BR112017013400B1 - Conjunto de saco duplo para cultura de células-t - Google Patents
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Abstract
conjunto de saco duplo para cultura de células-t. um saco de cultura de células é fornecido, compreendendo um saco de fluoropolímero interno poros, em quadro que permite crescimento e colheita de células e um saco de fluoropolímero externo que permite remoção e reabastecimento de meios de alimentação sem perda de células.
Description
[1] O presente pedido reivindica benefício de acordo com 35 U.S.C.§ 119(e) para US no. De série 62/095.124, intitulado “T- CELL CULTURE DOUBLE BAG ASSEMBLY”, depositado em 22 de dezembro de 2014, e US 14/976.027, depositado em 21 de dezembro de 2015, cujos teores são incorporados aqui por referência na íntegra.
[2] A invenção se refere em geral a um aparelho de cultura de células e um método de cultura de células.
[3] Cultura de células é o processo complexo pelo qual células são cultivadas em condições controladas, em geral fora de seu ambiente natural. Na prática cultura de células se refere ao cultivo de células derivadas de eucariotas multicelulares, em especial células de animais. Entretanto, há também culturas de plantas, fungos, insetos e micróbios, incluindo vírus, bactérias e protista.
[4] As células são cultivadas e mantidas em uma temperatura e mistura de gás apropriadas (tipicamente, 37°C, CO2 a 5% para células de mamíferos) em um incubador de células. Condições de cultura variam amplamente para cada tipo de célula, e variação de condições para um tipo específico de células pode resultar em fenótipos diferentes.
[5] Uma variedade de tipos de célula é cultivada in vitro e similarmente uma variedade de meios é disponível dependendo das exigências de crescimento específicos das células e condições de crescimento.
[6] Células T ou linfócitos T são um tipo de linfócito que desempenha um papel central em imunidade mediada por células. Podem ser distinguidos de outros linfócitos, como células B e células assassinas naturais (células NK), pela presença de um receptor de células-T (TCR) na superfície da célula. São chamadas células T porque amadurecem no timo. Há vários subconjuntos de células T, cada com uma função distinta, incluindo células ajudantes T, células T citotóxicas, células T de memória, células T reguladoras, células T assassinas naturais e células T invariantes associadas a mucosa.
[7] Muitos dispositivos foram desenvolvidos para cultivar células, que podem ser divididos em três categorias: 1) dispositivos em pequena escala com um volume de cultura tipicamente entre 1 L a 20 L, embora volumes de cultura menores que 1 L, mesmo na faixa de 10 mL ou 100 mL não sejam excepcionais; 2) dispositivos em escala média com volumes de cultura entre 20 e 2.000 L; e 3) biorreatores em grande escala com volumes operacionais de 2.000 até 20.000 L. Em geral, dispositivos em pequena escala são limitados a alguns litros em volume porque se baseiam em transferência de oxigênio de superfície para fornecer aeração para células. Os exemplos de dispositivos em pequena escala incluem placas de cultura de tecido de cavidades múltiplas, frascos de rotação, frascos-T, garrafas de rolo e sacos para cultura de células.
[8] Dispositivos de cultura de células permeáveis a gás comercialmente disponíveis na forma de sacos são atualmente um formato de dispositivo padrão usado para cultura de células. Sacos de cultura de células têm a vantagem de serem descartáveis, o que reduz o tempo de preparação e limpeza. Adicionalmente, sacos de cultura de células são pré- esterilizáveis, baratas, fáceis de usar e exigem espaço mínimo para armazenagem e uso.
[9] Sacos de cultura de células de fluoropolímero permeáveis a gás são comercialmente disponíveis junto a OriGen Biomedical Group (OriGen PermaLife™ Bags), Baxter (Lifecell® X- Fold™ relacionado às Patentes US 4.829.002, 4.937.194, 5.935.847, 6.297.046 B1), Medtronic (Si-Culture™, Patente US 5.686.304), Biovectra (VectraCell™), e American Fluoroseal (VueLife™ Culture Bag System, abrangido pelas Patentes US 4.847.462 e 4.945.203).
[10] Um problema de sacos de cultura de células de fluoropolímero convencionais é que os meios de alimentação e células são misturados na câmara de cultura e, portanto, a quantidade de meios adicionados é limitada ao volume do recipiente. Em um exemplo, Matsumiya e outros (Patente US 5.225.346) tenta corrigir o problema de fornecimento de meios por integrar o saco com um compartimento de armazenagem de meio. A câmara de cultura e compartimento de armazenagem de meio são conectados e quando meio novo é necessário é passado a partir do compartimento de armazenagem de meio para a câmara de cultura.
[11] Outro problema de sacos de cultura de célula de fluoropolímero convencionais é a remoção de meios tendo teor de nutrientes diminuído e teor de refugo aumentado durante cultivo de células o que remove de modo não disponível as células desejadas também.
[12] Portanto, existe uma necessidade para a remoção e reabastecimento de meios de alimentação sem diminuir a contagem de células, desse modo concentrando vantajosamente as células durante um período de tempo não controlado por limitações de fornecimento de meios de alimentação.
[13] Um aparelho e um método para cultivo de célula que superem uma ou mais das desvantagens conhecidas na técnica são fornecidos. Foi descoberto que é possível preparar um saco de cultura de células compreendendo um saco permeável a gás interno poroso em quadro que permite crescimento e colheita de células contidas em um saco permeável a gás externo que permite remoção e reabastecimento de meios de alimentação sem perda de células.
