CN114632022A - 一种胶原蛋白冻干纤维及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物药物制剂领域，涉及一种胶原蛋白冻干纤维及其制备方法和应用。具体而言，本发明提供了一种胶原蛋白冻干纤维的制备方法，其包括如下步骤：(1)使用pH调节剂调节胶原蛋白原液的pH值至5‑9；(2)冷冻干燥；其中，所述冷冻干燥的程序包括预冻、升华干燥和解析干燥。据此成功制备得到重组人源III型胶原蛋白冻干纤维，其可长期保存，并能保持胶原蛋白的天然生物活性。本发明提供的冻干工艺和制备方法简单可行，条件温和，重现性好，可控性强，适合大规模生产。实验数据显示本发明的含有重组人源III型胶原蛋白冻干纤维的涂抹液可以明显改善皮肤肤色，增加皮肤角质层含水量，改善皮肤组织结构。

Description

一种胶原蛋白冻干纤维及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物药物制剂领域，具体涉及一种胶原蛋白冻干纤维及其制备方法和应用。

背景技术

胶原蛋白是生物高分子，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，在成人体内含有大约30％胶原蛋白，其存在有28种类型，其中III型胶原蛋白的含量占人体总蛋白质的10％左右，其形态在体内呈细微的原纤维网状，广泛分布在具有伸展性的组织中，如皮肤、血管及内脏等疏松结缔组织。在创伤修复中，如果III型胶原蛋白比例高，则皮肤组织也会更加细腻柔滑，同时III型胶原蛋白在细胞粘附等生理过程中也发挥着重要的作用。此外，III型胶原蛋白分子有较大的亲和力、较弱的抗原性，具有良好的生物相容性和降解安全性，现已被广泛应用于医药领域。

人体皮肤覆盖于体表，总面积约为1.5-2.0m²，厚度为1-4mm，是由表皮层、真皮层和皮下组织构成。随着年龄的增加，人体皮肤中的胶原蛋白含量会逐渐减少，同时胶原蛋白的合成能力也在下降，皮肤逐渐失去弹性和光泽，不再柔软，并出现色斑、皱纹，发生老化。由于胶原蛋白是皮肤的主要蛋白质成分，使用胶原蛋白及其水解产物制作而成的护肤品可以有效的减少皮肤皱纹，保湿补水，备受科研学者、制造商青睐。另一方面，随着生活水平的提高，人们对化妆品具有的保湿和美白功能日益关注，天然保湿剂成为国内护肤品的研究热点。然而，现在市面上大多胶原蛋白护肤品都是使用动物类胶原，生物安全性较低，易诱发免疫反应。

申请号为CN201811438582.6、发明名称为“多肽、其生产方法和用途”的专利申请记载了本发明的发明人在之前研究并生产的重组人源III型胶原蛋白原液，该蛋白和人类皮肤中的III型胶原蛋白序列高度一致，使用时不存在诱发生物免疫的问题，安全性更高。目前该重组人源III型胶原蛋白的用途在申请号为CN202110864279.8、CN202110881466.7、CN202110981458.X和CN202110960230.2四项专利申请中已有记载。为了进一步更好的利用该重组人源III型胶原蛋白，拓宽其应用领域和场景，急需开发一种能够使该蛋白稳定储存和运输的剂型。

众所周知，蛋白质在温度过高时会变性失活，而且蛋白质溶液养分丰富，容易滋养细菌，导致酸败，所以一般含有蛋白质的制剂都需要低温储藏，且需要添加适当的防腐剂。

真空冷冻干燥技术可以解决蛋白制剂的储藏和运输问题。真空冷冻干燥技术又称为冻干，此法将需要干燥的制品置于低温下使其所含的水分冻结，然后放在真空环境下干燥，让水分由固体状态直接升华为水蒸气并从制品中排出而使制品干燥。该方法有效地防止了制品理化及生物特性的改变，有效保护了许多热敏性药物生物制品有效成份的稳定性。其次，冻干制品在干燥后形态疏松、颜色基本不发生改变，加水后能够快速溶解并恢复原有水溶液的理化特性和生物活性。此外，制品经过冻干后水分含量非常低，使制品的稳定性提高，受污染的机会减小，这不仅方便了运输还延长了制品保存期限。

发明内容

发明要解决的问题

本发明中所涉及的重组人源III型胶原蛋白为申请号CN201811438582.6、发明名称为“多肽、其生产方法和用途”的专利申请所记载，其自身理化性质不够稳定，过高的温度容易使其变性失活，且极易染菌导致酸败失效。目前并未有关于有效储藏和运输该蛋白的稳定剂型。

对此，本发明拟提供一种胶原蛋白冻干纤维，并提供其制备方法和用途，以满足相关储存和运输要求。通过对冻干程序参数进行优化，极大提高冻干制剂的性状，保证冻干制剂的稳定性。

用于解决问题的方案

[1]、一种胶原蛋白冻干纤维的制备方法，其包括如下步骤：(1)使用pH调节剂调节胶原蛋白原液的pH值至5-9；(2)冷冻干燥；其中，所述冷冻干燥的程序包括预冻、升华干燥和解析干燥。

