WO2019188044A1 - 多層細胞培養容器および細胞培養装置 - Google Patents

多層細胞培養容器および細胞培養装置 Download PDF

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WO2019188044A1
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culture container
container
cell culturing
cells
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Inventor
高橋　靖典
達朗 大森
Original Assignee
日本ゼオン株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/04—Apparatus for enzymology or microbiology with gas introduction means

Definitions

  • the present invention relates to a multilayer cell culture container and a cell culture apparatus.
  • Patent Document 1 describes a multilayer plate culture tank that is supported by a support and a support portion so as to be rotatable when the medium is discharged.
  • the lower layer stack plate Since such a multilayer cell culture vessel is configured by stacking a plurality of stack plates (cell culture vessels), the lower layer stack plate has a lower gas exchange efficiency due to the aeration gas, and the uppermost stack plate and the lowermost layer
  • the culture environment such as CO 2 concentration varies.
  • the present invention has been made in view of the above-described circumstances, and multi-layer cells that improve the culture efficiency by uniformizing the gas concentration of each cell culture vessel from the uppermost layer to the lowermost layer without impairing the discharge efficiency of the medium.
  • An object is to provide a culture vessel.
  • the present inventor has intensively studied to achieve the above object.
  • a gap formed from the bottom surface of one cell culture container and the top surface of the edge of the inlet of another cell culture container disposed immediately below the cell culture container By controlling the size of the cross-section along the edge of the (gap), the culture efficiency can be improved by uniformizing the gas concentration in the cell culture vessel from the top layer to the bottom layer without impairing the medium discharge efficiency. It has been found that it can be improved, and the present invention has been completed.
  • the present invention has been made on the basis of the above-mentioned novel findings, and aims to advantageously solve the above-mentioned problems.
  • the first aspect of the present invention comprises two or more cell culture vessels.
  • a multilayer cell culture container configured by stacking, each cell culture container including an inlet for allowing gas to flow into the interior and an outlet for allowing gas to flow to the outside.
  • the vertical cross-sectional area of the gap along the edge is 5.0 mm 2 or more and 40.0 mm 2 or less.
  • the said inflow port and the said outflow port are arrange
  • the stacked cell culture container has a height of 400 mm or more.
  • the effect of the present invention of making the gas concentration in the cell culture container uniform from the uppermost layer to the lowermost layer by controlling the cross-sectional area of the gap portion is exhibited more highly. Because.
  • the height of the multi-layer cell culture container is reduced from the viewpoint that the convenience of handling deteriorates, such as an increase in size or weight, and that the weight is applied to the lowermost layer of the container, causing problems in the durability of the container.
  • the thickness is preferably 1000 mm or less.
  • a second aspect of the present invention is a cell culture apparatus comprising the multilayer cell culture container of the first aspect and a forced ventilation system.
  • a forced ventilation system gas for forming the environment required for cultured cells is forced in all cell culture containers from the top layer to the bottom layer through the inlet and outlet of each cell culture container. Can be distributed.
  • the gas concentration in each cell culture container from the uppermost layer to the lowermost layer can be made uniform to improve the culture efficiency without impairing the medium discharge efficiency.
  • FIG. 1 is a perspective view of a multilayer cell culture container according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a perspective view of a cell culture container according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a perspective view of a multilayer cell culture container according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a perspective view of a cell culture container according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is an enlarged perspective view of the inlet of the cell culture container according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is an enlarged plan view of the inlet of the cell culture container according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a partial cross-sectional view of a multilayer cell culture container according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a partial cross-sectional perspective view of a multilayer cell culture container according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is an enlarged plan view of the inlet of the cell culture container according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is a partial cross-sectional view of a multilayer cell culture container according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is a partial cross-sectional perspective view of a multilayer cell culture container according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 is an enlarged view showing a modified example (circular shape) of the edge portion of the inflow port.
  • FIG. 13 is an enlarged view showing another modified example (no peripheral portion curve) of the edge portion of the inflow port.
  • FIG. 14 is a schematic view of a cell culture device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 15 is a schematic view of a cell culture device according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 16 is a schematic view of a cell culture container showing the installation position of the CO 2 sensor.
  • FIG. 17 is a schematic view of a multilayer cell culture container for explaining a method for discharging a culture medium.
  • FIG. 18 is a graph showing the relationship between the CO 2 concentration difference between the uppermost layer and the lowermost layer of the cell culture container, the discharge rate of the medium, and the cross-sectional area of the gap.
  • a multilayer cell culture container 1 according to an embodiment of the present invention includes a stacked cell culture container 2 as shown in FIG.
  • 41 cell culture vessels 2 are stacked to form a multilayer cell culture vessel 1 having 40 steps and a height of 701.1 mm.
  • each cell culture container 2 has an inlet 3 and an outlet 4 for circulating a gas.
