JP5868592B2 - ケラチンバイオマテリアルを含有する創傷治癒組成物 - Google Patents

Description

［関連出願］
本出願は、２００７年４月１７日出願の米国特許仮出願第６０／９１２，２６５号に対する優先権を主張する。その開示は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。

［政府支援］
本発明は、米国陸軍の契約番号Ｗ８１ＸＷＨ−０４−１−０１０５のもと、政府支援を受けて行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。

［発明の分野］
本発明は、ケラチンバイオマテリアルおよび生物医学的用途におけるその使用に関する。

ケラチンを医学で使用することを記した最古の文書は、李時珍（Ｌｉ Ｓｈｉ−Ｚｈｅｎ）という名の中国人植物学者による（本草綱目（Ｂｅｎ Ｃａｏ Ｇａｎｇ Ｍｕ）。本草学（Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ）、李時珍（Ｌｉ Ｓｈｉ−Ｚｈｅｎ）（１５１８−１５９３）著による中国の薬草の辞典）。３８年間の間、李は本草綱目として知られる一群の８００冊の書物を執筆した。これらの書物は彼の死から３年後の１５９６年に出版された。これらの巻に記載された１１，０００を超える処方の中には、血余炭（Ｘｕｅ Ｙｕ Ｔａｎ）として公知であり、Ｃｒｉｎｉｓ Ｃａｒｂｏｎｉｓａｔｕｓとしても公知の、熱分解した人毛の灰を粉砕したものからなる物質がある。血余炭（Ｘｕｅ Ｙｕ Ｔａｎ）について述べられた適応は、創傷治癒および血液凝固の促進であった。

タンパク質がまだアルブミノイドと呼ばれていた１８００年代初頭（アルブミンはその当時よく知られたタンパク質であった）、多くの異なる種類のタンパク質が発見された。１８４９年ごろ、動物の角および蹄などの硬組織を構成する物質を記述するために、文献に「ケラチン」という語が出現した（ケラチンは、角を意味するギリシャ語「ｋｅｒａ」に由来する）。この新しいタンパク質は、他のタンパク質のように挙動しないので、科学者たちの興味をそそった。例えば、タンパク質を溶解するために用いられる通常の方法がケラチンには効かなかった。燃焼および粉砕などの方法がしばらくの間知られていたが、多くの科学者および発明者たちは、より良い製品を作るために毛および角を溶解することに、より大きな関心をもった。

１９０５年から１９３５年までの数年間に、酸化および還元化学を用いてケラチンを抽出する多数の方法が開発された（Ｂｒｅｉｎｌ Ｆ ａｎｄ Ｂａｕｄｉｓｃｈ Ｏ，Ｚ ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９０７；５２：１５８−６９；Ｎｅｕｂｅｒｇ Ｃ，米国特許第９２６，９９９号、１９０９年７月６日；Ｌｉｓｓｉｚｉｎ Ｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｕｌｌ １９１５；４：１８−２３；Ｚｄｅｎｋｏ Ｓ，Ｚ ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９２４；１３６：１６０−７２；Ｌｉｓｓｉｚｉｎ Ｔ，Ｚ ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９２８；１７３：３０９−１１）。１９２０年代後期までに、毛、角および蹄の構造を分解するための多くの技術が開発されたが、科学者は、これらの精製タンパク質の一部の挙動に困惑した。程なく、科学者たちは、多くの異なる形態のケラチンがこれらの抽出物中に存在すること、および、毛髪繊維は単純なタンパク質鎖でなく複雑な構造であるに違いない、という結論に達した。１９３４年、主として異なる分子量を有することにより区別された、異なる種類のケラチンを記載した重要な研究論文が発表された（Ｇｏｄｄａｒｄ ＤＲ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ Ｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９３４；１０６：６０５−１４）。この将来性のある論文は、多くの異なるケラチン同族体が存在すること、および、それぞれが毛包の構造および機能において異なる役割を果たすことを示した。

