CN102746372B - 一种细胞外基质冷冻干燥保护液及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
一种细胞外基质冷冻干燥保护液，本发明是以生理盐水为溶剂，组分包括硫酸软骨素、维生素C、聚乙二醇、海藻糖、葡聚糖、丝氨酸和苏氨酸。本发明保护液具有渗透性强、低温条件下可玻璃化、富含负极性基团和羟基、能与胶原分子高效粘附的优点，保证了细胞外基质冻干效果的稳定均匀，低温下保护液形成玻璃态能避免冰晶损伤蛋白结构，并在基质外层形成保护膜取代水分子与胶原形成氢键，保护胶原功能和三维结构的稳定性。本发明的细胞毒性低，使用时经生理盐水或无菌水涮洗后即可使用；冻干后的细胞外基质经真空包装在常温下可保存三年以上；适于纯化的细胞外基质保存，如胶原、弹性蛋白、糖蛋白等，也适于由细胞外基质材料构建的各类生物材料。
Description
技术领域
本发明属于医用生物材料保护技术领域，具体涉及一种用于细胞外基质冷冻干燥(简称冻干)的保护液及其使用方法。
背景技术
细胞外基质是由细胞分泌，可以通过特异的表面受体启动细胞内信号通路，调控细胞的分化、增殖、迁移、粘附等功能，其来源于天然组织，相比高分子合成材料具有良好的生物相容性。细胞外基质主要由胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白等成分组成；是通过物理、化学等手段将生物材料中的细胞成分去除获得，该类生物材料在临床修复和组织工程的组织构建中具有明显的疗效和优势；目前以细胞外基质为基础的上市产品有几十种，如小肠粘膜下层、真皮、血管、心脏瓣膜等。
虽然细胞外基质已广泛应用于临床，但是其保存方式一直存在问题，通常采用晾干或冻干两种方式。晾干的细胞外基质保留了基质蛋白的氢键及一些分子作用力，保护并维持了胶原的三级结构，但晾干的细胞外基质的保质期较短，仅是冻干保存方式的三分之一，因此给产品的销售带来困难。而冻干的细胞外基质虽然更利于运输和保存，但水分的丢失导致氢键被破坏，造成基质结构坍塌和功能破坏、丧失活性；而且结构的破坏是不可逆转的，即使复水后，也难以恢复到以前状态。
冷冻干燥技术(简称冻干)是将含水物质在低温下冻结，再于真空条件下使冰升华，从而除去物料中的吸附水，得到冻干制品。该技术已广泛应用于食品、药品、蛋白制品的冻干保护。
细胞外基质是一种大分子量、由一种或多种蛋白类分子组成的生物材料。在预冷、一次干燥、二次干燥和储存过程中，基质结构容易改变，导致基质变性。通常采用添加生物活性保护剂，如糖类、大分子聚合物、表面活性剂等，这些物质通过替代水分子与蛋白质形成羟基来平衡pH，降低蛋白质的表面张力，促进低温条件下玻璃态(玻璃态是保持液体结构的固体状态，液体在低温条件下形成玻璃态可避免冰晶的形成)的形成，保护蛋白质分子结构的稳定性，并且这些物质组成的保护剂对大部分的小分子活性蛋白能起到保护作用。
由于细胞外基质是以胶原为主的大分子蛋白，其结构致密，不易被糖类等冻干保护剂渗入，致使冻干效果不均一(指不同批次产品)，故对保护液的渗透压要求高。而且细胞外基质不溶于水，不能与冻干保护剂形成共熔点，因而在冷冻过程中保护剂与细胞外基质不能形成稳定的共态，因此针对可溶性小分子蛋白的冻干保护剂在用于细胞外基质时，所产生冰晶会损伤基质的三维结构，导致基质的物化性能改变。此外胶原分子表面带有大量正电荷，而糖类的电负性较弱，因此与胶原的粘附性弱，与水分子竞争性替代氢键的能力也较弱，对胶原分子的保护不充分，容易使胶原结构坍塌、活性下降。因此有必要针对细胞外基质的特性，开发出更合适的冻干保护液。
