CN117694337A - 一种保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法及其冻干粉 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种保存血小板或外泌体内生长因子的方法及其冻干粉，属于生物医疗技术领域。其包括：向血小板或干细胞外泌体中加入0.01wt％～20wt％的保存液重新悬浮，将混合液在零下温度下进行冷冻干燥。本发明提供的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法，使用的保存液配方中含多醣类和高分子生物材料来稳定血小板膜的稳定性维持正常生理环境来让血小板不易聚集或破裂而释放出生长因子，并结合冷冻干燥技术可更有效地延长生长因子的保存时间及增加使用效率，可以长期保存与富血小板疗法(EPT)或富血小板血浆(PRP)或外泌体体原有的生长因子活性相近，并且方便长期保存及临床应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医疗技术领域，具体涉及一种保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法及其冻干粉。
背景技术
EPT是指富血小板疗法(enriched platelet treatment，EPT)对富血小板血浆(platelet rich plasma，PRP)其内含生长因子的保存技术，此技术也可用于保存，其EPT内血小板的含量为全血内的4～8倍，主要技术包含两个层面：1)该疗法的配方中含有多醣类，多醣类可以增加血小板上细胞膜泵的活性，稳定血小板周围的正常生理环境；增加血小板膜的微黏度，使膜的流动性升高，有助于更好地保存血小板内部所含的生长因子，确保血小板于溶液中可均匀分散。2)使用冻干工艺将悬浮于多醣溶液浓缩血小板进行冻干，冰冻状态时血小板基本处于休眠状态且无细菌污染及繁殖，有利于血小板内的生长因子长期有效保存，解决生长因子因水解失活的困恼，也避免因保存期短而造成资源浪费、需反复采集制备的问题。
EPT中的血小板浓度为正常外周血的4～8倍，其浓缩血小板中的α-颗粒被激活后可释放大量的生长因子，包括转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)，血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)，血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowth factor，FGF)等。在抗衰老或创面愈合的治疗过程中，血小板中的EGF、TGF-α、VEGF和FGF被释放，刺激上皮细胞迁移、增殖，加速角质形成细胞迁移，促进再上皮化，促进肉芽组织形成、再上皮化及基质形成和组织重塑。这些生长因子相互协同，共同起着抗炎修复、促进血管化及组织再生等作用。因此EPT内所含的这些生长因子活性对于抗衰及组织修复有至关重要的影响。
科技的进步PRP的采集技术也从手采转变成机采的EPT，其血小板浓度增加4～8倍，血小板所包含的生长因子浓度也大大提升。另外采集量从手采的3～10毫升提升到100-150毫升，其内的红细胞跟白细胞残留也相对手采而言也低很多。这项采集技术的突破改善临床使用血小板治疗时的反复采集造成病患的不便，并增加一采多用的方便性。另外延长血小板内生长因子的保质期，在多次使用的过程中如何更好地保存EPT或PRP里面生长因子的浓度及活性便是重要的课题。
生长因子的稳定性低、容易失活，为了维持生长因子的结构完整性必须在相对低温下维持和运送这类制剂以便维持其生物活性。生长因子活性的丧失多发生在贮存保藏阶段，一般制成液体制剂超低温(例如不高于-60℃)下保存，在低温冷冻条件下运输，并在使用前解冻。而在冷冻点以下的温度保存稳定的主要挑战之一就是防止生长因子的氨基酸或多肽的结构性和功能性在冷冻期间和保存阶段的不被冰晶产生物理性破坏。另外，超低温保存的时间过长在使用过程中反复冻融或者使用不当，EPT或PRP内含的生长因子是临床上治疗上的关键所在，生长因子的生物活性在反复的冻存过程往往会迅速大幅下降，从而限制了它的治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法及其冻干粉，解决了血小板保存生长因子时，受保存温度的影响，需要在超低温下保存，同时需要在低温冷冻条件下运输，使用前解冻，重复解冻再冻存不但容易增加污染的风险，更容易降低EPT或PRP里面生长因子的浓度的问题。
