665791);ミクロランス 3 0.4x19mm 27G13/4 REF302200(ベクトンディッキンソン);無菌の外科用手袋、ラテックス製ペハ−タフト(ハートマン、製品番号9423 53/8(サイズ7)又は9423 54/7(サイズ7 1/2);無菌の外科用手袋ペハ−タフトシンテックス、ラテックスなし(ハートマン、製品番号9426 33/8(サイズ7))。
薬品
モルガモスティム(Molgramostim)(GM−CSF)(リューコマックス(Leukomax)(登録商標)400)、乾燥物質54.38mg及び1mlの無菌水(医薬品認可番号25756.03.00)(サンド、製品番号PZN−4608744);NaCl、0.9%、10mlバイアル(ブラウン、製品番号02246228);アクアアドインジェクショネム(aqua ad injectionem)、10mlバイアル(ブラウン、製品番号02240246);無菌、エンドトキシンを含まない、GMP品質のPBS(バイオウィタカー(Bio Whittaker)/セルバ(Serva)、製品番号17−512F);無菌、エンドトキシンを含まない、GMP品質の組み換えヒトIL−4(セルジェニックス);インターロイキン1b(アメダック(Amedak));インターロイキン6(ノバルティス);腫瘍壊死因子α(ベーリンガーインゲルハイム);プロスタグランジンE2、ミンプロスチン(Minprostin)(登録商標)(ファルマシア);70%アルコール(ラボセンター、ヌールンブルグ);バリーシダル(Barrycidal)(登録商標)36、殺菌剤(Helmut Schroder)
−インシジンプラス(Incidin Plus)(登録商標)(ヘンケル);無菌スポンジ ガジン、無菌、個別包装(ローマン、製品番号0197);無菌トリパンブルー 0.4%(シグマ、製品番号T−8154)。
【0049】
培養培地、サイトカイン、モノクローナル抗体(mAb)
以下の培養培地を用いた:最終濃度20μg/mlのゲンタマイシン(ドイツ、ダルムスタットのメルク、レフォバシン10)、最終濃度2mMのグルタミン(米国、ウォーカーズビルのバイオウィタカー、製品番号17−605)、及び加熱非働化(56℃で30分間した1%のヒト血漿を補完した標準培地RPMI1640(バイオウィタカー、製品番号12−167)を用いた(=さらに完全培地と呼ぶ)。ヒト血漿は、ヘパリン化(スイス、バーゼルのホフマンラロシュ製、Liquemin N 2500、20mlの血液当たり500I.U.)自己血漿(新しく採血して得る)又は10%ACD−A(酸クエン酸デキストロース処方A、ドイツ、Bad Homburg, Fresenius AG)血漿(白血球分離採取法により得る)のいずれかであり、若しくは、選択された実験については、輸血部門から、単一供血者で同種AB陽性ACD血漿を得た。もう1つの方法として、我々は、我々の標準培地と同じ方法で補完したX−VIVO15及びX−VIVO20(バイオウィタカー)を調べた。
【0050】
GMP品質の組換えヒトGM−CSF(800U/ml)(スイス、バーゼルのサンド、リューコマックス)及び組換えヒトIL−4(500U/ml)(オーストリア、ウィーンのノバルティス研究所、E.リール博士より供与)を標準培養法に用いた。ゲンザイム社(米国、マサチューセッツ州、ケンブリッジ)から入手した、GLP(製品管理及び品質管理規則)に準拠して製造され、GLP指針に準拠して調べられたヒトIL−4も使用した。
【0051】
成熟誘導のサイトカインとMCMを比較する実験では、10ng/mlの組換えヒトTNFα(オーストリア、ウィーンのベンダー社のアドルフ博士から供与)、1000U/mlのIL−6(スイス、バーゼルのノバルティスから供与)、10ng/mlのIL−1β(米国ミズーリ州、セントルイスのシグマ)及び1μg/mlのプロスタグランジンE2(米国ミシガン州、アナーバーのカイマンケミカル)を用いた。IL−10抵抗性実験については、10ng/mlの用量にてrhIL−10(米国マサチューセッツ州、ケンブリッジのゲンザイムコーポレーション)を用いた。
【0052】
フローサイトメトリについては、以下の抗原に対するモノクローナル抗体を用いた:CD1a(ドイツ、オルソダイアグノスティックシステム)、CD2、CD4、CD8、CD14、CD19、CD25、CD56、HLA−DR(すべて、ベルギー、ブリュッセルのベクトンディッキンソンから入手)、CD3、CD40、CD86(ドイツ、ハンブルグのCymbus、Dianova),CD83(フランス、Marseilesのイムノテック)、CD95(米国サンディエゴのファーミンジェン)、CD115(米国マサチューセッツのカルビオケム)。アイソトープ対照も並行して流した。
【0053】
細胞内FACS染色については、製造元の指示書に従って、フィックス&パーム(ドイツ、Eching, Biozol)により細胞を固定し、透過性にしてp55/抗ファシン(fascin)上清(Mosialos, G. et al., Am. J. Pathol., 148, 593 (1996))(K-2クローン、ボストンのランゴフ博士(Dr. E. Langhoff)より供与)により染色した。二次抗体として、Fcガンマ断片特異的で、蛍光を結合したアフィニピュアF(ab’)2ヤギ抗マウスIgG(ドイツ、ハンブルグ、Dianova, ジャクソン免疫研究所)を用いた。
【0054】
白血球アフェレーシス及びPBMCの単離
アフェレーシス産物の最初の処理:インフォームドコンセントを行った後、健常提供者又は黒色腫の患者から単球分離産物として、輸血部門より白血球分離採取法産物を得た(健常志願者は定期的な細胞分離(サイタフェレーシス)の供血者であり、黒色腫患者は、エリアンゲン−ヌールンベルグ(Eriangen-Nuerenberg)大学倫理委員会並びに米国ニューヨークのルードウィック癌研究所の国際審査会により認可されたフェーズIのDCワクチン接種試験の治療を受けていた)。細胞分離機として、コベスペクトラ(米国コロラド州、レイクウッドのCobe BCT社)又はフレセニウスASTEC204(ドイツ、Bad Homburg、フレセニウスAG)のいずれかを使用した。白血球細胞のセット及びMNCプログラムにコベスペクトラを用い、P1Y−セット及びMNCプログラムにフレセニウスASTEC204を用いた。白血球分離採取の間、製造元の指示書に従って、抗凝固物質として酸−クエン酸−デキストロース処方A(ACD−A、フレセニウス)を用いた。10%のACD−A(フレセニウス社)と共にPBS(米国、ウォーカーズビルのバイオウィタカー、製品番号17−512)により希釈した後(灌流シリンジを用いて、600mlの培養フラスコに白血球分離採取法産物を満たし、次いで、10%のACD−Aを含有するPBSを最終容量480mlで加える)、室温にて30分間460gでリンフォプレップ(1.077g/ml;ノルウェイ、オスロのニコメッドファーマ)にて遠心することによりPBMCを単離する(15mlのリンフォプレップに30mlの希釈した白血球分離採取法産物を重層する)。1mMのEDTAを含有するが、カルシウム又はマグネシウムを含まないPBSで3回細胞を洗浄し、最初は、250g、2回目は175g、3回目は110gでそれぞれ4℃にて12分間遠心した。
【0055】
自己単球で調整した培地(MCM)の生成
使用直前に、Igを被覆した細菌用プレート(85mm、ファルコン1005)を用意する。免疫グロブリンとして、我々はサンドグロビン(スイス、バーゼルのノバルティス)を用いた。10mlの希釈した(バイオウィタカーのカルシウム又はマグネシウムを含まないPBSにて)免疫グロブリン(10μg/ml)で室温にて10分間、被覆を行った。被覆操作後、カルシウム又はマグネシウムを含まないPBS(バイオウィタカー)で2回プレートをすすいだ。サイトカインを含まない完全培地中でこれらディッシュに50x106個のPBMCを入れ、5%CO2、37℃で20時間インキュベートした。次いで、単球調整培地を回収し、1360gにて10分間遠心し(22℃)、無菌的に濾過し(0.22μmのフィルタ、フランス、Molsheimミリポア)、−20℃にアリコットで(in aliquots)凍結した。単球調整培地の場合、ウエル(3ml容量を含有する)当たり、750μlのMCM、すなわち、20容積%加えた。もう1つの方法として、我々は、サイトカインのカクテル(IL−1β+IL−6+TNF−α、各10ng/ml)又はTNF−α単独(10−20−40ng/ml)を加えた。各成熟誘導刺激は、プロスタグランジンE2(1μg/ml)の有無との組み合わせにおいても調べた。培養培地、サイトカインも参照のこと。
【0056】
磁気セルソータ(MACS)によるCD14+単球の単離
製造元の指示書に従って、CD14微細磁気ビーズ(ドイツ、Bergisch-Gladbach, Miltenyi)(Miltenyi, S. et al., Cytometry, 11, 231 (1990))を用いた陽性選抜を行い、CD14+細胞を分離した。
【0057】
単球単離のための代替方法
A)アクアデストによる細胞溶解:白血球分離採取法産物を50ml試験管(試験管当たり10ml)に入れ、遠心した(4℃にて1100rpmで12分間)。上清を捨て、20mlのアクアデストを沈殿物に加え、20秒間ボルテックスで撹拌することによってそれを再浮遊させ、次いで800U/mlのGM−CSFを補完した30mlの完全培地で満たした。次いで、懸濁液を1100rpm、4℃にて12分間遠心し、上清を捨て、残りを50mlのPBS/EDTA(1mM)で満たした。得られた懸濁液を900rpm、4℃にて12分間遠心し、上清を捨て、残りを50mlのPBS/EDTA(1mM)で満たした。10μlの細胞懸濁液を細胞計数のために取り出した。懸濁液を800rpm、4℃にて12分間遠心し、上清を捨て、残りを完全培地(完全培地:500mlのRPMI1640、5mlの自己加熱非働化血漿、5mlのグルタミン及び200μlのゲンタマイシン)で満たし、通常の方法で培養容器に入れた/充填した。
【0058】
B)塩化アンモニウムによる細胞溶解:白血球分離採取法産物を50ml試験管(試験管当たり10ml)に入れ、遠心した。(4℃にて1100rpmで12分間)。上清を捨てた。10mlの完全培地(800U/mlのGM−CSFを補完した)で沈殿物を再浮遊し、10mlの1.6%NH4Clを加えた。得られた懸濁液をよく振り、温水槽(37℃)に5〜15分間入れた。その後、懸濁液を1100rpm、4℃にて12分間遠心し、上清を捨て、残りに50mlのPBS/EDTA(1mM)を満たした。次いで、懸濁液を900rpm、4℃にて12分間遠心し、上清を捨て、残りに50mlのPBS/EDTAを満たした。10μlの懸濁液を細胞計数のために取り出した。懸濁液を800rpm、4℃にて12分間遠心し、上清を捨て、残りに完全培地を満たし、通常の方法で培養容器に入れた/充填した。
【0059】
フローサイトメトリ:上記で列記したmAbのパネルによって細胞集団の表現型を分け、ロマーニ(Romani et al., J. Immunol. Methods, 196, 137 (1996))らが記載したようにFACScan(ファックスキャン)(ベクトン−ディッキンソン)で分析した。死細胞は、光散乱特性に基づいてゲートの外に出した。
【0060】
T細胞刺激性/機能性アッセイ:一次同種MLR:T細胞刺激性の機能を調べるために、段階的な用量にて同種T細胞にDCを加え、ゲンタマイシン、グルタミン及び5%の加熱非働化同種ヒト血清(単一供血者)を補完したRPMI1640中にて4〜5日間共にインキュベートした。2x105個のT細胞/ウエルで96穴平底プレートにて試験を行った。製造元の指示書(ドイツ、フランクフルトのTEBU)に従って、分離カラムを用いてT細胞を単離した。三連ウエルに12〜16時間、50μlの3Hチミジン(最終濃度4μCi/ml)加えることにより増殖を測定した。
【0061】
T細胞刺激性/機能性アッセイ:二次同種MLR:製造元の指示書に従ってCD4/CD45RAマルチソートキット(ドイツ、Bergisch-Gladbach, Miltenyi)により未処置のCD4T細胞を単離した。CD4+/CD45RA+細胞の純度は95%以上だった。ゲンタマイシン、グルタミン及び5%の加熱非働化同種ヒト血清(単一供血者)を補完したRPMI1640中にて、未処置のT細胞(3x106個/ウエル)をマクロウエル(24穴プレート、ファルコン)に蒔き、成熟DC(3x105個/ウエル)で刺激した。約3日後、T細胞をIL−2(米国、エメリービル、キロン、プロウキン(Proleukin))(50U/ml)で増殖させた。一次刺激の2週間後、一次刺激と同じ提供者から生成された成熟DCで同一条件下にてT細胞を再刺激した。再刺激のために、3x106個のT細胞+3x105個のDCを24穴プレートに蒔いた。48時間後、上清を回収し、−20℃で凍結し、後で、後述するように、ELISAアッセイによってサイトカインを測定した。
【0062】
インフルエンザウイルス特異的CTLの誘導;T細胞の調製:記載されているように(Bender et al., 1996)ノイラミニダーゼ(neuraminidase)処理したヒツジ赤血球とのロゼット形成によってTリンパ球を濃縮した。
【0063】