英国のリーズ大学および羊毛工業研究所（Ｗｏｏｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）での以前の研究は、羊毛およびその他の繊維が、外側のキューティクルと中心の皮質で構成されていることを示した。この情報に基づいて、ＣＳＩＲＯの科学者らは、羊毛の構造および組成に関する最も基本的な研究の多くを行った。酸化および還元化学法と併せて、Ｘ線回折および電子顕微鏡法を用いて、ＣＳＩＲＯは、毛髪繊維の最初の完全な図を作成した（Ｒｉｖｅｔｔ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，「Ｋｅｒａｔｉｎ ａｎｄ Ｗｏｏｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，Ｔｈｅ Ｌｅｎｎｏｘ Ｌｅｇａｃｙ，ＣＳＩＲＯ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ，ＶＩＣ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ；１９９６）。

１９６５年、ＣＳＩＲＯの科学者Ｗ．Ｇｏｒｄｏｎ Ｃｒｅｗｔｈｅｒとその同僚は、ケラチンの化学に関する決定的な文章を発表した（Ｃｒｅｗｔｈｅｒ ＷＧ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｋｅｒａｔｉｎｓ．Ａｎｆｉｎｓｅｎ Ｃ．Ｂ．Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９６５．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：１９１−３４６）。「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ」中のこのチャプターには、６４０を超える公表されたケラチンに関する研究への参照が含まれていた。科学者たちが、毛髪繊維からケラチンを抽出し、それらを精製および特性付けする方法を知るやいなや、ケラチンを用いて製造するこのできる派生材料の数は、指数関数的に増大した。１９７０年からの１０年の間に、世界中で抽出ケラチンを粉末、フィルム、ゲル、コーティング、繊維および泡沫にする方法が、いくつかの研究グループにより開発および発表された（Ａｎｋｅｒ ＣＡ，米国特許第３，６４２，４９８号，１９７２年２月１５日；Ｋａｗａｎｏ Ｙ ａｎｄ Ｏｋａｍｏｔｏ Ｓ，Ｋａｇａｋｕ Ｔｏ Ｓｅｉｂｕｔｓｕ １９７５；１３（５）：２９１−２２３；Ｏｋａｍｏｔｏ Ｓ，Ｎｉｐｐｏｎ Ｓｈｏｋｕｈｉｎ Ｋｏｇｙｏ Ｇａｋｋａｉｓｈｉ １９７７；２４（ｌ）：４０−５０）。これらの方法はすべて、数十年前に開発された酸化および還元化学を利用していた。

１９８２年、日本の科学者が、血液凝固を排除する方法として移植血管へのケラチンコーティングの使用を説明する最初の研究（Ｎｏｉｓｈｉｋｉ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｋｏｂｕｎｓｈｉ Ｒｏｎｂｕｎｓｈｕ １９８２；３９（４）：２２１−７）、ならびにケラチンの生体適合性に関する実験（Ｉｔｏ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｋｏｂｕｎｓｈｉ Ｒｏｎｂｕｎｓｈｕ １９８２；３９（４）：２４９−５６）を発表した。その後間もなく、１９８５年に、英国出身の２名の研究者が、新しいバイオマテリアル開発のための構成単位としてケラチンを使用する見通しを考察する総説を発表した（Ｊａｒｍａｎ Ｔ ａｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｊ，Ｗｏｒｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｒｅｐ １９８５；ｌ：５０５−１２）。１９９２年、ケラチンに基づくバイオマテリアルの宿主の開発および試験が、フランス人学士Ｉｓａｂｅｌｌｅ Ｖａｌｈｅｒｉｅの博士論文の主題であった（Ｖａｌｈｅｒｉｅ Ｉ ａｎｄ Ｇａｇｎｉｅｕ Ｃ．「Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｋｅｒａｔｉｎｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｐｈｙｓｉｃａｌ，ｐｈｙｓｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」．Ｄｏｃｔｏｒａｌ ｔｈｅｓｉｓ．Ｉｎｓｔ Ｎａｔｌ Ｓｃｉ Ａｐｐｌ Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ １９９２）。その後間もなく、日本の科学者らは、バイオマテリアル開発の最前線でケラチンがとり得る卓越した位置に関する解説書を１９９３年に発表した（様々な執筆者、Ｋｏｇｙｏ Ｚａｉｒｙｏ １９９３；４１（１５）Ｓｐｅｃｉａｌ ｉｓｓｕｅ ２：１０６−９）。