本发明通过下述技术方案实现：
本发明提供一种保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法，包括：
向血小板(EPT或PRP)或干细胞外泌体中加入0.01wt％～20wt％的保存液重新悬浮，得到混合液；所述保存液包括：多糖类、高分子生物材料和生理盐水；
将混合液在零下温度下进行冷冻干燥。
进一步地，在所述的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法中，所述血小板来自富血小板疗法或富血小板血浆。
进一步地，在所述的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法中，所述多糖类包括：海藻糖；或，
海藻糖以及葡萄糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖中的至少一种。
进一步地，在所述的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法中，多醣类在混合液中的重量浓度为0.1wt％～20wt％。
进一步地，在所述的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法中，所述高分子生物材料包括：透明质酸；或，
透明质酸以及几丁聚糖、聚乙二醇、甲基纤维素和三仙胶中的至少一种。
进一步地，在所述的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法中，所述高分子生物材料在混合液中的浓度为0.01wt％～5wt％，高分子生物材料的总分子量在10000Mw～200000Mw。
进一步地，在所述的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法中，所述生理盐水在混合液中的重量浓度为0.85wt％～0.95wt％。
进一步地，在所述的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法中，所述冷冻干燥的处理为：
将混合液于-80℃～-20℃温度下进行预先冷冻1hrs～8hrs；
在冷井温度-90℃～-20℃，样品温度在-20℃～20℃，真空压力在0.01Pa～10Pa下维持6hrs～24hrs，除去水。
本发明还提供一种冻干粉，所述冻干粉由上述的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法制备得到。
进一步地，在所述的冻干粉中，所述冻干粉采用生理盐水或无菌水在30s～60s内溶解。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
本发明提供的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法，使用的保存液配方中含多醣类和高分子生物材料来稳定血小板膜的稳定性维持正常生理环境来让血小板不易聚集或破裂而释放出生长因子，并结合冷冻干燥技术可更有效地延长生长因子的保存时间及增加使用效率，可以长期保存与富血小板疗法(EPT)或富血小板血浆(PRP)或外泌体体原有的生长因子活性相近，并且方便长期保存及临床应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。在附图中：
图1为本发明提供的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法制备的冻干粉成品图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明的技术方案为：
一种保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法，包括：
向血小板(EPT或PRP)或干细胞外泌体中加入0.01wt％～20wt％的保存液重新悬浮，得到混合液；所述保存液包括：多糖类、高分子生物材料和生理盐水；
将混合液在零下温度下进行冷冻干燥。