[2]、根据[1]所述的制备方法，其特征在于，每1mL所述胶原蛋白原液中含有1-2mg的胶原蛋白；优选地，所述胶原蛋白包含以SEQ ID NO.1所示的序列的n个重复和任选的以SEQ ID NO.2所示的序列，n为大于等于1的整数，其中当n为大于等于2的整数时，各重复序列之间是直接连接的；更优选地，所述胶原蛋白包含以SEQ ID NO.3所示的序列、或保留SEQID NO.3的氨基酸序列的细胞黏附效果并与SEQ ID NO.3的氨基酸序列具有90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列、或保留SEQ ID NO.3的氨基酸序列的细胞黏附效果并在SEQ ID NO.3的氨基酸序列中添加、取代或缺失1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列、或由核苷酸序列编码的保留SEQ ID NO.3的氨基酸序列的细胞黏附效果的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码SEQ ID NO.3的氨基酸序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。

[3]、根据[1]或[2]所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的程序中的预冻、升华干燥和解析干燥的具体操作条件如下：

程序	温度/℃	升温时间/min	保持时间/min	真空度/Pa
					预冻	-50～-20	20～60	60～300
升华干燥	-40～10	20～60	300～1500	0～30
					解析干燥	-20～10	60～300	60～600	0～30

。

[4]、根据[1]至[3]中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述pH调节剂为磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠。

[5]、一种胶原蛋白冻干纤维，其通过[1]至[4]中任一项所述的制备方法制得。

[6]、一种基于胶原蛋白冻干纤维的溶液，其包括根据[5]所述的胶原蛋白冻干纤维和溶剂；优选地，所述溶剂与所述胶原蛋白冻干纤维的用量比为1mL:(10-20mg)；优选地，所述溶剂为生理盐水。

[7]、根据[6]所述的基于胶原蛋白冻干纤维的溶液，其特征在于，所述溶液中还包括保湿剂；优选的，所述保湿剂为乳酸。

[8]、根据[6]或[7]所述的基于胶原蛋白冻干纤维的溶液的制备方法，其包括如下步骤：采用溶剂对胶原蛋白冻干纤维进行复溶，不添加或添加所述保湿剂，形成溶液。

[9]、根据[5]所述的胶原蛋白冻干纤维、根据[6]和/或[7]所述的基于胶原蛋白冻干纤维的溶液在制备用于抗皮肤老化的产品中的用途。

[10]、根据[9]所述的用途，其特征在于，所述抗皮肤老化包括提高皮肤含水量、改善皮肤整体色度和/或改善皮肤组织结构；优选地，所述提高皮肤含水量包括提高皮肤角质层水分含量；所述改善皮肤整体色度包括提高皮肤亮度和/或降低皮肤的红色；所述改善皮肤组织结构包括提高皮肤表皮层的完整连续程度、提升皮肤表皮层和/或真皮层的厚度、提高皮肤表皮层和真皮层之间界限的清晰度、和/或提高皮肤成纤维细胞数量。

发明的效果

通过以上技术方案的实施，本发明利用真空冷冻干燥技术，经过对技术参数的实验摸索，成功将重组人源III型胶原蛋白制备成冻干纤维剂型，提高了该蛋白的稳定性，延长了该蛋白的保存期限。同时本发明提供的冻干工艺和制备方法简单可行，条件温和，重现性好，可控性强，适合大规模生产。此外，本发明利用重组人源III型胶原蛋白冻干纤维复溶后制备涂抹液，在小鼠皮肤角质层实验中表明该胶原蛋白涂抹液可以明显改善皮肤肤色，增加皮肤角质层含水量，改善皮肤组织结构。

附图说明

图1为胶原蛋白冻干曲线图。

图2为空白组小鼠皮肤角质层ART-FTIR图谱。

图3为对照组小鼠皮肤角质层ART-FTIR图谱。

图4为实验组小鼠皮肤角质层ART-FTIR图谱。

图5为三组小鼠皮肤组织切片图。

具体实施方式

以下对本发明的实施方式进行说明，但本发明不限定于此。本发明不限于以下说明的各构成，在发明请求保护的范围内可以进行各种变更，而适当组合不同实施方式、实施例中各自公开的技术手段而得到的实施方式、实施例也包含在本发明的技术范围中。

除非另有定义，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。

在本发明中，使用“数值A～数值B”或“数值A-数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

在本发明中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。

在本发明中，术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”可以指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。

在本发明中，术语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”，也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。

在本发明中，术语“多肽”、“蛋白”可互换地指通过共价键(例如肽键)相互连接的一串至少两个氨基酸残基，可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。多肽可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。

在本发明中，术语“氨基酸”可以包括天然氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物以及所有它们的D和L立体异构体。