これらを総合すると、前述の発表された研究の内容は、ケラチンの特有の化学的、物理的および生物学的特性を例証するものである。しかし、特に創傷の治療のための、生物医学的用途での使用のために最適なケラチン調製品は、依然として大きな必要性がある。

本発明の態様は、ケラチン誘導体（例えば、ケラトース、ケラテイン、またはそれらの組合せ）および所望により少なくとも１種類の付加的な有効成分（例えば、鎮痛薬、抗菌剤、付加的な創傷治癒剤など）を含む医薬組成物である。

本発明のもう一つの態様は、ケラチン誘導体を、創傷を治療するために有効な量で創傷に適用することを含む、治療を必要とする被験体において創傷（例えば、熱傷、擦過傷、裂傷、切開、褥瘡、穿刺創、貫通創、銃創、圧挫損傷など）を治療するための方法である。一部の実施形態では、該正に帯電した組成物は、ケラトース、ケラテイン、またはそれらの組合せを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。

一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、αケラトース、γケラトース、酸性αケラトース、塩基性αケラトース、酸性γケラトース、塩基性γケラトース、αケラテイン、γケラテイン、酸性αケラテイン、塩基性αケラテイン、酸性γケラテイン、塩基性γケラテイン、またはその組合せを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。

一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、創傷変化（ｗｏｕｎｄ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）を阻害するため、創傷閉鎖を促進するため、またはその両方のために効果的な量で創傷に適用される。一部の実施形態では、ケラチン誘導体は局所適用される。一部の実施形態では、ケラチン誘導体は被験体の身体への注射により適用される。

本発明のさらなる態様は、ケラチン誘導体を、熱傷創を治療するために有効な量で創傷に適用することを含む、治療を必要とする被験体において熱傷創を治療するための方法である。一部の実施形態では、該正に帯電した組成物ケラトース、ケラテイン、またはそれらの組合せを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。

一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、αケラトース、γケラトース、酸性αケラトース、塩基性αケラトース、酸性γケラトース、塩基性γケラトース、αケラテイン、γケラテイン、酸性αケラテイン、塩基性αケラテイン、酸性γケラテイン、塩基性γケラテイン、またはその組合せを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。

一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、創傷変化を阻害するため、創傷閉鎖を促進するため、またはその両方のために効果的な量で創傷に適用される。一部の実施形態では、ケラチン誘導体は局所適用される。一部の実施形態では、ケラチン誘導体は被験体の身体への注射により適用される。

本発明のもう一つの態様は、固体の、生理学的に許容される支持体、および支持体上のケラチン誘導体を含む、外科用または救急医療用補助具（ｓｕｒｇｉｃａｌ ｏｒ ｐａｒａｍｅｄｉｃ ａｉｄ）である。一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、αケラトース、γケラトース、酸性αケラトース、塩基性αケラトース、酸性γケラトース、塩基性γケラトース、αケラテイン、γケラテイン、酸性αケラテイン、塩基性αケラテイン、酸性γケラテイン、塩基性γケラテイン、またはその組合せを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。

本発明のなおさらなる態様は、ケラチン誘導体、および、該ケラチン誘導体が滅菌形態でその中に包装されている容器を含む、キットである。一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、αケラトース、γケラトース、酸性αケラトース、塩基性αケラトース、酸性γケラトース、塩基性γケラトース、αケラテイン、γケラテイン、酸性αケラテイン、塩基性αケラテイン、酸性γケラテイン、塩基性γケラテイン、またはその組合せを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。