[14] Em uma modalidade, um saco compreendendo um saco externo e um saco interno é apresentado. O saco externo compreende um filme permeável a gás tendo um primeiro orifício e um segundo orifício fixados ao mesmo e o saco interno compreende um filme permeável a gás tendo um terceiro orifício fixado ao mesmo que passa através do saco externo para o saco interno. O filme permeável a gás do saco interno aumentou o tamanho de poro para permitir movimento de meios entre o saco externo e o saco interno.
[15] Em outra modalidade o filme permeável a gás do saco externo compreende FEP (propileno-etileno fluorado), TFE (tetrafluoroetileno), PFA (perfluoroalcoxi), PVF (fluoreto de polivinila), PVDF (fluoreto de polivinilideno), PTFE (politetrafluoroetileno), PCTFE (policlorotrifluoroetileno), ETFE (polietilenotetrafluoroetileno), ECTFE (polietilenoclorotrifluoroetileno), FFPM/FFKM (perfluoroelastômero), FPM/FKM (fluoreto de clorotrifluoroetilenovinilideno), PFPE (perfluoropoliéter), MFA (tetrafuoroetileno e copolímero de éter-vinil perfuorometil), CTFE/VDF (copolímero de fluoreto de vinilideno- clorotrifuoroetileno), TFE/HFP (copolímero de etrafuoroetileno- hexafuoropropileno), ou misturas dos mesmos.
[16] Em outra modalidade o primeiro e o segundo orifícios do saco externo compreendem tubos fixados ao saco externo.
[17] Em outra modalidade o terceiro orifício do saco interno compreende um tubo fixado ao saco interno.
[18] Em outra modalidade os tubos fixados aos sacos interno e externo compreendem FEP (propileno-etileno fluorado), TFE (tetrafluoroetileno), PFA (perfluoroalcoxi), PVF (fluoreto de polivinila), PVDF (fluoreto de polivinilideno), PTFE (politetrafluoroetileno), PCTFE (policlorotrifluoroetileno), ETFE (polietilenotetrafluoroetileno), ECTFE (polietilenoclorotrifluoroetileno), FFPM/FFKM (perfluoroelastômero), FPM/FKM (fluoreto de clorotrifluoroetilenovinilideno), PFPE (perfluoropolieter), MFA (tetrafuoroetileno e copolímero de éter-vinil perfuorometil), CTFE/VDF (copolímero de fluoreto de vinilideno- clorotrifuoroetileno), TFE/HFP (copolímero de tetrafuoroetileno- hexafuoropropileno), ou misturas dos mesmos.
[19] Em outra modalidade as extremidades não ligadas dos tubos fixados aos sacos interno ou externo contêm aberturas de agulha.
[20] Em outra modalidade os tubos são fixados aos sacos interno ou externo por ligação química, ligação adesiva, ligação por fusão térmica, ligação por solvente, soldagem a laser, tratamento de superfície ou combinações dos mesmos.
[21] Em outra modalidade o filme permeável a gás do saco interno compreende FEP (propileno-etileno fluorado), TFE (tetrafluoroetileno), PFA (perfluoroalcoxi), PVF (fluoreto de polivinila), PVDF (fluoreto de polivinilideno), PTFE (politetrafluoroetileno), PCTFE (policlorotrifluoroetileno), ETFE (polietilenotetrafluoroetileno), ECTFE (polietilenoclorotrifluoroetileno), FFPM/FFKM (perfluoroelastômero), FPM/FKM (fluoreto de clorotrifluoroetilenovinilideno), PFPE (perfluoropolieter), MFA (tetrafuoroetileno e copolímero de éter-vinil fuorometil), CTFE/VDF (copolímero de fluoreto de vinilideno- clorotrifuoroetileno), TFE/HFP (copolímero de tetrafuoroetileno- hexafuoropropileno), ou misturas dos mesmos.
[22] Em um aspecto, o tamanho de poro do filme permeável a gás do saco interno está entre aproximadamente 1 mícron a aproximadamente 6 mícrons em diâmetro.
[23] Em outro aspecto o tamanho de poro do filme permeável a gás do saco interno está entre aproximadamente 1,5 mícrons e aproximadamente 5 mícrons em diâmetro.
[24] Em outro aspecto o tamanho de poro do filme permeável a gás do saco interno está entre aproximadamente 2 mícrons e aproximadamente 4 mícron em diâmetro.
[25] Em outro aspecto o tamanho de poro do filme permeável a gás do saco interno está entre aproximadamente 2,5 mícrons e aproximadamente 3,5 mícrons em diâmetro.
[26] Ainda em outro aspecto o tamanho de poro do filme permeável a gás do saco interno tem aproximadamente 3 mícrons em diâmetro.
[27] Em outro aspecto a porosidade do filme permeável a gás do saco interno é pelo menos 20%.
[28] Em outro aspecto a porosidade do filme permeável a gás do saco interno é pelo menos 30%.
[29] Ainda em outro aspecto a porosidade do filme permeável a gás do saco interno é aproximadamente 50%.
[30] Em outra modalidade o saco interno é fixado por um quadro de fluoropolímero e chanfro.
[31] Ainda em outra modalidade o quadro de fluoropolímero e chanfro são PTFE, FEP, PFA ou um fluoropolímero interno.