本发明提供的保存血小板(EPT或PRP)或干细胞外泌体内生长因子的方法，使用的保存液配方中含多醣类和高分子生物材料来稳定血小板膜的稳定性维持正常生理环境来让血小板不易聚集或破裂而释放出生长因子，并结合冷冻干燥技术可更有效地延长生长因子的保存时间及增加使用效率，可以长期保存血小板或干细胞外泌体原有的生长因子活性相近，并且方便长期保存及临床应用。
目前大多是使用海藻糖对血小板或是外泌体的细胞膜进行保护，避免血小板及外泌体在运送冻存的过程产生聚集，在工艺流程上先将海藻糖与血小板或是外泌体混合进行冷冻干燥后形成冻干粉，海藻糖主要作用是为了避免血小板或外泌体在冷冻干燥过程中包膜破裂，导致无法制作成冻干粉以及血小板或外泌体在冻干的过程中胞膜破裂导致数量减少，因此进行添加。
本发明提供的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法，采用的保存液中添加多醣的目的是血小板(EPT或PRP)或外泌体内含的生长因子为多肽结构，可以与多醣产生两种结合方式：(1)醣的半缩醛羟基和含羟基的胺基酸(丝氨酸、苏氨酸、羟基赖氨酸等)以O-醣苷键结合；(2)醣的半缩醛羟基和天冬酰胺的酰胺基以N-醣苷键结合。与生长因子肽类是能够形成抑制冰晶生长、改变冰晶形态、抑制冰的重结晶的多肽类。另外多醣也可应用于保护皮肤，在化妆品中作为抗衰老和抗氧化添加剂，可以减缓细胞的衰老，具有抗皱、修复、保湿、增加皮肤弹性等作用。具有抗日光照射剂—保护和修复，可以有效减少日光照时所引起的红斑。使用在细胞和组织的低温贮藏，可以有效抑制低温环境下冰晶的形成，能够显著提高细胞和组织等活体的存活率，如菌株保存、胚胎保存、器官保存等，如可以用在器官移植中。
在临床应用其它案例均先将外泌体或PRP与海藻糖先混合做成冻干粉，在进行使用时，才与玻尿酸或其他材料混合溶解，与本发明的工艺流程所有不同，其他案例其玻尿酸的作用为提高填充效果，延长填充部位的维持时间。现有提供了冷冻干燥(冻干)海藻糖稳定的血小板或其衍生物，用于治疗药物引起的凝血病，以及在冻干血小板衍生物存在的情况下加速促凝血药物的功效。或使用来冻干外泌体的方法，所述冻干保护剂包含甲硫氨酸、甘露醇和海藻糖。冻干外泌体表现出维持多孔海绵形状而不形成冰晶的良好性质。另外，根据本发明的冻干外泌体或包含其的组合物可以应用于药物组合物、外用皮肤制剂和化妆品组合物。例如，本发明的冻干外泌体可以作为通过简单地与稀释剂混合而获得的溶液来使用。本发明提供的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法，采用同时包含多醣类和高分子材料的保存液与血小板或外泌体来进行混合，并进行冷冻干燥来保存内涵的生长因子，来确保其活性成分，用于组织修复及再生应用。在实施例中仅加入多醣或高分子材料其对EPT的生长因子都没有两种搭配起来对生长因子的活性保存的好。
由于一般血小板的冷冻保存需要深低温冰箱，不利于血小板的远距离运送。为此，本发明提供的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法，采用冻干工艺最后得到冻干粉，方便临床使用，使用前生理盐水或无菌水可快速溶解冻干粉沫可在30s-60s内均匀溶解均匀，采用冻干技术还能有效地维持生长因子的浓度。保存液中加入的多种多醣分子，可有效地保护血小板避免在冻融过程损害也保护生长因子并维持其活性。
本发明提供的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法，冻干工艺上，配置好的溶液仅需要预冻低于-20的温度下超过4小时(可通过目视确认已形成冰)后，直接在冷井温度低于-20的冷冻干燥机进行冻干，冻干负压为高于1Pa的压力进行，冻干时间以冷冻干燥机的功率及样品体积不同而有所不同。海藻糖或其它醣类可以更均匀渗透到血小板或外泌体的包膜上的平衡时间，避免在冻干过程因浓度不平衡导致胞膜破裂。本发明的保存液含有生物材料，生物材料分子的长链可使外泌体或血小板不易聚集不但可以保持生长因子的活性，也避免在预冻的过程外泌体及血小板的沉积产生的聚集及分层的现象。同样的在冻干过程齐冷井的温度均须低于-30℃，本发明的温度仅需低于-20℃。
其冻干后的生长因子与新鲜血小板相似的特性，并具有特别长的保质期，并且可以直接复水后注射到体内或与水光针等医美产品联合使用，加速伤口愈合及褪红，有效地维持生长因子的浓度。