本発明のもう一つの態様は、本明細書に記載されるような治療方法を行うための組成物または薬物を調製するための、または本明細書に記載されるような製品を製造するための、本明細書に記載されるようなケラチン誘導体の使用である。

皮膚成分の細胞増殖を示すグラフである。可溶性ケラチンバイオマテリアルで処理したケラチノサイト（ａ）および線維芽細胞（ｂ）は、媒体単独で処理した細胞よりもより即座に増殖する。 化学熱傷創面積の経時的変化を示すグラフである。フェノールで処理して化学熱傷を誘導したマウスは、創傷部位の不動態化を経験し、正常な過程の創傷の増大が起こらない。 ブタにおける熱傷創面積を示すグラフである。創傷面積をデジタル画像解析により決定し、０日の値に正規化した。ケラチンゲルで処理した創傷は最初の数日間、認め得るほど面積を増加させず、対照よりも速く治癒した。 カプラン・マイヤー生存率グラフを示す図である。時間は対数目盛り上の分に表される。対照群の全ての動物が６０分以内に死亡した。ケラチン群の一匹の動物およびＨｅｍＣｏｎ（登録商標）止血用包帯群の一匹を、動物飼育スタッフの助言の下に犠牲にした。全般的に、ケラチンがその他の群よりも優れ、ＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）止血剤およびＨｅｍＣｏｎ（登録商標）止血用包帯群では２匹が死亡したのに比較して、１匹しか死亡しなかった。 流した血液を示すグラフである。失血量を体重に対して正規化し、体重に対する百分率として表す。ケラチンおよびＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）止血剤群は、対照およびＨｅｍＣｏｎ（登録商標）止血用包帯群よりも失血が有意に（^＊）少なかった。 平均動脈圧（ＭＡＰ）を表すグラフである。血圧は初期圧力に対する百分率で表される。陰性対照群およびＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）止血剤群は、初期ＭＡＰの４０％への圧力の急落を示した。ケラチンまたはＨｅｍＣｏｎ（登録商標）止血用包帯で処置した動物は、ＭＡＰを初期圧力の８０％前後で安定化させることができた。これらの差は、対照群と比較して、統計的に差はなかった。 ショック指数（ＳＩ）を示すグラフである。修正ショック指数は、心拍数をＭＡＰで除算することにより算出した。この指数を臨床で用いてショックの重症度を評価する。値が低いほど良好である。ケラチン群の動物は、全試験期間にわたって代償性の（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅｄ）低い値を示したが、一方ＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）止血剤群およびＨｅｍＣｏｎ（登録商標）止血用包帯群は陰性対照と同様の値を有した。群間に統計的有意性はなかった。 組織学的評価を表す図である。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した代表的な組織切片、５０倍。Ａ）陰性対照群は、広く中空の類洞とともに乏しい灌流の徴候を示す。その表面には有効な血塊はない。Ｂ）ＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）止血剤処置した試料の表面は、壊死（矢印）および凝固の領域を示す。最小限の細胞浸潤および組織の再生だけが見える。何もない白い領域は、除去されたＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）止血剤顆粒に相当する。Ｃ）ＨｅｍＣｏｎ（登録商標）止血用包帯処置した動物の組織試料は、低レベルの細胞浸潤のある、付着した凝固血の斑状の領域を示した。Ｄ）ケラチンで処理した動物の肝臓試料は、損傷面に付着したケラチンバイオマテリアルの厚い層を示す。高い細胞活性およびケラチン間の空間における初期の顆粒状組織（大きい矢印）の形成を含む、優れた生体適合性の徴候がある。さらに、ケラチンバイオマテリアルと肝細胞の高レベルの直接接触がある（小さな矢印）。 ケラチン処置群（高倍率）を表す図である。Ａ）ケラチンゲルの空間内での初期の肉芽様組織の形成、２００倍。Ｂ）バイオマテリアルと組織の統合、および初期の細胞浸潤を示す、ケラチンゲルと肝臓組織の界面、４００倍。

引用された全ての米国特許参照文献の開示は、それらが本明細書中の開示に一致する程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。

