KR20210142698A - 해동액 및 그 제조 방법과 응용 - Google Patents
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- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
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- A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
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Abstract
본 발명은 동결 보존용 해동액 및 그 제조 방법과 응용을 공개하고, 여기서 해동액은 0.1 ~ 50 g의 바이오닉 얼음 제어 재료, 0 ~ 1.0 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하며, 바이오닉 얼음 제어 재료는 얼음-친화성 그룹 및 친수성 그룹을 구비한 얼음 제어 재료이고; 친수성 그룹은 물 분자와 비공유 상호작용을 형성할 수 있는 관능기이며, 얼음-친화성 그룹은 얼음과 비공유 상호작용을 형성할 수 있는 관능기이다. 본 발명에서 얼음-친화성 및 친수성을 구비한 바이오닉 얼음 제어 재료로 제조된 해동액 및 해동 시약은 얼음 결정의 성장을 효과적으로 제어할 수 있고, 소생 과정에서 통제불능의 얼음 결정 성장으로 인한 세포 또는 조직의 손상을 크게 개선할 수 있으며; 생체적합성이 우수하고, 동물 혈청을 포함하지 않으며, 독성이 작고, 혈청을 포함하는 종래의 해동액에 비해 유통기한이 짧고 기생물이 물질을 오염시키는 위험을 줄이며, 세포 또는 조직의 후대 안정성을 유지하는데 더 유리하다. 또한, 본 발명은 성분이 간단하고 비용이 저렴하며 응용 전망이 좋다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 발명은 2019년 4월 9일에 중국 국가지식재산권국에 제출한, 특허 출원번호가 2019102824210이고, 발명의 명칭이 “동결보존용 해동액 및 해동 방법”,및 특허 출원번호가 2019102824155이고, 발명의 명칭이 “동결보존된 난모 세포 또는 배아의 해동에서 해동액의 응용”인 선출원의 우선권을 주장한다. 상기 두 건의 선출원된 전문 내용은 참조로서 본원 발명에 인용된다.
본 발명은 바이오메디컬 재료 기술분야에 속하며, 구체적으로 동결보존용 해동액 및 해동 방법에 관한 것이다.
동결 보존은 생물학적 재료를 초저온 상태로 보존하여 세포의 신진대사와 분열 속도를 늦추거나 멈추는 것을 의미하고, 정상적인 생리적 온도로 회복되면 계속하여 발육할 수 있다. 처음부터 이 기술은 자연과학 분야에서 없어서는 안될 연구 방법 중 하나로서 널리 사용되고 있다. 최근 몇년 간 생활 스트레스의 증가와 함께 인간의 생식능력은 해마다 감소되고, 생식능력의 보존은 갈수록 주목받고 있으며, 인간의 생식 세포(정자, 난모 세포), 생식선 조직 등의 동결 보존은 생식능력을 보존하는 중요한 수단으로 되었다. 또한, 세계 인구의 고령화에 따라 재생의학 및 장기이식에 사용 가능한 기증된 인간 유래 세포, 조직 또는 기관의 동결 보존에 대한 수요도 급증하고 있다. 따라서, 비상시를 위해 소중한 세포, 조직 및 기관 자원을 어떻게 효과적으로 동결 보존할 것인가는 시급히 해결해야 할 과학적인 기술적 과제이다.
현재 가장 일반적인 동결 보존 방법은 동결이다. 해동 과정에서, 얼음 결정, 저온 충격, 용질 효과, 파쇄 손상, 재결정화, 삽투압 충격과 같은 동결 해동 손상이 발생하지 않도록 주의해야 하고, 배아, 난모 세포 소생 생존율의 향상을 고려하여, 통상적인 동결 해동 해결수단은 다음과 같다. 급속 재가온법을 사용하여 고삼투압의 포배 또는 난모 세포를 소정 농도 구배의 동결보호제를 포함하는 배양액에 넣어, 세포 내부와 외부 사이의 삼투압 갭을 점차 감소시키고, 세포 부피의 변화를 최소화하며, 해동 과정에서 생기는 세포 또는 배아의 손상을 방지한다. 현재 임상에서 널리 사용되는 대부분의 해동 시약은 수크로스, 혈청 및 버퍼를 주요 성분으로 한다. 그러나, 상기 해동액은 재가온 과정에서 얼음 결정의 성장을 효과적으로 제어하지 못하므로 세포를 손상시킨다. 이 밖에, 현재의 해동액은 사용 성분이 불분명하고 변질하기 쉬운 혈청을 포함하기 때문에, 해동액은 유통기한이 짧고 기생물이 물질을 오염시키는 문제가 있다.
선행 기술의 상기 결함을 개선하기 위해, 본 발명은 동결 보존용 해동액 및 해동 방법을 제공한다.
본 발명은 하기와 같은 기술적 해결수단을 통해 구현된다.
해동액으로서, 100 mL당 0.1 ~ 50 g의 바이오닉 얼음 제어 재료, 0 ~ 1.0 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하고, 상기 바이오닉 얼음 제어 재료는 얼음-친화성 그룹 및 친수성 그룹을 구비한 얼음 제어 재료이다.