[32] Em outra modalidade um método é revelado para cultivar células em um saco compreendendo adicionar células e meios a um saco permeável a oxigênio. O saco compreende um saco externo e um saco interno. O saco externo compreende um filme permeável a gás tendo um primeiro orifício e um segundo orifício fixados ao mesmo. O saco interno compreende um filme permeável a gás tendo um terceiro orifício fixado ao mesmo que passa através do saco externo até o saco interno. O filme permeável a gás do saco interno tem tamanho de poro aumentado em comparação com o saco externo para permitir movimento de meios entre o saco externo e o saco interno.
[33] Em um aspecto as células compreendem células de tecido conectivo, células de esqueleto, células cardíacas, células epiteliais, células neurais, células endócrinas, células imunes, linfócitos, melanócitos, células de tumor ou misturas dos mesmos.
[34] Em outro aspecto o meio é adicionado ao saco em que o meio está contido no saco externo e saco interno.
[35] Ainda em outro aspecto o saco é incubado.
[36] Em outra modalidade o diâmetro dos poros é suficientemente pequeno o bastante para reter as células no saco interno.
[37] Em outra modalidade o meio pode ser adicionado através do primeiro orifício e removido através do segundo orifício.
[38] Em outra modalidade as células podem ser introduzidas ou removidas através do terceiro orifício.
[39] Embora múltiplas modalidades sejam reveladas, ainda outras modalidades da presente invenção se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica a partir da seguinte descrição detalhada. Como será evidente, a invenção é capaz de modificações em vários aspectos óbvios, tudo sem se afastar do espírito e escopo da presente invenção. Por conseguinte, as descrições detalhadas devem ser consideradas como de natureza ilustrativa e não restritiva.
[40] A figura 1 mostra uma vista plana inferior de um aparelho para cultura de células tendo conjunto de saco duplo.
[41] A figura 2 mostra uma vista plana lateral de um aparelho para cultura de células tendo conjunto de saco duplo.
[42] A figura 3 mostra uma vista tridimensional de um aparelho para cultura de células tendo conjunto de saco duplo.
[43] A figura 4 mostra uma vista tridimensional de um aparelho de quadro redondo.
[44] No relatório descritivo e nas reivindicações, os termos “incluindo” e “compreendendo” são termos ilimitados e devem ser interpretados como significando “incluindo, porém, não limitado a ” Esses termos abrangem os termos mais restritivos “consistindo essencialmente em” e “consistindo em.”
[45] Deve ser observado que como usado aqui e nas reivindicações apensas, as formas singulares “um”, “uma” e “o, a” incluem referência plural a menos que o contexto claramente determine de outro modo. Também, os termos “um” (ou “uma”), “um ou mais” e “pelo menos um” podem ser usados de forma intercambiável aqui. Deve ser também observado que os termos “compreendendo”, “incluindo”, “caracterizado por” e “tendo” podem ser usados de forma intercambiável.
[46] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm os mesmos significados como comumente entendidos por uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica a qual essa invenção pertence. Todas as publicações e patentes especificamente mencionadas aqui são incorporadas por referência na íntegra para todas as finalidades incluindo descrever e revelar os produtos químicos, instrumentos, análises estatísticas e metodologias que são relatadas nas publicações que poderiam ser usadas com relação à invenção. Todas as referências citadas nesse relatório descritivo devem ser tomadas como indicativas do nível de conhecimento na técnica. Nada na presente invenção deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não tem direito a antedatar tal revelação em virtude da técnica anterior.
[47] A presente revelação permite a remoção e reabastecimento de meios de alimentação a partir de um aparelho de cultura de células sem diminuir contagem de células desse modo concentrando vantajosamente as células durante um período de tempo não controlado por limitações de fornecimento de meio de alimentação.
[48] O saco de cultura revelado compreende um saco externo permeável a gás com pelo menos quatro orifícios que permitem acesso ao interior do saco. Oxigênio é necessário para crescimento celular em um meio e dióxido de carbono é necessário para um meio para buffer pH. Uma faixa de pH de 7.4 - 7.6 é ótima para crescimento normal de células e pH que esteja compreendido fora dessa faixa, por exemplo, um pH mais alto que 7.8 pode inibir o crescimento normal de células. Portanto, é necessário para o saco de cultura ter boa permeabilidade a gás a oxigênio e dióxido de carbono.
[49] Aqueles versados na técnica reconhecerão que o material permeável a gás deve ser selecionado com base em uma variedade de características incluindo flexibilidade, capacidade de vedação a calor que assegura hermeticidade, boa claridade que permite o exame microscópico de crescimento de células, livre de plastificantes (como ftalato de dioctila e ftalato de diisodecila) que são tóxicos para células, transmissão de vapor de umidade, capacidade de ser alterado para interação desejada de células com células, claridade ótica, resistência física e similar. As modalidades atuais descritas aqui são isentas de tais materiais.
[50] Fluoropolímeros permeáveis a gás são uma escolha preferida para sacos de cultura porque são biologicamente, quimicamente e imunologicamente inertes. O filme do saco externo da presente invenção compreende FEP (propileno-etileno fluorado), TFE (tetrafluoroetileno), PFA (perfluoroalcoxi), PVF (fluoreto de polivinila), PVDF (fluoreto de polivinilideno), PTFE (politetrafluoroetileno), PCTFE (policlorotrifluoroetileno), ETFE (polietilenotetrafluoroetileno), ECTFE (polietilenoclorotrifluoroetileno), FFPM/FFKM (perfluoroelastômero), FPM/FKM (fluoreto de clorotrifluoroetilenovinilideno), PFPE (perfluoropolieter), MFA (tetrafuoroetileno e copolímero de éter-vinil perfuorometil), CTFE/VDF (copolímero de fluoreto de vinilideno- clorotrifuoroetileno), e TFE/HFP (copolímero de tetrafuoroetileno-hexafuoropropileno), ou misturas dos mesmos.