インフルエンザウイルス特異的CTLの誘導:HLA−A2.1陽性の提供者から調製された成熟DCを洗浄し、0.5〜1x107個/mlでRPMI1640に再浮遊した。最終濃度1000HAU/mlでインフルエンザ生ウイルスを加えるか、又は50μg/mlのインフルエンザマトリクスペプチド(IMP)、GILGFVFTLを37℃にて1時間、DCに負荷した。細胞を3回洗浄し、24穴プレート(ファルコン)における1x106個の精製T細胞に3x104個のDCを加えた。培養7日後、T細胞を回収し、ユーロピウム放出アッセイを用いて細胞障害活性を調べた。
【0064】
細胞障害活性の測定:3x106個の標的細胞(HLA A2.1+、MHCクラスII陰性 T2細胞)を洗浄し、50μg/mlのインフルエンザマトリクスペプチドと共に又はそれなしで37℃にて1時間インキュベートした。洗浄した後、10%FCSを補完した1mlの培養培地にて3μlの蛍光増強リガンド(フィンランド、トゥルク、ワラック、BATDA)と共に37℃にて15分間、1x106個のT2細胞をインキュベートした。PBSにて細胞を少なくとも5回洗浄し、10%FCS培養培地に慎重に再浮遊した。96穴の平底プレートにてエフェクタ細胞と共に5x103個の標的細胞を37℃で2時間インキュベートした。エフェクタ:標的の比は45:1、20:1及び5:1であった。2時間後、96穴プレートを遠心し、各上清を新しい96穴プレートに移し、1420−002ビクターTMマルチラベルカウンタ(フィンランド、トゥルク、ワラック)で分析した。
【0065】
エンドサイトーシス活性及びTTの処理と提示の測定:2、3の実験では、サルスト(Sallusto et al., 1995)らにより記載されているようにFITCデキストランの取り込みを正確に測定した。破傷風トキソイドペプチド特異的T細胞クローンAS11.15(バーゼルのバーゼル免疫研究所のランザベキア博士より供与)を用いて、ちょうど記載されているように(Romani et al., 1996)破傷風トキソイドの抗原処理/提示の活性を調べた。
【0066】
サイトカイン及びPG E2のELISA:ELISAについては、マイクロタイタープレート(ヌンク マキシソープ(Maxisorb)II丸底)をIL−6(ファーミンジェン)、IL−1β、IL4、インターフェロン−γ、THF−α(すべて米国、ウォバーンのエンドジェンから入手)に特異的な抗体で4℃にて一晩被覆した。プレートを洗浄し、1%のヒト血清でブロックした。試料及び標準物質は3連一組で分析し、アビジン−ペルオキシダーゼ系でアッセイした。プロスタグランジンE2のELISAについては、調製済みのキット(英国、バッキンハンプシャー(Buckinhamshire)、アマシャムファルマシア)を用いた。405nmの波長にてELISAリーダ(フィンランド、トゥルク、ワラック)によりプレートを測定した。
【0067】
PBMC又はDCの凍結保存:20%のGMP品質のヒト血清アルブミン(ドイツ、マールブルグ、センテオン)+10%(最終容積濃度)のDMSO(米国、セントルイスのシグマ、カタログ番号2650)を含有する凍結培地にて、凍結培地1ml当たり10〜35x106個のPBMCにて完全自動型の凍結装置(フランス、ビュッシー・パリ、ニコールプラス、エアリキッド)(出発点+6℃、終点−120℃、Tx−40℃)を用いてPBMCを凍結した。凍結容積はバイアル当たり4.5mlを超えなかった。凍結された細胞は、56℃の温水槽で融解し、次いで5mlの冷却したハンクス平衡塩(米国、ウォーカーズビルのバイオウィタカー)に投入し、125g、4℃にて10分間一回遠心した。その後、上述のようにPBMCをプレートに蒔いた。培養5又は7日間でのDCの凍結については、我々は、細胞密度を5〜15x106個のDC/mlに減らしたが、凍結培地及び凍結手順は変更しないままだった。
【実施例1】
【0068】
(比較例):開放容器におけるDCの生成
PBMCからのDCの生成:
トゥルナー(Thurner, B. et al., J. Immunol. Methods 223, 1-15 (1999))が開示した方法に従って、85mmのディッシュ(細菌培養用ディッシュ、プライマリアディッシュ又は組織培養用ディッシュのいずれか、ファルコン、カタログ番号1005、3038又は3003:米国、ハーシーのベクトンディッキンソン)に、10mlの完全培養培地にて、ディッシュ当たり50x106個の細胞密度でPBMCを入れ、37℃及び5%CO2にて1時間培養した。顕微鏡で付着性を制御した後、非付着性分画を除き、10mlの新鮮で温かい完全培地を加えた(0日目)。非付着分画を遠心し、再付着のために新しい85mmの組織培養ディッシュにもう一回蒔いた。1時間後、「再び蒔いた」ディッシュから非付着分画を除いた。付着分画すべてを1日目まで培養し、次いで、緩やかに付着した細胞が剥がれないように慎重に培養培地を取り去り、GM−CSF(最終濃度、800U/ml)及びIL−4(最終濃度、1000U/ml)を含有する新しい培養培地を加えた。3日目にディッシュ当たり3mlの新鮮な培地(8000UのGM−CSFと10000UのIL−4を含有する)でサイトカインを再び加えた。5日目に全ての非付着性細胞を回収し、数を数え、3mlの培地中5x105個/ウエルの密度で6穴プレートに新鮮な完全培地(上述と同じ用量のサイトカインを含有する)で再び蒔いた。6日目にDCの成熟を誘導する別の刺激を加え、7又は8日目(予備実験では、9及び10日目も)に細胞を回収した。
前記方法により得られた成熟DCは以下の特性を有する(Thurner, B. et al., J. Immunol. Methods 223, 1-15 (1999)を参照のこと):
(a)サイトカインを取り除いて、さらに36時間培養しても形態的には安定している非付着性、不鮮明な細胞;
(b)フローサイトメトリでの解析により判定すると成熟DCの特徴的表現型を呈する;
(c)一次同種MLRにおいてDC:Tの比1:300以上にて強い同種刺激能を示し、IL−10の阻害効果に抵抗性である(一方、未成熟DC(成熟を誘導するMCMに暴露せずに、GM−CSF+IL−4で生成される)はこれらの特性を欠く);
(d)強い細胞障害性T細胞反応を誘導する;及び
(e)CD1aの表面発現を示す(一方、X−vivo15又はX−vivo20培地で生成されたDCはほとんどが、別の点では匹敵する表現型を示すが、表面CD1a分子を欠く)。
【実施例2】
【0069】
:ヌンクセルファクトリにおける樹状細胞の調製
A:ヌンクセルファクトリにおける新鮮PMBCからのヒト樹状細胞の調製のためのプロトコール
1.0日目におけるPBMCの平板培養:何個のPBMCが得られたかによって、相当する数の組織培養容器に装填することができる。各セルファクトリの組織培養ディッシュについて、各200mlの完全培地にて1200x106個のPBMCを蒔いた(例えば、3800百万個のPBMCがある場合:1200百万x3=3600百万;3個のセルファクトリに蒔き、残りはPBMCとして凍結保存する)。培養すべき細胞を50ml試験管に移し、もう1回遠心する(4℃、700rpm/110×gで10分間)。
真空ポンプを用いて上清を除き、培養すべきセルファクトリ当たり10mlの培養培地で沈殿物を取り上げ、再浮遊した(=細胞懸濁液)。セルファクトリ毎にラベルを付け(「患者名」)、190mlの培地を入れ、セルファクトリ当たり10mlの細胞懸濁液を加えた。慎重にディッシュを揺らした後、レベル間で平衡化し、1時間、インキュベータに入れた。
【0070】
2.1時間後の非付着性細胞の除去、培地の交換:60分後、反射光学顕微鏡のもとで、十分な(約70%のディッシュ表面が長めの細胞をしっかり付着させることによって覆われるべきである)細胞の培養ディッシュへの付着が達成されているかどうかをチェックした。
付着が十分であれば、細胞培養容器を慎重に撹拌することにより、非付着性分画を移動させ、非付着性細胞とともに培地を無菌の細胞培養ジャーに注ぎ込んだ。140mlの純粋RPMIを細胞培養容器に再び入れ、再び撹拌し、再び注ぎ出した。工程を再び繰り返し、200mlの完全培地を加え、平衡化し、新しい密封用リングと空気フィルタを適用した。10mlの注射器を用いて、注ぎだした培養培地から10ml取り、血液培養用ジャーに注入した。ジャーにラベルを付け、それを直ちにインキュベータに入れ、その後、細菌をチェックした。
実験台では一度に1つのディッシュだけを処理した。次いで、ディッシュを再び24時間インキュベータに入れた。
付着が十分ではない場合、非付着性分画の移動の開始前に、さらに15〜30分間ディッシュをインキュベータ内に残した。
非付着性分画を50mlの試験管に回収し、再び遠心した(18℃、900rpm/175×gにて10分間)。各セルファクトリの回収した非付着細胞を上述したように(再付着)100mlの完全培地中で1つのヌンクトリプルフラスコに再び蒔き、37℃にて60分間再びインキュベートした。上述したように、非付着細胞分画を再び除いた(非付着細胞は、GMP部門の外で処分することができ、又は免疫モニタリングのために凍結することができる)。
【0071】
3.1日目のサイトカインの添加:GM−CSFの添加:事前に温めた独自に穴を空けたジャーで、リューコマックス(登録商標)400を同封のNaCl(1ml)で溶解し、110mlのPBS/2%ヒト血清アルブミン(99mlのPBS+11mlの20%HSA、ベーリング製)により希釈した。続いて、等量を100本の無菌の1.5ml凍結試験管に入れ、−80℃で保存した。
IL−4の調製:元のバイアル中の乾燥粉末(Genzyme IL−4、4mg)を室温にして100μlのアクアアドインジェクトで溶解し、500μlのPBS/2%HSAで希釈した。等量を各50μlの無菌1mlの凍結試験管に入れ、−80℃で保存した。
さらなる使用については、IL−4アリコットをバイアル当たり450μlずつのRPMIで希釈した。培養ディッシュを慎重にインキュベータから取り出し、反射光学顕微鏡でチェックした。各セルファクトリについては、20mlの培養培地に加えて4800μlずつのGM−CSFと180μlずつのIL−4(総量240mlに対して)を調製し、各トリプルフラスコについては10mlの培養培地に加えて、2000μlずつのGM−CSFと75μlずつのIL−4(総量100mlに対して)を調製した(800U/mlのGM−CSF及び500U/mlのIL−4に相当する)。新しい培地を添加し、平衡化した。続いて、細胞をインキュベータに移し、再び48時間、インキュベータで維持した。
【0072】
4.3日目におけるサイトカインの添加:必要量のGM−CSFとIL−4を融解した。培養培地を温かい場所に保管した。各セルファクトリについては、40mlの培養培地に加えて6000μlずつのGM−CSFと225μlずつのIL−4(総量300mlに対して)を調製し、各トリプルフラスコについては20mlの培養培地に加えて、2600μlずつのGM−CSFと97.5μlずつのIL−4(総量130mlに対して)を調製した(800U/mlのGM−CSF及び500U/mlのIL−4に相当する)。
培養ディッシュを慎重にインキュベータから取り出し、反射光学顕微鏡でチェックした。新しい培地を添加し、平衡化した。続いて、細胞を再び48時間、インキュベータに移した。
【0073】
5.5日目におけるサイトカインの添加:必要量のGM−CSFとIL−4を融解した。培養培地を温かい場所に保管した。各セルファクトリについては、40mlの培養培地に加えて6000μlずつのGM−CSFと225μlずつのIL−4(総量300mlに対して)を調製し、各トリプルフラスコについては20mlの培養培地に加えて、2600μlずつのGM−CSFと97.5μlずつのIL−4(総量130mlに対して)を調製した(800U/mlのGM−CSF及び500U/mlのIL−4に相当する)。
培養ディッシュを慎重にインキュベータから取り出し、反射光学顕微鏡でチェックした。新しい培地を添加し、平衡化した。細胞を乱すために、ディッシュを慎重に揺らし、再びインキュベータに移した。
【0074】
6.6日目の成熟用カクテルの添加:実験台を稼動させながら、室温にて必要量のサイトカインを融解した(培養培地ml当たり10μlの成熟用カクテル)。成熟用サイトカインは溶解形態であり、完全培地のml当たりの10μlの成熟用カクテルの添加が以下に述べる濃度に相当するように濃縮した。
個々のサイトカインの最終濃度/mlは以下に相当する:
2ng IL−1β(インターロイキン1β)
1000U IL−6(インターロイキン6)
10ng TNF−α(腫瘍壊死因子α)
1μg PG E2(プロスタグランジンE2)
セルファクトリは:355ml、すなわち、セルファクトリ当たり3.55mlの成熟用カクテルを含有する。
トリプルフラスコ:156ml、すなわち、トリプルフラスコ当たり1.56mlの成熟用カクテル
容器をインキュベータから取り出し、反射光学顕微鏡下で評価した。上述の量にて成熟用カクテルをピペットでディッシュに加え、平衡化させ、再びインキュベータに移した。
【0075】
7.7日目における成熟樹状細胞の回収:
0日目及び5日目における培養培地の細菌チェックが満足できれば、すなわち、試料が無菌であることが判明すれば、DCの以下の最適なチェックを行う:
インキュベータから容器を取り出し、反射光学顕微鏡下で樹状細胞の表面を評価した。反射光学顕微鏡を用いて、ポラロイド写真を作成した。
細胞が良好な外観を有していれば(ほとんど死細胞がない、ほとんど付着していない、培養培地は赤く透明である、目に見える微生物はいない、汚染の兆候はない、SOP DC12、項目1も参照されたい)、4mlの細胞懸濁液をセルファクトリから取り出し、FACS解析を行うのに使用する。