在本发明中，氨基酸缺失可指从氨基酸序列中删除1、2或3个以上氨基酸，只要改变后的序列完全或部分保留原有氨基酸序列的活性。

在本发明中，氨基酸添加可指在氨基酸序列的C端、N端或C端与N端中间的任意位置处添加1、2或3个以上氨基酸，只要改变后的序列完全或部分保留原有氨基酸序列的活性。

在本发明中，氨基酸取代可指在氨基酸序列的某个位置的氨基酸被其他氨基酸替代，只要改变后的序列完全或部分保留原有氨基酸序列的活性。氨基酸取代可以是保守氨基酸取代，指与原有氨基酸序列相比，若干个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所取代而形成肽(保守性变异肽)。示例性的，这些保守性变异肽可以根据下列氨基酸取代而产生：Val、Leu或Ile对Ala的取代，Lys、Gln、Asn或His对Arg的取代，Gln、His、Lys或Arg对Asn的取代，Glu或Asn对Asp的取代，Ser或Ala对Cys的取代，Asn或Glu对Gln的取代，Asp或Gln对Glu的取代，Ala对Gly的取代，Asn、Lys、Gln或Arg对His的取代，Leu、Met、Ala、Val或Phe对Ile的取代，Ile、Met、Ala、Val或Phe对Leu的取代，Asn、Gln或Arg对Lys的取代，Ile、Leu或Phe对Met的取代，Leu、Val、Ile、Ala或Tyr对Phe的取代，Ala对Pro的取代，Thr对Ser的取代，Ser或Val对Thr的取代，Phe或Tyr对Trp的取代，Trp、Phe、Thr或Ser对Tyr的取代，及Phe、Ala、Met、Ile或Leu对Val的取代。氨基酸取代也可以是非保守氨基酸取代。

在本发明中，“杂交”意指多核苷酸或寡核苷酸在严格条件下与大体互补的序列结合的能力，而在这些条件下不发生与非互补对象之间的非特异性结合。对此，所述序列优选为90～100％互补的。将能够互相特异性结合的互补序列的特性应用于例如Northern或Southern印迹技术中，或是PCR或RT-PCR的引物结合中。根据本发明，杂交在中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下发生。此类杂交条件描述于CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中。例如，具体的杂交条件如下：(1)低严格性杂交条件在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，在约45℃，然后在至少50℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤2次(对于低严格性条件，可以将洗涤温度升高到55℃)；(2)中等严格性杂交条件在6×SSC，在约45℃，然后在60℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤1次或多次；(3)高严格性杂交条件在6×SSC，在约45℃，然后在65℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤1次或多次且优选；(4)非常高的严格性杂交条件是0.5M磷酸钠，7％SDS，在65℃，然后在65℃，在0.2×SSC，1％SDS中洗涤1次或多次。

<胶原蛋白和胶原蛋白原液>

在本发明中，“胶原蛋白原液”是指经过如下步骤得到的含有胶原蛋白的溶液：(1)大肠杆菌基因工程菌的发酵培养，其中，所述大肠杆菌基因工程菌包含重组表达载体，所述重组表达载体包含所述胶原蛋白的编码基因；(2)通过Ni柱粗纯化蛋白；(3)对粗纯蛋白进行任选的酶切；(4)通过离子交换层析精纯化蛋白，使蛋白留存于Tris和氯化钠缓冲液中；(5)将蛋白换液至纯化水中，此时蛋白原液电导率小于0.2mS/cm；(6)除菌过滤。上述步骤的具体操作方法均为本领域常规的实验方法。

在本发明一些优选的实施方式中，所述胶原蛋白为重组人源III型胶原蛋白，所述胶原蛋白原液为重组人源III型胶原蛋白原液，其由申请号为201811438582.6、发明名称为“多肽、其生产方法和用途”的专利申请所记载。具体而言，在本发明一些优选的实施方式中，所述胶原蛋白包含以SEQ ID NO.1所示的序列的n个重复和任选的以SEQ ID NO.2所示的序列，n为大于等于1的整数，其中当n为大于等于2的整数时，各重复序列之间是直接连接的；更优选地，所述胶原蛋白包含以SEQ ID NO.3所示的序列、或保留SEQ ID NO.3的氨基酸序列的细胞黏附效果并与SEQ ID NO.3的氨基酸序列具有90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列、或保留SEQ ID NO.3的氨基酸序列的细胞黏附效果并在SEQ ID NO.3的氨基酸序列中添加、取代或缺失1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列、或由核苷酸序列编码的保留SEQ ID NO.3的氨基酸序列的细胞黏附效果的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码SEQ ID NO.3的氨基酸序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。

GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP(SEQ ID NO.1)。

GPPGPCCGGG(SEQ ID NO.2)。

GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP(SEQ ID NO.3)。

在本发明一些具体的实施方式中，每1mL所述胶原蛋白原液中含有1-2mg的胶原蛋白。

<胶原蛋白冻干纤维>

本发明提供了一种胶原蛋白冻干纤维，其由所述胶原蛋白原液经冷冻干燥而制得。

在本发明一些具体的实施方式中，胶原蛋白原液在冷冻干燥前的pH值对最终胶原蛋白冻干纤维的性状具有重要意义，因此需要控制胶原蛋白原液的pH值为5-9，优选pH值为6-8，更优选pH值为7。在本发明一些具体的实施方式中，利用pH调节剂调节上述胶原蛋白原液的pH值，所述pH调节剂为磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠，优选为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。

在本发明一些具体的实施方式中，所述冷冻干燥为真空冷冻干燥；优选地，所述冷冻干燥的程序中的预冻、升华干燥和解析干燥的具体操作条件如下：

程序	温度/℃	升温时间/min	保持时间/min	真空度/Pa
					预冻	-50～-20	20～60	60～300
升华干燥	-40～10	20～60	300～1500	0～30
					解析干燥	-20～10	60～300	60～600	0～30