[51] Em uma modalidade preferida o filme do saco externo é FEP (propileno-etileno fluorado).
[52] FEP é um copolímero de hexafluoropropileno e tetrafluoroetileno. É flexível, extremamente resistente a ataque químico, altamente transparente, e resistente a luz solar. Pse refere que FEP não contenha plastificantes, lixiviáveis ou meios extraíveis que possam afetar adversamente culturas de células. FEP tem excelentes taxas de transferência de gás oxigênio, dióxido de carbono e nitrogênio e é altamente impermeável a água, permitindo incubação de células com perda mínima de água. Ter impermeabilidade elevada a água é vantajoso visto que fornecer meio adicional para umidificação pode ser uma fonte comum para a introdução de mofo e contaminação por fungo.
[53] A espessura do filme do saco externo pode variar mediante aplicação e volume desejado do recipiente. A espessura do saco externo pode ser 0,1 mm a 0,7 mm, 0,2 mm a 0,5 mm, porém preferivelmente 0,3 mm. Volumes de saco externo podem variar de 100 mL a 100 L, 500 mL a 20 L, porém preferivelmente 1 L a 5 L.
[54] O saco externo compreende duas folhas de fluoropolímero que são ligadas juntas em suas bordas para formar um compartimento selado. O método de ligação é selecionado entre soldagem a laser, descarga corona, radiação, laminação por fusão ou calor extremo, cauterização, tratamento com plasma, umedecimento, adesivos ou combinações dos mesmos.
[55] Em uma modalidade preferida as bordas de duas folhas FEP são soldadas a laser juntas.
[56] A figura 1 mostra uma vista plana inferior do conjunto de saco duplo 1. O saco externo 10 tem orifícios 30 e 40 localizados em extremidades opostas para alimentar e remover meios de refugo a partir do interior do saco externo 10. Um terceiro orifício 50 é localizado entrando na parte inferior do saco externo 10 que se fixa ao saco interno 20. A localização de orifícios 30, 40 e 50 não é limitada à configuração atual e orifícios 30, 40 e 50 podem ser posicionados para conveniência de uso ou fabricação.
[57] Orifícios 30, 40 e 50, cada individualmente, compreendem tubos de fluoropolímero que são ligados no lugar. Os tubos de fluoropolímero compreendem FEP (propileno-etileno fluorado), TFE (tetrafluoroetileno), PFA (perfluoroalcoxi), PVF (fluoreto de polivinila), PVDF (fluoreto de polivinilideno), PTFE (politetrafluoroetileno), PCTFE (policlorotrifluoroetileno), ETFE (polietilenotetrafluoroetileno), ECTFE (polietilenoclorotrifluoroetileno), FFPM/FFKM (perfluoroelastômero), FPM/FKM (fluoreto de clorotrifluoroetilenovinilideno), PFPE (perfluoropolieter), MFA (tetrafuoroetileno e copolímero de éter-vinil perfuorometil), CTFE/VDF (copolímero de fluoreto de vinilideno- clorotrifuoroetileno), e TFE/HFP (copolímero de tetrafuoroetileno-hexafuoropropileno), ou misturas dos mesmos.
[58] O número total de orifícios não é limitado às modalidades atuais. Um conjunto de saco duplo pode ter pelo menos dois orifícios. Um orifício para fornecer acesso ao saco interno e outro orifício para fornecer acesso ao saco externo.
[59] Em uma modalidade preferida os tubos são FEP (propileno-etileno fluorado).
[60] Os tubos que compreendem orifícios 30, 40 e 50 são ligados às folhas de FEP. A localização dos orifícios 30, 40 e 50 não é limitada à configuração atual e orifícios 30, 40 e 50 podem ser posicionados para conveniência de uso ou fabricação. O método de ligação é selecionado a partir de soldagem a laser, descarga corona, radiação, laminação por fusão ou calor extremo, cauterização, tratamento com plasma, umedecimento, adesivos ou combinações dos mesmos.
[61] Em uma modalidade preferida os tubos FEP são ligados ao saco externo FEP por soldagem a laser.
[62] O saco externo 10 é fabricado contendo saco interno permeável a gás 20. O saco interno compreende o compartimento de cultivo de células 60 e a espessura do filme pode variar mediante aplicação. O saco interno 20 contém poros tendo diâmetro de poro entre aproximadamente 1 mícron e aproximadamente 6 mícrons em diâmetro, preferivelmente entre aproximadamente 1,5 mícrons a aproximadamente 5 mícrons em diâmetro, mais preferivelmente entre aproximadamente 2 mícrons a aproximadamente 4 mícron em diâmetro, mais preferivelmente entre aproximadamente 2,5 mícrons a aproximadamente 3,5 mícrons em diâmetro, e mais preferivelmente aproximadamente 3 mícrons em diâmetro. O tamanho de poro no filme permite movimento dos meios entre o saco interno e o saco externo, porém evita que as células localizadas no saco interno entrem no compartimento de saco externo.