近年来，对血小板治疗技术在抗衰的需求不断增加，EPT采集浓度高且量大的血小板对于临床上的使用十分有优势，很好的避免重复扎针及检测的不便。然而，由于跟所有的生物制剂一样，对于血小板内的生长因子长期的保存是特别重要的。本身血小板及外泌体具双层膜，双层膜可以很好的保存生长因子的活性，使用本发明可以实现稳定双层膜，进而实现长期保存生物活性及生长因子。在冻干前会进行配方，配方有多醣类，多醣类含有大量羟基，可以取代生物大分子中的水，在细胞表面形成独特的水化膜。水化膜稳定血小板膜的结构和功能，防止血小板膜变性，从而避免损伤。
从20世纪50年代发现真菌多醣具有抗癌作用以来，陆续发现多醣类化合物具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗病毒、抗炎症、抗氧化、抗突变、抗菌、抗衰老等生物活性。并具有保持细胞活力和生物大分子活性的特性，可以直接涂抹或注射到受伤的部位形成一层特殊的保护膜，不仅能保持需修复部位营养和水分，起到较好的保湿、滋润作用。
通常血小板或外泌体产品在22℃环境下保存仅3-7天，冷藏(4℃)或冷冻保存(-80℃或-196℃)虽然在一定程度上減少了生长因子失活的状况，但在使用上需要回温解冻，这些程序也会降低血小板内含的生长因子活性，在临床使用上也相当不便。在多醣及冷冻干燥技术可最大限度的保存生长因子的活性。
本发明提供的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法，在临床上应用上能够保留生长因子生物活性、方便与其它制剂搭配，经过复苏，回温等程序，可保证生长因子的活性，另一方面避免在这些过程产生污染及失活。正常的血小板治疗程序需要在3至6个月的期间内进行若干次治疗，尤其在使用机采EPT治疗甚至可达1年以上。在每次接受治疗之前，病人先进行血小板提取，需经过静脉穿刺进行血小板的提取。利用机采的方式提取大量的血小板来进行冻干保存，不但延长血小板中生长因子的保质期，也节省了医师和病人花费在多次静脉穿刺和EPT提取上的时间与人工，并降低了处理血小板的成本。
进一步地，所述血小板来自富血小板疗法或富血小板血浆。
进一步地，所述多醣类包括：海藻糖以及葡萄糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖中的至少一种。
生长因子为多肽类或是蛋白质，多肽及蛋白质可与多醣形成抗冻多肽，能够吸附在冰晶表面，改变冰晶生长特性，抑制冰晶生长。所以加入多醣类，可与生长因子形成抗冻多肽类，其抗冻多肽类的结构可以很好的与冰的基平面和棱面结合，使得这类的抗冻蛋白具有较高的活性。所有抗冻多肽都有非依数性降低冰点并抑制冰晶生长的特性。多醣与生长因子的多肽或蛋白质其结构组成及其与冰的结合机制，可保护血小板的双层膜及生长因子的活性，在冷冻干燥程序中，避免生长因子的活性丧失导致血小板或干细胞外泌体在组织修复上或抗衰老的效果不佳。
进一步地，多醣类在混合液中的重量浓度为0.1wt％～20wt％，可以为0.1wt％、0.5wt％、1wt％、2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％、20wt％等浓度。
进一步地，所述高分子生物材料包括：透明质酸；或，
透明质酸以及几丁聚醣、聚乙二醇、甲基纤维素和三仙胶中的至少一种。
高分子生物材料具有长链生物性高分子，在水溶液中会形成网状结构，这种网状结构所造成空间上的立体屏障效应可以更好的稳定EPT内所含的血小板及生长因子的稳定，这些聚集形成小空隙的三维空间网络结构，能够包封生长因子，缓慢释放生长因子，从而提高血小板或生长因子等细胞活性因子在创伤表面的驻留时间，促进其包含的大量细胞因子深入到创面皮肤基底层，促进皮肤组织分化、血管新生以及肉芽组织的生成，促进损伤皮肤组织的结构重建与再生。这些分子可以提供粘弹性并有助于润滑，同时表现出多种多效性信号传导特性，包括抗炎、抗细胞凋亡、抗血管生成和抗纤维化作用。或者具有镇痛特性，对阿片受体具有特定活性。本发明表明EPT或外泌体和与这些生物材料混合物在生长因子的活性保存上比单独使用EPT或外泌体+海藻糖进行冻干的效果更好更有效。