。

在本发明一些优选的实施方式中，所述冷冻干燥的程序中的预冻、升华干燥和解析干燥的具体操作条件如下：

程序	温度/℃	升温时间/min	保持时间/min	真空度/Pa
					预冻	-50～-25	20～60	60～270
升华干燥	-20～10	25～60	960～1500	0～30
					解析干燥	-20～-2	60～300	60～510	0～30

。

在本发明一些更优选的实施方式中，所述冷冻干燥的程序中的预冻、升华干燥和解析干燥的具体操作条件如下：

程序	温度/℃	升温时间/min	保持时间/min	真空度/Pa
					预冻	-40	60	240
升华干燥	-15	60	1200	30
					解析干燥	-5	300	240	20

。

在本发明一些优选的实施方式中，在对所述胶原蛋白原液进行冷冻干燥前还可以包括对其进行灌装的步骤：将所述胶原蛋白原液灌装于西林瓶中，优选灌装于10mL西林瓶中；每瓶灌装4-5mL，每瓶的胶原蛋白含量为4-5mg，优选每瓶灌装4mL，每瓶的胶原蛋白含量为4mg。相应的，在本发明一些优选的实施方式中，在对所述胶原蛋白原液进行冷冻干燥后还可以包括轧盖的步骤。

在本发明一些优选的实施方式中，上述针对胶原蛋白原液的操作均在无菌环境中进行。在本发明一些具体的实施方式中，所述冷冻干燥在冻干机中完成，可以先将冻干机经过CIP清洗及SIP灭菌处理，出箱气体为氮气。

在本发明一些具体的实施方式中，以质量百分比计，所述胶原蛋白冻干纤维的水分含量小于1.5％。

<一种基于胶原蛋白冻干纤维的溶液>

本发明提供了一种基于胶原蛋白冻干纤维的溶液，其包括所述胶原蛋白冻干纤维和溶剂。

本发明对所述溶剂的种类没有特别限制，本领域的技术人员可根据实际需要选择，例如本领域中常用的注射用水、生理盐水等。在本发明一些优选的实施方式中，所述溶剂为生理盐水。

在本发明一些具体的实施方式中，所述溶剂与所述胶原蛋白冻干纤维的用量比为1mL:(10-20mg)，优选为1mL:20mg。

在本发明其他一些具体的实施方式中，所述基于胶原蛋白冻干纤维的溶液中还可以包括保湿剂。在本发明一些优选的实施方式中，所述保湿剂为乳酸，优选地，所述乳酸的浓度为0.1-1.0mol/L，优选为0.5mol/L。

同时，本发明提供了上述基于胶原蛋白冻干纤维的溶液的制备方法，其包括如下步骤：采用溶剂对胶原蛋白冻干纤维进行复溶，形成溶液；优选地，复溶一般在温度为25℃的条件下进行。在本发明其他一些实施方式中，所述基于胶原蛋白冻干纤维的溶液的制备方法可以包括如下步骤：采用溶剂对胶原蛋白冻干纤维进行复溶，添加所述保湿剂，形成溶液。

<医药用途>

在本发明一些具体的实施方式中，本发明的胶原蛋白冻干纤维和/或基于胶原蛋白冻干纤维的溶液可以制备用于抗皮肤老化的产品。

在本发明一些具体的实施方式中，本发明的胶原蛋白冻干纤维和/或基于胶原蛋白冻干纤维的溶液可以抗皮肤老化。

在本发明一些具体的实施方式中，本发明提供了一种抗皮肤老化的方法，其可以包括向对其有需要的个体施用有效量的本发明的胶原蛋白冻干纤维和/或基于胶原蛋白冻干纤维的溶液。

在本发明一些具体的实施方式中，所述抗皮肤老化包括提高皮肤含水量、改善皮肤整体色度和/或改善皮肤组织结构；进一步地，所述提高皮肤含水量包括提高皮肤角质层水分含量；所述改善皮肤整体色度包括提高皮肤亮度和/或降低皮肤的红色；所述改善皮肤组织结构包括提高皮肤表皮层的完整连续程度、提升皮肤表皮层和/或真皮层的厚度、提高皮肤表皮层和真皮层之间界限的清晰度、和/或提高皮肤成纤维细胞数量。

实施例

下面通过具体实施例对本发明进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便凸显本发明的主旨。所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

在本发明中所提及或使用的部分包装材料和容器情况如下：所述西林瓶为中硼硅玻璃管制注射剂瓶；所述胶塞为注射用冷冻干燥用氯化丁基橡胶塞；所述铝盖为抗生素瓶用铝塑组合盖。

实施例1：蛋白冻干纤维的制备工艺研究

外包装洗烘和消毒处理流程：西林瓶领回后进入理瓶间，脱去外包装，整齐码放在理瓶盘上，经传送带传至洗瓶机，进行清洗。经洗瓶轨道进入烘箱，设置温度320℃，20-50Hz网带速率进行烘干待用。冻干胶塞、铝塑盖预处理：121℃灭菌30min。

