CN115715539A - 一种间充质干细胞保存液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种间充质干细胞保存液及其制备方法，间充质干细胞保存液的组成成分为：葡萄糖注射液、人血白蛋白注射液、L‑天冬酰胺及细胞悬液；其中人血白蛋白的浓度范围为(1～5g/ml)，L‑天冬酰胺的浓度范围为(6mmol/L～12mmol/L)；最终的细胞输注制剂总量为100ml；此款间充质干细胞保存液及其制备方法具有成分简单、安全性及稳定性高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种间充质干细胞保存液及其制备方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一种多能干细胞，广泛存在于机体的各种组织和器官中，具有自我更新、分化和免疫调节的功能。目前主要通过三大类机制在机体中发挥作用：(a)分化为特定类型的细胞谱系并整合到组织中，其具有再生医学的应用性；(b)分泌因子，包括促进细胞存活和生长并调节炎症的细胞因子和外泌体；(c)MSCs与宿主细胞直接接触以调节效应细胞的功能。间充质干细胞以其潜在的巨大的医疗价值而被广泛研究，并被逐步应用到临床医学方面，干细胞技术不仅正在为临床上一些疑难病症提供了有效疗法，而且也成为了世界上战略性新兴产业发展的重要方向。
MSCs的临床医疗应用，通常是先利用系列技术手段进行提取、培养、扩增后，然后通过一定途径对使用者进行调节治疗。应用MSCs进行疾病治疗的最主要途径为静脉输注，即将具有高活力的间充质干细胞加入输注载体中，制成稳定安全的细胞制剂对细胞进行保存，再通过静脉输注至人体从而达到治疗疾病的效果。
但是在临床应用阶段，由于MSCs制备的复杂性、制备条件的限制性、及使用者自身状况、环境距离等原因，在MSCs注射制剂制备以后，往往并不能立即进行使用，而需要一段时间的储存，才能输注给使用者。因此，细胞制剂在使用前的制备过程中，最重要的就是要解决好临床输注的安全性问题、和细胞活性的稳定性问题，这也是目前细胞治疗进行临床转化的主要难点。
因此在从实验室制备完成到临床输注的这一段时间里，如何保证MSCs的稳定性以及该稳定性能够保持多长时间就成了一个非常重要的课题，把这个问题解决好，就打通了细胞到使用者的传递通道中的重要一步，为加速MSCs的临床使用转化提供重要的效果保障。
一般来说，影响MSCs稳定性的因素主要有输注载体组分、存放温度、存放时间、pH值变化等，目前国内研究主要集中在回输载体组分和存放温度方面，也有部分文献涉及到光照、温度冷热不均等因素做了相关研究。现有常用的细胞保存液通常以生理盐水、或复方电解质注射液等作为输注基质，再添加葡萄糖、L-谷氨酰胺、透明质酸、肝素等多种物质来进行细胞保存，但是这些保存液有的成分过于复杂，对于后续临床应用的安全性会很难验证；有的保存液对细胞活性保存能力有限，活性维持时间一般在24小时以内，不能满足远距离临床应用所需。
所以，本项目当前着力解决的问题是，使用较为简单的输注载体组成成分及低温存放设置，通过控制pH值稳定、组分稳定、避免细胞结团，防止细胞老化，及低温损伤等，保证细胞的活性和对使用者的输注安全性，为临床安全有效的应用提供质量保障。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种成分简单、安全性及稳定性高的间充质干细胞保存液及其制备方法。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：一种间充质干细胞保存液，方案中间充质干细胞保存液的组成成分有：葡萄糖注射液、人血白蛋白注射液、L-天冬酰胺及细胞悬液；其中人血白蛋白的浓度范围为(1～5g/ml)，L-天冬酰胺的浓度范围为(6mmol/L～12mmol/L)；最终的细胞输注制剂总量为100ml。
作为优选，所述葡萄糖注射液、人血白蛋白及L-天冬酰胺的配比为82ml 5％葡萄糖注射液，10ml人血白蛋白注射液，158mg L-天冬酰胺，8ml细胞悬液。
为解决上述问题，本发明采用如下制备方法：包括以下步骤：
步骤一：取82ml 5％葡萄糖注射液，加入10ml人血白蛋白注射液，158mg L-天冬酰胺，8ml细胞悬液，混匀后即可；
步骤二：将步骤一的保存液放置于2-8℃的温度下保存。
本发明间充质干细胞保存液的有益效果是：
采用了葡萄糖注射液、人血白蛋白注射液、L-天冬酰胺，所制备成的细胞保存液，能够在72小时内冷藏条件下，通过在控制合适的pH值，避免细胞结团沉淀、保持MSCs的活率和活力，维持MSCs的细胞表面标记，而完全满足临床应用所需；该细胞保存液所包含的成分更少更简单，符合医用标准，安全可靠性高，保证了间充质干细胞的安全性和稳定性，以及对使用者的输注安全性，为临床应用提供了质量保障。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图
图1为本发明的流式细胞术测定MSCs表型--0h时(CD73、CD90、CD105(≥95％))的图；
图2为本发明的流式细胞术测定MSCs表型--0h时(CD34、CD45、HLA-DR(≤2％))的图；
图3为本发明的流式细胞术测定MSCs表型--72h时(5％葡萄糖注射液-1组)的图。
图4为本发明的流式细胞术测定MSCs表型--72h时(5％葡萄糖注射液+2％人血白蛋白注射液(g/ml)-2组)的图；
图5为本发明的流式细胞术测定MSCs表型--72h时(5％葡萄糖注射液+2％人血白蛋白注射液(g/ml)+L-天冬酰胺(6mmol/L)-3组)的图；
图6为本发明的流式细胞术测定MSCs表型--72h时(5％葡萄糖注射液+2％人血白蛋白注射液(g/ml)+L-天冬酰胺(12mmol/L)-4组)的图；
图7为本发明贴壁实验细胞活力测定(未处理样本细胞贴壁实验--0h时取样接种6孔板，观察培养72h)的图；