发明内容
针对现有技术所存在的问题，本发明的目的是提供一种细胞外基质冷冻干燥保护液及其使用方法，用其在冻干过程中能够维持细胞外基质的生物活性和三维结构不被破坏，并使冻干程度均匀。
本发明所提出的细胞外基质冻干保护液是以生理盐水为溶剂，其组成包括：硫酸软骨素50～150mg/ml、维生素C 1～5mg/ml、聚乙二醇65～380mg/ml、海藻糖10～100mg/ml、葡聚糖10～30mg/ml、丝氨酸1～16μg/ml和苏氨酸1～16μg/ml。该保护液的配制对温度和组分顺序无特殊要求。
所述的细胞外基质冻干保护液组成的优化选择为：硫酸软骨素50～100mg/ml、维生素C 1～5mg/ml、聚乙二醇65～250mg/ml、海藻糖10～50mg/ml、葡聚糖10～30mg/ml、丝氨酸1～10μg/ml和苏氨酸1～10μg/ml。
本发明所述的冻干保护液，是根据细胞外基质的理化特性及其分子结构(氢键和极性基团)在冷冻、干燥过程中与功能变化机理专门设计，采用本发明保护液具有细胞外基质干燥均匀、含水率低、结构与功能损伤小的优点。
1)硫酸软骨素是细胞外基质组成的重要成分，起着维持细胞外基质结构的作用，而且其富含阴离子，能与胶原类蛋白有很好的粘附性；细胞外基质在低温干燥过程中，硫酸软骨素能在胶原蛋白表面形成膜结构，稳定细胞外基质的三级结构，并替代水分子与胶原形成氢键稳定分子的空间结构；电镜检测结果显示，采用硫酸软骨素保护的细胞外基质在冻干后更接近天然细胞外基质的结构。
2)维生素C：细胞外基质在低温冷冻过程中产生大量的氧化自由基，对胶原蛋白的二级分子链有显著破坏作用，使分子链断裂。维生素C的抗氧化作用，可以通过脱氢反应清除液体中的单线态，降低对胶原蛋白结构的破坏；经电泳检测，在大分子胶原蛋白冻干后，不添加维生素C的小分子片段明显增多，证明在降温过程中其具有保护胶原蛋白断裂的作用。
3)聚乙二醇：在低温冷冻过程中，冰晶的形成会破坏蛋白的三级结构，故抑制冰晶形成对细胞外基质结构的保护至关重要。聚乙二醇水溶性好、熔点低，可有效脱除细胞外基质中的流动水分，其低熔点也保证了细胞外基质在降温过程中不形成冰晶；经组织学检测冻干后的胶原膜片，发现添加聚乙二醇的胶原纤维排列紧密，而未添加的胶原纤维结构散乱。
4)葡聚糖：在降温过程中，水分形态的变化会引起渗透压的快速改变，从而导致基质的空间结构发生改变，使功能活性受到影响。葡聚糖为大分子化合物，具有结构稳定、粘稠度高，能平衡液体渗透压、减弱降温过程中渗透压的变化速率，从而达到保护细胞外基质的目的；采用蛋白酶消化实验显示，不添加葡聚糖保护的基质在冻干后降解速率明显加快。
5)丝氨酸和苏氨酸：细胞外基质的空间结构需要氢键维持，通常氢键的羟基是由水分子提供，但在冻干的脱水过程中氢键被破坏，致使基质结构也受到破坏。而丝氨酸和苏氨酸富含羟基，在水分流失的情况下可以替代水分子提供羟基，维持蛋白的空间结构；同时其具有分子量小、穿透性强的特点，适宜于对结构致密的细胞外基质材料进行冻干保护；此外还能防止盐离子在冷冻干燥过程中的结晶，保护蛋白不受损伤；采用热力差扫描检测结果显示，未添加氨基酸保护的玻璃化转变温度显著低于添加保护的，可见未添加保护的蛋白质稳定性较差。