FACS染色で十分なCD83の発現(>75%CD83陽性)が得られれば、細胞を回収することができる。CDE83の発現が未だ不十分であれば(<75%)、新しいFACS解析を行う前にもう3時間待つ必要がある。
細胞の回収については、セルファクトリ及びトリプルフラスコの内容物を50mlの試験管に移した。それぞれ100mlのRPMIで細胞培養容器をもう2回すすぐ。700rpm/110×g、4℃にて12分間の遠心分離。
細胞の凍結については、20%のDMSOを伴った自己血清(もう1つの方法として、20%のDMSOを伴った20%のヒト血清アルブミンと5%グルコース)を調製した(例えば、36mlの血清に4mlのDMSOを添加)。凍結用培地は氷上で冷却した。
参照の試験管(3.6ml)には、DMSOの最終濃度が10%になるように、凍結用培地を半分(1.8ml)入れ、純粋な血清(又は20%のHSA)を半分入れた。凍結装置を動かし始めた。
細菌検査を繰り返すために、10mlの上清を血液培養ジャーに移した。細胞を40mlの培養培地で処理した後、細胞数を数えるために40μlを取り出した。10μlの細胞懸濁液(それに10μlのトリパンブルーを加えた)をピペットでノイバウエル計算盤に入れ、製造元の指示書に従って、細胞を数えた。
さらなる品質制御試験に100万個のDCが必要とされ、もう100万個のDCは追加の1mlバイアルでロット対照として凍結した。
純粋な自己血清(又は20%HSA)で細胞を約2000万個/mlの濃度に濃縮し、氷上で冷却した。あらかじめラベルを付けた凍結用試験管を氷上で冷却し、それぞれの半分に冷却した細胞懸濁液を入れた(例えば、3.6mlの試験管にはそれぞれ1.8mlの細胞懸濁液)。いったん、凍結装置で試験管挿入の準備ができると、凍結用培地を冷却した細胞懸濁液に添加し、試験管をネジ込みの蓋で密封し、揺すって、凍結用装置に入れ、凍結工程を開始した。
凍結工程終了後(−130℃に達する)、試験管を液体窒素に移した。
【0076】
B:結果
上記のプロトコールにより9.26%のDCの収率を達成することができた(19人の患者の白血球分離採取法産物の平均値)。CD83の発現は89.53%であった。得られたDCは、実施例1のDCと比べて同一の特性を示した。
【図面の簡単な説明】
【0077】
本発明に係る装置の好ましい実施形態を図に示す。
【図1】積み重ね可能な盆状の試験槽を有する、本発明に係る装置の概略上面図を示す。
【図2】図1で示される装置の線X−Xに沿った断面図を示す。
【図3】図1及び図2に示す装置の充填装置を伴った概略三次元図を示す。
【図4】本発明に係る装置の第2の好ましい実施形態の概略上面図を示す。
【図5】線XII−XIIに沿った、図3に示す装置の断面図を示す。
【図6】本発明に係る装置の第3の好ましい実施形態の断面図を示す。
【図7】本発明に係る装置の第4の好ましい実施形態の断面図を示す。
【0001】
本発明は、無菌培養装置において造血系前駆細胞を培養することを含んでなる成熟し、且つ安定した樹状細胞又は未成熟樹状細胞を産出する方法、前記方法に好適な装置、並びに樹状細胞を培養するのに好適である末梢血単核細胞を調製する方法を提供する。
【背景技術】
【0002】
関連技術の考察
樹状細胞(DC)は、抗原提示細胞の系を構成し、リンパ球と相互作用することによって免疫を制御する。ほとんどのDCは、骨髄由来であり、免疫刺激性である(Banchereau, J., Steinman, R.M., Nature 392, 245, (1998))。これら古典的なDCは、いくつかの方法で特殊化され、インビボでヘルパーT細胞及びキラーT細胞を感作する(「天然のアジュバント」)。最も重要なことに、末梢組織に存在する未成熟DCは、抗原を捕捉し、免疫原性のMHC−ペプチド複合体を産出する能力を備えている(「抗原処理の状態」)。炎症性サイトカイン(「危険」)のような成熟を誘導する刺激に応答して、これら未成熟DCは、接着分子及び共刺激分子をアップレギュレートすることにより、強力なT細胞刺激因子になり(「T細胞刺激の状態」)、同時に二次リンパ器官に移動して稀な抗原特異的T細胞を選択し、刺激する。組織又は血液から苦労して単離したDCは、試験管内で抗原を負荷し、成熟DCとして戻せば、インビボで免疫原性であることが判っている(Inaba, K. et al., J. Exp. Med., 178, 479, (1993); Inaba, K. et al., Int. Rev. Immunol., 6, 197, (1990); Hsu, F. J. et al., Nature Med., 2, 52, (1996))。これらのデータは、DCが、腫瘍や感染への免疫介在性の抵抗性に対して有効な免疫賦活剤であることを示唆している。
【0003】
造血系前駆細胞から大量に生体外でDCを生成する方法の開発は、そのようなDCを基にしたワクチン法をさらに詳細に探求するための前提条件である。GM−CSFがマウスの血液からDCを生成する鍵となるサイトカインであることが発見された(Inaba, K. et al., J. Exp. Med., 175, 1157, (1992))のに続いて、マウスの骨髄から(一次成熟)DCを生成するための簡単で、信頼性のある技術(Inaba, K. et al., J. Exp. Med., 176, 1693, (1992))が開発された。次いで、幾つかのグループが、そのようなDC子孫の注射は、腫瘍抗原を負荷すれば、マウスにおいてCD8+CTL介在性の腫瘍の緩解を誘導することを一様に実証した(Young, J. W., Inaba, K., J. Exp. Med., 183, 7, (1996); Schuler, G., Steinman, R. M., J. Exp. Med., 186, 1183, (1997)において概説)。ヒトのDCを生成する方法も練り上げられてはいるが、未だ、マウスのように標準化されてはいない。前駆細胞から生体外で生成されたDCはすでにヒトにワクチン接種し、疾患を治療するのに上手く使用されている(Bancherau, J. et al., Cell, 2001, 印刷中)。
【0004】
ヒトでは、GM−CSFとTNFαを鍵となるサイトカインとして用いて、稀な、増殖しているCD34+前駆細胞(Caux, C. et al., Nature, 360, 258, (1992); Siena, S. et al., Exp. Hematol., 23, 1463, (1995); WO 93/20185)、又はGM−CSFとIL−4(WO97/29182)の保護のもとで末梢血における頻度は高いが増殖していないCD14+前記細胞(単球)のいずれかからDCを生成することができる。1994年に導入されて以来(Sallusto, F., Lanzavecchia, A., J. Exp. Med., 179, 1109, (1994); Romani, N. et al., J. Exp. Med., 180, 83, (1994))、後者の方法が実験目的で広く使用されており、また、多数の理由においても、免疫療法について魅力的であると思われる。第一に、CD14+前駆細胞は豊富にあるので、ほとんどの場合、G−CSF(末梢血においてCD34+細胞及びさらに進んだ前駆細胞を増やすのに使用される)のようなサイトカインで患者を前処置する必要がない(Romani, N. et al., J. Immunol. Methods, 196, 137, (1996))。第二に、この方法で生成したDCはある程度均質であると思われ、未成熟な状態又は完全に分化した又は成熟した状態で産出することができる。第三に、FCS(ウシ胎児血清)のような非ヒトタンパク質を避けることができ、成熟刺激として自己単球で調整した培地を使用することによって完全に且つ不可逆性に成熟した且つ安定なDCを得ることができることが示された(Romani, N. et al., J. Immunol. Methods, 196, 137 (1996); Bender, A. et al., J. Immunol. Methods, 196, 121 (1996))。(感染性及び免疫原性のために)有害である可能性があり、標準化されていない(使用する特定のFCSバッチによって後代のDCの質は顕著に変化する)ので、FCSを回避することが望ましい。
【0005】
さらに、以下の特許/特許出願が樹状細胞の産出を開示している:
EP−A−0 922 758号は、マクロファージ又は樹状細胞のいずれかの特徴を発現する能力を有する多能性細胞に由来する未成熟樹状細胞からの成熟樹状細胞の産出を開示しており、前記方法は、IFNαを含む樹状細胞成熟因子に未成熟樹状細胞を接触させることを含んでなる。
EP−B−0 633930号は、
(a)ヒトCD34+造血系細胞を(i)GM−CSF、(ii)TNFαとIL−3、又は(iii)GM−CSFとTNF−αとともに培養し、それによってCD1a+造血系細胞の形成を誘導する工程;と
(b)前記培養から前記CD1a+ヒト樹状細胞を回収する工程
とを含んでなるヒト樹状細胞の産出を開示している。
WO 95/28479号は、末梢血細胞を単離すること、CD34抗原を発現する血液前駆細胞をそれから濃縮すること、及び造血系増殖因子とサイトカインとの組み合わせで前記細胞を増やすことを含んでなる樹状細胞の調製方法を開示している。
【0006】
成熟DCは多数の理由で免疫療法について未成熟なものに対して好ましいと思われる。成熟DCの後代細胞だけがM−CSF−Rを欠いており、M−CSFを除いた場合/その非存在下で相変わらず安定なままである(Romani, N. et al., J. Immunol. Methods, 196, 137 (1996))。成熟DCは、IL−10(Steinbrink, K. et al., J. Immunol., 159, 4772 (1997); Steinbrink, K. et al., (1998))又はVEGF(Gabrilovich et al., Nature Med., 2, 1096, (1996))のような(腫瘍由来の)阻害因子に抵抗性であるが、未成熟なものはそうではない。成熟DCはまた、インビトロで(Sallusto, F., Lanzavecchia, A., J. Exp. Med., 179, 1109 (1994); Romani, N. et al., J. Immunol. Methods, 196, 137 (1996); Bender, A. et al., Immunol, Methods, 196, 121 (1996); Reddy, A. et al., Blood, 90, 3640 (1997); Inaba et al., J. Exp. Med., 175, 1157 (1992); Inaba et al., J. Exp. Med., 176, 1693 (1992); Larsson, M. et al., J. Immunol., 165(3), 1182-90 (2000年8月1日); Jonuleit, H. et al., J. Exp. Med., 192(9):1213-22(2000年11月6日))及びインビボで(Dhodapkar, M.V. et al., J. Exp. Med., 193(2):233-8(2001年1月15日)及びJonuleit, H. et al., Int. J. Cancer., 93(2):243-51(2001年7月15日))T細胞反応を誘導するのに優れていることも明らかにされている。実際のところ、未成熟DCは、調節性T細胞を誘導することにより、インビトロで(Jonuleit, H. et al., J. Exp. Med., 192(9):1213-22(2000年11月6日))並びにインビボで(Dhodapkar, M.V. et al., J. Exp. Med., 193(2):233-8(2001年1月15日))トレランスを誘導することさえできる。従って、成熟DCは、トレランスを誘導するために免疫性、未成熟DCを誘導するのに好ましい。
【0007】
CD14+単球前駆細胞からDCを発生させる上記方法はさらに改変され、DCに基づいた更に大掛かりなワクチン接種試験を行うために臨床的に実用化されている(Thurner, B. et al., J. Immunological Methods 223, 1-15 (1999))。GMP(製品管理及び品質管理規則)指針に合わせて実施することができ、DCを生成するための複数回の採血の必要性を回避する再生可能なDC生成方法(ヒトにおけるDCに基づいたワクチン接種のアプローチには必須である)を提供するために、白血球分離採取法産物(出発集団としての繰り返し採血した新鮮血ではなく)からの完全に成熟したDCの再生可能な生成ができるような改変が導入された。特に前記方法では、出発集団としての白血球分離採取法産物とともに使用するために二工程法(GM−SF+IL−4で感作した後、単球で調整した培地で成熟させる)によってCD14+単球から成熟DCを生成した。幾つかの順応が必要であった。改変付着工程は、アフェレーシス単核細胞からCD14+DC前駆細胞を確実に濃縮するために必要であることが開示された。培養開始時でのGM−CSF+IL−4の添加は不利であることが判ったので、24時間遅らせた。アフェレーシス細胞からのDCの発生は、新鮮血やバフィコートからよりも速く、7日後に完了した。6日目に添加した単球で調整した培地によって、24時間後すでに完全に成熟し且つ安定したDC(≧85%がCD83+、p55/ファシン+、CD115/M−CSF−R−、CD86++のような特徴的な表現型を持つ不鮮明な、移動性の高い且つT細胞感作性の細胞)を生じた。成熟DCの後代細胞はサイトカインの非存在下でさらに1〜2日培養しても安定で且つ生きたままであり、IL−10の阻害作用に抵抗性であることが示された。PBMC(末梢血単核細胞)の凍結試料からDCを生成するために、又は後で使用するために成熟DC自体を凍結するために凍結条件が確立された。そのアプローチによって、互いに比較することができる正常なDCに基づいたワクチン接種試験を行うのに好適である多数の標準化されたDC(5〜10x108個の成熟CD83+DC/白血球分離採取)が得られる。