본 발명에 따르면, 상기 친수성 그룹은 물 분자와 비공유 상호작용을 형성할 수 있는 관능기이고, 예를 들어 물과 수소 결합, 반데르발스 상호작용, 정전기 상호작용, 소수성 상호작용 또는 π-π 상호작용을 형성할 수 있으며; 예시적으로, 상기 친수성 그룹은 히드록실(-OH), 아미노(-NH2), 카르복시산기(-COOH), 아미드(-CONH2) 중 적어도 하나로부터 선택되거나, 또는 프롤린(L-Pro), 아르기닌(L-Arg), 라이신(L-Lys), 히스티딘(L-His), 글리신(L-Gly), 글루코노델타락톤(GDL), 당류와 같은 화합물 분자 또는 이들의 분자 단편으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 얼음-친화성 그룹은 얼음과 비공유 상호작용을 형성할 수 있는 관능기이고, 예를 들어 얼음과 수소 결합, 반데르발스 상호작용, 정전기 상호작용, 소수성 상호작용 또는 π-π 상호작용을 형성할 수 있으며; 예시적으로, 상기 얼음-친화성 그룹은 히드록실(-OH), 아미노(-NH2), 페닐(-C6H5), 피롤리딘일(-C4H8N)로부터 선택되거나, 또는 글루타민(L-Gln), 트레오닌(L-Thr), 아스파르트산(L-Asn), 벤젠고리(-C6H6), 피롤리딘(-C4H9N)과 같은 화합물 분자 또는 이들의 분자 단편으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 바이오닉 얼음 제어 재료는 폴리비닐알코올(PVA), 아미노산(amino acid), 폴리펩티드(polypeptide), 폴리아미노산(polyamino acid) 중 적어도 하나 또는 둘 이상의 조합으로부터 선택된다.
본 발명에 따르면, 상기 아미노산은 아르기닌(arginine), 트레오닌(threonine), 프롤린(proline), 라이신(lysine), 히스티딘(histidine), 글루타민(glutamine), 아스파르트산(aspartic acid), 글리신(glycine) 등 중 하나 또는 둘 이상의 조합으로부터 선택될 수 있고; 상기 폴리아미노산은 라이신, 아르기닌, 프롤린, 트레오닌, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 글리신글루탐산(glutamic acid), 아스파르트산, 글리신 등 중 적어도 하나로부터 선택될 수 있는 호모폴리머(homopolymer)(중합도≥2, 바람직하게 중합도는 2 ~ 40이고, 예를 들어 중합도는 6, 8, 15, 20 등임)이다.
예시적으로, 상기 폴리펩티드는 상기 아미노산 중의 둘 이상으로 구성된 폴리펩티드이거나 또는 아미노산과 당류(예를 들어, 글루코락톤(glucolactone))가 반응하여 생성된 당펩티드(glycopeptide) 유도체이고, 예를 들어 상기 폴리펩티드는 2 ~ 8개의 상이한 아미노산으로 구성된 폴리펩티드이며, 더 예를 들면 디펩티드(dipeptide), 트리펩티드(tripeptide), 테트라펩티드(tetrapeptide) 등이다. 본 발명의 실시형태에서, 상기 폴리펩티드는 L-Thr-L-Arg(TR), L-Thr-L-Pro(TP), L-Arg-L-Thr(RT), L-Pro-L-Thr(PT), L-Thr-L-Arg-L-Thr(TRT), L-Thr-L-Pro-L-Thr(TPT), L-Ala-L-Ala-L-Thr(AAT), L-Thr-L-Cys-L-Thr(TCT) 중의 하나 또는 둘 이상이다.
본 발명에 따르면, 상기 바이오닉 얼음 제어 재료의 함량은 1.0 ~ 50 g, 2.0 ~ 20 g, 5.0 ~ 10 g이고; 하나의 실시형태에서, 상기 바이오닉 얼음 제어 재료의 함량은 3.0 g, 4.0 g, 5.0 g, 10 g, 25g, 30g이다.
본 발명의 하나의 실시형태로서, 상기 바이오닉 얼음 제어 재료는 1.0 ~ 6.0 g의 PVA를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시형태로서, 상기 바이오닉 얼음 제어 재료는 1.0 ~ 30 g의 아미노산을 포함한다. 예시적으로, 상기 아미노산은 아르기닌과 트레오닌의 조합으로 구성되고, 예를 들어 1.0 ~ 20 g, 1.0 ~ 10 g, 1.0 ~ 5 g의 아르기닌을 포함하며, 1.0 ~ 10 g, 1.0 ~ 5.0 g, 1.0 ~ 2.5 g의 트레오닌을 포함한다.
본 발명의 하나의 실시형태로서, 상기 바이오닉 얼음 제어 재료는 0.1 ~ 9.0 g의 폴리아미노산을 포함하고, 예를 들어 1 ~ 5.0g을 포함한다. 예시적으로, 상기 아미노산은 폴리-L-프롤린 및/또는 폴리-L-아르기닌이다.
본 발명의 하나의 실시형태로서, 상기 바이오닉 얼음 제어 재료는 1.0 ~ 50 g의 폴리펩티드를 포함하고; 예를 들어 1.0 ~ 25 g, 1.0 ~ 13 g, 1.0 ~ 10 g , 1.0 ~ 5.0 g을 포함한다.
본 발명의 하나의 실시형태로서, 상기 바이오닉 얼음 제어 재료는 PVA와 상기 아미노산, 폴리펩티드 및/또는 폴리아미노산의 조합이다.