  • each cell culture vessel 2 is substantially rectangular in plan view, but may be circular in plan view or square in plan view as long as it is suitable for cell culture, and is not limited to the shape of the embodiment.
  • the cell culture container 2 is laminated
  • the inlet 3 and the outlet 4 are preferably arranged point-symmetrically with respect to the center of the cell culture vessel 2 in plan view, as shown in FIGS. 1 and 2.
  • the diffusion efficiency of the gas from the inflow port to the outflow port is increased. This is because the gas concentration in each cell culture vessel from the uppermost layer to the lowermost layer can be made more uniform.
  • FIG. 5 is an enlarged perspective view of the inlet 3.
  • the edge portion 6 of the inflow port 3 has a lower height from the bottom surface 5 than the outer periphery of the cell culture container 2, and when the cell culture container 2 is stacked, a cross section is observed from the direction A in FIG. 7 as shown in FIG. 7, as shown in FIG. 8 when the cross section is observed from the direction B of FIG. 6, and as shown in FIGS. 10 and 11 when the cross section is observed from the direction C of FIG.
  • a gap that is, a gap 8 is formed between the bottom surface 5 of one cell culture container 2 and the upper surface 7 of the edge 6 of the inlet 3 of the other cell culture container 2 disposed immediately below. Is formed.
  • the cross-sectional area of the gap 8 is determined by (total length of the edge) ⁇ (height of the gap).
  • the “edge portion” refers to a circumferential portion indicated by reference numeral 6A in FIG. 5 (a portion along the circumference of the inlet 3) and a peripheral portion indicated by reference numeral 6B (along the circumference of the inlet 3).
  • the “total length of the edge portion” refers to a length obtained by adding the circumferential portion 6A and the two peripheral portions 6B.
  • the “height of the gap portion” means the height of the gap forming the gap portion 8 shown in FIGS. 7 to 8 and FIGS. 10 to 11, that is, the bottom surface 5 of one cell culture vessel 2 and immediately below it.
  • the height of the clearance gap formed from the upper surface 7 of the edge part 6 of the inflow port 3 of the other cell culture container 2 arrange
  • the cross-sectional area of each gap 8 is set to 5.0 mm 2 or more and 40.0 mm 2 or less. More preferably 5.0 mm 2 or more 14.0 mm 2 or less.
  • the edge 6 of the inlet 3 may be substantially circular in plan view as shown in FIG. 12, and the peripheral portion 6B is curved in plan view as shown in FIG. Any shape may be used as long as the gap portion 8 can be formed in an arrangement relationship with the bottom surface 5.
  • the material of the cell culture vessel 2 is not particularly limited, and may be formed of various resins or glass.
  • a cycloolefin polymer (COP) is preferable from the viewpoint of easy molding and ensuring transparency.
  • the cycloolefin polymer is a polymer having an alicyclic structure in one or both of the main chain and the side chain.
  • the molding method of each cell culture container 2 constituting the multilayer cell culture container 1 can be arbitrarily selected according to the shape of the cell culture container 2. Specific examples of molding methods include injection molding, extrusion molding, cast molding, inflation molding, blow molding, vacuum molding, press molding, compression molding, rotational molding, calendar molding, rolling molding. Method, cutting molding method, spinning, and the like. These molding methods can be combined, or post-treatment such as stretching can be performed as necessary after molding.
  • size of the outflow port 4 is more than the diameter of the inflow port 3 from a viewpoint of the discharge efficiency of a culture medium.
  • the shape of the inflow port 3 and the outflow port 4 is circular in this embodiment, it is not limited to such a shape, The hole which can distribute
  • the cell culture device 9 may be configured by a forced ventilation system 10 and a multilayer cell culture container 1 connected thereto.
  • the forced ventilation system 10 measures the concentration of CO 2 or the like of the flowing gas and prepares the concentration of CO 2 or the like of the flowing gas.
  • the forced ventilation system 10 is good also as installing the filter 11 in the middle of the gas flow path as needed. By disposing the filter 11 in the flow path on the gas inflow side, it is possible to prevent the inflow of the foreign material into the culture vessel even if the inflowing gas contains foreign material. Further, by disposing the filter 11 in the flow path on the gas outflow side, it is possible to prevent the outflow of pollutants when the gas in the culture vessel is contaminated.
  • the forced ventilation system 10 include a forced ventilation large-sized CO 2 incubator Prescito MG-1300-2A manufactured by Taitec Co., Ltd., MaxCell MLF manufactured by Wakenbee Tech Co., and the like. It is not limited to these as long as it can be distributed. Further, in FIG. 14, the gas that flows out is configured to flow out of the cell culture device 9, but instead of this, as shown in FIG. It is good also as making it flow out in the culture apparatus 9, and making it flow out of the cell culture apparatus 9 after that. In the cell culture device 9, by connecting the multilayer cell culture container 1 to the forced ventilation system 10, it is possible to forcibly ventilate each cell culture container 2 and form an environment suitable for cultured cells in a short time.