图8为本发明贴壁实验细胞活力测定(5％葡萄糖注射液-1组的细胞贴壁实验-72小时取样接种6孔板，观察培养72h)的图；
图9为本发明贴壁实验细胞活力测定(5％葡萄糖注射液+2％人血白蛋白注射液(g/ml)-2组的细胞贴壁实验-72小时取样接种6孔板，观察培养72h)的图；
图10为本发明贴壁实验细胞活力测定(5％葡萄糖注射液+2％人血白蛋白注射液(g/ml)+L-天冬酰胺(6mmol/L)-3组的细胞贴壁实验-72小时取样接种6孔板，观察培养72h)的图；
图11为本发明贴壁实验细胞活力测定(5％葡萄糖注射液+2％人血白蛋白注射液(g/ml)+L-天冬酰胺(12mmol/L)-4组的细胞贴壁实验-72小时取样接种6孔板，观察培养72h)的图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
一种间充质干细胞保存液，方案中间充质干细胞保存液的组成成分有：葡萄糖注射液、人血白蛋白注射液、L-天冬酰胺及细胞悬液；其中人血白蛋白的浓度范围为(1～5g/ml)，L-天冬酰胺的浓度范围为(6mmol/L～12mmol/L)；最终的细胞输注制剂总量为100ml；
所述葡萄糖注射液、人血白蛋白及L-天冬酰胺的配比为82ml 5％葡萄糖注射液，10ml人血白蛋白注射液，158mg L-天冬酰胺，8ml细胞悬液。
一种间充质干细胞保存液的制备方法，
步骤一：取82ml 5％葡萄糖注射液，加入10ml人血白蛋白注射液，158mg L-天冬酰胺，8ml细胞悬液，混匀后即可；
步骤二：将步骤一的保存液放置于2-8℃的温度下保存。
实验例
对比保存液为：
(1)5％葡萄糖注射液-1组；
制备：取92ml 5％葡萄糖注射液，加入8ml细胞悬液，混匀后即为1组；
(2)5％葡萄糖注射液+2％人血白蛋白注射液(g/ml)-2组；
制备：取82ml 5％葡萄糖注射液，加入10ml人血白蛋白注射液，和8ml细胞悬液，混匀后即为2组；
(3)5％葡萄糖注射液+2％人血白蛋白注射液(g/ml)+L-天冬酰胺(6mmol/L)-3组；
制备：取82ml 5％葡萄糖注射液，加入10ml人血白蛋白注射液，79mg L-天冬酰胺，8ml细胞悬液，混匀后即为3组；
(4)本申请间充质干细胞保存液为第4组。
将制备好的四组细胞输注制剂，每组均分为两个平行小组，分别标记为1-①组、1-②组；2-①组、2-②组；3-①组、3-②组；4-①组、4-②组。然后置于2-8℃条件下，到设定的时间节点进行相关指标检测。
间充质干细胞(MSCs)的制备：
(1)取液氮冻存的MSCs进行复苏并置于专门培养基中进行培养，培养条件为37℃、5％CO2；
(2)待细胞生长至密度为90％左右时进行扩大增殖，继续培养至生长密度为90％以上时，收获细胞；
(3)将收获的细胞进行留样计数，并用PBS洗涤一次后，再用40ml5％葡萄糖注射液进行悬浮，备用。
实验结果：
细胞活性测定(0h、24h、48h、72h)：6孔板贴壁实验：
| 性状观察 | 常规检验 | pH | 细胞活率 | 表型测定 | 细胞活性检测 | |
| 0h | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| 6h | √ | / | / | √ | / | / |
| 24h | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| 48h | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| 72h | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
外观性状观察(透明情况、结团情况)：
pH测定：
细胞活率及细胞浓度测定：
注：表格中的“/”表示活率低于75％，不再进行活率检测。
常规检验(无菌检验、内毒素检验)：
各实验组在72小时内，无菌检验均为阴性，内毒素检验合格。
本发明间充质干细胞保存液的有益效果是：
采用了葡萄糖注射液、人血白蛋白注射液、L-天冬酰胺，所制备成的细胞保存液，能够在72小时内冷藏条件下，通过在控制合适的pH值，避免细胞结团沉淀、保持MSCs的活率和活力，维持MSCs的细胞表面标记，而完全满足临床应用所需；该细胞保存液所包含的成分更少更简单，符合医用标准，安全可靠性高，保证了间充质干细胞的安全性和稳定性，以及对使用者的输注安全性，为临床应用提供了质量保障。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”“前端”、“后端”、“两端”、“一端”、“另一端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (3)
1.一种间充质干细胞保存液，其特征在于：间充质干细胞保存液的组成成分为：葡萄糖注射液、人血白蛋白注射液、L-天冬酰胺及细胞悬液；其中人血白蛋白的浓度范围为(1～5g/ml)，L-天冬酰胺的浓度范围为(6mmol/L～12mmol/L)；最终的细胞输注制剂总量为100ml。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞保存液，其特征在于：所述葡萄糖注射液、人血白蛋白及L-天冬酰胺的配比为82ml 5％葡萄糖注射液，10ml人血白蛋白注射液，158mg L-天冬酰胺，8ml细胞悬液。
3.一种如权利要求1所述的间充质干细胞保存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：取82ml 5％葡萄糖注射液，加入10ml人血白蛋白注射液，158mg L-天冬酰胺，8ml细胞悬液，混匀后即可；
步骤二：将步骤一的保存液放置于2-8℃的温度下保存。
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