본 발명에 따르면, 해동액 100 mL당 상기 수용성 당의 함량은 0.1 ~ 1.0 mol L-1이고, 예를 들어 0.1 ~ 0.8 mol L-1, 0.2 ~ 0.6 mol L-1이며; 예를 들어 0.25mol L-1, 0.5 mol L-1, 1.0 mol L-1이다.
해동 시약으로서, 해동액 I, 해동액 II, 해동액 III 및 해동액 IV를 포함하고, 상기 해동액 I ~ IV는 상기와 같은 해동액의 구성을 구비한다.
본 발명의 해동 시약에 따르면, 상기 해동액 I ~ IV에서 바이오닉 얼음 제어 재료의 농도 구배는 특별히 한정되지 않고, 각 해동액에서 바이오닉 얼음 제어 재료의 농도는 동일하거나 상이할 수 있으며; 예시적인 실시형태로서, 상기 해동액 I ~ IV에서 바이오닉 얼음 제어 재료의 농도는 상이하고, 예를 들어 상기 해동액 II에서 바이오닉 얼음 제어 재료의 함량은 해동액 I 중의 50% ~ 100%이며, 상기 해동액 III에서 바이오닉 얼음 제어 재료의 함량은 해동액 II 중의 50% ~ 100%이다.
본 발명의 해동 시약에 따르면, 상기 해동액 I ~ IV에는 1.0 ~ 6.0 g의 PVA가 포함되고; 바람직하게, 상기 해동액 I-IV에서 PVA의 농도는 동일하다.
본 발명의 해동 시약에 따르면, 상기 해동액 II에서 수용성 당의 농도는 해동액 I 중의 50% ~ 100%이고, 상기 해동액 III에서 수용성 당의 농도는 해동액 II 중의 50% ~ 100%이며, 상기 해동액 IV에서 당의 농도는 0이다.
본 발명에 따른 해동 시약의 하나의 실시형태로서, 상기 해동액 I는 100 mL당 1.0 ~ 50 g의 아미노산, 1.0 ~ 5.0 g의 PVA, 1.0 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하고;
상기 해동액 II는 100 mL당 1.0 ~ 25 g의 아미노산, 1.0 ~ 5.0 g의 PVA, 0.5 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하며;
상기 해동액 III는 100 mL당 1.0 ~ 12.5 g의 아미노산, 1.0 ~ 5.0 g의 PVA, 0.25 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하고;
상기 해동액 IV는 100 mL당 0 ~ 6.25 g의 아미노산, 1.0 ~ 5.0 g의 PVA 및 여분의 버퍼를 포함한다.
본 발명에 따른 해동 시약의 하나의 실시형태로서, 상기 해동액 I는 100 mL당 1.0 ~ 5.0 g의 PVA, 1.0 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하고;
상기 해동액 II는 100 mL당 1.0 ~ 5.0 g의 PVA, 0.5 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하며;
상기 해동액 III는 100 mL당 1.0 ~ 5.0 g의 PVA, 0.25 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하고;
상기 해동액 IV는 100 mL당 1.0 ~ 5.0 g의 PVA 및 여분의 버퍼를 포함한다.
본 발명에 따른 해동 시약의 하나의 실시형태로서, 상기 해동액 I는 100 mL당 0.1 ~ 9.0 g의 폴리아미노산, 1.0 ~ 5.0 g의 PVA, 1.0 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하고;
상기 해동액 II는 100 mL당 0.1 ~ 4.5 g의 폴리아미노산, 1.0 ~ 5.0 g의 PVA, 0.5 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하며;
상기 해동액 III는 100 mL당 0.1 ~ 2.3 g의 폴리아미노산, 1.0 ~ 5.0 g의 PVA, 0.25 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하고;
상기 해동액 IV는 100 mL당 0 ~ 1.2 g의 폴리아미노산, 1.0 ~ 5.0 g의 PVA 및 여분의 버퍼를 포함한다.
본 발명에 따른 해동 시약의 하나의 실시형태로서, 상기 해동액 I는 100 mL당 1.0 ~ 50 g의 폴리펩티드, 1.0 ~ 5.0 g의 PVA, 1.0 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하고;
상기 해동액 II는 100 mL당 1.0 ~ 25 g의 폴리펩티드, 1.0 ~ 5.0 g의 PVA, 0.5 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하며;
상기 해동액 III는 100 mL당 1.0 ~ 12.5 g의 폴리펩티드, 1.0 ~ 5.0 g의 PVA, 0.25 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하고;
상기 해동액 IV는 100 mL당 0 ~ 6.25 g의 폴리펩티드, 1.0 ~ 5.0 g의 PVA 및 여분의 버퍼를 포함한다.
본 발명에 따르면, 상기 수용성 당은 비환원성 이당, 수용성 다당, 당무수물 중의 적어도 하나일 수 있고, 예를 들어 수크로스(sucrose), 트레할로오스(trehalose)로부터 선택되고; 바람직하게 수크로스이다. 상기 수용성 당은 세포막을 보호하고 세포 침강을 방지할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 버퍼 DPBS 또는 hepes-buffered HTF 버퍼 또는 다른 세포 배양 버퍼 중 적어도 하나로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 PVA는 동일 배열(isotactic) PVA, 교대 배열(syndiotactic) PVA 및 혼성 배열(atactic) PVA 중 하나 또는 둘 이상의 조합으로부터 선택되고, 예를 들어 상기 PVA의 교대 배열성(syndiotacticity)은 15% ~ 65%이며, 구체적으로, 예를 들어 40% ~ 60%, 53% ~ 55%이다. 바람직하게 혼성 배열 PVA는 예를 들어 상기 PVA의 교대 배열성이 45% ~ 65%인 PVA이다.