  • the multilayer cell culture container 1 is preferably sterilized before being used for cell culture.
  • sterilization method heating methods such as the high-pressure steam method and dry heat method, radiation methods that irradiate radiation such as ⁇ rays and electron beams, irradiation methods that irradiate high frequencies, and ethylene oxide gas (EOG)
  • the method can be selected according to the shape of the culture vessel and the cells to be used from methods generally employed in the medical field, such as a gas method in which a gas is brought into contact, a filtration method using a sterilization filter, and the like.
  • the gas method is preferable because the change in the polar state of the surface is small.
  • the medium in which the cells are suspended is transferred into each cell culture container 2, and the multilayer cell culture container 1 is left to be cultured.
  • the types of cells to be cultured are, for example, CHO cells, HEK cells, SP2 / 0 cells, MRC5 cells, ES cells, iPS cells and cells derived from humans such as neural crest cells and adipose stem cells.
  • Stem cells, Sf9 cells, cells isolated from human tissues, and the like can be mentioned, but the invention is not particularly limited and can be arbitrarily selected according to the purpose.
  • the cell culture conditions are not particularly limited, and can be appropriately determined according to the cells to be used and the purpose. For example, in a temperature range of 20 ° C. to 40 ° C., the cells can be cultured by aeration in a humidified environment with a carbon dioxide concentration of about 5%.
  • the cells as described above are cultured using a liquid medium.
  • a liquid medium For example, Ham's F-12 medium, DMEM medium, MEM medium, RPMI 1640 medium, medium supplemented with serum, chemical refined medium prepared with amino acids, nucleic acids, vitamins, etc., and insulin, FGF, etc.
  • a liquid medium for example, Ham's F-12 medium, DMEM medium, MEM medium, RPMI 1640 medium, medium supplemented with serum, chemical refined medium prepared with amino acids, nucleic acids, vitamins, etc., and insulin, FGF, etc.
  • proteins such as growth factors and albumin
  • compounds such as metabolic inhibitors, receptor inhibitors and antibiotics
  • protein degradation products such as casein Examples include conditioned medium using Kiyoshi.
  • the liquid medium a medium having a pH buffering action, having an osmotic pressure suitable for cells, containing nutrient components of cells, and not toxic to cells is used.
  • Examples of the component that imparts a pH buffering action to the liquid medium include Tris hydrochloride, various phosphates, and various carbonates.
  • the osmotic pressure of the liquid medium is usually adjusted using an aqueous solution in which the concentrations of potassium ions, sodium ions, calcium ions, glucose and the like are adjusted so as to be almost the same as the osmotic pressure of the cells.
  • Specific examples of the aqueous solution include physiological saline such as phosphate buffered saline, Tris buffered saline, and HEPES buffered saline; Ringer's solution such as lactated Ringer's solution, acetated Ringer's solution, and bicarbonated Ringer's solution; It is done.
  • Examples of the nutrient component of the cell include amino acids, nucleic acids, vitamins, minerals and the like.
  • As the liquid medium a commercially available medium suitable for various cells can be used.
  • Additives used include peptides; minerals; metals; vitamin components; ligands, agonists and antagonists that act on cell surface receptors; nuclear receptors, ligands, agonists and antagonists; extracellular such as collagen and fivenectin Matrix: A part of the extracellular matrix or a compound that mimics the extracellular matrix; a component that acts on a protein involved in a signal transduction pathway in a cell; a component that acts on an enzyme of primary or secondary metabolism in a cell; Components that affect gene expression in the nucleus or mitochondria. These additives can be used individually by 1 type or in combination of 2 or more types.
  • ZEONOR 1060R manufactured by Nippon Zeon Co., Ltd., ring-opening polymer hydride of norbornene monomer
  • ZEONOR 1060R has an outlet 4 with a diameter of 25mm at one corner by injection molding.
  • a cell having a short side of 205 mm, a long side of 334 mm, and a height of 17.1 mm, having an inlet 3 with a diameter of 12.5 mm and a cross-sectional area of the gap 8 of 6.9 mm 2 at a point symmetric with the outlet 4
  • a culture vessel 2 was prepared.
  • 41 cell culture vessels 2 were stacked in the height direction using a heat welding apparatus to form 40 layers, and a multilayer cell culture vessel 1 having a width of 205 mm ⁇ depth of 334 mm ⁇ height of 701.1 mm was produced (implementation).
  • Example 1 a multilayer cell culture vessel 1 having a width of 205 mm ⁇ depth of 334 mm ⁇ height of 701.1 mm was produced (implementation).