西林瓶灌装流程：先调节装量，调好后，关闭装量调节，开始正常灌装操作。灌装过程中每间隔30分钟抽取10个样品在电子天平上称量每支装量，每支装量范围符合生产指令要求。灌装开始时需启动全自动真空冷冻干燥机，启动自动冻干周期进料模式，启动后以80-120支/分钟速度进行灌装。

冻干机操作流程：冻干机经过CIP清洗及SIP灭菌处理，设置冻干参数，启动冻干周期，打开小门进行进料程序等待灌装完成，待灌装成品进入冻干机箱后自动启动冻干程序，执行冻干周期。

根据市面上常用的动物胶原蛋白牛跟腱胶原蛋白冷冻干燥程序作为对照实验，探究本发明胶原蛋白最适的冷冻干燥温度和时间。根据该胶原蛋白发酵液pH6-8以及结合制剂常规pH4-9，设计pH考察范围为5-9，具体调节值为5、6、7、8、9，探究该胶原蛋白冻干纤维最适pH值。

编号1：

一种胶原蛋白冻干纤维的制备工艺包括以下步骤：将重组人源III型胶原蛋白原液用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠调节其pH值为7，根据上述流程灌装在10mL西林瓶中，每瓶4mL，设置冻干程序进行冻干。

本发明优化冻干曲线(图1)，冷冻干燥的程序如表1：

表1冷冻干燥程序

冻干结束后，冲入氮气，箱内压塞，环境的温度和湿度达到要求后，打开冻干机箱门，将产品输送至轧盖轨道进行无菌轧盖。

编号2：采取上述同样的冻干过程，仅将重组人源III型胶原蛋白原液的pH值用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠调节为5。

编号3：采取上述同样的冻干过程，仅将重组人源III型胶原蛋白原液的pH值用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠调节为6。

编号4：采取上述同样的冻干过程，仅将重组人源III型胶原蛋白原液的pH值用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠调节为8。

编号5：采取上述同样的冻干过程，仅将重组人源III型胶原蛋白原液的pH值用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠调节为9。

编号6：

一种胶原蛋白冻干纤维的制备工艺包括以下步骤：将重组人源III型胶原蛋白原液用磷酸二氢钠调节其pH值为7，无菌条件下灌装在10mL西林瓶中，每瓶4mL，设置冻干程序进行冻干。

采用市面上较常用的动物胶原蛋白冷冻干燥程序作为本次对照实验，具体冷冻干燥的程序如表2：

表2冷冻干燥程序

冻干结束后，冲入氮气，箱内压塞，环境的温度和湿度达到要求后，打开冻干机箱门，将产品输送至轧盖轨道进行无菌轧盖。

对上述6种处理后的冻干纤维进行相关物质的检测，以及放置长期稳定性试验。具体冻干纤维检测项目和方法如表3所示：

表3冻干纤维检测项目

品种	检测项目
		冻干纤维	外观性状、水分、酸碱度、复溶时间、溶液澄清度与颜色、蛋白含量。

冻干纤维检测方法：

·外观性状：取供试品，置明亮处观察。

·水分：取本品，按照《中华人民共和国药典》(2020年版)四部通则(0832水分测定法第一法)的方法测定。

·酸碱度：用灭菌注射用水将本品复溶成0.2mg/mL后，按照《中华人民共和国药典》(2020年版)四部通则(0631pH值测定法)的方法测定。

·溶液澄清度与颜色：取本品，加水制成每1mL中约含蛋白5mg的溶液，按照《中华人民共和国药典》(2020年版)四部通则0902第一法与0901第一法，检测溶液澄清度与颜色。

·复溶时间：取本品5支，揭铝盖，用注射器注入1.0mL水，振摇，测定复溶时间。

·蛋白含量：用灭菌注射用水将供试品稀释成1mg/mL后，精密称取样品(约相当于含氮量1.0mg～2.0mg)，按照《中华人民共和国药典》(2020年版)四部(0731蛋白质含量测定法第一法凯氏定氮法)规定的方法进行。

蛋白冻干纤维的检测结果如下所示：

表4冻干纤维的外观性状考察结果

表5冻干纤维的水分考察结果

试验编号	0天	1个月	2个月	3个月	6个月
						1	1.08％	0.97％	1.10％	1.01％	1.14％
2	1.11％	1.13％	1.05％	1.08％	1.10％
						3	1.04％	1.08％	1.11％	1.20％	1.15％
4	0.92％	1.05％	0.98％.	1.03％	0.99％
						5	0.91％	0.99％	1.02％	1.24％	1.06％
6	5.41％	6.52％	6.83％	5.91％	6.32％

表6冻干纤维的酸碱度(pH)考察结果

试验编号	0天	1个月	2个月	3个月	6个月
						1	7.1	7.1	7.0	7.0	7.0
2	5.0	5.1	5.0	5.1	5.0
						3	6.0	5.9	6.0	6.0	6.0
4	7.9	8.0	8.0	8.0	8.1
						5	9.1	8.9	9.0	9.0	9.0
6	6.5	6.5	6.5	6.5	6.4

表7冻干纤维的澄清度与颜色考察结果

表8冻干纤维的复溶时间考察结果

试验编号	0天	1个月	2个月	3个月	6个月
						1	8s	10s	9s	9s	9s
2	15s	17s	19s	16s	18s
						3	8s	9s	9s	9s	10s
4	9s	9s	9s	10s	10s
						5	10s	9s	10s	8s	10s
6	20s	18s	17s	19s	20s