【0008】
アフェレーシス細胞を出発集団として使用すると、TNF−α自体は成熟への刺激に不十分であることも判明した。最近、炎症誘発性(pro-inflammatory)サイトカイン、TNF−α、IL−1−β、IL−6及びプロスタグランジンE2から成るカクテルによってMCMを模倣できることが示されている(Jonuleit, H. et al., Eur. J. Immunol., 27, 3135 (1997))。これらは、MCMの主要な構成成分である。また、TNF−α+プロスタグランジンE2の組み合わせ(Rieser, C. et al., J. Exp. Med., 186, 1603 (1997))はさらに変異が大きいが、このMCMはほとんどの場合、このカクテルと同じくらい有効であった。1%の自己血漿を補完したX−vivo15又は20培地が、最近、完全に成熟したDCの生成に推奨されている(Jonuleit, H. et al., Eur. J. Immunol., 27, 3135 (1997))。しかしながら、RPMI培地がさらに優れていることが判明した。興味深いことに、X−vivo培地で生成されるDCは、CD1a陰性又は弱陽性であるが、RPMI培地の使用によってCD1a分子を発現した完全に成熟したDCを生じる。出発集団としての白血球アフェレーシス産物とともに使用するための方法への適応によって、DCを生成するために繰り返し採血する必要性が未然に防がれ、それは、トゥルナー(Thurner, B. et al., J. Immunol. Methods 223, 1-15 (1999))によって確立された。一連のワクチン接種全体(≧5x108個の成熟CD83+DC/白血球分離採取)のためにDCを生成するのに一回きりの白血球分離採取で十分である。DCは、連続するワクチン接種のために凍結したPBMC試料から繰り返し生成されるか、又は最適な凍結プロトコールを用いて、後の使用に備えてアリコートに(in aliquots)凍結することができる大量のDCを得るために開始時にアフェレーシス産物全体を処理する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
しかしながら、上記方法における主要な欠点は、必要なDCの培養が一般に(大量の)開放系容器(ウエル又はフラスコ)で行われることである。種々の操作工程、すなわち、試薬を繰り返し添加又は除去することによって、全体の手順を制御された且つ無菌の条件下で処理することが困難になり、すなわち、GMP指針に準拠した製造方法は未だに利用可能ではない。しかしながら、そのようなGMP法は、産出されたDCが元来の提供者又はほかの受入者に戻すことが意図されている生体外のDCの増殖又は生成の手順(例えば、DCを基にしたワクチン接種処方計画の範囲内で)に対する重要な必要要件である。一方、2,3の論文が樹状細胞の産出における閉鎖系容器の使用を強調しているにすぎない(例えば、WO98/06826;Kowalski, K. L. et al., Blood, 88(10), suppl. 1, 111a (1996))。しかしながら、前記文献で利用される容器は、前記容器で産出されるDCの量に特定の制限を課す標準的な容器である。
【0010】
最後に、樹状細胞の実際の培養に先立つ工程、すなわち、患者からの好適な造血系前駆細胞の単離を円滑にするという一般的な必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
以下に特定する方法及び装置によって上記課題は解決した。特に、本発明は
(1)GMP(製品管理及び品質管理規則)指針に従って、成熟し且つ安定した樹状細胞又は未成熟の樹状細胞を産出する方法であって、該方法は少なくとも1つの樹状細胞分化/成熟因子の存在下で無菌の培養装置において造血系前駆細胞を培養することを含んでなり、前記培養装置は増殖領域を形成する拡張された内部表面を有し、それによって細胞が表面に付着する閉鎖系容器を含んでなる方法;
(2)増殖領域を形成する拡張された内部表面を有する閉鎖系容器を含んでなり、成熟し且つ安定した樹状細胞を産出するのに使用するための装置;及び
(3)樹状細胞の培養に好適である末梢血単核細胞を白血球分離採取法産物から調製する方法であって、水又は塩化アンモニウム水溶液の添加によって白血球分離採取法産物において赤血球(及び顆粒球の一部)を溶解することを含んでなる前記方法
を提供する。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、細胞は、容器の拡張された内部表面に付着する。容器の内部表面を拡張するために、容器は、主要な小部屋を含有してもよく、及び/又は、重合体材料などからできた粒子、例えば、ビーズ、球体、螺旋体、スポンジ様構造体、羊毛様構造体又は網様構造体、三次元網などで満たされてもよい。複数のこれら粒子によって、容器の表面積が拡張され、それによって細胞は、これら粒子の表面に付着する。
【0013】
本発明によれば、該粒子はいかなる三次元構造を有することもできる。例えば、ナイロン、羊毛、レイティング(ratings)、螺旋体、スポンジ様構造体などを使用することができる。
【0014】
本発明の好ましい実施形態によれば、容器は少なくとも2つの流状連通試験槽を含み、それによって各試験槽が増殖領域を規定する。この種の容器は、多数の試験槽に容器を分離する1以上の分離壁を有する。本発明によれば、試験槽は流状に接続する。従って、唯一の主入口開口部を持ち、それを介して培養されるべき細胞を含有する流体を挿入することができる装置を提供することができる。好ましくは、流状に連通する手段を介して、流体は試験槽の間に規則正しく分割される。
【0015】
好ましくは、容器が連通状態において保持されなければならない方法において連通手段は、試験槽の間に配置される。この状態においてのみ、容器の流体は試験槽間に均等に分配される。容器が培養状態又は培養位置に保持されれば、試験槽は互いに流状に連通しないので、流体は、この状態では一方の試験槽からもう1つの試験槽に流れることはない。
【発明を実施するための最良の形態】
【0016】
図1〜7を参照して、本発明の実施形態(1)の方法にも好適である本発明の実施形態(2)の培養装置について以下説明する。図1及び図2は、成熟した且つ安定した樹状細胞又は未成熟の樹状細胞を産出するのに使用することができる装置の第1の好ましい実施形態を示す。示された装置は、図2に示すように積み重ねが可能である、積み重ね可能な盆状の手段10を含む。各盆状の手段10は、底部12及び底部12を取り囲む側壁14を有する。1つの盆状手段10をもう1つの盆状手段10の上に積み重ねることによって、底部12がさらに上部の役目をするので、図2に示すように2つの盆状手段10を積み重ねることによって試験槽16が形成される。最上の盆状手段10は、最上の盆状手段10の底部12の下にある試験槽16の蓋を形成する。
【0017】
各盆状手段10は、隣接する試験槽16に接続するための少なくとも1つの手段18を有する。示された好ましい実施形態の範囲内では、各盆状手段10は隣接する試験槽16の流状接続のために2つの手段18を含む。流状接続のための手段18は好ましくは、円筒状の中空の突起として形成される。言い換えれば、流状接続のための手段18はパイプ又は管として形成される。これら管のそれぞれは、底部12の底表面22から離れて配置される開口部20を有する。開口部20の反対側にて、各管は、底部12の面に配置される第2の開口部24を有する。この第2の開口部24は隣接する試験槽16に対して開口する。
【0018】
図2は、培養状態又は培養位置での装置を示す。この水平位置では、流体は、底表面22に配置され、それによって細胞は底表面22に付着する。従って、盆状手段10全体及び少なくとも底部12は、ポリカーボネート、ポリスチレン及びポリオレフィン類を含むが、これらに限定されないプラスチック材から作製される。もう1つの方法として、細胞が底表面22に付着するように、底部12の前記材料を、好適な付着介在手段、例えば、Ig(免疫グロブリン)被覆(IgG被覆を含む)、又は単球の表面分子(CD14、CD16を含む)に対する抗体で被覆するように被覆することができる。
【0019】
示された培養状態では、各試験槽16は、流体が管18の開口部20より高くなるレベルまで満たすとよい。記載される方法について示される装置を使用することによって、流体のレベルはさらにはるかに低くなる。流体の厚さは約3mmである。
【0020】
示された試験槽16の流状接続については、管18が底に配置されるように、図2に示す装置を90°回転する(図1)。従って、流体26は、管18を介して試験槽16間に均等に分配される。
【0021】
一番下の盆状手段10の管18の開口部24は蓋28により閉鎖される。培養に使用されない最上の盆状手段10は、管18に挿入された管状部30を有する。管状部30の一方は、管状部30の開口部を無菌的に閉鎖する蓋32により閉鎖される。蓋32は、管30から剥ぎ取ることができるストライプ34に接続される。図2に示すように、他方の管状部はすでに開口しており、すなわち、蓋32は外されていた。従って、主入口開口部36を形成する管状部30の開口部36を介して流体を試験槽16に充填することができる。主開口部36を介してどの試験槽にも流体が充填される。流体が充填される一方で、装置をすでに培養状態に保持することができる。流体の入口開口部及び/又は出口開口部として各管状部30を使用することができる。培養状態では各試験槽16における流体の上の領域は気体で満たされる。例えば、試験槽16を介して、5%CO2の空気をポンプで送ることによりこの気体を交換することができる。
【0022】
図3に示すように、接続のために、1つ、又は好ましくは2つのフィルター128を手段18に接続することができる。フィルター128は空気供給のために提供され、そのためにフィルターは漏出耐性である。接続のための追加の手段18又は接続のための2つの手段18の1つと共に(図1及び図2)、注入/排出装置130を接続する。装置130は、好ましくはPVCからできた管状アダプタ又は三方コック132を提供する。アダプタ132を介してチュービング140によってバッグ134、136、138の1つを接続することができる。チュービング140には、管140の1つを閉鎖する/開放するための締め具142又はそのほかの種類の開閉装置が提供され、すなわち、図1及び図2に示されるような装置にバッグ134,136,138の1つを接続する、又は接続を断つ。バッグ134,136,138の代わりに、培地を貯蔵する又は回収するためのそのほかの種類の試験槽様の手段を提供することができる。
【0023】
上記バッグ134,136,138は、例えば、PBMC、培地又は非付着性分画(NAF/廃棄物)を含有してもよい。装填の設定では、PBMCを含有するバッグ134を熱シールによって装置130のPVCチュービングに接続する。次いで、それぞれの締め具142を開放して細胞(例えば、完全培地240mlにおける約120x106個)を二重トレイのセルファクトリに移す。慎重に均衡化した後、セルファクトリを37℃及び5%CO2のインキュベータに入れる。1時間後、装置130のPVCチュービングを介してNAF/廃棄物バッグ138に非付着性分画(NAF)を移す。セルファクトリを(例えば、純粋な培地1640にて)洗浄する。その後、培地(例えば、240mlの完全培地)を添加し、両トレイ上に均等に分配する。システムを開放することなく、熱シールによって各バッグ136は、常に接続され、接続を断たれる。
【0024】
セルファクトリの養分補給設定では、培地を含有するバッグ136が熱シールによってPVCチュービング130に接続され、内容物がセルファクトリに移される。セルファクトリの成熟設定では、成熟刺激を含有するバッグ136が熱シールによってPVCチュービング130に接続され、内容物がセルファクトリに移される。セルファクトリの回収設定では、各バッグ138が熱シールによってPVCチュービング130に接続される。穏やかに再浮遊した後、システムを開放することなく、非付着性細胞をDCバッグ138の中に移す。次いでセルファクトリを培地で満たし、ゆるやかに付着した細胞を移動させ、第2のDCバッグに回収をもする。次いで双方のDCバッグをシステムとの接続から外す。
【0025】
図4及び図5に示す第2の実施形態は、分離壁40,42,44及び46を有し、そのために、示された実施形態においてこれら分離壁40,42,44、46が、3つの試験槽49,50及び52(図5)を形成する、ビン状容器である。試験槽の数はさらに多くてもよい。上の試験槽49は、図5では水平である底部42と側壁40及び44とを有する盆状手段でできている。底部42は表面48を有し、本発明の方法に従って細胞がその上に付着する。図5に示されるように培養状態又は培養位置において流体が試験槽49の内側に保持されるように、底部42は、容器の全高に伸びる側壁54及び56に密封可能に接続される。側壁40及び44も密封可能に壁54及び56に接続される。上の壁48に近接して、各側壁40,44は、それぞれ開口部60及び62を有する。