进一步地，所述高分子生物材料在混合液中的浓度为0.01wt％～5wt％，各高分子生物材料在该浓度下均可自由配比，这浓度下可避免EPT在预冻过程中内部含有的血小板产生聚集沉淀而导致失活，及冻干过程导致样品产生塌陷及分层。高分子生物材料在混合液中的浓度优选地0.01wt％～5wt％，进一步地优选为0.05～5wt％，更优选为1～5wt％，高分子生物材料在混合液中的浓度可以为0.01wt％、0.05wt％、0.1wt％、0.15wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.9wt％、1wt％、5wt％等浓度。
等浓度。高分子生物材料的总分子量在10000Mw～200000Mw。
进一步地，所述生理盐水在混合液中的重量浓度为0.85wt％～0.95wt％。
进一步地，所述冷冻干燥的处理为：
将混合液于-80℃～-20℃温度下进行预先冷冻1hrs～8hrs，预先冷冻的温度可以为-80℃、-70℃、-60℃、-50℃、-40℃、-30℃或-20℃等预先冷冻温度；预先冷冻的时间可以为1hrs、2hrs、3hrs、4hrs、5hrs、6hrs、7hrs或8hrs等时间。
在冷井温度-90℃～-20℃，可以为-90℃、-80℃、-70℃、-60℃、-50℃、-40℃、-30℃或-20℃等冷井温；样品温度在-20℃～20℃，可以为-20℃、-15℃、-10℃、-5℃、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃等样品温度；真空压力在0.01Pa～10Pa下维持6hrs～24hrs，除去水。真空压力可以为0.01Pa、0.05Pa、0.1Pa、0.5Pa、1Pa、2Pa、3Pa、4Pa、5Pa、6Pa、7Pa、8Pa、9Pa或10Pa等压力；时间可以为6hrs、8hrs、10hrs、12hrs、15hrs、18hrs、20hrs、22hrs、24hrs等时间。
本发明还提供一种冻干粉，所述冻干粉由上述的保存血小板及干细胞外泌体内生长因子的方法制备得到。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法进行描述，但是应当理解，这些实施例是以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明的保护范围也不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例提供的一种保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法，由该方法制备得到外泌体冻干粉，其方法包括以下步骤：
(1)EPT制备：采用南格尔血浆分离机SD928提取自体外周血液中得血小板，得富血小板因子血浆，备用；
(2)混合液制备：向步骤(1)中制得的EPT中加入含生理盐水和海藻糖及玻尿酸的保存液(记作配方1)重悬，得混合液；其中，混合液中海藻糖物质的重量浓度为0.1％，玻尿酸的重量浓度0.01％，EPT占比在50％。
(3)冷冻干燥：然后在-20℃条件下预速冻12h，再在-20℃，1Pa条件下冷冻干燥24h，制得。
制备的冻干粉成品见图1所示。
实施例2
本实施例提供的一种保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法，由该方法制备得到外泌体冻干粉，其方法包括以下步骤：
(1)EPT制备：采用南格尔血浆分离机SD928提取自体外周血液中得血小板，得富血小板因子血浆，备用；
(2)混合液制备：向步骤(1)中制得的EPT中加入含生理盐水和海藻糖与葡萄糖及玻尿酸及甲基纤维素的保存液(记作配方2)重悬，得混合液；其中，混合液中海藻糖物质的重量浓度为5％，葡萄糖的重量浓度5％，玻尿酸的重量溶度2％，甲基纤维素8％，EPT占比在50％；
(3)冷冻干燥：然后在-20℃条件下预速冻12h，再在-20℃，1Pa条件下冷冻干燥24h，制得。
对照例1
本对照例提供的一种保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法，由该方法制备得到外泌体冻干粉，其方法包括以下步骤：
(1)EPT制备：采用南格尔血浆分离机SD928提取自体外周血液中得血小板，得富血小板因子血浆，备用；
(2)混合液制备：向步骤(1)中制得的EPT中加入生理盐水和玻尿酸(记作仅玻尿酸)重悬，得混合液；其中，混合液中，玻尿酸的重量溶度10％，EPT占比在90％；
(3)冷冻干燥：然后在-20℃条件下预速冻12h，再在-20℃，1Pa条件下冷冻干燥24h，制得。
对照例2