抽出ケラチン溶液がミクロン規模で自発的に自己組織化する能力は、１９８６年および１９８７年の２つの論文において発表された（Ｔｈｏｍａｓ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌ １９８６；８：２５８−６４；ｖａｎ ｄｅ Ｌｏｅｃｈｔ Ｍ，Ｍｅｌｌｉａｎｄ Ｔｅｘｔｉｌｂｅｒｉｃｈｔｅ １９８７；１０：７８０−６）。この現象は毛髪ケラチンが得られる高度に制御された上部構造を考えると、驚くことではない。正確に処理されると、この自己組織化能力を保存して、細胞浸潤をもたらすサイズ規模で整然とした構築物を作り出すために用いることができる。ケラチンが（例えば、酸または塩基で）加水分解されると、その分子量は減少し、それらは自己組織化能力を失う。従って、加水分解を最小限にする処理条件が好ましい。

自己組織化する能力は、２つの理由で組織工学スキャフォールドに特に有用な特徴である。第一に、自己組織化は、再現可能な構築物、次元、および気孔率を有する高度に規則的な構造をもたらす。第二に、これらの構築物が良性条件下で自発的に形を成すという事実により、マトリックスが形成されるときに細胞の組み込みが可能となる。これら２つの特色は、天然の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の模倣を試みるいずれのシステムにとっても極めて重要である。

細胞認識も、ＥＣＭを模倣しようとするバイオマテリアルの重要な特徴である。かかる認識は、構成成分ＥＣＭタンパク質によって提示される特異的アミノ酸モチーフとの細胞表面インテグリンの結合によって促進される。主なタンパク質としては、コラーゲンおよびフィブロネクチンが挙げられ、これらの両方が、細胞結合に関して広範に研究されている。両方のタンパク質は、幅広い種類の細胞種による結合を支持する幾つかの領域を含む。広く知られているアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）モチーフに加えて、フィブロネクチン上の「Ｘ」−アスパラギン酸−「Ｙ」モチーフもインテグリンα４β１によって認識される（この際、Ｘは、グリシン、ロイシンまたはグルタミン酸に相当し、Ｙは、セリンまたはバリンに相当する）ことが示されている。

人毛から誘導されるケラチンバイオマテリアルは、これらの同じ結合モチーフを含む。ＮＣＢＩタンパク質データベースを検索すると、７１の別個の特有の人毛ケラチンタンパク質の配列が明らかとなった。このうち、５５が、高分子量、低硫黄、αヘリカルファミリーに由来する。このタンパク質グループは、多くの場合、α−ケラチンと呼ばれ、人毛繊維への靭性の付与を担う。これらのα−ケラチンは、４０ｋＤａより大きい分子量、および４．８モルパーセントの平均システイン（タンパク質結合の分子間および分子内に関与する主なアミノ酸）含有率を有する。さらに、これらのαケラチンタンパク質のアミノ酸配列の分析により、７８％が少なくとも１つのフィブロネクチン様インテグリン受容体結合モチーフを含み、２５％が、少なくとも２以上を含むことが示された。２つの最近の論文は、加工ケラチン泡沫への優れた細胞接着を実証することによって、これらの結合部位がケラチンバイオマテリアルの表面に存在する可能性が高いことを強調している（Ｔａｃｈｉｂａｎａ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００２；９３：１６５−７０；Ｔａｃｈｉｂａｎａ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００５；２６（３）：２９７−３０２）。

本開示のケラチン調製品と同じように利用することのできる天然ポリマーのその他の例としては、限定されるものではないが、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブリン、ムチン、エラスチン、ナイドジェン（エンタクチン）、プロテオグリカンなどが挙げられる（例えば、Ｋａｔｓｕｅｎ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第５，６９１，２０３号を参照）。