【0026】
中間試験槽60も、側壁54及び56に密封可能に接続される底部42及び側壁40を有する。側壁40の反対側に、中間試験槽50は、開口していない側壁46を有する。従って、側壁46は、底部42、上の試験槽49の側壁44及び側壁54及び56に密封可能に接続される。さらに、中間試験槽50は、底部42に密封可能に接続され、中間試験槽50に開口する開口部66を有する管状突起64を有する。開口部66の反対側に、管64は、下の試験槽52に向かって開口する、底部42の面における第2の開口部68を有する。
【0027】
側壁70、底壁72及び側壁70に対向する側壁74によって下の試験槽52の境界が形成される。側壁70は、底壁72から上壁58まで伸びている。
【0028】
側壁74の範囲内で開口部76が形成される。開口部76は蓋80(図5)で閉じられる管状突起78を有する。蓋80の範囲内で、空気が容器に入ることができるように疎水性フィルタ82が配置される。
【0029】
同一量の流体26で試験槽49,50及び52を満たすために、矢印80の方向で管状突起78及び開口部76を介して流体が試験槽に充填されるように、図4に示すようにビン状装置を保持する。この連通状態で装置が保持されれば、破線の矢印によって図5で示されるように流体は試験槽の中を流れる。先ず最初に、下の試験槽52において矢印84の方向に流体は流れる。下の試験槽52から、側壁44における開口部62を介して上の試験槽48と下の試験槽52を接続する水路89において矢印86の方向に流体は流れる。水路89は側壁70と対向する側壁46及び44とからできている。さらに、中間試験槽50において管64及び開口部66を介して矢印88の方向に流体は流れる。試験槽49、50、52が同一量の流体で均等に満たされれば、流体が平坦な底部42及び72の上で均等に分配されるように、ビン状装置を図5に示す位置に回転する。本発明の図1〜5に基づいた好適な無菌培養装置はヌンク(Nunc)セルファクトリ及びヌンクトリプルフラスコである。
【0030】
本発明のさらなる実施形態では、容器の拡張された内部表面(22、48)は、1以上の規則正しい又は不規則な形状の構造体又は粒子によって形成され、それによって、細胞は容器の内部表面及び/又は前記粒子の表面に付着する。好適な構造体及び粒子は、上述のようなビーズ、球体、螺旋体、巻き上げたホイル又はフィルム、スポンジ状、羊毛状又は網状の構造体、三次元の網などである。
【0031】
成熟した且つ安定した樹状細胞を産出するための連続又は非連続の流体灌流法において前述した本発明の2つの好ましい実施形態を使用することもできる。このためには、管状部(30)(図2)及び管状突起28(図5)を柔軟性のある管などに接続することができる。それぞれ試験槽16及び49、50、52において流体をポンプで動かせるように、柔軟性のある管をペリスタポンプ又はもう1つの流体輸送用装置に接続する。
【0032】
試験槽の中で流体を分配するために、特に、細胞が付着する底表面22、48の上で流体を分配するために、装置を移動させるか、又は傾けることができる。
【0033】
第3の好ましい実施形態(図6)によれば、培地は柔軟性のある管90を介してポンプで運ばれる。管90は2つの試験槽92に分離する。試験槽92の内側で、細胞は、これら試験槽の表面又は試験槽92の内側に配置された粒子に付着する。流体は、矢印94の方向に連続的に又は非連続的に運ばれる。2つの試験槽は、流体が試験槽92を通過した後、再び管90に接続される。試験槽92を介して流体を運ぶために、ポンプ96、特に、ペリスタポンプが使用される。
【0034】
各試験槽92は底表面98を有する。底表面98の反対側には、空気透過性の表面100が施される。これら表面100は空気透過性ではあるが、流体は透過しない。表面100を介して気体は試験槽92を通り抜け、中間の気体試験槽102に入ることができ、逆もできる。気体を供給し、気体試験槽102から分散されるように、各気体試験槽102は、それぞれ共通の入口開口部104及び出口開口部106に接続される。図5に示す実施形態は、特に非連続的な流体供給に使用することができる。
【0035】
もう1つの好ましい実施形態(図7)は、2以上の試験槽124に流体を連続して供給するのに使用される。各試験槽124は、例えば、波状構造の使用によって拡張された表面を有する底表面107を有する。2つの試験槽124は、共通の柔軟性のある管126に接続される。矢印108の方向で試験槽124に培地を供給するために、ポンプ110、特にペリスタポンプが使用される。矢印112の方向で試験槽124を流れ出て柔軟性のある管126に入る培地は、気体交換装置114に運ばれる。気体交換装置の範囲内で、管は、気体透過性且つ液体非透過性の表面116を有する。表面116を介して、柔軟性のある管126と気体交換装置114との間で気体が交換される。従って、気体交換装置は、入口開口部118及び出口開口部120を有する。
【0036】
細胞が管126や気体交換装置114にポンプで運ばれるのを防ぐために、試験槽124を傾けて、細胞がその重量により試験槽104の範囲内に留まるようにすることができる。
【0037】
容器(装置)の試験槽及び/又は試験槽の内部での規則正しい又は不規則な形状の粒子及び構造体は好ましくは、25〜10000cm2の、好ましくは500〜5000cm2の有効表面、すなわち、容器の内側表面の増殖面積を提供する。本発明に従って、その面積はプラスチック、好ましくは、ポリカーボネート、ポリスチレン又はポリオレフィンから作られる。本発明の好ましい実施形態では、容器の内側表面、好ましくは、盆状手段10及び規則正しい又は不規則な形状の構造体又は粒子の表面を含む内側表面の増殖領域は、付着介在性作用物(単球を付着させる作用剤を含む)で被覆される。好適な付着介在性作用物は、Ig被覆(IgG被覆を含むがこれに限定されない)、細胞表面タンパク質に対する抗体による被覆(抗CD14又は抗CD16抗体による被覆を含むが、これに限定されない)、接着分子(E−セレクチン及びP−セレクチンのようなセレクチン及び/又はVCAM−1のような免疫グロブリンスーパーファミリーの一員を含むが、これらに限定されない)による被覆、などである。
【0038】
実施形態(1)の成熟及び未成熟の樹状細胞の生成、すなわち、前駆細胞の培養は、公知の方法に類似して行われる。好適な前駆細胞は、多能性細胞、樹状細胞前駆細胞又は未成熟の樹状細胞であり、好ましくは、前記造血系前駆細胞は、
(i)CD14+単核細胞(単球)、CD34+細胞、又は血液から直接得られる、及び/又は
(ii)白血球分離採取法産物、懸濁分離(エルトリエーション)プロトコール、末梢で採取した血液又は骨髄に由来する樹状細胞前駆細胞である。
例えば、前駆細胞は(及びDCも)、その全体を本願に引用するトゥルナー(Thurner, B. et al., J. Immunol. Methods 223, 1-15 (1999))が開示した方法に従って白血球分離採取法産物から入手可能である。もう1つの方法としては、以下でさらに定義する本発明の実施形態(3)の方法によって白血球分離採取法産物から前記先駆細胞を単離することができる。培養は好ましくは以下の工程によって行われる。
(i)末梢血単核細胞を培養試験槽に適用し、試験槽の内側表面にそれらを付着させる工程、
(ii)非付着性細胞を除くために試験槽を洗浄する工程、
(iii)少なくとも1種の樹状細胞分化/成熟因子の存在下で培養培地にて付着性細胞を培養する工程、及び任意で
(iv)さらなる分化/成熟因子を培養培地に添加する工程、及び又は
(v)培養培地を除き、付着性細胞を洗浄し、工程(iii)と同一の又は異なった樹状細胞成熟因子を含む培養培地で付着性細胞を培養する工程。
【0039】
本発明の実施形態(1)の好ましい方式では、培養は、以下を含む。
(i)(有効な)増殖領域のcm2当たり3x105〜4x106個の前駆細胞を負荷すること、及び/又は
(ii)増殖領域が、十分に、好ましくは1〜5mmの培養培地で覆われるように培養領域cm2当たり0.01〜3ml、好ましくは0.1〜0.5mlの培養培地を加えること。特に、ヌンクトリプルフラスコ(500cm2の増殖領域を有する)には、20〜200mlの培養培地で150〜2000x106個の細胞を加え、ヌンクのセルファクトリ(2つ重ね:1200cm2の増殖領域を有する)には、100〜400mlの培養培地にて360〜4800x106個の細胞を加える。
【0040】
好適な分化因子は、GM−CSFとIL−4、IL−13、IL−5又はIFN−αとの混合物である。本発明の方法に好適な樹状細胞成熟因子には、MCM、IL−1β、IL−6、TNF−α、PGE2、INF−α、リポ多糖類及びそのほかの菌体産物(例えば、MPL(モノホスホリル脂質A)及びリポタイコ酸)、ホスホリルコリン、カルシウムイオノフォア、ホルボールエステル(例えば、PMA)、熱ショックタンパク質、ヌクレオチド類(例えば、ATP)、リポペプチド、トールライク受容体に対する人工リガンド、二本鎖RNA(ポリI:C)、免疫刺激性DNA配列、CD40リガンドなどが挙げられるが、これらに限定されない。最も好適な成熟因子は、IL−1β、IL−6、TNFα及びPGE2の混合物である。
【0041】
本発明の実施形態(3)の方法では、水による細胞溶解を行うのであれば、
(a)20〜30℃にて5〜30秒間、細胞溶解を行うこと;及び/又は
(b)白血球分離採取法産物と水の容積比が20:1〜2:1であることが好ましい。
【0042】
一方、塩化アンモニウム水溶液で細胞溶解を行うならば
(a)添加溶液における塩化アンモニウムの濃度が0.5〜5%(w/w)、好ましくは1〜3%(w/w)であること;及び/又は
(b)25〜50℃にて5〜20分間、細胞溶解を行うこと;及び/又は
(c)白血球分離採取法産物と塩化アンモニウムの容積比が20:1〜2:1であることが好ましい。
【0043】
上記方法は、さらに、反応を停止する工程及び/又は溶解産物を洗浄する工程及び/又は溶解産物を好適な培養培地(血漿又はタンパク質を含まない)又は塩溶液(例えば、やや低張の塩溶液)に浮遊させる工程を含んでもよい。
【0044】
特に、水による細胞溶解では、白血球分離採取法産物を50ml試験管(試験管当たり10ml)に入れ、遠心する(4℃にて1100rpmで12分間)。上清を捨て、20mlのアクアデスト(5〜30ml)を沈殿物に加え、それを再浮遊させ、20秒間(5〜30秒間)ボルテックスで撹拌し、30mlの完全培地で、好ましくは800U/mlのGM−CSFを補完して満たす。次いで、トゥルナー(Thurner, B. et al., J. Immunol. Methods 223, 1-15 (1999))により記載されたように懸濁液を洗浄する。細胞溶解はさらに大きな容器、例えば、白血球分離採取用バッグに入れた白血球分離採取法産物で行うことができ、それを遠心する(4℃にて1100rpmで12分間)。上清を捨て、50mlのアクアデストを加え、沈殿物を再浮遊し、20秒(5〜30秒)後、150mlの完全培地で満たし、上記のような洗浄工程に進む。
【0045】
塩化アンモニウムによる細胞溶解では、白血球分離採取法産物を50ml試験管(試験管当たり10ml)に入れ、遠心する(4℃にて1100rpmで12分間)。上清を捨てる。800U/mlのGM−CSFを補完した10mlの完全培地に沈殿物を再浮遊し、10ml(5〜20ml)の1.6%NH4Clを加える。懸濁液をよく振り、温水槽(37℃)に10(5〜15)分間入れ、上記のように洗浄工程に進む。上述の水による細胞溶解のように、この場合も、細胞溶解手順をさらに大きな容器で行うことができる。
【0046】
以下の非限定的な実施例によって本発明をさらに説明する。
【0047】
実施例
材料及び方法
臨床応用のためにDCを生成するのに開発されたプロトコールで採用した試薬及び材料はすべて、エンドトキシンを含まず、利用可能な限り、ほとんどは、GMP(製品管理及び品質管理規則)の品質であった。
【0048】
装置: 微生物学的に安全な実験台(ヘレウス(Heraeus), HERA safe HS 12/2);遠心分離機(ヘレウス、メガヒュージ2、ORS);インキュベータ(ヘレウス、サイトパーム2);−80℃のフリーザ(National Lab, Profimaster EPF);−20℃のフリーザ(Liebherr, GS 1382);冷蔵庫 レイブヘール(Liebherr) KB1001(Liebherr, ベルリン);透過型光学顕微鏡(Leica, DMLS);反射型光学顕微鏡(Leica, DMIL);ピペッティング補助 ピペットエイド(Drummond);ピペット, エッペンドルフリファレンス(Eppendorf);ノイバウエル(Neubauer)血球計算盤(スーペリアー・マリエンフェルド(Superior Marienfeld))
プラスチック材料