본 발명에 따르면, 상기 PVA는 10 ~ 500 kDa의 분자량 또는 더 높은 분자량의 PVA로부터 선택될 수 있고, 예를 들어 분자량은 10 ~ 30 kDa, 30 ~ 50 kDa, 80 ~ 90 kDa, 200 ~ 500 kDa일 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 PVA는 가수분해도가 80%보다 큰 PVA로부터 선택될 수 있고, 예를 들어 가수분해도는 80% ~ 99%, 82-87%, 87% ~ 89%, 89% ~ 99%, 98% ~ 99%일 수 있다.
본 발명의 해동액은 본 기술분야의 공지된 방법으로 제조할 수 있고, 예를 들어,
바이오닉 얼음 제어 재료를 버퍼의 일부에 용해하고, pH를 조절하며, 수용성 당을 버퍼의 일부에 용해하고, 실온으로 냉각시킨 후 두 용액을 혼합한다.
동결 보존된 세포 또는 조직 또는 기관을 해동하는 방법으로서,
동결된 세포 또는 조직 또는 기관을 37 ℃의 온도의 상기 해동액 I에 넣어 3 ~ 5분 동안 소생시킨 다음, 상온에서 상기 해동액 II, 해동액 III, 해동액 IV에 순차적으로 넣어 각각 3 ~ 5분 동안 소생시키는 단계를 포함한다.
상기 해동액 및 해동 시약은 동결 보존된 난모 세포 및 배아, 조직 또는 기관의 소생 및 해동에 사용될 수 있다. 예를 들어 상기 조직 또는 기관은 난소 조직 또는 난소 기관이다.
또한, 본 발명은 상기 해동액 및 해동 시약의 응용을 제공하고, 구체적으로 동결 보존된 난모 세포 및 배아, 조직 또는 기관의 소생 및 해동에서의 응용이며, 예를 들어 상기 조직 또는 기관은 난소 조직 또는 난소 기관이다.
본 발명에서 얼음-친화성 및 친수성을 구비한 바이오닉 얼음 제어 재료로 제조된 해동액 및 해동 시약은 얼음 결정의 성장을 효과적으로 제어할 수 있고, 소생 과정에서 온도 변화로 인한 세포 또는 조직의 손상을 크게 개선할 수 있으며; 생체적합성이 우수하고, 동물 혈청을 포함하지 않으며, 독성이 작고, 혈청을 포함하는 종래의 해동액에 비해 유통기한이 짧고 기생물이 물질을 오염시키는 위험을 줄이며, 세포 또는 조직의 후대 안정성을 유지하는데 더 유리하다. 또한, 본 발명은 성분이 간단하고 비용이 저렴하며 응용 전망이 좋다.
도 1은 신선하고 동결되지 않은 난소 기관의 절편 염색 사진이다.
도 2는 난소 기관이 실시예 1의 해동액으로 해동된 후의 절편 염색 사진이다.
도 3은 신선하고 동결되지 않은 난소 조직의 절편 염색 사진이다.
도 4는 난소 조직이 실시예 1의 해동액으로 해동된 후의 절편 염색 사진이다.
도 2는 난소 기관이 실시예 1의 해동액으로 해동된 후의 절편 염색 사진이다.
도 3은 신선하고 동결되지 않은 난소 조직의 절편 염색 사진이다.
도 4는 난소 조직이 실시예 1의 해동액으로 해동된 후의 절편 염색 사진이다.
이하 구체적인 실시예에 결부하여 본 발명의 제조 방법을 보다 더 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 예시적으로 본 발명을 설명 및 해석할 뿐 본 발명의 보호범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 아니 됨을 이해해야 한다. 본 발명의 상기 내용에 의해 구현되는 기술은 본 발명이 보호하고자 하는 범위 내에 포함된다.
하기 실시예에서 사용되는 실험 방법은 달리 설명하지 않는 한 모두 일반적인 방법이고; 하기 실시예에서 사용되는 시약, 재료 등은 달리 설명하지 않는 한 상업적인 경로로 획득할 수 있다.
본 발명의 실시예에서 사용되는 PVA의 교대 배열성은 50% ~ 55%이고, 분자량은 13 ~ 23 kDa이며, 가수분해도는 98%이다.
본 발명의 실시예에서 동결 보존액에 사용되는 폴리-L-프롤린의 중합도는 15이고, 분자량은 1475이다. 해동액에서 폴리-L-프롤린의 중합도는 8이고, 분자량은 795이다.
본 발명의 실시예에서 하기와 같은 동결 평형액 및 동결 보존액을 사용한다.
동결 보존액 A: 전체 부피는 100 mL이며, 80 ℃의 온도의 수조에서 2.0 g의 PVA를 가열하고 30 mL의 DPBS에서 자기교반하여 용해시키며, pH를 7.0으로 조절하여 용액 1로 하고; 17 g(0.05 mol)의 수크로스(동결 보존액에서 수크로스의 최종 농도는 0.5 mol L-1임)를 초음파로 25 mL의 DPBS에 용해시키며, 수크로스가 전부 용해된 후 10 mL의 에틸렌글리콜을 첨가하여 용액 2로 하고, 용액 1과 용액 2가 실온으로 회복된 후, 두 용액을 골고루 혼합하며, pH를 조절하고 DPBS로 여분을 보충하여 전체 부피가 100 mL 되도록 만든 다음 비축한다.