  • the uppermost layer and the lowermost cell culture vessel 2 of the multilayer cell culture vessel 1 are made by Taitec Co., Ltd. at the center of the short side far from the inlet 3.
  • a sensor chip SP-CD1-D5-rMy-US (CO 2 sensor) for nondestructive carbon dioxide measurement was installed. Then, using a forced aeration system 10 (MaxCell MLF manufactured by Wakenbee Tech Co., Ltd.), a gas having a carbon dioxide concentration of 37% at 37 ° C. was passed through the multi-layer cell culture vessel 1, and after 2 hours, the cell culture of the uppermost layer and the lowermost layer was performed.
  • the discharge rate is preferably 65 ml / sec or more, more preferably 75 ml / sec or more. If the discharge speed is lower than this, the discharge work efficiency becomes worse, or the cells are exposed to the external environment between the cells exposed to the external environment immediately after the start of discharge and the cells exposed to the external environment immediately before the end of discharge. The time required for the process differs greatly, which may change the viability of both cells and the characteristics of the product.
  • Comparative Example 5 in which the cross-sectional area of the gap 8 deviates from the range of 5.0 mm 2 or more and 40.0 mm 2 or less, the number of stacked layers is 20 (20 stacked layers), and the CO 2 concentration difference evaluation is B
  • the CO 2 concentration difference evaluation is C
  • the gas concentration is uniform. Decreased.
  • the cross-sectional area of the part 8 When the cross-sectional area of the part 8 is in the range of 5.0 mm 2 or more and 40.0 mm 2 or less, it is kept high, and the CO 2 concentration difference in the cell culture vessel 2 from the uppermost layer to the lowermost layer (“concentration difference indicated by ⁇ ”) (Point symmetry) ”) was maintained below 1.3%. Further, the CO 2 concentration difference when a point-symmetrical arrangement with CO 2 concentration difference is a point-asymmetrical arrangement ( ⁇ "density difference represented by the (" density difference (point symmetry) "represented by ⁇ ) (point-asymmetrical ) ”), The“ concentration difference (point symmetry) ”had a lower CO 2 concentration difference, and the gas diffusion efficiency was further improved.
  • the gas concentration in the cell culture container from the uppermost layer to the lowermost layer can be made uniform to improve the culture efficiency without impairing the medium discharge efficiency.