6)海藻糖富含羟基，是良好的玻璃化试剂。其在冻干过程中可以替代水分子与蛋白质形成氢键，同时促进液体的玻璃化在降温过程中减少冰晶形成，保护蛋白结构；采用热力差扫描检测结果显示，未添加海藻糖保护的玻璃化转变温度显著低于添加保护的，可见未添加保护的蛋白质稳定性更差。
本发明适用于细胞外基质类生物材料的冻干保护。具体的使用方法为，在室温条件下，将细胞外基质浸泡于不低于2倍体积的冻干保护液中，振荡5～30分钟，连同保护液一起转入4℃水浴中，使细胞外基质与冻干保护液都达到4℃，再置入冻干设备以0.5～2℃/分钟的速度降温至-45～-80℃后，维持1～6小时；开始抽真空，在30分钟内使绝对真空压力达到10～20Pa，再以3～5℃/分钟的速度升温至-15～-45℃，维持12～30小时；然后解析升温，以5～15℃/分钟的速度升温至15～30℃，维持4～15小时后，结束冻干取出，产品的含水率控制在2％～8％之间。其中，细胞外基质浸泡于冻干保护液的形式允许是固态(包括片状、粉状)或是液态(包括溶液)。
本发明的细胞外基质冻干保护液具有渗透性强、低温条件下可玻璃化、富含负极性基团和羟基、能与胶原分子高效粘附的优点，保证了结构致密的细胞外基质被更好的渗入使冻干效果稳定均匀，低温下保护液形成玻璃态能避免冰晶损伤蛋白结构，并能高效替代水分子在基质外层形成保护膜取代水分子与胶原形成氢键，保护胶原功能和三维结构的稳定性。本发明保护液的细胞毒性低，用前经生理盐水或无菌水涮洗后即可使用；冻干后的细胞外基质经真空包装在常温下可保存三年以上。本发明更适用于纯化的细胞外基质保存，如胶原、弹性蛋白、糖蛋白等，也适用于由细胞外基质材料构建的各类生物材料。
具体实施方式
以下结合实例详细说明本发明技术方案的具体实施方式和使用效果。
实例1、胶原蛋白的冻干保护(所用胶原购自美国Sigma公司)。
以生理盐水为溶剂配制冻干保护液，内含硫酸软骨素60mg/ml，维生素C 2mg/ml，聚乙二醇130mg/ml，海藻糖20mg/ml，葡聚糖20mg/ml，丝氨酸3μg/ml，苏氨酸3μg/ml。
使用实例：
由于胶原蛋白能够溶解弱酸，而不发生变性。因此将胶原蛋白先溶解于体积浓度为3％的乙酸溶液，再调pH至7.2，形成终浓度为20mg/ml的胶原溶液；然后把该胶原溶液与3倍体积的冻干保护液混合，在室温下振荡5分钟后转入4℃水浴；再以1℃/分钟的速度降温至-65℃，维持4小时后开始抽真空，在30分钟内使绝对压力达到20Pa，然后以3℃/分钟的速度升温至-35℃后维持24小时；最后进行解析升温，以7℃/分钟的速度升温至15℃后维持12小时，结束冻干，产品呈白色棉絮状。冻干胶原在室温、无菌、密闭、干燥、避光的状态下能保存3年。
由于胶原蛋白通常溶解在液体中，因此低浓度的保护液就可以充分均匀的混合在胶原溶液中，达到保护胶原蛋白的目的；并且避免高浓度液体在低温冻干过程中产生的高渗透压差，对胶原蛋白造成的损害。
实例2、脱细胞小肠粘膜的冻干保护(所用脱细胞小肠粘膜是按中国专利申请200810150792.5中方法制备)。