동결 평형액 a: 전체 부피는 100 mL이며, 80 ℃의 온도의 수조에서 2.0 g의 PVA를 가열하고 50 mL의 DPBS에서 자기교반하여 용해시키며, PVA 전부가 용해된 후 pH를 7.0으로 조절하고, 7.5 mL의 에틸렌글리콜을 첨가하여 골고루 혼합하며, pH 값을 조절하고 DPBS로 여분을 보충하여 전체 부피가 100 mL 되도록 만든 다음 비축한다.
동결 보존액 B: 전체 부피는 100 mL이며, 80 ℃의 온도의 수조에서 2.0 g의 PVA를 가열하고 25 mL의 DPBS에서 자기교반하여 용해시키며, pH를 7.0으로 조절하여 용액 1로 하고; 1.5 g의 폴리-L-프롤린을 초음파로 다른 20 mL의 DPBS에 용해하며, pH를 7.0으로 조절하여 용액 2로 하고; 17 g(0.05 mol)의 수크로스(동결 보존액에서 수크로스의 최종 농도는 0.5mol L-1임)를 초음파로 25 mL의 DPBS에 용해시키며, 수크로스가 전부 용해된 후 10 mL의 에틸렌글리콜을 순차적으로 첨가하여 용액 3으로 하고, 용액 1, 용액 2 및 용액 3이 실온으로 회복된 후, 세 가지 용액을 골고루 혼합하며, pH 값을 조절하고 DPBS로 여분을 보충하여 전체 부피가 100 mL 되도록 만든 다음 비축한다.
동결 평형액 b: 동결 평형액 a의 구성과 동일하고, 전체 부피는 100 mL이며, 80 ℃의 온도의 수조에서 2.0 g의 PVA를 가열하고 40 mL의 DPBS에서 자기교반하여 용해시키며, PVA 전부가 용해된 후 pH를 7.0으로 조절하고, 7.5 mL의 에틸렌글리콜을 첨가하여 골고루 혼합하며, pH 값을 조절하고 DPBS로 여분을 보충하여 전체 부피가 100 mL 되도록 만든 다음 비축한다.
동결 보존액 C: 1 mL당 10%(v/v)의 에틸렌글리콜, 20%(v/v)의 소태아혈청, 0.5 M의 수크로스를 포함하고, 여분은 DPBS이다.
동결 평형액 c: 1 mL당 7.5%(v/v)의 에틸렌글리콜, 20%(v/v)의 소태아혈청을 포함하고, 여분은 DPBS이다.
실시예 1
해동액 Ⅰ는 100 mL당 하기와 같은 성분을 포함한다.
해동액 Ⅱ는 100 mL당 하기와 같은 성분을 포함한다.
해동액 Ⅲ는 100 mL당 하기와 같은 성분을 포함한다.
해동액 Ⅳ는 100 mL당 하기와 같은 성분을 포함한다.
실시예 2해동액 Ⅰ는 100 mL당 하기와 같은 성분을 포함한다.
해동액 Ⅱ는 100 mL당 하기와 같은 성분을 포함한다.
해동액 Ⅲ는 100 mL당 하기와 같은 성분을 포함한다.
해동액 Ⅳ는 100 mL당 하기와 같은 성분을 포함한다.
비교예 1:
해동액 Ⅰ: 1.0 mol L-1의 수크로스, 20%의 혈청을 포함하고, 여분은 DPBS이다.
해동액 Ⅱ: 0.5 mol L-1의 수크로스, 20%의 혈청을 포함하고, 여분은 DPBS이다.
해동액 Ⅲ: 0.25 mol L-1의 수크로스, 20%의 혈청을 포함하고, 여분은 DPBS이다.
해동액 Ⅳ: 0 mol L-1의 수크로스, 20%의 혈청을 포함하고, 여분은 DPBS이다.
용응예 1 동결 난모 세포의 해동
본 발명에 사용되는 난모 세포의 동결 보존 방법은 구체적으로 다음과 같다. 먼저 난모 세포를 동결 평형액에서 5분 동안 평형시킨 후, 상기 동결 보존액에서 45초 동안 평형시키며, 동결 보존액에서 평형된 난모 세포를 동결 로드에 배치한 후, 재빨리 액체 질소(-196 ℃)에 투입시키고, 로드를 밀폐하여 보존한다.
상기 실시예 1, 2 중의 배합 방법과 비교예 1에서 제조된 해동용 시약을 사용하여 마우스의 난모 세포를 해동하고, 난모 세포의 해동 방법은 구체적으로 다음과 같다. 액체 질소에서 난모 세포를 재빨리 취하여 37 ℃의 온도의 해동액 Ⅰ에 3분 내지 5분 동안 넣은 후, 상온에서 순차적으로 해동액 Ⅱ, 해동액 Ⅲ, 해동액 Ⅳ에 각 3분 동안 넣은 다음, 난모 세포를 배지에 넣고, 37 ℃ 및 5% 이산화탄소의 인큐베이터에서 2시간 동안 배양한 후, 난모 세포의 생존율(표 1)을 관찰한다.