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Abstract

２以上の細胞培養容器２を積層して構成される多層細胞培養容器１であって、前記各細胞培養容器２は、気体を内部に流入させるための流入口３と、気体を外部に流出させるための流出口４とを備え、一の前記細胞培養容器２の底面５と、その直下に配置される他の前記細胞培養容器２の前記流入口３の辺縁部６の上面７とから形成される隙間である隙間部８の断面積が、5.0mm２以上40.0mm２以下である、多層細胞培養容器１を提供する。

Description

多層細胞培養容器および細胞培養装置
　本発明は、多層細胞培養容器および細胞培養装置に関する。
　細胞は、培地を入れた培養容器の中で増殖させる。培養容器としては、フラスコ、ディッシュ、プレートなどが挙げられるが、限られた培養スペースで、ある程度の量の培養細胞を生産する必要がある場合、複数のスタックプレートを重ねて構成される多層細胞培養容器が使用される。例えば、特許文献１には、支柱と支持部によって、培地を排出する際に回転可能なように支持される多層平板培養槽が記載されている。
　近年、大量培養装置を用いた培養までは必要としないものの、ある程度の量の細胞を、限られたスペースの中で培養することができる、多層細胞培養容器の必要性が高まってきている。例えば、発症率の極めて低い疾病の治療薬の開発などに、ある程度の量の細胞が必要とされる場合が挙げられる。
特開昭６２－２９４０７７号公報
　このような多層細胞培養容器は、複数のスタックプレート（細胞培養容器）を重ねて構成されるため、下層側のスタックプレートは通気気体によるガス交換効率が低下し、最上層のスタックプレートと最下層のスタックプレートでは、ＣＯ２濃度などの培養環境にばらつきが生じるという問題がある。
　本発明は、上述した実情に鑑みてなされたものであり、培地の排出効率を損なうことなく、最上層から最下層までの各細胞培養容器の気体濃度を均一にして培養効率を向上させる多層細胞培養容器を提供することを目的とする。
　本発明者は、上記目的を達成するために鋭意検討を行った。その結果、積層されている複数の細胞培養容器のうち、一の細胞培養容器の底面と、その直下に配置される他の細胞培養容器の流入口の辺縁部の上面とから形成される隙間（隙間部）の辺縁部に沿った断面の大きさを制御することにより、培地の排出効率を損なうことなく、最上層から最下層までの細胞培養容器の気体濃度を均一にして培養効率を向上できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、上記の新規な知見に基づきなされたものであって、上記課題を有利に解決することを目的とするものであり、本発明の第１の態様は、２以上の細胞培養容器を積層して構成される多層細胞培養容器であって、前記各細胞培養容器は、気体を内部に流入させるための流入口と、気体を外部に流出させるための流出口とを備え、一の前記細胞培養容器の底面と、その直下に配置される他の前記細胞培養容器の前記流入口の辺縁部の上面とから形成される隙間である隙間部の断面積（細胞培養容器の底面に対して垂直方向の、辺縁部に沿った隙間部の断面の面積）が、5.0mm２以上40.0mm２以下であることを特徴とする。
　多層細胞培養容器内で形成される、全ての隙間部の各断面積を上記の範囲に制御することにより、培地の排出効率を損なうことなく、最上層から最下層までの細胞培養容器の気体濃度を均一にして培養効率を向上させることができる。
　また、上記第１の態様では、前記流入口と前記流出口とが、前記細胞培養容器の平面視中心に対して点対称に配置されていることが好ましい。
　このような配置とすることで、流入口から流出口にかけての気体の拡散効率が高まるため、最上層から最下層までの各細胞培養容器の気体濃度をより均一にすることができる。
　また、上記第１の態様では、積層された前記細胞培養容器の高さが400mm以上であることが好ましい。
　このような高さを有する多層細胞培養容器では、隙間部の断面積を制御することにより最上層から最下層までの細胞培養容器の気体濃度を均一にするという本願発明の効果がより高く発揮されるためである。
　また、サイズが大きくなったり重量が重くなるなど取り扱いの利便性が悪化する、重量が容器の最下層にかかるため容器の耐久性に問題が生じる、という観点から、多層細胞培養容器の高さは、1000mm以下であることが好ましい。
　本発明の第２の態様は、上記第１の態様の多層細胞培養容器と、強制通気システムとを備える、細胞培養装置である。
　強制通気システムを備えることにより、各細胞培養容器の流入口から流出口を経て、最上層から最下層までの全ての細胞培養容器に、培養細胞に必要な環境を形成するための気体を強制的に流通させることができる。
　本発明によれば、培地の排出効率を損なうことなく、多層細胞培養容器において、最上層から最下層までの各細胞培養容器の気体濃度を均一にして培養効率を向上させることができる。