[63] O tamanho de poro do compartimento de cultivo de células 60 é a medida do diâmetro de poro em um material poroso. O tamanho de poro em um material dado é comumente graduado como extrafino, fino, médio, grosso e extra grosso.
[64] O tamanho de poro pode ser selecionado com base no cultivo do tipo de célula exigido. Por exemplo, um tamanho de poro de filme interno de 1 mícron a 3 mícrons pode ser selecionado para células-T tendo diâmetro médio de 5 mícrons.
[65] O filme do saco interno 20 da revelação compreende FEP (propileno-etileno fluorado), TFE (tetrafluoroetileno), PFA (perfluoroalcoxi), PVF (fluoreto de polivinila), PVDF (fluoreto de polivinilideno), PTFE (politetrafluoroetileno), PCTFE (policlorotrifluoroetileno), ETFE (polietilenotetrafluoroetileno), ECTFE (polietilenoclorotrifluoroetileno), FFPM/FFKM (perfluoroelastômero), FPM/FKM (fluoreto de clorotrifluoroetilenovinilideno), PFPE (perfluoropolieter), MFA (tetrafuoroetileno e copolímero de éter-vinil perfuorometil), CTFE/VDF (copolímero de fluoreto de vinilideno- clorotrifuoroetileno), e TFE/HFP (copolímero de tetrafuoroetileno-hexafuoropropileno)), ou misturas dos mesmos.
[66] Em uma modalidade preferida, o filme do saco interno é material de PTFE (politetrafluoroetileno), isto é, ZITEX®. ZITEX da Saint-Gobain está disponível em diversas porosidades e espessuras.
[67] A porosidade ou volume médio de poro é uma medida da densidade de poro de um material, e é uma fração do volume de poros em relação ao volume total, normalmente indicado como uma percentagem entre 0 e 100%. A porosidade pode ser medida por empregar vários métodos de porosimetria. Esses métodos incluem métodos direto, óptico, tomografia computadorizada, embebimento, evaporação de água, intrusão de mercúrio, expansão de gás, termoporosimetria e crioporometria.
[68] O volume médio de poro do saco interno 20 nas persentes modalidades está entre aproximadamente 20% e aproximadamente 55%, mais preferivelmente 30% e aproximadamente 50% e mais preferivelmente entre aproximadamente 40% e aproximadamente 45%.
[69] O saco interno 20 compreende duas folhas de fluoropolímero que são ligadas juntas em suas bordas para formar compartimento de cultura de célula selado 60.
[70] Em uma modalidade preferida as bordas de duas folhas PTFE são ligadas juntas por um quadro e chanfro. O chanfro redondo é extrusado para fixar o quadro 70 ao saco interno 20.
[71] O saco interno poroso 20 é sustentado pelo quadro de fluoropolímero 70 e chanfro 80. O quadro de fluoropolímero e chanfro, cada individualmente, pode compreender FEP (propileno- etileno fluorado), TFE (tetrafluoroetileno), PFA (perfluoroalcoxi), PVF (fluoreto de polivinila), PVDF (fluoreto de polivinilideno), PTFE (politetrafluoroetileno), PCTFE (policlorotrifluoroetileno), ETFE (polietilenotetrafluoroetileno), ECTFE (polietilenoclorotrifluoroetileno), FFPM/FFKM (perfluoroelastômero), FPM/FKM (fluoreto de clorotrifluoroetilenovinilideno), PFPE (perfluoropolieter), MFA (tetrafuoroetileno e copolímero de éter-vinil perfuorometil), CTFE/VDF (copolímero de fluoreto de vinilideno- clorotrifuoroetileno), e TFE/HFP (copolímero de tetrafuoroetileno-hexafuoropropileno)ou misturas dos mesmos.
[72] Em uma modalidade preferida o quadro de fluoropolímero 70 e chanfro 80 são cada individualmente PTFE (politetrafluoroetileno), FEP (propileno-etileno fluorado) ou PFA (perfluoroalcoxi).
[73] A figura 4 mostra outra modalidade onde o quadro quadrado 70 pode ser quadro circular 120. O saco interno 20 pode ser fixado ao quadro circular 120 por chanfro na crista 140.
[74] Em outra modalidade o interior do saco interno tendo quadro 120 pode ser acessado através do orifício integrado 130.
[75] O terceiro orifício 50 compreende tubagem de fluoropolímero que passa através do saco externo e se fixa ao saco interno. O terceiro orifício que suspende o saco interno, quadro e chanfro compreende um cotovelo de fluoropolímero 90 que fixa a tubagem de fluoropolímero ao saco interno.
[76] Os orifícios 30, 40 e 50 têm aberturas vedáveis que permitem acesso ao interior dos sacos.
[77] A figura 2 mostra uma vista plana lateral de conjunto de saco duplo. Os tubos de orifícios 30 e 40 entram no saco externo 10 em emendas 100 e 110 onde as folhas de FEP são ligadas juntas. O cotovelo 90 pode ser inclinado de 0 a 90 graus para posicionar o saco interno 20 no interior do saco externo 10. O terceiro orifício 50 é usado para adicionar e remover células.
[78] O posicionamento do saco interno 20 no interior do saco externo 10 permite que o saco interno 20 esteja em contato com os meios contidos no saco externo 10.