50mlの試験管、γ線照射による無菌の円錐底ポリプロピレン製試験管(コーニングコースター、製品番号430829);15mlの試験管、γ線照射による無菌の円錐底ポリプロピレン製試験管、1包装当たり25本(コーニングコースター、製品番号25315−15);γ線照射による無菌の、個別包装したピロゲンを含まない使い捨てのピペット(コーニングコースター、製品番号4485/1ml、4486/2ml、4487/5ml、4488/10ml、4489/25ml);無菌個別包装のピペットチップ(Biozym、Safeseal−Tips、製品番号790011/10μl、790101/100μl、791001/1000μl);無菌、エンドトキシンを含まない、個別包装の使い捨て滅菌フィルタ、0.22mm(ミリポア、ミレックス−GS、製品番号SBGS025SB);細胞培養用の表面を持つ培養ディッシュ、NUNCLON(登録商標)表面製品[ヌンクセルファクトリ、2つずつ重ねた、個別包装、独自包装、γ線照射により無菌、エンドトキシンを含まない(ヌンク、製品番号167695);細胞培養用ジャー、ヌンクトリプルフラスコ、γ線照射により無菌、エンドトキシンを含まない(ヌンク、製品番号1328867又は132913);細胞培養用6穴プレート、個別包装、オプティルクス(Optilux)表面、γ線照射により無菌、エンドトキシンを含まない(ファルコン/ベクトンディッキンソン、製品番号3046);空気フィルタ ミディサート(Midisart)2000(ザルトリウス、製品番号17805−G);凍結用試験管、無菌、エンドトキシンを含まない(ヌンク、ヌンククライオチューブバイアル、製品番号375418/1.8ml、337516/4.5ml);カニューレ:ステリカム(Stericam)0.9x70mm 20Gx2 4/5ルア、薄壁使い捨てカニューレ(ブラウン、製品番号04665791);ミクロランス 3 0.4x19mm 27G13/4 REF302200(ベクトンディッキンソン);無菌の外科用手袋、ラテックス製ペハ−タフト(ハートマン、製品番号9423 53/8(サイズ7)又は9423 54/7(サイズ7 1/2);無菌の外科用手袋ペハ−タフトシンテックス、ラテックスなし(ハートマン、製品番号9426 33/8(サイズ7))。
薬品
モルガモスティム(Molgramostim)(GM−CSF)(リューコマックス(Leukomax)(登録商標)400)、乾燥物質54.38mg及び1mlの無菌水(医薬品認可番号25756.03.00)(サンド、製品番号PZN−4608744);NaCl、0.9%、10mlバイアル(ブラウン、製品番号02246228);アクアアドインジェクショネム(aqua ad injectionem)、10mlバイアル(ブラウン、製品番号02240246);無菌、エンドトキシンを含まない、GMP品質のPBS(バイオウィタカー(Bio Whittaker)/セルバ(Serva)、製品番号17−512F);無菌、エンドトキシンを含まない、GMP品質の組み換えヒトIL−4(セルジェニックス);インターロイキン1b(アメダック(Amedak));インターロイキン6(ノバルティス);腫瘍壊死因子α(ベーリンガーインゲルハイム);プロスタグランジンE2、ミンプロスチン(Minprostin)(登録商標)(ファルマシア);70%アルコール(ラボセンター、ヌールンブルグ);バリーシダル(Barrycidal)(登録商標)36、殺菌剤(Helmut Schroder)
−インシジンプラス(Incidin Plus)(登録商標)(ヘンケル);無菌スポンジ ガジン、無菌、個別包装(ローマン、製品番号0197);無菌トリパンブルー 0.4%(シグマ、製品番号T−8154)。
【0049】
培養培地、サイトカイン、モノクローナル抗体(mAb)
以下の培養培地を用いた:最終濃度20μg/mlのゲンタマイシン(ドイツ、ダルムスタットのメルク、レフォバシン10)、最終濃度2mMのグルタミン(米国、ウォーカーズビルのバイオウィタカー、製品番号17−605)、及び加熱非働化(56℃で30分間した1%のヒト血漿を補完した標準培地RPMI1640(バイオウィタカー、製品番号12−167)を用いた(=さらに完全培地と呼ぶ)。ヒト血漿は、ヘパリン化(スイス、バーゼルのホフマンラロシュ製、Liquemin N 2500、20mlの血液当たり500I.U.)自己血漿(新しく採血して得る)又は10%ACD−A(酸クエン酸デキストロース処方A、ドイツ、Bad Homburg, Fresenius AG)血漿(白血球分離採取法により得る)のいずれかであり、若しくは、選択された実験については、輸血部門から、単一供血者で同種AB陽性ACD血漿を得た。もう1つの方法として、我々は、我々の標準培地と同じ方法で補完したX−VIVO15及びX−VIVO20(バイオウィタカー)を調べた。
【0050】
GMP品質の組換えヒトGM−CSF(800U/ml)(スイス、バーゼルのサンド、リューコマックス)及び組換えヒトIL−4(500U/ml)(オーストリア、ウィーンのノバルティス研究所、E.リール博士より供与)を標準培養法に用いた。ゲンザイム社(米国、マサチューセッツ州、ケンブリッジ)から入手した、GLP(製品管理及び品質管理規則)に準拠して製造され、GLP指針に準拠して調べられたヒトIL−4も使用した。
【0051】
成熟誘導のサイトカインとMCMを比較する実験では、10ng/mlの組換えヒトTNFα(オーストリア、ウィーンのベンダー社のアドルフ博士から供与)、1000U/mlのIL−6(スイス、バーゼルのノバルティスから供与)、10ng/mlのIL−1β(米国ミズーリ州、セントルイスのシグマ)及び1μg/mlのプロスタグランジンE2(米国ミシガン州、アナーバーのカイマンケミカル)を用いた。IL−10抵抗性実験については、10ng/mlの用量にてrhIL−10(米国マサチューセッツ州、ケンブリッジのゲンザイムコーポレーション)を用いた。
【0052】
フローサイトメトリについては、以下の抗原に対するモノクローナル抗体を用いた:CD1a(ドイツ、オルソダイアグノスティックシステム)、CD2、CD4、CD8、CD14、CD19、CD25、CD56、HLA−DR(すべて、ベルギー、ブリュッセルのベクトンディッキンソンから入手)、CD3、CD40、CD86(ドイツ、ハンブルグのCymbus、Dianova),CD83(フランス、Marseilesのイムノテック)、CD95(米国サンディエゴのファーミンジェン)、CD115(米国マサチューセッツのカルビオケム)。アイソトープ対照も並行して流した。
【0053】
細胞内FACS染色については、製造元の指示書に従って、フィックス&パーム(ドイツ、Eching, Biozol)により細胞を固定し、透過性にしてp55/抗ファシン(fascin)上清(Mosialos, G. et al., Am. J. Pathol., 148, 593 (1996))(K-2クローン、ボストンのランゴフ博士(Dr. E. Langhoff)より供与)により染色した。二次抗体として、Fcガンマ断片特異的で、蛍光を結合したアフィニピュアF(ab’)2ヤギ抗マウスIgG(ドイツ、ハンブルグ、Dianova, ジャクソン免疫研究所)を用いた。
【0054】
白血球アフェレーシス及びPBMCの単離
アフェレーシス産物の最初の処理:インフォームドコンセントを行った後、健常提供者又は黒色腫の患者から単球分離産物として、輸血部門より白血球分離採取法産物を得た(健常志願者は定期的な細胞分離(サイタフェレーシス)の供血者であり、黒色腫患者は、エリアンゲン−ヌールンベルグ(Eriangen-Nuerenberg)大学倫理委員会並びに米国ニューヨークのルードウィック癌研究所の国際審査会により認可されたフェーズIのDCワクチン接種試験の治療を受けていた)。細胞分離機として、コベスペクトラ(米国コロラド州、レイクウッドのCobe BCT社)又はフレセニウスASTEC204(ドイツ、Bad Homburg、フレセニウスAG)のいずれかを使用した。白血球細胞のセット及びMNCプログラムにコベスペクトラを用い、P1Y−セット及びMNCプログラムにフレセニウスASTEC204を用いた。白血球分離採取の間、製造元の指示書に従って、抗凝固物質として酸−クエン酸−デキストロース処方A(ACD−A、フレセニウス)を用いた。10%のACD−A(フレセニウス社)と共にPBS(米国、ウォーカーズビルのバイオウィタカー、製品番号17−512)により希釈した後(灌流シリンジを用いて、600mlの培養フラスコに白血球分離採取法産物を満たし、次いで、10%のACD−Aを含有するPBSを最終容量480mlで加える)、室温にて30分間460gでリンフォプレップ(1.077g/ml;ノルウェイ、オスロのニコメッドファーマ)にて遠心することによりPBMCを単離する(15mlのリンフォプレップに30mlの希釈した白血球分離採取法産物を重層する)。1mMのEDTAを含有するが、カルシウム又はマグネシウムを含まないPBSで3回細胞を洗浄し、最初は、250g、2回目は175g、3回目は110gでそれぞれ4℃にて12分間遠心した。
【0055】
自己単球で調整した培地(MCM)の生成
使用直前に、Igを被覆した細菌用プレート(85mm、ファルコン1005)を用意する。免疫グロブリンとして、我々はサンドグロビン(スイス、バーゼルのノバルティス)を用いた。10mlの希釈した(バイオウィタカーのカルシウム又はマグネシウムを含まないPBSにて)免疫グロブリン(10μg/ml)で室温にて10分間、被覆を行った。被覆操作後、カルシウム又はマグネシウムを含まないPBS(バイオウィタカー)で2回プレートをすすいだ。サイトカインを含まない完全培地中でこれらディッシュに50x106個のPBMCを入れ、5%CO2、37℃で20時間インキュベートした。次いで、単球調整培地を回収し、1360gにて10分間遠心し(22℃)、無菌的に濾過し(0.22μmのフィルタ、フランス、Molsheimミリポア)、−20℃にアリコットで(in aliquots)凍結した。単球調整培地の場合、ウエル(3ml容量を含有する)当たり、750μlのMCM、すなわち、20容積%加えた。もう1つの方法として、我々は、サイトカインのカクテル(IL−1β+IL−6+TNF−α、各10ng/ml)又はTNF−α単独(10−20−40ng/ml)を加えた。各成熟誘導刺激は、プロスタグランジンE2(1μg/ml)の有無との組み合わせにおいても調べた。培養培地、サイトカインも参照のこと。
【0056】
磁気セルソータ(MACS)によるCD14+単球の単離
製造元の指示書に従って、CD14微細磁気ビーズ(ドイツ、Bergisch-Gladbach, Miltenyi)(Miltenyi, S. et al., Cytometry, 11, 231 (1990))を用いた陽性選抜を行い、CD14+細胞を分離した。
【0057】
単球単離のための代替方法
A)アクアデストによる細胞溶解:白血球分離採取法産物を50ml試験管(試験管当たり10ml)に入れ、遠心した(4℃にて1100rpmで12分間)。上清を捨て、20mlのアクアデストを沈殿物に加え、20秒間ボルテックスで撹拌することによってそれを再浮遊させ、次いで800U/mlのGM−CSFを補完した30mlの完全培地で満たした。次いで、懸濁液を1100rpm、4℃にて12分間遠心し、上清を捨て、残りを50mlのPBS/EDTA(1mM)で満たした。得られた懸濁液を900rpm、4℃にて12分間遠心し、上清を捨て、残りを50mlのPBS/EDTA(1mM)で満たした。10μlの細胞懸濁液を細胞計数のために取り出した。懸濁液を800rpm、4℃にて12分間遠心し、上清を捨て、残りを完全培地(完全培地:500mlのRPMI1640、5mlの自己加熱非働化血漿、5mlのグルタミン及び200μlのゲンタマイシン)で満たし、通常の方法で培養容器に入れた/充填した。
【0058】
B)塩化アンモニウムによる細胞溶解:白血球分離採取法産物を50ml試験管(試験管当たり10ml)に入れ、遠心した。(4℃にて1100rpmで12分間)。上清を捨てた。10mlの完全培地(800U/mlのGM−CSFを補完した)で沈殿物を再浮遊し、10mlの1.6%NH4Clを加えた。得られた懸濁液をよく振り、温水槽(37℃)に5〜15分間入れた。その後、懸濁液を1100rpm、4℃にて12分間遠心し、上清を捨て、残りに50mlのPBS/EDTA(1mM)を満たした。次いで、懸濁液を900rpm、4℃にて12分間遠心し、上清を捨て、残りに50mlのPBS/EDTAを満たした。10μlの懸濁液を細胞計数のために取り出した。懸濁液を800rpm、4℃にて12分間遠心し、上清を捨て、残りに完全培地を満たし、通常の方法で培養容器に入れた/充填した。
【0059】
フローサイトメトリ:上記で列記したmAbのパネルによって細胞集団の表現型を分け、ロマーニ(Romani et al., J. Immunol. Methods, 196, 137 (1996))らが記載したようにFACScan(ファックスキャン)(ベクトン−ディッキンソン)で分析した。死細胞は、光散乱特性に基づいてゲートの外に出した。
【0060】
T細胞刺激性/機能性アッセイ:一次同種MLR:T細胞刺激性の機能を調べるために、段階的な用量にて同種T細胞にDCを加え、ゲンタマイシン、グルタミン及び5%の加熱非働化同種ヒト血清(単一供血者)を補完したRPMI1640中にて4〜5日間共にインキュベートした。2x105個のT細胞/ウエルで96穴平底プレートにて試験を行った。製造元の指示書(ドイツ、フランクフルトのTEBU)に従って、分離カラムを用いてT細胞を単離した。三連ウエルに12〜16時間、50μlの3Hチミジン(最終濃度4μCi/ml)加えることにより増殖を測定した。
【0061】