以生理盐水为溶剂配制冻干保护液，内含硫酸软骨素120mg/ml，维生素C 4mg/ml，聚乙二醇250mg/ml，海藻糖40mg/ml，葡聚糖30mg/ml，丝氨酸8μg/ml，苏氨酸8μg/ml。
使用实例：将脱细胞小肠粘膜浸泡于8倍体积的冻干保护液中，在室温下振荡20分钟后转入4℃水浴；再以2℃/分钟的速度降温至-65℃，维持5小时后开始抽真空，在30分钟内使绝对真空压力达到10Pa，然后以3℃/分钟的速度升温至-35℃后维持15小时；最后进行解析升温，以10℃/分钟的速度升温至25℃后维持6小时，结束冻干，产品为白色半透明膜状。
脱细胞小肠粘膜主要由I型和III型胶原组成，含有丰富的糖胺蛋白；其结构致密、不溶于水，较高浓度的保护液能提高保护液中各组分对蛋白的渗透，起到保护作用。此外，高浓度的保护液能够形成更彻底的玻璃态，避免冰晶对小肠粘膜下层结构的损伤，及其基质对细胞迁移和粘附的影响。
实例3、脱细胞牛皮基质的冻干保护(所用脱细胞牛皮基质购自烟台正海公司)。
以生理盐水为溶剂配制冻干保护液，内含硫酸软骨素80mg/ml，维生素C 4mg/ml，聚乙二醇350mg/ml，海藻糖40mg/ml，葡聚糖15mg/ml，丝氨酸8μg/ml，苏氨酸8μg/ml。
使用实例：将脱细胞牛皮基质浸泡于20倍体积的冻干保护液中，在室温下振荡20分钟后转入4℃水浴；再以2℃/分钟的速度降温至-65℃，维持5小时后开始抽真空，在30分钟内使绝对真空压力达到10Pa，然后以3℃/分钟的速度升温至-35℃后，维持15小时；最后进行解析升温，以10℃/分钟速度升温至25℃后维持6小时，结束冻干，产品为白色膜状。
虽然脱细胞牛皮基质主要成分也是胶原，但是不同于脱细胞小肠粘膜，脱细胞牛皮基质材料本身结构较为疏松且糖胺蛋白含量较高，因此保护液中的硫酸软骨素组分浓度较低。脱细胞牛皮基质相对于脱细胞小肠下粘膜来说材料厚度更大，因此提高保护液中聚乙二醇的浓度可以促进热传导，使材料的冻干效果更为均匀。
Claims (3)
1.一种细胞外基质冷冻干燥保护液，其特征在于，是以生理盐水为溶剂，其组分为：硫酸软骨素50～150mg/ml、维生素C1～5mg/ml、聚乙二醇65～380mg/ml、海藻糖10～100mg/ml、葡聚糖10～30mg/ml、丝氨酸1～16μg/ml和苏氨酸1～16μg/ml。
2.根据权利要求1所述的冷冻干燥保护液，其特征在于，所述的组分为：硫酸软骨素50～100mg/ml、维生素C1～5mg/ml、聚乙二醇65～250mg/ml、海藻糖10～50mg/ml、葡聚糖10～30mg/ml、丝氨酸1～10μg/ml和苏氨酸1～10μg/ml。
3.使用权利要求1所述的细胞外基质冷冻干燥保护液的方法，其特征在于，在室温条件下，将细胞外基质浸泡于不低于2倍体积的冷冻干燥保护液中，振荡5～30分钟，连同冷冻干燥保护液一起转入4℃水浴中，在达到4℃后，再以0.5～2℃/分钟的速度降温至-45～-80℃维持1～6小时；在30分钟内使绝对真空压力达到10～20Pa，再以3～5℃/分钟的速度升温至-15～-45℃，维持12～30小时；然后以5～15℃/分钟的速度升温至15～30℃，维持4～15小时后，结束冻干；使产品的含水率控制在2％～8％之间。
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