응용예 2 동결 배아의 해동
본 발명에 사용되는 배아의 동결 보존 방법은 구체적으로 다음과 같다. 먼저 배아를 동결 평형액에서 8분 동안 평행시킨 후, 상기 배합 방법으로 제조된 동결 보존액에서 50초 동안 평형시키며, 동결 보존액에서 평형된 배아를 동결 로드에 배치한 후, 재빨리 액체 질소(-196 ℃)에 투입시키고, 로드를 밀폐하여 보존한다.
상기 실시예 1, 2 중의 배합 방법과 비교예 1에서 제조된 해동용 시약을 사용하여 마우스의 배아를 해동하고, 배아의 해동 방법은 구체적으로 다음과 같다. 액체 질소에서 배아를 재빨리 취하여 37 ℃의 온도의 해동액 Ⅰ에 3분 내지 5분 동안 넣은 후, 상온에서 순차적으로 해동액 Ⅱ, 해동액 Ⅲ, 해동액 Ⅳ에 각 3분 동안 넣은 다음, 배아를 배지에 넣고, 37℃ 및 5% 이산화탄소의 인큐베이터에서 2시간 동안 배양한 후, 배아의 생존율(표 2)을 관찰한다.
본 발명의 실시예에서 생존율은 3 ~ 12회 반복 실험을 거친 생존율의 평균값이다.
| 번호 | 평형액 | 동결액 | 해동액 | 동결 난모 세포 전체 개수 | 2시간 후 생존율% |
| 응용 구현예 1 | a | A | 실시예 1 | 53 | 96.5 |
| 응용 구현예 2 | b | B | 실시예 2 | 60 | 98.6 |
| 응용 구현예 3 | c | C | 실시예 1 | 44 | 94.7 |
| 비교 구현예 1 | a | A | 비교예 1 | 50 | 93.4 |
| 비교 구현예 2 | b | B | 비교예 1 | 39 | 89.7 |
| 비교 구현예 3 | c | C | 비교예 1 | 96 | 81.9 |
| 번호 | 평형액 | 동결액 | 해동액 | 배아 전체 개수 | 2시간 후 생존율% |
| 비교 구현예 4 | c | C | 비교예 1 | 39 | 82.0 |
| 응용 구현예 4 | b | B | 실시예 2 | 39 | 97.4 |
| 응용 구현예 5 | a | A | 실시예 1 | 37 | 97.1 |
표 1 및 표 2의 데이터로부터 볼 수 있다시피, 본 발명의 해동 시약으로 해동된 난모 세포의 생존율은 모두 94% 이상에 도달하고, 최대 98.6%까지 도달할 수 있으며, 해동된 배아의 생존율은 97% 이상에 도달하여, 배아 해동 생존율은 비교예 1(상업화 해동액)보다 훨씬 높으므로, 난모 세포 및 배아를 해동함에 있어서 상기 해동 시약은 일반적인 유리화 해동액보다 더 효과적임을 나타낸다. 또한, 본 발명의 해동 시약은 혈청을 첨가하지 않아, 기생물이 물질을 오염시키는 위험을 줄이고, 세포 또는 조직의 후대 안정성을 유지하는데 더 유리하다.
응용예 3 완전한 난소 기관 또는 난소 조직의 절편이 동결된 후의 해동
상기 동결 평형액 a 및 동결 보존액 A의 조합을 사용하여 생후 3일 이내의 마우스의 난소 기관 및 성적으로 성숙된 마우스의 난소 조직의 절편을 각각 동결 보존한 후, 상기 실시예 1의 해동액을 사용하여 해동한다. 동결 및 해동 과정은 다음과 같다. 먼저 전체 난소 기관 또는 난소 조직의 절편을 평형액에 놓고 실온에서 25분 동안 평행시킨 후, 제조된 동결 보존액에 15분 동안 놓은 다음, 완전한 난소 기관 또는 난소 조직의 절편을 동결 로드에 배치하여 액체 질소에 투입시켜 보존한다. 해동 후, 완전한 난소 기관 또는 난소 조직의 절편을 배양액(10% FBS+a-MEM)에 넣은 후, 37 ℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서 2시간 동안 소생 및 배양한 다음, 4% 파라포름알데히드를 사용하여 고정하고, 파라핀으로 포매하며, HE로 염색하여 형태를 관찰한다.
결과는 도 1 ~ 4에 도시된 바와 같고, 여기서 도 1은 신선하고 동결되지 않은 난소 기관의 절편 염색 사진이며, 도 2는 난소 기관이 실시예 1의 해동액으로 해동된 후의 절편 염색 사진이고; 도 3은 신선하고 동결되지 않은 난소 조직의 절편 염색 사진이며, 도 4는 난소 조직이 실시예 1의 해동액으로 해동된 후의 절편 염색 사진이다. 볼 수 있다시피, 실시예 1의 해동액으로 해동한 후, 난소 기관 또는 난소 조직의 난포 구조는 상대적으로 완전하고, 간엽 구조도 상대적으로 완전하며, 세포질이 균질하고 연함 염색이 상대적으로 많으며, 세포핵이 수축되고 진한 염색이 상대적으로 적으며; 혈관벽 구조가 완전하고, 내강의 붕괴가 비교적 적으며, 내피 세포질이 균질하고 연한 염색이 상대적으로 많으며, 세포핵이 수축되고 진한 염색이 상대적으로 적어, 우수한 소생 효과를 달성한다.