図１は、本発明の一実施形態に係る多層細胞培養容器の斜視図である。 図２は、本発明の一実施形態に係る細胞培養容器の斜視図である。 図３は、本発明の別の一実施形態に係る多層細胞培養容器の斜視図である。 図４は、本発明の別の一実施形態に係る細胞培養容器の斜視図である。 図５は、本発明の一実施形態に係る細胞培養容器の流入口の拡大斜視図である。 図６は、本発明の一実施形態に係る細胞培養容器の流入口の拡大平面図である。 図７は、本発明の一実施形態に係る多層細胞培養容器の部分断面図である。 図８は、本発明の一実施形態に係る多層細胞培養容器の部分断面斜視図である。 図９は、本発明の一実施形態に係る細胞培養容器の流入口の拡大平面図である。 図１０は、本発明の一実施形態に係る多層細胞培養容器の部分断面図である。 図１１は、本発明の一実施形態に係る多層細胞培養容器の部分断面斜視図である。 図１２は、流入口の辺縁部の変形例（円形）を示す拡大図である。 図１３は、流入口の辺縁部の別の変形例（周辺部湾曲なし）を示す拡大図である。 図１４は、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置の概略図である。 図１５は、本発明の別の一実施形態に係る細胞培養装置の概略図である。 図１６は、ＣＯ２センサーの設置位置を示す細胞培養容器の概略図である。 図１７は、培地の排出方法を説明するための多層細胞培養容器の概略図である。 図１８は、細胞培養容器の最上層と最下層とのＣＯ２濃度差および培地の排出速度と、隙間部の断面積との関係を示すグラフである。
　以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
＜多層細胞培養容器＞
　本発明の一実施形態に係る多層細胞培養容器１は、図１に示されるように、積層された細胞培養容器２で構成される。本実施形態では41枚の細胞培養容器２を積層し、40段で高さが701.1mmの多層細胞培養容器１としている。
＜細胞培養容器＞
　各細胞培養容器２は、図２に示されるように、気体を流通させるための流入口３と流出口４とを有する。本実施形態では、各細胞培養容器２は平面視略矩形であるが、細胞培養に適しているものであれば平面視円形や平面視正方形であってもよく、実施形態の形状に限定されない。また、各細胞培養容器２を積層して多層細胞培養容器１を構成し、上下に隣り合う細胞培養容器２間で隙間部を形成することができれば、細胞培養容器２の側面視の形状についても限定されない。
　また、流入口３と流出口４は、図１および図２に示されるように、細胞培養容器２の平面視中心に対して点対称に配置されていることが好ましい。図３および図４に示されるように、流入口３と流出口４とが隣り合う角部に配置されている場合と比較して、流入口から流出口にかけての気体の拡散効率が高まるため、最上層から最下層までの各細胞培養容器の気体濃度をより均一にすることができるからである。
　図５は、流入口３の拡大斜視図である。流入口３の辺縁部６は、細胞培養容器２の外周よりも底面５からの高さが低くなっており、細胞培養容器２を積層したとき、図６のＡ方向から断面を観察した場合に図７に示されるように、また、図６のＢ方向から断面を観察した場合に図８に示されるように、また、図９のＣ方向から断面を観察した場合に図１０および１１に示されるように、一の細胞培養容器２の底面５と、その直下に配置される他の細胞培養容器２の流入口３の辺縁部６の上面７との間に隙間、つまり隙間部８が形成される。
　この隙間部８の断面積は、（辺縁部の延べ長さ）×（隙間部の高さ）により求めるものとする。ここで、「辺縁部」とは、図５において符号６Ａで示される円周部（流入口３の円周に沿う部分）と符号６Ｂで示される周辺部（流入口３の円周に沿う部分以外の部分）を指し、「辺縁部の延べ長さ」とは、円周部６Ａと２ヶ所の周辺部６Ｂを足した長さを指す。また、「隙間部の高さ」とは、図７～８および図１０～１１に示される隙間部８を形成する隙間の高さ、すなわち、一の細胞培養容器２の底面５と、その直下に配置される他の細胞培養容器２の流入口３の辺縁部６の上面７とから形成される隙間の高さを指す。培地の排出効率の観点、および最上層から最下層までの各細胞培養容器２における気体濃度を均一にする観点から、各隙間部８の断面積は5.0mm２以上40.0mm２以下とする。より好ましくは5.0mm２以上14.0mm２以下である。
　なお、流入口３の辺縁部６は、図１２に示されるように、平面視で略円形とすることとしてもよく、図１３に示されるように、周辺部６Ｂが平面視で湾曲していないこととしてもよく、底面５との配置関係で隙間部８を形成することができれば、どのような形状であってもよい。
　細胞培養容器２の素材は特に限定されず、種々の樹脂、またはガラスで形成されることとしてもよい。成形が容易であること、また、透明性を確保する観点からシクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）が好ましい。シクロオレフィンポリマーとは、主鎖及び側鎖の片方または両方に脂環式構造を有するポリマーである。
　多層細胞培養容器１を構成する各細胞培養容器２の成形方法は、細胞培養容器２の形状に応じて任意に選択することができる。成形方法の具体例としては、射出成形法、押出成形法、キャスト成形法、インフレーション成形法、ブロー成形法、真空成形法、プレス成形法、圧縮成形法、回転成形法、カレンダー成形法、圧延成形法、切削成形法、紡糸等が挙げられ、これらの成形法を組み合わせたり、成形後必要に応じて延伸等の後処理をすることもできる。
　また、流出口４の大きさは、培地の排出効率の観点から、流入口３の直径以上であることが好ましい。
　なお、流入口３および流出口４の形状は、本実施形態では円形であるが、このような形状に限定されず、気体を流通させることができる孔が形成されており、強制通気システム１０と接続することができれば、楕円形、矩形等、どのような形状であってもよい。
＜細胞培養装置＞