人毛抽出物の生物活性に関する学説の中には、人毛ケラチン（「ＨＨＫ」）は、それら自体が生物活性であるという説がある。７０種類を超える人毛ケラチンが公知であり、そのｃＤＮＡ由来配列が公表されている。しかし、ＨＨＫの完全な補完物（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）は不明であり、１００を超えるという推定値が提案されている（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ ＪＭ，Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｈａｉｒ：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ ＬＡ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｋｉｎ（１９８３），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；４７５−５１０）。全種類のＨＨＫの中には、創傷拘縮および細胞移動に関与することが証明された、少数のＨＨＫがある（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７；２７６：７５−８１）。特に、ケラチンＫ−６およびＫ−１６は、創傷治癒中に表皮で発現され、毛包の外毛根鞘においても見出される（Ｂｏｗｄｅｎ ＰＥ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（１９９３），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ：１９−５４）。人毛の抽出物中のこれらのＨＨＫが存在すること、およびそれらをその後創傷床へ直接投与することは、そうでなければ長期にわたる長い分化、遊走および増殖プロセスを「ショートカットする」か、または何らかの生化学物質の欠乏を解消し、その結果、組織修復および再生プロセスを促進する原因となり得る。

骨形成因子−４（ＢＭＰ−４）などの増殖因子および形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのその他のメンバーが発育中の毛包に存在することは１０年以上前から知られている（Ｊｏｎｅｓ ＣＭ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９１；１１１：５３１−４２；Ｌｙｏｎｓ ＫＭ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９０；１０９：８３３−４４；Ｂｌｅｓｓｉｎｇｓ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐ １９９３；７：２０４−１５）。実際、３０を超える増殖因子およびサイトカインが、循環する毛包の成長に関与する（Ｈａｒｄｙ ＭＨ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １９９２；８（２）：５５−６１；Ｓｔｅｎｎ ＫＳ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏ Ｓｃｉ １９９４；７Ｓ：Ｓ１０９−２４；Ｒｏｇｅｒｓ ＧＥ，Ｉｎｔ Ｊ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２００４；４８（２− ３）：１６３−７０）。これらの分子の多くは、多様な組織の再生に中心的な役割を有する。サイトカインが毛包のバルジ領域にある幹細胞に結合すると、多数の増殖因子が人毛内に同伴する（ｅｎｔｒａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ）可能性が高い（Ｐａｎｔｅｌｅｙｅｖ ＡＡ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ ２００１；ｌ１４：３４１９−３１）。これらの増殖因子は、末端を切断した人毛からケラチンとともに抽出されると予測される。この知見は、先例のないものではない。それというのも、様々な組織の抽出物に多くの異なる種類の増殖因子が存在すること、およびその活性は化学抽出の後でさえも維持されることが既に示されているためである。これらのような知見は、多数の増殖因子が末端を切断した人毛中に存在する可能性があり、ケラチンはとりわけこれらの増殖因子の非常に有効な送達マトリックスとして作用する可能性があることの証拠が増していることを示す。

ケラチンは、脊椎動物の毛、皮膚およびその他の組織に見出されるタンパク質の１ファミリーである。毛は、容易に入手でき、かつ高価でない数少ないヒト組織の１つであるので、特有のヒトケラチン源である。その他のケラチン源は、本発明に許容される原料ではあるが（例えば、羊毛、毛皮、角、蹄、くちばし、羽、うろこなど）、ヒト被験体での使用には、その生体適合性の故に人毛が好ましい。

ケラチンは、当分野で公表された方法を用いて、酸化または還元により、人毛繊維から抽出することができる（例えば、Ｃｒｅｗｔｈｅｒ ＷＧ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｋｅｒａｔｉｎｓ，ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９６５；２０：１９１−３４６を参照）。これらの方法は一般に、酸化または還元のいずれかによってケラチンの架橋構造を破壊する二段階法を用いる。これらの反応では、システインアミノ酸残基のジスルフィド結合が切断されて、ケラチンを可溶性にさせる（スキーム１）。そのキューティクルは基本的にこの処理による影響を受けないので、大部分のケラチンは、キューティクルの保護構造の中に捕捉されたままである。これらのケラチンを抽出するために、変性溶液を使用する第二段階を用いる必要がある。あるいは、還元反応の場合には、これらの段階を組み合わせてもよい。当分野で公知の変性溶液としては、尿素、遷移金属水酸化物、界面活性剤溶液、およびそれらの組合せが挙げられる。好ましい方法は、０．１〜１．０Ｍの間の濃度のトリスの水溶液、および０．１〜１０Ｍの間の尿素溶液を、それぞれ酸化反応および還元反応に使用する。