本对照例提供的一种保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法，由该方法制备得到外泌体冻干粉，其方法包括以下步骤：
(1)EPT制备：采用南格尔血浆分离机SD928提取自体外周血液中得血小板，得富血小板因子血浆，备用；
(2)混合液制备：向步骤(1)中制得的EPT中加入含生理盐水和海藻糖的保存液(记作仅海藻糖)重悬，得混合液；其中，混合液中海藻糖物质的重量浓度为10％，EPT占比在50％；
冷冻干燥：然后在-20℃条件下预速冻12h，再在-20℃，1Pa条件下冷冻干燥24h，制得。
对照例3(不经冷冻干燥)
本对照例提供的一种保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法，其方法包括以下步骤：
(1)EPT制备：采用南格尔血浆分离机SD928提取自体外周血液中得血小板，得富血小板因子血浆，备用；
(2)混合液制备：向步骤(1)中制得的EPT中加入生理盐水和海藻糖及玻尿酸(配方2)重悬，得混合液；其中，混合液中海藻糖物质的重量浓度为5％，葡萄糖的重量浓度5％，玻尿酸的重量溶度2％，甲基纤维素8％，EPT占比在50％。
测试例
TGF-β1、VEGF和PDGF-BB和bFGF是血小板中含量较高的四种生长因子，以新鲜EPT为基础对照组，分析了实施例1-2以及对照例1-3不同保存处理方式在一个月后对EPT中上述生长因子含量的影响，测试结果见表1-4。
表1
表2
表3
表4
从表1-4可以看出，采用配方1和配方2的保存液的冻干粉中的TGF-β1、VEGF、PDGF-BB和bFGF均与新鲜EPT组无明显差异。
经配方1和2及冻干保存EPT的方法对生长因子保护有更优异的表现，甚至个别生长因子优于新鲜状态的情况。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法，其特征在于，包括：
向血小板或干细胞外泌体中加入0.01wt％～20wt％的保存液重新悬浮，得到混合液；所述保存液包括：多醣类、高分子生物材料和生理盐水；
将混合液在零下温度下进行冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法，其特征在于，所述血小板来自富血小板疗法或富血小板血浆。
3.根据权利要求1所述的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法，其特征在于，所述多醣类包括：海藻糖；或，
海藻糖以及葡萄糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法，其特征在于，多醣类在混合液中的重量浓度为0.1wt％～20wt％。
5.根据权利要求1所述的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法，其特征在于，所述高分子生物材料包括：透明质酸；或，
透明质酸以及几丁聚糖、聚乙二醇、甲基纤维素和三仙胶中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法，其特征在于，所述高分子生物材料在混合液中的浓度为0.01wt％～5wt％，高分子生物材料的总分子量在10000Mw～200000Mw。
7.根据权利要求1所述的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法，其特征在于，所述生理盐水在混合液中的重量浓度为0.85wt％～0.95wt％。
8.根据权利要求1所述的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法，其特征在于，所述冷冻干燥的处理为：
将混合液于-80℃～-20℃温度下进行预先冷冻1hrs～8hrs；
在冷井温度-90℃～-20℃，样品温度在-20℃～20℃，真空压力在0.01Pa～10Pa下维持6hrs～24hrs，除去水。
9.一种冻干粉，其特征在于，所述冻干粉由权利要求1-8任一项所述的保存血小板或干细胞外泌体内生长因子的方法制备得到。
10.根据权利要求9所述的冻干粉，其特征在于，所述冻干粉采用生理盐水或无菌水在30s～60s内溶解。
Priority Applications (1)
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