T細胞刺激性/機能性アッセイ:二次同種MLR:製造元の指示書に従ってCD4/CD45RAマルチソートキット(ドイツ、Bergisch-Gladbach, Miltenyi)により未処置のCD4T細胞を単離した。CD4+/CD45RA+細胞の純度は95%以上だった。ゲンタマイシン、グルタミン及び5%の加熱非働化同種ヒト血清(単一供血者)を補完したRPMI1640中にて、未処置のT細胞(3x106個/ウエル)をマクロウエル(24穴プレート、ファルコン)に蒔き、成熟DC(3x105個/ウエル)で刺激した。約3日後、T細胞をIL−2(米国、エメリービル、キロン、プロウキン(Proleukin))(50U/ml)で増殖させた。一次刺激の2週間後、一次刺激と同じ提供者から生成された成熟DCで同一条件下にてT細胞を再刺激した。再刺激のために、3x106個のT細胞+3x105個のDCを24穴プレートに蒔いた。48時間後、上清を回収し、−20℃で凍結し、後で、後述するように、ELISAアッセイによってサイトカインを測定した。
【0062】
インフルエンザウイルス特異的CTLの誘導;T細胞の調製:記載されているように(Bender et al., 1996)ノイラミニダーゼ(neuraminidase)処理したヒツジ赤血球とのロゼット形成によってTリンパ球を濃縮した。
【0063】
インフルエンザウイルス特異的CTLの誘導:HLA−A2.1陽性の提供者から調製された成熟DCを洗浄し、0.5〜1x107個/mlでRPMI1640に再浮遊した。最終濃度1000HAU/mlでインフルエンザ生ウイルスを加えるか、又は50μg/mlのインフルエンザマトリクスペプチド(IMP)、GILGFVFTLを37℃にて1時間、DCに負荷した。細胞を3回洗浄し、24穴プレート(ファルコン)における1x106個の精製T細胞に3x104個のDCを加えた。培養7日後、T細胞を回収し、ユーロピウム放出アッセイを用いて細胞障害活性を調べた。
【0064】
細胞障害活性の測定:3x106個の標的細胞(HLA A2.1+、MHCクラスII陰性 T2細胞)を洗浄し、50μg/mlのインフルエンザマトリクスペプチドと共に又はそれなしで37℃にて1時間インキュベートした。洗浄した後、10%FCSを補完した1mlの培養培地にて3μlの蛍光増強リガンド(フィンランド、トゥルク、ワラック、BATDA)と共に37℃にて15分間、1x106個のT2細胞をインキュベートした。PBSにて細胞を少なくとも5回洗浄し、10%FCS培養培地に慎重に再浮遊した。96穴の平底プレートにてエフェクタ細胞と共に5x103個の標的細胞を37℃で2時間インキュベートした。エフェクタ:標的の比は45:1、20:1及び5:1であった。2時間後、96穴プレートを遠心し、各上清を新しい96穴プレートに移し、1420−002ビクターTMマルチラベルカウンタ(フィンランド、トゥルク、ワラック)で分析した。
【0065】
エンドサイトーシス活性及びTTの処理と提示の測定:2、3の実験では、サルスト(Sallusto et al., 1995)らにより記載されているようにFITCデキストランの取り込みを正確に測定した。破傷風トキソイドペプチド特異的T細胞クローンAS11.15(バーゼルのバーゼル免疫研究所のランザベキア博士より供与)を用いて、ちょうど記載されているように(Romani et al., 1996)破傷風トキソイドの抗原処理/提示の活性を調べた。
【0066】
サイトカイン及びPG E2のELISA:ELISAについては、マイクロタイタープレート(ヌンク マキシソープ(Maxisorb)II丸底)をIL−6(ファーミンジェン)、IL−1β、IL4、インターフェロン−γ、THF−α(すべて米国、ウォバーンのエンドジェンから入手)に特異的な抗体で4℃にて一晩被覆した。プレートを洗浄し、1%のヒト血清でブロックした。試料及び標準物質は3連一組で分析し、アビジン−ペルオキシダーゼ系でアッセイした。プロスタグランジンE2のELISAについては、調製済みのキット(英国、バッキンハンプシャー(Buckinhamshire)、アマシャムファルマシア)を用いた。405nmの波長にてELISAリーダ(フィンランド、トゥルク、ワラック)によりプレートを測定した。
【0067】
PBMC又はDCの凍結保存:20%のGMP品質のヒト血清アルブミン(ドイツ、マールブルグ、センテオン)+10%(最終容積濃度)のDMSO(米国、セントルイスのシグマ、カタログ番号2650)を含有する凍結培地にて、凍結培地1ml当たり10〜35x106個のPBMCにて完全自動型の凍結装置(フランス、ビュッシー・パリ、ニコールプラス、エアリキッド)(出発点+6℃、終点−120℃、Tx−40℃)を用いてPBMCを凍結した。凍結容積はバイアル当たり4.5mlを超えなかった。凍結された細胞は、56℃の温水槽で融解し、次いで5mlの冷却したハンクス平衡塩(米国、ウォーカーズビルのバイオウィタカー)に投入し、125g、4℃にて10分間一回遠心した。その後、上述のようにPBMCをプレートに蒔いた。培養5又は7日間でのDCの凍結については、我々は、細胞密度を5〜15x106個のDC/mlに減らしたが、凍結培地及び凍結手順は変更しないままだった。
【実施例1】
【0068】
(比較例):開放容器におけるDCの生成
PBMCからのDCの生成:
トゥルナー(Thurner, B. et al., J. Immunol. Methods 223, 1-15 (1999))が開示した方法に従って、85mmのディッシュ(細菌培養用ディッシュ、プライマリアディッシュ又は組織培養用ディッシュのいずれか、ファルコン、カタログ番号1005、3038又は3003:米国、ハーシーのベクトンディッキンソン)に、10mlの完全培養培地にて、ディッシュ当たり50x106個の細胞密度でPBMCを入れ、37℃及び5%CO2にて1時間培養した。顕微鏡で付着性を制御した後、非付着性分画を除き、10mlの新鮮で温かい完全培地を加えた(0日目)。非付着分画を遠心し、再付着のために新しい85mmの組織培養ディッシュにもう一回蒔いた。1時間後、「再び蒔いた」ディッシュから非付着分画を除いた。付着分画すべてを1日目まで培養し、次いで、緩やかに付着した細胞が剥がれないように慎重に培養培地を取り去り、GM−CSF(最終濃度、800U/ml)及びIL−4(最終濃度、1000U/ml)を含有する新しい培養培地を加えた。3日目にディッシュ当たり3mlの新鮮な培地(8000UのGM−CSFと10000UのIL−4を含有する)でサイトカインを再び加えた。5日目に全ての非付着性細胞を回収し、数を数え、3mlの培地中5x105個/ウエルの密度で6穴プレートに新鮮な完全培地(上述と同じ用量のサイトカインを含有する)で再び蒔いた。6日目にDCの成熟を誘導する別の刺激を加え、7又は8日目(予備実験では、9及び10日目も)に細胞を回収した。
前記方法により得られた成熟DCは以下の特性を有する(Thurner, B. et al., J. Immunol. Methods 223, 1-15 (1999)を参照のこと):
(a)サイトカインを取り除いて、さらに36時間培養しても形態的には安定している非付着性、不鮮明な細胞;
(b)フローサイトメトリでの解析により判定すると成熟DCの特徴的表現型を呈する;
(c)一次同種MLRにおいてDC:Tの比1:300以上にて強い同種刺激能を示し、IL−10の阻害効果に抵抗性である(一方、未成熟DC(成熟を誘導するMCMに暴露せずに、GM−CSF+IL−4で生成される)はこれらの特性を欠く);
(d)強い細胞障害性T細胞反応を誘導する;及び
(e)CD1aの表面発現を示す(一方、X−vivo15又はX−vivo20培地で生成されたDCはほとんどが、別の点では匹敵する表現型を示すが、表面CD1a分子を欠く)。
【実施例2】
【0069】
:ヌンクセルファクトリにおける樹状細胞の調製
A:ヌンクセルファクトリにおける新鮮PMBCからのヒト樹状細胞の調製のためのプロトコール
1.0日目におけるPBMCの平板培養:何個のPBMCが得られたかによって、相当する数の組織培養容器に装填することができる。各セルファクトリの組織培養ディッシュについて、各200mlの完全培地にて1200x106個のPBMCを蒔いた(例えば、3800百万個のPBMCがある場合:1200百万x3=3600百万;3個のセルファクトリに蒔き、残りはPBMCとして凍結保存する)。培養すべき細胞を50ml試験管に移し、もう1回遠心する(4℃、700rpm/110×gで10分間)。
真空ポンプを用いて上清を除き、培養すべきセルファクトリ当たり10mlの培養培地で沈殿物を取り上げ、再浮遊した(=細胞懸濁液)。セルファクトリ毎にラベルを付け(「患者名」)、190mlの培地を入れ、セルファクトリ当たり10mlの細胞懸濁液を加えた。慎重にディッシュを揺らした後、レベル間で平衡化し、1時間、インキュベータに入れた。
【0070】
2.1時間後の非付着性細胞の除去、培地の交換:60分後、反射光学顕微鏡のもとで、十分な(約70%のディッシュ表面が長めの細胞をしっかり付着させることによって覆われるべきである)細胞の培養ディッシュへの付着が達成されているかどうかをチェックした。
付着が十分であれば、細胞培養容器を慎重に撹拌することにより、非付着性分画を移動させ、非付着性細胞とともに培地を無菌の細胞培養ジャーに注ぎ込んだ。140mlの純粋RPMIを細胞培養容器に再び入れ、再び撹拌し、再び注ぎ出した。工程を再び繰り返し、200mlの完全培地を加え、平衡化し、新しい密封用リングと空気フィルタを適用した。10mlの注射器を用いて、注ぎだした培養培地から10ml取り、血液培養用ジャーに注入した。ジャーにラベルを付け、それを直ちにインキュベータに入れ、その後、細菌をチェックした。
実験台では一度に1つのディッシュだけを処理した。次いで、ディッシュを再び24時間インキュベータに入れた。
付着が十分ではない場合、非付着性分画の移動の開始前に、さらに15〜30分間ディッシュをインキュベータ内に残した。
非付着性分画を50mlの試験管に回収し、再び遠心した(18℃、900rpm/175×gにて10分間)。各セルファクトリの回収した非付着細胞を上述したように(再付着)100mlの完全培地中で1つのヌンクトリプルフラスコに再び蒔き、37℃にて60分間再びインキュベートした。上述したように、非付着細胞分画を再び除いた(非付着細胞は、GMP部門の外で処分することができ、又は免疫モニタリングのために凍結することができる)。
【0071】
3.1日目のサイトカインの添加:GM−CSFの添加:事前に温めた独自に穴を空けたジャーで、リューコマックス(登録商標)400を同封のNaCl(1ml)で溶解し、110mlのPBS/2%ヒト血清アルブミン(99mlのPBS+11mlの20%HSA、ベーリング製)により希釈した。続いて、等量を100本の無菌の1.5ml凍結試験管に入れ、−80℃で保存した。
IL−4の調製:元のバイアル中の乾燥粉末(Genzyme IL−4、4mg)を室温にして100μlのアクアアドインジェクトで溶解し、500μlのPBS/2%HSAで希釈した。等量を各50μlの無菌1mlの凍結試験管に入れ、−80℃で保存した。
さらなる使用については、IL−4アリコットをバイアル当たり450μlずつのRPMIで希釈した。培養ディッシュを慎重にインキュベータから取り出し、反射光学顕微鏡でチェックした。各セルファクトリについては、20mlの培養培地に加えて4800μlずつのGM−CSFと180μlずつのIL−4(総量240mlに対して)を調製し、各トリプルフラスコについては10mlの培養培地に加えて、2000μlずつのGM−CSFと75μlずつのIL−4(総量100mlに対して)を調製した(800U/mlのGM−CSF及び500U/mlのIL−4に相当する)。新しい培地を添加し、平衡化した。続いて、細胞をインキュベータに移し、再び48時間、インキュベータで維持した。
【0072】
4.3日目におけるサイトカインの添加:必要量のGM−CSFとIL−4を融解した。培養培地を温かい場所に保管した。各セルファクトリについては、40mlの培養培地に加えて6000μlずつのGM−CSFと225μlずつのIL−4(総量300mlに対して)を調製し、各トリプルフラスコについては20mlの培養培地に加えて、2600μlずつのGM−CSFと97.5μlずつのIL−4(総量130mlに対して)を調製した(800U/mlのGM−CSF及び500U/mlのIL−4に相当する)。
培養ディッシュを慎重にインキュベータから取り出し、反射光学顕微鏡でチェックした。新しい培地を添加し、平衡化した。続いて、細胞を再び48時間、インキュベータに移した。
【0073】
5.5日目におけるサイトカインの添加:必要量のGM−CSFとIL−4を融解した。培養培地を温かい場所に保管した。各セルファクトリについては、40mlの培養培地に加えて6000μlずつのGM−CSFと225μlずつのIL−4(総量300mlに対して)を調製し、各トリプルフラスコについては20mlの培養培地に加えて、2600μlずつのGM−CSFと97.5μlずつのIL−4(総量130mlに対して)を調製した(800U/mlのGM−CSF及び500U/mlのIL−4に相当する)。
培養ディッシュを慎重にインキュベータから取り出し、反射光学顕微鏡でチェックした。新しい培地を添加し、平衡化した。細胞を乱すために、ディッシュを慎重に揺らし、再びインキュベータに移した。
【0074】
6.6日目の成熟用カクテルの添加:実験台を稼動させながら、室温にて必要量のサイトカインを融解した(培養培地ml当たり10μlの成熟用カクテル)。成熟用サイトカインは溶解形態であり、完全培地のml当たりの10μlの成熟用カクテルの添加が以下に述べる濃度に相当するように濃縮した。
個々のサイトカインの最終濃度/mlは以下に相当する:
2ng IL−1β(インターロイキン1β)
1000U IL−6(インターロイキン6)
10ng TNF−α(腫瘍壊死因子α)