이상, 본 발명의 실시형태에 대해 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시형태에 한정되지 않는다. 본 발명의 사상 및 원칙 내에서 이루어진 모든 수정, 균등한 대체, 개선 등은 모두 본 발명의 보호범위 내에 포함되어야 한다.
Claims (11)
- 해동액으로서,
해동액 100 mL당 0.1 ~ 50 g의 바이오닉 얼음 제어 재료, 0 ~ 1.0 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하고, 상기 바이오닉 얼음 제어 재료는 얼음-친화성 그룹 및 친수성 그룹을 구비한 얼음 제어 재료이며; 상기 친수성 그룹은 물 분자와 비공유 상호작용을 형성할 수 있는 관능기 또는 분자이고, 상기 얼음-친화성 그룹은 얼음과 비공유 상호작용을 형성할 수 있는 관능기 또는 분자인 것을 특징으로 하는 해동액. - 제1항에 있어서,
상기 친수성 그룹은 물과 수소 결합, 반데르발스 상호작용, 정전기 상호작용, 소수성 상호작용 또는 π-π 상호작용을 형성하고; 예시적으로, 상기 친수성 그룹은 히드록실(-OH), 아미노(-NH2), 카르복시산기(-COOH), 아미드(-CONH2) 중 적어도 하나로부터 선택되거나, 또는 프롤린(L-Pro), 아르기닌(L-Arg), 라이신(L-Lys), 글루코노델타락톤(GDL), 당류와 같은 화합물 분자 또는 이들의 분자 단편으로부터 선택되며;
바람직하게, 상기 얼음-친화성 그룹은 얼음과 수소 결합, 반데르발스 상호작용, 정전기 상호작용, 소수성 상호작용 또는 π-π 상호작용을 형성하고; 예시적으로, 상기 얼음-친화성 그룹은 히드록실(-OH), 아미노(-NH2), 페닐(-C6H5), 피롤리딘일(-C4H8N)로부터 선택되거나, 또는 글루타민(L-Gln), 트레오닌(L-Thr), 아스파르트산(L-Asn), 히스티딘(L-His), 글리신(L-Gly), 벤젠고리(C6H6), 피롤리딘(C4H9N)과 같은 화합물 분자 또는 이들의 분자 단편으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 해동액. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 바이오닉 얼음 제어 재료는 폴리비닐알코올(PVA), 아미노산(amino acid), 폴리펩티드(polypeptide), 폴리아미노산(polyamino acid) 중 적어도 하나 또는 둘 이상의 조합으로부터 선택되고;
바람직하게, 상기 아미노산은 아르기닌(arginine), 트레오닌(threonine), 프롤린(proline), 라이신(lysine), 히스티딘(histidine), 글루타민(glutamine), 아스파르트산(aspartic acid), 글리신(glycine) 등 중 하나 또는 둘 이상의 조합으로부터 선택되며; 상기 폴리아미노산은 라이신, 아르기닌, 프롤린, 트레오닌, 히스티딘, 글루탐산(glutamic acid), 아스파르트산, 글리신 등 중 적어도 하나로부터 선택되는 호모폴리머(homopolymer)(중합도≥2, 바람직하게 중합도는 2 ~ 40이고, 예를 들어 중합도는 6, 8, 15, 20 등임)이고;
바람직하게, 상기 폴리펩티드는 둘 이상의 아미노산으로 구성되거나 또는 아미노산과 당류로 구성되는 당펩티드(glycopeptide) 유도체이며, 예를 들어 2 ~ 8개의 상이한 아미노산으로 구성되고, 바람직하게 상기 폴리펩티드는 L-Thr-L-Arg(TR), L-Thr-L-Pro(TP), L-Arg-L-Thr(RT), L-Pro-L-Thr(PT), L-Thr-L-Arg-L-Thr(TRT), L-Thr-L-Pro-L-Thr(TPT), L-Ala-L-Ala-L-Thr(AAT), L-Thr-L-Cys-L-Thr(TCT) 중의 하나 또는 둘 이상이며;
바람직하게, 상기 PVA는 동일 배열(isotactic) PVA, 교대 배열(syndiotactic) PVA 및 혼성 배열(atactic) PVA 중 하나 또는 둘 이상의 조합으로부터 선택되고, 예를 들어 상기 PVA의 교대 배열성(syndiotacticity)은 15% ~ 65%이며, 바람직하게 45% ~ 65%이고;
바람직하게, 상기 PVA는 10 ~ 500 kDa의 분자량 또는 더 높은 분자량의 PVA로부터 선택되며; 바람직하게 PVA의 가수분해도는 80% ~ 99%, 82% ~ 87%, 87% ~ 89%, 89% ~ 99%, 98% ~ 99%인 것을 특징으로 하는 해동액. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 바이오닉 얼음 제어 재료의 함량은 1.0 ~ 30 g이고;
바람직하게, 상기 바이오닉 얼음 제어 재료는 1.0 ~ 6.0 g의 PVA를 포함하며;
바람직하게, 상기 바이오닉 얼음 제어 재료는 1.0 ~ 30 g의 아미노산을 포함하고, 보다 바람직하게, 상기 아미노산은 아르기닌과 트레오닌의 조합으로 구성되며;
바람직하게, 상기 바이오닉 얼음 제어 재료는 0.1 ~ 9.0 g의 폴리아미노산을 포함하고;
바람직하게, 상기 바이오닉 얼음 제어 재료는 1.0 ~ 50 g의 폴리펩티드를 포함하며;
바람직하게, 상기 바이오닉 얼음 제어 재료는 PVA와 상기 아미노산, 폴리펩티드 및/또는 폴리아미노산의 조합인 것을 특징으로 하는 해동액. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
해동액 100 mL당 상기 수용성 당의 함량은 0.1 ~ 1.0 mol L-1이고;
바람직하게, 상기 수용성 당은 비환원성 이당, 수용성 다당, 당무수물 중의 적어도 하나일 수 있으며, 예를 들어 수크로스(sucrose), 트레할로오스(trehalose), 수용성 셀룰로오스(cellulose)(예를 들어, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스(Hydroxypropylmethylcellulose)), 피콜(ficoll)로부터 선택되고;