[79] Em uma modalidade preferida o saco interno 20 é submerso nos meios do saco externo 10 para permitir que meios permeiem para dentro e para for a do compartimento de cultura de células 60 do saco interno 20.
[80] O tubo e cotovelo 90 do terceiro orifício 50 cada individualmente, podem compreender FEP (propileno-etileno fluorado), TFE (tetrafluoroetileno), PFA (perfluoroalcoxi), PVF (fluoreto de polivinila), PVDF (fluoreto de polivinilideno), PTFE (politetrafluoroetileno), PCTFE (policlorotrifluoroetileno), ETFE (polietilenotetrafluoroetileno), ECTFE (polietilenoclorotrifluoroetileno), FFPM/FFKM (perfluoroelastômero), FPM/FKM (fluoreto de clorotrifluoroetilenovinilideno), PFPE (perfluoropolieter), MFA (tetrafuoroetileno e copolímero de éter-vinil perfuorometil), CTFE/VDF (copolímero de fluoreto de vinilideno- clorotrifuoroetileno), e TFE/HFP (copolímero de tetrafuoroetileno-hexafuoropropileno)ou misturas dos mesmos.
[81] Em uma modalidade preferida o tubo de fluoropolímero do terceiro orifício 50 é FEP (propileno-etileno fluorado) e o cotovelo 90 do terceiro orifício 50 é PFA (polímero de perfluoroalcoxi).
[82] O cotovelo 90 do terceiro orifício 50 é ligado em uma extremidade ao tubo de fluoropolímero e na segunda extremidade ao saco interno de modo que o cotovelo 90 une o tubo de fluoropolímero e o saco interno 20 no orifício 50.
[83] O método de ligação pode compreender soldagem a laser, descarga corona, radiação, laminação de fusão ou calor extremo, cauterização, tratamento de plasma, umedecimento, adesivos ou combinações dos mesmos.
[84] Em uma modalidade preferida o cotovelo de PFA 90 é soldado a laser ao saco interno FEP 20 e ao tubo FEP do orifício 50. Além disso, o tubo FEP é soldado a laser ao saco externo FEP 10 onde sai do saco externo FEP 10.
[85] Volumes de saco interno podem ser menores que os volumes de saco externo e podem variar de 50 mL a 50 L, 250 mL a 10 L, porém preferivelmente 500 mL a 2 L.
[86] Meios de crescimento adequados incluem meios apropriados para a escolha de célula cultivada.
[87] Células adequadas incluem, por exemplo, células de tecido conectivo, células de esqueleto, células cardíacas, células epiteliais, células neurais, células endócrinas, células imunes, linfócitos, melanócitos, células de tumor ou misturas das mesmas.
[88] Em uma modalidade, em um primeiro parágrafo (1), a presente invenção prove um saco compreendendo um saco externo e um saco interno, em que o saco externo compreende um filme permeável a gás tendo um primeiro orifício e um segundo orifício fixado ao mesmo; e o saco interno compreende um filme permeável a gás tendo um terceiro orifício fixado ao mesmo que passa através do saco externo para o saco interno, adicionalmente fornecido o filme permeável a gás do saco interno tem tamanho de poro aumentado.
[89] 2. Saco de acordo com o parágrafo 1, em que o filme permeável a gás do saco externo é FEP (propileno-etileno fluorado), TFE (tetrafluoroetileno), PFA (perfluoroalcoxi), PVF (fluoreto de polivinila), PVDF (fluoreto de polivinilideno), PTFE (politetrafluoroetileno), PCTFE (policlorotrifluoroetileno), ETFE (polietilenotetrafluoroetileno), ECTFE (polietilenoclorotrifluoroetileno), FFPM/FFKM (perfluoroelastômero), FPM/FKM (fluoreto de clorotrifluoroetilenovinilideno), PFPE (perfluoropolieter), MFA (tetrafuoroetileno e copolímero de éter-vinil perfuorometil), CTFE/VDF (copolímero de fluoreto de vinilideno- clorotrifuoroetileno), e TFE/HFP (copolímero de tetrafuoroetileno-hexafuoropropileno) ou misturas dos mesmos.
[90] 3. Saco de acordo com o parágrafo 1, em que o primeiro e o Segundo orifícios do saco externo compreendem tubos fixados ao saco externo.
[91] 4. Saco, de acordo com o parágrafo 1, em que o terceiro orifício do saco interno compreende um tubo fixado ao saco interno.
[92] 5. Saco, de acordo com qualquer parágafo 3 ou 4, em que os tubos são fixados aos sacos por ligação química, ligação por adesivo, ligação por fusão térmica, ligação por solvente, soldagem a laser, tratamento de superfície ou combinações dos mesmos.
[93] 6. Saco, de acordo com qualquer parágrafo 3 ou 4, em que as extremidades não ligadas dos tubos fornecem um acesso selável no interior dos sacos.
[94] 7. Saco de acordo com o parágrafo 1, em que o filme permeável a gás do saco interno é FEP (propileno-etileno fluorado), TFE (tetrafluoroetileno), PFA (perfluoroalcoxi), PVF (fluoreto de polivinila), PVDF (fluoreto de polivinilideno), PTFE (politetrafluoroetileno), PCTFE (policlorotrifluoroetileno), ETFE (polietilenotetrafluoroetileno), ECTFE (polietilenoclorotrifluoroetileno), FFPM/FFKM (perfluoroelastômero), FPM/FKM (fluoreto de clorotrifluoroetilenovinilideno), PFPE (perfluoropolieter), MFA (tetrafuoroetileno e copolímero de éter-vinil perfuorometil), CTFE/VDF (copolímero de fluoreto de vinilideno- clorotrifuoroetileno), e TFE/HFP (copolímero de tetrafuoroetileno-hexafuoropropileno)ou misturas dos mesmos.