表9冻干纤维的蛋白含量考察结果

试验编号	0天	1个月	2个月	3个月	6个月
						1	99.35％	99.52％	98.89％	99.07％	99.10％
2	95.25％	96.51％	95.88％	96.13％	95.49％
						3	98.67％	98.35％	98.66％	99.01％	98.69％
4	98.78％	98.40％	98.39％	98.84％	98.75％
						5	95.84％	95.76％	96.62％	95.81％	95.30％
6	95.89％	96.38％	96.05％	95.06％	94.82％

胶原蛋白冻干纤维试验结果表明：

冻干纤维在编号1、2、3、4、5条件下外观均为白色海绵状固体，对照组编号6条件下外观发生塌陷(具体参见表4)；冻干纤维在编号1、2、3、4、5条件下含水量均小于2％，对照组编号6条件下含水量大于2％(具体参见表5)；冻干纤维各编号在放置下复溶酸碱度均无变化(具体参见表6)；冻干纤维各编号复溶后澄清度均<0.5号浊度标准液，为澄清溶液；冻干纤维在编号1、2、3、4条件下颜色均为无色，编号5在放置1个月后均为几乎无色，编号6条件下颜色均浅于1号黄色比色液(具体参见表7)；冻干纤维在编号1、3、4、5条件下复溶时间均小于15s，满足要求，在编号2、6条件下复溶时间均大于15s(具体参见表8)；相比于冻干纤维在编号1、3、4条件下的蛋白含量(98％-99％)，冻干纤维在编号2、5、6条件下的蛋白含量(94％-96％)有所降低，此外，各编号下冻干纤维的蛋白含量在储存期间没有明显变化。

综合上述结果显示，相比于市面上常用的动物胶原蛋白冷冻干燥程序而言，编号1冷冻干燥程序更加适合本品；该胶原蛋白冻干纤维较稳定的pH范围为6-8。

实施例2：重组人源III型胶原蛋白对小鼠皮肤护肤作用的研究

将通过编号1方法制备得到的重组人源III型胶原蛋白冻干纤维复溶后制成涂抹液，在小鼠背部皮肤进行涂抹实验，测量小鼠背部皮肤角质层含水量、皮肤色度、组织形态变化，来评价上述蛋白的护肤功效。

涂抹液配制：

实验组涂抹液：取0.2g重组人源III型胶原蛋白冻干纤维复溶于10mL的生理盐水中，加入一滴0.5mol/L的乳酸溶液，使用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH至6；

对照组涂抹液：10mL生理盐水，加入一滴0.5mol/L的乳酸溶液，使用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH至6。

实验过程：小鼠分为空白组，实验组，对照组，每组10只(n＝10)。用电动剃须刀剔除小鼠背部毛发，使脊背对称位置正方形区域1.5cm×1.5cm无毛发。手术剪修剪细小毛发，保证小鼠皮肤可以完全裸露。当小鼠该区域毛发生长至影响涂抹时，再次进行修剪处理。对空白组、对照组、实验组小鼠的具体处理方法如表10所示：

表10蛋白护肤实验方法

鼠皮的制备：采用颈椎脱臼处死小鼠，使用眼科手术剪剪取涂抹液体的小鼠背部皮肤，除去皮下脂肪，适当保留皮下组织。修剪剪下的皮肤组织为1.5cm×1.5cm×0.2cm的大小。皮肤可置于生理盐水中短时间保存。

角质层的制备：取上述方法制得的鼠皮放在60℃的蒸馏水中恒温30min，取出后放入质量分数为0.001％的胰蛋白酶和0.5％碳酸钠混合液中处理24h。用镊子夹住鼠皮组织的角皮质层，轻轻晃动，使角质层游离，慢慢剥离出完整角质层，真皮层等残留物可以用镊子轻轻剥去。用蒸馏水反复清洗，冷冻干燥后，置于干燥器中备用。

皮肤含水量测定采用衰减全反射傅立叶变换红外光谱仪(ART-FTIR)。其基本原理是红外光谱图中，在1600-1700cm^-1(酰胺基I)下出现C＝O吸收峰，可以反映蛋白质和水的吸收；在1500-1600cm^-1(酰胺基II)下出现HN—C＝O吸收峰，仅反映了蛋白质的吸收，所以可以看出，当有水分存在的情况下，酰胺基I就会明显增强，酰胺基II不会发生变化，那么就可以用酰胺基I和酰胺基II的吸光度之比来体现角质层的含水量。

对制备好的角质层进行ART-FTIR检测，室温下，砖石单晶作为反射晶体，扫描64次，扫描范围1000-2000cm^-1。分别对空白组，对照组和实验组角质层进行检测并计算。空白组、对照组和实验组小鼠皮肤角质层ART-FTIR图谱分别如图2、3、4所示。各组小鼠皮肤角质层吸光度之比结果如表11所示。

表11小鼠皮肤角质层吸光度之比

组别	数量	吸光度之比(酰胺基I/II值)
			空白组	10只	0.51±0.04
对照组	10只	0.58±0.05
			实验组	10只	1.54±0.11**