スキーム１．ケラチンにおけるジスルフィド架橋の（ａ）酸化および（ｂ）還元の全体図。これらの反応は、シスチン残基の硫黄−硫黄結合を切断し、それにより上部構造を破壊し、ケラチンを反応媒質に可溶性にする。結果として得られる画分は、ケラトース（ａ）およびケラテイン（ｂ）である。

酸化処理を用いる場合、得られるケラチンは「ケラトース」と呼ばれる。還元処理を用いる場合、得られるケラチンは「ケラテイン」と呼ばれる（スキーム１を参照）。

ケラチンの粗抽出物は、酸化還元状態にかかわらず、例えば等電沈殿により、さらに「γ」および「α」画分に精製することができる。高分子量ケラチン、すなわち「αケラチン」、（αヘリックス状）は、毛包の微小繊維領域に由来すると考えられ、一般に、分子量は約４０〜８５キロダルトンの範囲である。低分子量ケラチン、すなわち「γケラチン」、（球状）、は、毛包の細胞外マトリックス領域に由来すると考えられ、一般に、分子量は約１０〜１５キロダルトンの範囲である。（Ｃｒｅｗｔｈｅｒ ＷＧ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｋｅｒａｔｉｎｓ，ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９６５；２０：１９１−３４６を参照）。

αケラチンおよびγケラチンは特有の特性を有するにもかかわらず、αケラチンとγケラチンの両方のサブファミリーの特性はさらに高度な精製手段によってしか明らかにすることができない。例えば、ケラチンは、「酸性」タンパク質画分および「塩基性」タンパク質画分に分画することができる。好ましい分画方法は、イオン交換クロマトグラフィーである。これらの画分は、特有の特性、例えば、血液細胞の凝集へのそれらの異なる効果を有する（下の表１を参照。さらに米国特許出願公開第２００６／００５１７３２号を参照）。

本明細書において「ケラチン誘導体」とは、単独で、あるいはその他のケラチン誘導体またはその他の成分と組み合わせた、ケラチン画分、その誘導体または混合物をさし、それには、限定されるものではないが、αケラトース、γケラトース、αケラテイン、γケラテイン、メタケラチン、ケラチン中間径フィラメント、およびそれらの組合せ（本開示を考慮して当業者に明らかなその変形とともに、別段の指定がなければその酸性および塩基性成分を含む）が含まれる。一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、ケラチンの特定の画分または細画分を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。誘導体は、少なくとも８０、９０、９５もしくは９９重量パーセント（またはそれ以上）の該画分または細画分を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になってよい。

一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、酸性αケラトースを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。

一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、αケラトースを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になり、該αケラトースは、少なくとも８０、９０、９５もしくは９９重量パーセント（またはそれ以上）の酸性αケラトースを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になり、かつ、該αケラトースは、多くて２０、１０、５または１重量％（またはそれ未満）の塩基性αケラトースを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。

一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、塩基性αケラトースを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。

一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、αケラトースを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になり、該αケラトースは、少なくとも８０、９０、９５もしくは９９重量パーセント（またはそれ以上）の塩基性αケラトースを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になり、かつ、該αケラトースは、多くて２０、１０、５または１重量％（またはそれ未満）の酸性αケラトースを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。

一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、酸性αケラテインを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。

一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、αケラテインを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になり、該αケラテインは、少なくとも８０、９０、９５もしくは９９重量パーセント（またはそれ以上）の酸性αケラテインを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になり、かつ、該αケラテインは、多くて２０、１０、５または１重量％（またはそれ未満）の塩基性αケラテインを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。

一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、塩基性αケラテインを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。