[95] 8. Saco, de acordo com o parágrafo 7, em que o tamanho de poro do filme de fluoropolímero do saco interno está entre aproximadamente 1 mícron e aproximadamente 6 mícrons em diâmetro.
[96] 9. Saco, de acordo com o parágrafo 7, em que o tamanho de poro do filme de fluoropolímero do saco interno está entre aproximadamente 1,5 mícrons e aproximadamente 5 mícrons em diâmetro.
[97] 10. Saco, de acordo com o parágrafo 7, em que o tamanho de poro do filme de fluoropolímero do saco interno está entre aproximadamente 2 mícrons e aproximadamente 4 mícron em diâmetro.
[98] 11. Saco, de acordo com o parágrafo 7, em que o tamanho de poro do filme de fluoropolímero do saco interno está entre aproximadamente 2,5 mícrons e aproximadamente 3,5 mícrons em diâmetro.
[99] 12. Saco, de acordo com o parágrafo 7, em que o tamanho de poro do filme de fluoropolímero do saco interno tem aproximadamente 3 mícrons em diâmetro.
[100] 13. Recipiente, de acordo com o parágrafo 7 até 12, em que o volume médio de poro está entre aproximadamente 20% e aproximadamente 55%.
[101] 14. Recipiente, de acordo com o parágrafo 7 até 13, em que o volume médio de poro está entre aproximadamente 30% e aproximadamente 50%.
[102] 15. Recipiente, de acordo com o parágrafo 7 até 14, em que o volume médio de poro está entre aproximadamente 40% e aproximadamente 45%.
[103] 16. Saco de acordo com o parágrafo 1, em que o saco interno é fixado por um quadro de fluoropolímero e chanfro.
[104] 17. Saco de acordo com o parágrafo 10, em que o quadro de fluoropolímero e chanfro são PTFE, FEP ou PFA.
[105] 18. Método para cultivar células em um saco compreendendo a etapa de: a) adicionar células ao saco, em que o saco compreende um saco externo e um saco interno, em que o saco externo compreende um filme permeável a gás tendo um primeiro orifício e um segundo orifício fixados ao mesmo; e o saco interno compreende um filme permeável a gás tendo um terceiro orifício fixado ao mesmo que passa através do saco externo até o saco interno, adicionalmente fornecido o filme de fluoropolímero do saco interno é poroso, em que as células são contidas no saco interno.
[106] 19. Método, de acordo com o parágrafo 18, em que as células compreendem células de tecido conectivo, células de esqueleto, células cardíacas, células epiteliais, células neurais, células endócrinas, células imunes, linfócitos, melanócitos, células de tumor ou misturas dos mesmos.
[107] 20. Método, de acordo com o parágrafo 18, compreendendo ainda a etapa de adicionar meio ao saco em que o meio está contido no saco externo e no saco interno.
[108] 21. Método, de acordo com o parágrafo 20, compreendendo ainda a etapa de incubar o saco.
[109] 22. Método, de acordo com o parágrafo 18, em que o diâmetro dos poros é suficiente para reter as células no saco interno.
[110] 23. Método, de acordo com o parágrafo 20, em que o meio pode ser adicionado através do primeiro orifício e removido através do segundo orifício.
[111] 24. Método, de acordo com o parágrafo 19, em que as células podem ser introduzidas ou removidas através do terceiro orifício.
[112] Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência a modalidades preferidas, pessoas versadas na técnica reconhecerão que alterações podem ser feitas em forma e detalhe sem se afastar do espírito e escopo da invenção. Todas as referências citadas em todo o relatório descritivo, incluindo aquelas nos antecedentes, são incorporadas aqui na íntegra. Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar, usando não mais que experimentação de rotina, muitos equivalentes a modalidades específicas da invenção descrita especificamente aqui. Tais equivalentes pretendem ser abrangidos no escopo das reivindicações a seguir.
Claims (21)
1. Saco, caracterizado porcompreender: um saco externo permeável a gás, um filme poroso permeável ao O2 e Co2 e com o volume interno acessível ao fluido, o saco externo tem um primeiro orifício e um segundo orifício fixado ao mesmo, cada do primeiro e segundo orifício fornece uma conexão de fluido ao volume interno do saco externo, o saco externo permeável ao O2 e Co2 tem o tamanho do poro suficiente para reter a mídia dentro do saco externo e saco interno permeável a gás disposto dentro do saco externo, o saco interno tem um volume interno acessível por fluido, o saco interno compreende uma folha de um filme poroso permeável a O2 e CO2, tendo um terceiro orifício anexado a ela que passa através do volume interno do saco externo e do saco interno, o filme poroso permeável a O2 e CO2 do saco interno tem poros de tamanho de poro que permitem o movimento da mídia entre o saco interno e o saco interno; em que o terceiro orifício é o único orifício em comunicação direta com o fluido com o volume interno do saco interno sem requerer que o fluido passe através dos poros do saco interno; em que o saco interno é menor em tamanho em todas as dimensões do que o saco externo, e é conectado ao saco externo somente através do terceiro orifício, de tal modo que o saco interno esteja configurado para ser cercado em todas as direções por mídia disposta no volume interno do saco externo; em que o tamanho do poro do saco interno é maior que o tamanho do poro do saco externo, e em que uma cultura de células é retida dentro do saco interno.