实验结果显示，从各组小鼠角质层吸光度之比数值来看，空白组和对照组小鼠角质层酰胺基I/II值比较接近，说明涂抹乳酸钠溶液的小鼠角质层并没有提高含水量，所以我们可以忽略乳酸钠溶液带来的保湿效果；而实验组小鼠角质层的酰胺基I/II值比空白组要明显提高，且变化极为显著(P<0.01)，说明实验组涂抹液对小鼠角质层的保湿效果明显。

小鼠皮肤的白度测定采用色差计测出L，a，b的数值并记录。L值代表亮度，值越大，皮肤颜色更显白；a值代表红、绿色品，即+a代表红色方向，-a代表绿色方向；b值代表黄、蓝色品，即+b代表黄色方向，-b代表蓝色方向。在Lab色度系统中，以坐标L、a、b之差ΔL、Δa、Δb来表示两种实验之间的色差ΔE_ab，即在颜色空间两颜色点之间的距离。ΔE_ab的计算公式：ΔE_ab＝[(ΔL)²+(Δa)²+(Δb)²]^1/2。ΔE_ab代表了色度的立体变化，是评价肤色变化的合适指标。小鼠皮肤的白度测定结果如表12所示。

表12小鼠皮肤的白度测定结果

组别	L	a	b	ΔE<sub>ab</sub>
					空白组	39.20±1.39	17.50±1.10	24.67±0.92	0
对照组	39.96±2.25	17.59±1.05	24.59±2.22	3.57±1.89
					实验组	44.45±2.13**	10.38±1.48**	25.71±1.91	9.38±1.66**

实验结果显示，对照组，即涂抹乳酸钠溶液的小鼠，它的皮肤白度值L值，a值，b值均和空白组小鼠无显著差异(P>0.05)，而ΔE_ab值与空白组很明显差异显著。因此在分析小鼠肤色白度变化时，需要考虑作为溶剂的乳酸钠溶液的影响。与对照组相比，实验组小鼠的L值增大，说明皮肤亮度增加，与对照组相比变化极为显著(P<0.01)；a值减小，且为正数，说明皮肤红色变浅，与对照组相比变化极为显著(P<0.01)；b值虽然增大，但与对照组相比变化无显著差异(P>0.05)；ΔE_ab值增大，且与对照组相比变化极为显著。结果表明本次实验中，实验组涂抹液对小鼠皮肤白度的影响有明显作用，能够改善小鼠皮肤的整体色度。

小鼠皮肤组织形态的观察

小鼠皮肤组织石蜡切片制作步骤分为固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片和烤片、脱蜡和水化、染色，具体步骤如下：

固定：将小鼠皮肤组织浸没在含有甲醛的固定液中48h，将组织硬化。

脱水：用一系列浓度梯度的乙醇(50％、70％、85％、95％、无水乙醇)依次浸泡组织1h进行脱水，组织可放在70％的乙醇中保存。

透明：将组织放入无水乙醇和透明剂二甲苯各半混合液中浸泡2h，再将其依次放入二甲苯I，二甲苯II中各浸泡2h。

浸蜡：将组织放入熔化的石蜡和二甲苯各半混合液中浸泡2h，再将其依次放入熔化的石蜡I，石蜡II中各浸泡2h。

包埋：用熔化的石蜡将组织贴在包埋盒中，速冻，固定组织。

切片：用全自动石蜡切片机进行切片，厚度大概3～5mm。

贴片和烤片：将组织切片完全展开置于玻片上，尽量不出现皱纹，再将其置于恒温箱中40℃干燥2h。

脱蜡水化：将切片依次放入二甲苯I，二甲苯II中，各浸泡10min，进行脱蜡，再用一系列浓度梯度的乙醇(无水乙醇、95％、85％、70％)各浸泡5min，用蒸馏水冲洗2～3min，进行水化。

染色：进行H&E染色，将切片放入苏木素染液3～5分钟，用蒸馏水冲洗2min，在用1％盐酸酒精分化5s，蒸馏水冲洗2min；将切片放入伊红染色液中染色3min。

脱水封片：将切片依次放入一系列浓度梯度的乙醇(70％、85％、95％、无水乙醇)各5min，依次放入二甲苯I、二甲苯II各5min，将切片拿出晾干，用中性树脂封片。进行图像采集分析。

结果如图5所示，小鼠皮肤组织切片各指标如表13所示。

表13小鼠皮肤切片各指标结果

组别	表皮厚度/μm	真皮厚度/μm	成纤维细胞数/个
				空白组	25.83±0.88	724.87±10.34	98.50±7.76
对照组	25.11±0.84	737.92±16.83	104.50±13.52
				实验组	27.03±0.93*	738.16±11.32*	118.00±10.43**

从表13中可以看出，与空白组相比，对照组在表皮厚度、真皮厚度和成纤维细胞数方面均无显著变化(P>0.05)；实验组在表皮厚度和真皮厚度上略有提升，刚好达到显著水平(P<0.05)，成纤维细胞数明显增加，与对照组相比差异极显著(P<0.01)；从小鼠皮肤组织切片可以看出，与空白组和对照组相比，实验组，即涂抹胶原蛋白后的小鼠皮肤，表皮层完整连续，胶原纤维更加丰富紧密，数量明显增多，表皮层和真皮层界限清晰，表明胶原蛋白对小鼠皮肤的组织学结构有积极意义。