바람직하게, 상기 버퍼는 DPBS 또는 hepes-buffered HTF 버퍼 또는 다른 세포 버퍼 중 적어도 하나로부터 선택될 수 있는 것을 특징으로 하는 해동액. - 해동 시약으로서,
해동액 I, 해동액 II, 해동액 III 및 해동액 IV를 포함하고, 상기 해동액 I ~ IV는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 해동액의 구성을 구비하는 것을 특징으로 하는 해동 시약. - 제6항에 있어서,
바람직하게, 상기 해동액 II에서 수용성 당의 농도는 해동액 I 중의 50% ~ 100%이고, 상기 해동액 III에서 수용성 당의 농도는 해동액 II 중의 50% ~ 100%이며, 상기 해동액 IV에서 수용성 당의 농도는 0이고; 바람직하게, 상기 해동액 I ~ IV에서, 예를 들어 바이오닉 얼음 제어 재료의 농도는 동일하거나 상이하며, 예를 들어 해동액 II에서 바이오닉 얼음 제어 재료의 농도는 해동액 I 중의 50% ~ 100%이고, 상기 해동액 III에서 바이오닉 얼음 제어 재료의 농도는 해동액 II 중의 50% ~ 100%이며, 상기 해동액 IV에서 바이오닉 얼음 제어 재료의 농도는 0이고;
바람직하게, 상기 해동액 I ~ IV에는 1.0 ~ 6.0 g의 PVA가 포함되며; 바람직하게, 상기 해동액 I ~ IV에서 PVA의 농도는 동일한 것을 특징으로 하는 해동 시약. - 제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 해동 시약에서, 상기 해동액 I는 100 mL당 1.0 ~ 50 g의 아미노산 또는 폴리펩티드 중 적어도 하나, 1.0 ~ 5.0 g의 PVA, 1.0 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하고;
상기 해동액 II는 100 mL당 1.0 ~ 25 g의 아미노산 또는 폴리펩티드 중 적어도 하나, 1.0 ~ 5.0 g의 PVA, 0.5 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하며;
상기 해동액 III는 100 mL당 1.0 ~ 12.5 g의 아미노산 또는 폴리펩티드 중 적어도 하나, 1.0 ~ 5.0 g의 PVA, 0.25 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하고;
상기 해동액 IV는 100 mL당 0 ~ 6.25 g의 아미노산 또는 폴리펩티드 중 적어도 하나, 1.0 ~ 5.0 g의 PVA 및 여분의 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 해동 시약. - 제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 해동액 I는 100 mL당 1.0 ~ 5.0 g의 PVA, 1.0 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하고;
상기 해동액 II는 100 mL당 1.0 ~ 5.0 g의 PVA, 0.5 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하며;
상기 해동액 III는 100 mL당 1.0 ~ 5.0 g의 PVA, 0.25 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하고;
상기 해동액 IV는 100 mL당 1.0 ~ 5.0 g의 PVA 및 여분의 버퍼를 포함하며;
바람직하게, 상기 해동액 I는 100 mL당 0.1 ~ 9.0 g의 폴리아미노산, 1.0 ~ 5.0 g의 PVA, 1.0 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하고;
상기 해동액 II는 100 mL당 0.1 ~ 4.5 g의 폴리아미노산, 1.0 ~ 5.0 g의 PVA, 0.5 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하며;
상기 해동액 III는 100 mL당 0.1 ~ 2.3 g의 폴리아미노산, 1.0 ~ 5.0 g의 PVA, 0.25 mol L-1의 수용성 당 및 여분의 버퍼를 포함하고;
상기 해동액 IV는 100 mL당 0 ~ 1.2 g의 폴리아미노산, 1.0 ~ 5.0 g의 PVA 및 여분의 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 해동 시약. - 동결 보존된 세포 또는 조직을 해동하는 방법으로서,
동결된 세포 또는 조직을 37 ℃의 온도의 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 해동액 I에 넣어 3 ~ 5분 동안 소생시킨 다음, 상온에서 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 해동액 II, 해동액 III, 해동액 IV에 순차적으로 넣어 각각 3 ~ 5분 동안 소생시키는 단계를 포함하는 동결 보존된 세포 또는 조직을 해동하는 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 해동액 또는 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 해동 시약의 응용으로서,
동결 보존된 난모 세포 및 배아, 조직 또는 기관의 소생 및 해동에 응용되고, 예를 들어 상기 조직 또는 기관은 난소 조직 또는 난소 기관인 것을 특징으로 하는 응용.
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