　本発明の一実施形態に係る細胞培養装置９は、図１４に示されるように、強制通気システム１０とこれに接続される多層細胞培養容器１で構成され得る。強制通気システム１０は、流出した気体のＣＯ２等の濃度を測定し、流入する気体のＣＯ２等の濃度を調製する。強制通気システム１０は、必要に応じて、気体の流路の途中にフィルター１１を設置することとしてもよい。気体が流入する側の流路にフィルター１１を配置することで、流入する気体に異物が含まれていた場合であっても、培養容器内への異物の流入を防ぐことができる。また、気体が流出する側の流路にフィルター１１を配置することで、培養容器内の気体が汚染されてしまった場合に、汚染物質の流出を防ぐことができる。強制通気システム１０の具体例としては、タイテック株式会社製強制通気式大型ＣＯ２インキュベーターＰｒｅｓｃｙｔｏ　ＭＧ－１３００－２Ａ、ワケンビーテック社製ＭａｘＣｅｌｌ　ＭＬＦなどが挙げられるが、各細胞培養容器２内に気体を流通させることができればよく、これらに限定されない。また、図１４では、流出する気体は、細胞培養装置９外に流出するように構成されているが、これに代えて、図１５に示されるように、培養に使用された気体は、いったん細胞培養装置９内に流出させ、その後、細胞培養装置９外に流出させることとしてもよい。
　細胞培養装置９では、多層細胞培養容器１を強制通気システム１０と接続させることにより、各細胞培養容器２内に強制的に通気させ、短時間で培養細胞に適する環境を形成することができる。
＜滅菌処理＞
　多層細胞培養容器１は、細胞培養に使用する前に滅菌処理を施すことが好ましい。
　滅菌処理の方法に格別な制限はなく、高圧蒸気法や乾熱法などの加熱法、γ線や電子線などの放射線を照射する放射線法、高周波を照射する照射法、酸化エチレンガス（ＥＯＧ）などのガスを接触させるガス法、滅菌フィルタを用いる濾過法など、医療分野で一般的に採用される方法から、培養容器の形状や用いる細胞に応じて、選択することができる。なかでも、表面の極性状態の変化が少ないことから、ガス法が好ましい。
＜細胞培養＞
　本実施形態においては、細胞を懸濁させた培地を各細胞培養容器２内に移し、多層細胞培養容器１を静置して培養する。
　また、培養する細胞の種類は、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＭＲＣ５細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞およびｉＰＳ細胞から分化誘導した細胞、神経堤細胞や脂肪幹細胞等のヒト由来の幹細胞、Ｓｆ９細胞や、ヒト組織から分離した細胞などが挙げられるが、特に限定されず、目的に応じて任意に選択することができる。
　細胞の培養条件は特に限定されず、用いる細胞や目的に応じて適宜決定することができる。例えば、20℃～40℃の温度範囲で、二酸化炭素濃度が5％程度で、加湿された環境となるように通気し、細胞を培養することができる。
　液体培地を用いて、上記のような細胞を培養する。例えば、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２培地、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、それらに血清を添加した培地、アミノ酸、核酸、ビタミン類等を調合したケミカルディファインの培地、それらにインスリンやＦＧＦ等の増殖因子やアルブミンなどのタンパク質を添加したもの、代謝阻害剤や受容体阻害剤や抗生物質などの化合物を添加したもの、カゼインなどのタンパク質分解物を添加した培地、他の細胞や組織の培養上清を利用したコンディション培地などが挙げられる。
　液体培地としては、通常、ｐＨ緩衝作用があり、浸透圧が細胞に好適なものであり、細胞の栄養成分を含み、かつ、細胞に対して毒性がないものが用いられる。
　液体培地にｐＨ緩衝作用を付与する成分としては、トリス塩酸塩、各種リン酸塩、各種炭酸塩等が挙げられる。
　液体培地の浸透圧調整は、通常、細胞の浸透圧とほぼ同じになるように、カリウムイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、グルコース等の濃度を調整した水溶液を用いて行われる。かかる水溶液としては、具体的には、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等の生理食塩水；乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液等のリンゲル液；等が挙げられる。
　細胞の栄養成分としては、アミノ酸、核酸、ビタミン類、ミネラル類等が挙げられる。
　液体培地としては、市販の、各種細胞に好適な培地を利用することができる。
　液体培地には、添加剤を配合することもできる。
　用いる添加剤としては、ペプチド；ミネラル；金属；ビタミン成分；細胞表面の受容体に作用する、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト；核内受容体の、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト；コラーゲンやファイブネクチンなどの細胞外マトリックス；細胞外マトリックスの一部分あるいは、細胞外マトリックスを模擬した化合物；細胞内の情報伝達経路に関わるタンパク質に作用する成分；細胞内の１次代謝または２次代謝の酵素に作用する成分；細胞内の核内またはミトコンドリア内の遺伝子の発現に影響を与える成分；等が挙げられる。
　これらの添加剤は、一種を単独で、あるいは二種以上を組み合わせて用いることができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
●容器作成方法
　素材として、ゼオノア１０６０Ｒ（日本ゼオン社製、ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物）を用いて、射出形成法により、1つの角に口径φ25mmとなる流出口４を持ち、当該流出口４と点対称となる位置に、口径φ12.5mm、隙間部８の断面積が6.9mm2となる流入口３を持つ、短辺205mm×長辺334mm×高さ17.1mmの細胞培養容器２を作製した。