1μg PG E2(プロスタグランジンE2)
セルファクトリは:355ml、すなわち、セルファクトリ当たり3.55mlの成熟用カクテルを含有する。
トリプルフラスコ:156ml、すなわち、トリプルフラスコ当たり1.56mlの成熟用カクテル
容器をインキュベータから取り出し、反射光学顕微鏡下で評価した。上述の量にて成熟用カクテルをピペットでディッシュに加え、平衡化させ、再びインキュベータに移した。
【0075】
7.7日目における成熟樹状細胞の回収:
0日目及び5日目における培養培地の細菌チェックが満足できれば、すなわち、試料が無菌であることが判明すれば、DCの以下の最適なチェックを行う:
インキュベータから容器を取り出し、反射光学顕微鏡下で樹状細胞の表面を評価した。反射光学顕微鏡を用いて、ポラロイド写真を作成した。
細胞が良好な外観を有していれば(ほとんど死細胞がない、ほとんど付着していない、培養培地は赤く透明である、目に見える微生物はいない、汚染の兆候はない、SOP DC12、項目1も参照されたい)、4mlの細胞懸濁液をセルファクトリから取り出し、FACS解析を行うのに使用する。
FACS染色で十分なCD83の発現(>75%CD83陽性)が得られれば、細胞を回収することができる。CDE83の発現が未だ不十分であれば(<75%)、新しいFACS解析を行う前にもう3時間待つ必要がある。
細胞の回収については、セルファクトリ及びトリプルフラスコの内容物を50mlの試験管に移した。それぞれ100mlのRPMIで細胞培養容器をもう2回すすぐ。700rpm/110×g、4℃にて12分間の遠心分離。
細胞の凍結については、20%のDMSOを伴った自己血清(もう1つの方法として、20%のDMSOを伴った20%のヒト血清アルブミンと5%グルコース)を調製した(例えば、36mlの血清に4mlのDMSOを添加)。凍結用培地は氷上で冷却した。
参照の試験管(3.6ml)には、DMSOの最終濃度が10%になるように、凍結用培地を半分(1.8ml)入れ、純粋な血清(又は20%のHSA)を半分入れた。凍結装置を動かし始めた。
細菌検査を繰り返すために、10mlの上清を血液培養ジャーに移した。細胞を40mlの培養培地で処理した後、細胞数を数えるために40μlを取り出した。10μlの細胞懸濁液(それに10μlのトリパンブルーを加えた)をピペットでノイバウエル計算盤に入れ、製造元の指示書に従って、細胞を数えた。
さらなる品質制御試験に100万個のDCが必要とされ、もう100万個のDCは追加の1mlバイアルでロット対照として凍結した。
純粋な自己血清(又は20%HSA)で細胞を約2000万個/mlの濃度に濃縮し、氷上で冷却した。あらかじめラベルを付けた凍結用試験管を氷上で冷却し、それぞれの半分に冷却した細胞懸濁液を入れた(例えば、3.6mlの試験管にはそれぞれ1.8mlの細胞懸濁液)。いったん、凍結装置で試験管挿入の準備ができると、凍結用培地を冷却した細胞懸濁液に添加し、試験管をネジ込みの蓋で密封し、揺すって、凍結用装置に入れ、凍結工程を開始した。
凍結工程終了後(−130℃に達する)、試験管を液体窒素に移した。
【0076】
B:結果
上記のプロトコールにより9.26%のDCの収率を達成することができた(19人の患者の白血球分離採取法産物の平均値)。CD83の発現は89.53%であった。得られたDCは、実施例1のDCと比べて同一の特性を示した。
【図面の簡単な説明】
【0077】
本発明に係る装置の好ましい実施形態を図に示す。
【図1】積み重ね可能な盆状の試験槽を有する、本発明に係る装置の概略上面図を示す。
【図2】図1で示される装置の線X−Xに沿った断面図を示す。
【図3】図1及び図2に示す装置の充填装置を伴った概略三次元図を示す。
【図4】本発明に係る装置の第2の好ましい実施形態の概略上面図を示す。
【図5】線XII−XIIに沿った、図3に示す装置の断面図を示す。
【図6】本発明に係る装置の第3の好ましい実施形態の断面図を示す。
【図7】本発明に係る装置の第4の好ましい実施形態の断面図を示す。
Claims (32)
- GMP(製品管理及び品質管理規則)の指針に準拠して成熟した且つ安定した樹状細胞又は未成熟の樹状細胞を産出する方法であって、少なくとも一種の樹状細胞分化/成熟因子の存在下にて無菌の培養装置で造血系前駆細胞を培養することを含んでなり、前記培養装置は、増殖領域を形成する拡張された内部表面(22、48)を有し、それによって細胞が該表面(22、48)に付着する閉鎖容器を含んでなる方法。
- 容器が少なくとも2つの流状連通試験槽(16;49、50、52)を含み、各試験槽(16;49、50、52)が増殖領域を含む請求項1に記載の方法。
- 前記試験槽(16)は盆状の手段(10)により形成され、隣接する盆状の手段(10)の底表面(12)、好ましくは前記盆状の手段は平面の底表面(12)を有する請求項1又は2に記載の方法。
- 前記試験槽(16)は、前記盆状の手段(10)の積み重ねにより形成される請求項3に記載の方法。
- 流状接続のための前記手段(18、64)が隣接する試験槽(16;50、52)を接続する請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 各試験槽(16)が、少なくとも1つの入口開口部及び1つの出口開口部(30)を含み、好ましくは前記の少なくとも1つの入口開口部が注入/排出装置(130)に接続され、及び/又は前述の少なくとも1つの出口開口部がフィルター(128)に接続される請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の主入口開口部(36、37)を介して第1の試験槽(16、52)に流体を送達し、当該第1の試験槽(16、52)から次に隣接する試験槽(16、50)などに送達することができるように、装置が共通する1つの主入口開口部(36、37)を有する請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 容器の拡張された内部表面(22、48)が1以上の規則正しい又は不規則な形状の構造体又は粒子により形成され、それによって、細胞が容器の内部表面及び/又は前記粒子の表面に付着する請求項1に記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法であって、
(i)前記試験槽が、プラスチック類、好ましくは、ポリカーボネート、ポリスチレン、又はポリオレフィンから作られ、及び/又は
(ii)容器の内部表面、好ましくは、盆状の手段(10)を含む内部表面及び規則正しい又は不規則な形状の構造体又は粒子の表面の増殖領域が付着介在性作用物で被覆され、及び/又は
(iii)容器の内部表面の有効な増殖面積が25〜10000cm2の間、好ましくは500〜5000cm2の間である、前記方法。 - 付着介在性作用物が、IgGの被覆を含むIgの被覆、並びに抗CD14抗体又は抗CD16抗体による被覆を含む細胞表面タンパク質に対する抗体による被覆から選択される請求項9に記載の方法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法であって、造血系前駆細胞が、多能性細胞、樹状細胞前駆細胞又は未成熟の樹状細胞であり、好ましくは、前記造血系前駆細胞が、
(i)CD14+単核細胞(単球)から、CD34+細胞から、又は直接血液から得られる、及び/又は
(ii)白血球分離採取法産物、懸濁分離(エルトリエーション)プロトコール、末梢で採取した血液又は骨髄に由来する
樹状細胞前駆細胞である、前記方法。 - 請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法であって、培養が、
(i)末梢血単核細胞を培養試験槽に適用し、試験槽の内側表面にそれらを付着させること、
(ii)非付着性細胞を除くために試験槽を洗浄すること、
(iii)前記少なくとも1種の樹状細胞分化/成熟因子を含む培養培地にて付着性細胞を培養すること、及び任意で
(iv)さらなる分化/成熟因子を培養培地に添加すること、及び又は
(v)培養培地を除き、付着性細胞を洗浄し、工程(iii)と同一の又は異なった樹状細胞成熟因子を含む培養培地で付着性細胞を培養すること
を含んでなる、前記方法。 - 請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法であって、培養が、
(i)増殖領域のcm2当たり3x105〜4x106個の前駆細胞を負荷すること、及び/又は
(ii)増殖領域が、十分に、好ましくは1〜5mmの培養培地で覆われるように培養培地をcm2当たり0.01〜3ml、好ましくは0.1〜0.5ml加えること
を含んでなる、前記方法。 - 請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法であって、前記少なくとも1つの樹状細胞成熟因子が、IL−1β、IL−6、TNF−α、PGE2、INF−α、リポ多糖類及びそのほかの菌体産物(例えば、MPL(モノホスホリル脂質A)及びリポタイコ酸)、ホスホリルコリン、カルシウムイオノフォア、ホルボールエステル(例えば、PMA)、熱ショックタンパク質、ヌクレオチド類(例えば、ATP)、リポペプチド、トールライク受容体に対する人工リガンド、二本鎖RNA(例えば、ポリI:C)、免疫刺激性DNA配列、CD40リガンドなどから成る群から選択され、好ましくは、IL−1β、IL−6、TNF−α及びPGE2の混合物である、前記方法。
- 増殖領域を形成する拡張された内部表面(22、48)を有する閉鎖系容器を含んでなり、それによって細胞が表面(22、48)に付着する、請求項1〜14のいずれか1項に記載の成熟した且つ安定した樹状細胞を産出するのに使用するための装置。
- 容器が少なくとも2つの流状に連通する試験槽(16;48、50、52)を含み、各試験槽(16;48、50、52)が増殖領域を含むことを特徴とする請求項15に記載の装置。
- 前記増殖領域が平坦な表面(22、48)を有することを特徴とする請求項16に記載の装置。
- 容器が連通位置に配置されれば、流体が前記試験槽(16;48、50、52)の間で均等に分配されるように連通手段(18、64、88)を前記試験槽(16;48、50、52)の間に配置することを特徴とする請求項16又は17に記載の装置。
- 容器が培養位置に配置されれば、流体が試験槽(16;48、50、52)の内側に保持されるように連通手段(18、64、88)を前記試験槽(16;48、50、52)の間に配置することを特徴とする請求項15〜18のいずれか1項に記載の装置。
- 前記試験槽(16)が、盆状の手段(10)及び隣接する盆状の手段(10)の底表面(12)により形成されることを特徴とする請求項15〜19のいずれか1項に記載の装置。
- 前記試験槽(16)が、前記盆状の手段(10)の積み重ねにより形成されることを特徴とする請求項20に記載の装置。
- 流状接続(18、64)のための前記手段が、隣接する試験槽(16;48、50、52)を接続することを特徴とする請求項15〜21のいずれか1項に記載の装置。
- 各試験槽(16)が少なくとも1つの入口開口部と1つの出口開口部(20)とを含んでなることを特徴とする請求項15〜22のいずれか1項に記載の装置。
- 前記主入口開口部(36、76)を介して第1の試験槽(16、52)に流体を送達し、前記第1の試験槽(16、52)から次に隣接する試験槽(16、50)などに送達することができるように、容器が、共通する1つの主入口開口部(36、76)を有することを特徴とする請求項15〜23のいずれか1項に記載の装置。
- 前記主入口開口部(76)が疎水性のフィルタ(82)を有する蓋(80)によって密封されることを特徴とする請求項20〜29のいずれか1項に記載の装置。
- 容器の拡張された内部表面(22、48)が1以上の規則正しい又は不規則な形状の構造体又は粒子によって形成されることを特徴とする請求項20に記載の装置。
- 試験槽(92)が気体透過性且つ液体透過性の表面を有し、好ましくは、前記試験槽(92)が気体試験槽(102)に隣接することを特徴とする請求項15〜27に記載の装置。
- 注入/排出装置(130)が連通手段(18)に接続可能であることを特徴とする請求項15〜28に記載の装置。
- 注入/排出装置(130)がバッグ(134、136、138)に接続可能である多数の接続用の管(142)を含むことを特徴とする請求項29に記載の装置。
- 樹状細胞の培養に好適である末梢血単核細胞を白血球分離採取法産物から調製する方法であって、水又は塩化アンモニウム水溶液の添加によって白血球分離採取法産物の中で赤血球を細胞溶解することを含んでなる前記方法。
- 請求項31に記載の方法であって、細胞溶解が水によって行われ、
(a)20〜30℃にて5〜30秒間、細胞溶解を行い;及び/又は
(b)白血球分離採取法産物と水との容積比が20:1〜2:1であり、
又は
細胞溶解が塩化アンモニウム水溶液で行われ
(a)添加溶液における塩化アンモニウムの濃度が0.5〜5%(w/w)、好ましくは1〜3%(w/w)であり;及び/又は
(b)25〜50℃にて5〜20分間、細胞溶解を行い;及び/又は
(c)白血球分離採取法産物と塩化アンモニウムとの容積比が20:1〜2:1である、前記方法。 - さらに、反応を停止すること、及び/又は細胞溶解産物を洗浄すること、及び/又はそれを培養培地もしくは塩の水溶液に懸濁することを含んでなる請求項31又は32に記載の方法。
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