序列表

<110> 山西锦波生物医药股份有限公司

<120> 一种胶原蛋白冻干纤维及其制备方法和应用

<130> 6C39-2223251IP

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 重组人源III型胶原蛋白氨基酸序列组成部分

<400> 1

Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly

1 5 10 15

Ile Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro

20 25 30

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 重组人源III型胶原蛋白氨基酸序列组成部分

<400> 2

Gly Pro Pro Gly Pro Cys Cys Gly Gly Gly

1 5 10

<210> 3

<211> 480

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 重组人源III型胶原蛋白氨基酸序列

<400> 3

Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly

1 5 10 15

Ile Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Glu

20 25 30

Arg Gly Ala Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Ile Pro

35 40 45

Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly

50 55 60

Ala Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Ile Pro Gly Glu

65 70 75 80

Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Ala Pro

85 90 95

Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Ile Pro Gly Glu Lys Gly

100 105 110

Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Phe

115 120 125

Arg Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Ile Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala

130 135 140

Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Phe Arg Gly

145 150 155 160

Pro Ala Gly Pro Asn Gly Ile Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu

165 170 175

Arg Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala

180 185 190

Gly Pro Asn Gly Ile Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly

195 200 205

Ala Pro Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Pro

210 215 220

Asn Gly Ile Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro

225 230 235 240

Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly

245 250 255

Ile Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Glu

260 265 270

Arg Gly Ala Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Ile Pro

275 280 285

Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly

290 295 300

Ala Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Ile Pro Gly Glu

305 310 315 320

Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Ala Pro

325 330 335

Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Ile Pro Gly Glu Lys Gly

340 345 350

Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Phe

355 360 365

Arg Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Ile Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala

370 375 380

Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Phe Arg Gly

385 390 395 400

Pro Ala Gly Pro Asn Gly Ile Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu

405 410 415

Arg Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala

420 425 430

Gly Pro Asn Gly Ile Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly

435 440 445

Ala Pro Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Pro

450 455 460

Asn Gly Ile Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro

465 470 475 480

Claims (10)

1.一种胶原蛋白冻干纤维的制备方法，其包括如下步骤：

(1)使用pH调节剂调节胶原蛋白原液的pH值至5-9；

(2)冷冻干燥；

其中，所述冷冻干燥的程序包括预冻、升华干燥和解析干燥。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，每1mL所述胶原蛋白原液中含有1-2mg的胶原蛋白；

优选地，所述胶原蛋白包含以SEQ ID NO.1所示的序列的n个重复和任选的以SEQ IDNO.2所示的序列，n为大于等于1的整数，其中当n为大于等于2的整数时，各重复序列之间是直接连接的；

更优选地，所述胶原蛋白包含以SEQ ID NO.3所示的序列、或保留SEQ ID NO.3的氨基酸序列的细胞黏附效果并与SEQ ID NO.3的氨基酸序列具有90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列、或保留SEQ ID NO.3的氨基酸序列的细胞黏附效果并在SEQ ID NO.3的氨基酸序列中添加、取代或缺失1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列、或由核苷酸序列编码的保留SEQ ID NO.3的氨基酸序列的细胞黏附效果的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码SEQ ID NO.3的氨基酸序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的程序中的预冻、升华干燥和解析干燥的具体操作条件如下：

程序 温度/℃ 升温时间/min 保持时间/min 真空度/Pa 预冻 -50～-20 20～60 60～300 升华干燥 -40～10 20～60 300～1500 0～30 解析干燥 -20～10 60～300 60～600 0～30

。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述pH调节剂为磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠。

5.一种胶原蛋白冻干纤维，其通过权利要求1至4中任一项所述的制备方法制得。

6.一种基于胶原蛋白冻干纤维的溶液，其包括根据权利要求5所述的胶原蛋白冻干纤维和溶剂；

优选地，所述溶剂与所述胶原蛋白冻干纤维的用量比为1mL:(10-20mg)；

优选地，所述溶剂为生理盐水。

7.根据权利要求6所述的基于胶原蛋白冻干纤维的溶液，其特征在于，所述溶液中还包括保湿剂；优选的，所述保湿剂为乳酸。

8.根据权利要求6或7所述的基于胶原蛋白冻干纤维的溶液的制备方法，其包括如下步骤：采用溶剂对胶原蛋白冻干纤维进行复溶，不添加或添加所述保湿剂，形成溶液。

9.根据权利要求5所述的胶原蛋白冻干纤维、根据权利要求6和/或权利要求7所述的基于胶原蛋白冻干纤维的溶液在制备用于抗皮肤老化的产品中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述抗皮肤老化包括提高皮肤含水量、改善皮肤整体色度和/或改善皮肤组织结构；

优选地，所述提高皮肤含水量包括提高皮肤角质层水分含量；所述改善皮肤整体色度包括提高皮肤亮度和/或降低皮肤的红色；所述改善皮肤组织结构包括提高皮肤表皮层的完整连续程度、提升皮肤表皮层和/或真皮层的厚度、提高皮肤表皮层和真皮层之间界限的清晰度、和/或提高皮肤成纤维细胞数量。

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