2. Saco de acordo com a reivindicação 1, caracterizado poro saco interno é anexado ao quadro por um chanfro, em que o quadro suporta o saco interno.
3. Saco de acordo com a reivindicação 2, caracterizado poro quadro é um quadro de fluoropolímero, e em que o saco interno compreende uma primeira folha de um filme poroso permeável a O2 e CO2 e uma segunda folha de um filme poroso permeável a gás, com as bordas da primeira e da segunda folhas sendo fixadas ao quadro de fluoropolímero por um chanfro.
4. Saco, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado poro quadro de fluoropolímero e o chanfro são cada um individualmente PTFE, FEP ou PFA.
5. Saco, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado poro filme poroso permeável ao O2 e CO2 do saco externo é um filme de fluoropolímero selecionado de FEP (propileno-etileno fluorado), TFE (tetrafluoroetileno), PFA (perfluoroalcoxi), PVF (fluoreto de polivinila), PVDF (fluoreto de polivinilideno), PTFE (politetrafluoroetileno), PCTFE (policlorotrifluoroetileno), ETFE (polietilenotetrafluoroetileno), ECTFE (polietilenoclorotrifluoroetileno), FFPM/FFKM (perfluoroelastômero), FPM/FKM (fluoreto de clorotrifluoroetilenovinilideno), PFPE (perfluoropolieter), MFA (tetrafuoroetileno e copolímero de éter-vinil perfuorometil), CTFE/VDF (copolímero de fluoreto de vinilideno-clorotrifuoroetileno), e TFE/HFP (copolímero de tetrafuoroetileno-hexafuoropropileno) e suas misturas.
6. Saco, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado poro filme poroso permeável a O2 e CO2, do saco externo é um filme de fluoropolímero FEP (propileno-etileno fluorado).
7. Saco, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado poro primeiro e o segundo orifícios do saco externo compreende tubos anexados ao saco externo.
8. Saco, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado poro terceiro orifício do saco interno compreende um tubo anexado ao saco interno e passa através do volume interno do saco externo.
9. Saco, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado poro primeiro orifício do saco externo compreender um primeiro tubo ligado ao saco externo, o segundo orifício do saco externo compreende um segundo tubo ligado ao saco externo, e um terceiro orifício do saco externo compreende um terceiro tubo ligado ao filme poroso permeável a O2 e CO2, em que os tubos são ligados aos sacos por ligação química, ligação por adesivo, ligação por fusão térmica, ligação por solvente, soldagem a laser, tratamento de superfície ou suas combinações.
10. Saco, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado poras extremidades não ligadas dos tubos fornecerem um acesso selável no volume interno dos sacos.
11. Saco, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado poro filme poroso permeável ao O2 e CO2 do saco interno é um filme de fluoropolímero selecionado de FEP (propileno-etileno fluorado), TFE (tetrafluoroetileno), PFA (perfluoroalcoxi), PVF (fluoreto de polivinila), PVDF (fluoreto de polivinilideno), PTFE (politetrafluoroetileno), PCTFE (policlorotrifluoroetileno), ETFE (polietilenotetrafluoroetileno), ECTFE (polietilenoclorotrifluoroetileno), FFPM/FFKM (perfluoroelastômero), FPM/FKM (fluoreto de clorotrifluoroetilenovinilideno), PFPE (perfluoropolieter), MFA (tetrafuoroetileno e copolímero de éter-vinil perfuorometil), CTFE/VDF (copolímero de fluoreto de vinilideno-clorotrifuoroetileno), e TFE/HFP (copolímero de tetrafuoroetileno-hexafuoropropileno) e suas misturas.
12. Saco, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado poro filme poroso permeável a O2 e CO2, do saco interno é um filme de fluoropolímero FEP (propileno-etileno fluorado).
13. Saco, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o tamanho de poro do filme de fluoropolímero do saco interno está entre 1 mícron e 6 mícrons em diâmetro.
14. Saco, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado poro tamanho de poro do filme de fluoropolímero do saco interno está entre 1,5 mícrons e 5 mícrons em diâmetro.
15. Saco, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado poro volume médio do saco interno ser entre 20% a 55%.
16. Saco, de acordo a reivindicação 1, caracterizado poro volume médio do saco interno ser entre 30% a 50%.
17. Saco, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado poro saco interno compreender duas folhas de fluoropolímero poroso permeável a gás que são unidas nas bordas para formar um compartimento de cultura de células selada.
18. Método para cultivar células em um saco, conforme definido nas reivindicações anteriores, caracterizado porcompreender a etapa de: fornecer um saco definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 e 17 e adicionar células ao saco, em que as células estão contidas no saco interno.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado poras células compreenderem células de tecido conectivo, células de esqueletos, células cardíacas, células epiteliais, células neurais, células endócrinas, células imunes, linfócitos, melanócitos, células de tumor ou suas misturas.
20. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado porcompreender ainda a etapa de adicionar meio ao saco em que o meio está contido dentro do saco externo e do saco interno.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado poro meio ser adicionado através do primeiro orifício e removido através do segundo orifício, e em que as células são introduzidas ou removidas através do terceiro orifício.
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