　ここで、上記隙間部８の断面積は、（辺縁部６の延べ長さ）×（隙間部８の高さ）、すなわち、（円周部６Ａ：8.5mm＋周辺部６Ｂ：7.3mm×２）×0.3mm＝6.9mm2のようにして算出した。
　その後、熱溶着装置を用いて、高さ方向に41枚の上記細胞培養容器２を積層して40段とし、幅205mm×奥行334mm×高さ701.1mmの多層細胞培養容器１を作製した（実施例１）。
　同様に、表１に示されるように条件を変更して、（実施例２）～（実施例９）および（比較例１）～（比較例６）の多層細胞培養容器１を作製した。
　なお、表１における点対称とは、図２に示されるように、流入口３と流出口４とが、細胞培養容器２の平面視中心に対して点対称に配置されていることを指し、また、非点対称とは、図４に示されるように、流入口３と流出口４とが、細胞培養容器２の短辺側の隣り合う角部に配置されていることを指す。
●評価方法
・ＣＯ２濃度差
　多層細胞培養容器１の最上層および最下層の細胞培養容器２に、図１６に示されるように、流入口３から遠い側の短辺中央部にタイテック株式会社製非破壊二酸化炭素測定用センサーチップＳＰ－ＣＤ１－Ｄ５－ｒＭｙ―ＵＳ（ＣＯ２センサー）を設置した。その後、強制通気システム１０（ワケンビーテック社製ＭａｘＣｅｌｌ　ＭＬＦ）を用いて37℃二酸化炭素濃度5％の気体を多層細胞培養容器１に通気させ、２時間経過後に、最上層と最下層の細胞培養容器２における二酸化炭素濃度をそれぞれ計測し、これらの差（ＣＯ２濃度差（％））を算出し、Ａ：0.6％以下、Ｂ：0.6％超1.5％未満、Ｃ：1.5％以上のように評価した（濃度差評価）。
・培地の排出速度
　多層細胞培養容器１を構成する各細胞培養容器２に、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２培地をそれぞれ170mlずつ注入した後、図１７に示されるように、流出口４を下にして培地を排出した。排出開始から5秒間の培地の排出量を計測し、単位時間当たりの排出量（排出速度（mｌ/sec））を算出した。
　評価結果を表１および図１８（表１のデータのうち、実施例１～８および比較例１～４をプロットした）に示す。
　なお、排出速度は65mｌ/sec以上が好ましく、75mｌ/sec以上がより好ましい。かかる排出速度を下回ると、排出作業効率が悪くなってしまったり、排出開始直後から外部環境に曝された細胞と、終了直前で外部環境に曝された細胞との間で、外部環境に曝される時間が大きく異なることとなり、これに起因して、両者の細胞の生存率や産生物の特性が変わる可能性がある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　表１および図１８に示されるように、隙間部８の断面積が、5.0mm２以上40.0mm２以下の範囲である場合に、培地の排出効率を維持したまま、最上層から最下層までの細胞培養容器２の気体濃度を均一にすることができた。
　また、流入口３と流出口４とを平面視中心に対して点対称に配置することにより、流入口３から流出口４にかけての気体の拡散効率がより高められていることがわかる。隙間部８の断面積が、上記5.0mm２以上40.0mm２以下の範囲を逸脱している比較例５では、積層の段数が２０段（積層２０段）であり、ＣＯ２濃度差評価はＢだったが、同じ断面積で、比較例６（積層３０段）と比較例２（積層４０段）のように積層の段数を増やすと、ＣＯ２濃度差評価はＣとなり、気体濃度の均一性が低下した。
　具体的には、図１８において■で示される、流入口３と流出口４とが平面視中心に対して点対称配置である場合の培地の排出速度「排出速度（点対称）」は、隙間部８の断面積が5.0mm２以上40.0mm２以下の範囲にある場合に高く保たれ、かつ、最上層から最下層までの細胞培養容器２のＣＯ２濃度差（◆で示される「濃度差（点対称）」）が1.3％以下に維持された。また、点対称配置である場合のＣＯ２濃度差（◆で示される「濃度差（点対称）」）と非点対称配置であるＣＯ２濃度差（▲で示される「濃度差（非点対称）」）とを比較すると、「濃度差（点対称）」の方がＣＯ２濃度差が低く、気体の拡散効率がより高められていた。
　１　多層細胞培養容器
　２　細胞培養容器
　３　流入口
　４　流出口
　５　底面
　６　辺縁部
　６Ａ　円周部
　６Ｂ　周辺部
　７　上面
　８　隙間部
　９　細胞培養装置
１０　強制通気システム
１１　フィルター
　本発明の多層細胞培養容器および細胞培養装置によれば、培地の排出効率を損なうことなく、最上層から最下層までの細胞培養容器の気体濃度を均一にして培養効率を向上させることができる。

Claims (4)

  1. 　２以上の細胞培養容器を積層して構成される多層細胞培養容器であって、
    　前記各細胞培養容器は、気体を内部に流入させるための流入口と、気体を外部に流出させるための流出口とを備え、
    　一の前記細胞培養容器の底面と、その直下に配置される他の前記細胞培養容器の前記流入口の辺縁部の上面とから形成される隙間である隙間部の断面積が、5.0mm２以上40.0mm２以下である、多層細胞培養容器。
  2. 　前記流入口と前記流出口とが、前記細胞培養容器の平面視中心に対して点対称に配置されている、請求項１に記載の多層細胞培養容器。
  3. 　積層された前記細胞培養容器の高さが400mm以上である、請求項１また２に記載の多層細胞培養容器。
  4. 　請求項１から３のいずれかに記載の多層細胞培養容器と、強制通気システムとを備える、細胞培養装置。
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