一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、αケラテインを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になり、該αケラテインは、少なくとも８０、９０、９５もしくは９９重量パーセント（またはそれ以上）の塩基性αケラテインを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になり、かつ、該αケラテインは、多くて２０、１０、５または１重量％（またはそれ未満）の酸性αケラテインを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。

一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、未分画のα＋γ−ケラテインを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、酸性α＋γ−ケラテインを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、塩基性α＋γ−ケラテインを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。

一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、未分画のα＋γ−ケラトースを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、酸性α＋γ−ケラトースを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、塩基性α＋γ−ケラトースを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。

一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、未分画のβ−ケラトース（例えば、キューティクルに由来）を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、塩基性β−ケラトースを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、酸性β−ケラトースを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。

塩基性αケラトースは、好ましくは塩基性αケラトースを酸性および塩基性αケラトースを含む混合物から、例えば、イオン交換クロマトグラフィーで分離することにより製造され、所望によりこの塩基性αケラトースは１０〜１００または２００キロダルトンの平均分子量を有する。より好ましくは、平均分子量は３０または４０〜９０または１００キロダルトンである。所望により、しかし好ましくはこの方法は、該塩基性α−ケラトースを、所望により微量金属と錯体を形成するキレート化剤の存在下、変性溶液および／または緩衝液に再溶解する段階、そして次に、塩基性αケラトースを変性溶液から再沈殿させる段階をさらに含む。組成物が、好ましくは多くて５、２、１、または０．１重量％またはそれ未満の酸性αケラトースを含むことは、当然理解される。

酸性αケラトースは、好ましくは前述の技法とは逆の技法、つまり、酸性αケラトースを酸性および塩基性αケラトースの混合物から、例えばイオン交換クロマトグラフィーにより分離および維持することにより製造され、所望により上記酸性αケラトースは１０〜１００または２００キロダルトンの平均分子量を有する。より好ましくは、平均分子量は３０または４０〜９０または１００キロダルトンである。所望により、しかし好ましくはこの方法は、上記酸性α−ケラトースを、所望により微量金属と錯体を形成するキレート化剤の存在下、変性溶液および／または緩衝液に再溶解する段階、そして次に、塩基性αケラトースを変性溶液から再沈殿させる段階をさらに含む。組成物が、好ましくは多くて５、２、１、または０．１重量％またはそれ未満の塩基性αケラトースを含むことは、当然理解される。

その他のケラトースの塩基性および酸性画分は、塩基性および酸性αケラトースについて上に記載されるような同様の方法で調製することができる。

塩基性αケラテインは、好ましくは塩基性αケラテインを酸性および塩基性αケラテインの混合物から、例えばイオン交換クロマトグラフィーで分離することにより製造され、所望により、この塩基性αケラテインは１０〜１００または２００キロダルトンの平均分子量を有する。所望により、しかし好ましくはこの方法は、該塩基性α−ケラテインを、所望により微量金属と錯体を形成するキレート化剤の存在下、変性溶液および／または緩衝液に再溶解する段階、そして次に、塩基性αケラテインを変性溶液から再沈殿させる段階をさらに含む。組成物が、好ましくは多くて５、２、１、または０．１重量％またはそれ未満の酸性αケラテインを含むことは、当然理解される。

酸性αケラテインは、好ましくは前述の技法とは逆の技法、つまり、酸性αケラテインを酸性および塩基性酸性αケラテインの混合物から、例えばイオン交換クロマトグラフィーにより分離および維持することにより製造され、所望によりこの酸性αケラテインは１０〜１００または２００キロダルトンの平均分子量を有する。より好ましくは、平均分子量は３０または４０〜９０または１００キロダルトンである。所望により、しかし好ましくはこの方法は、上記酸性α−ケラテインを、所望により微量金属と錯体を形成するキレート化剤の存在下、変性溶液および／または緩衝液）に再溶解する段階、そして次に、塩基性αケラテインを変性溶液から再沈殿させる段階をさらに含む。組成物が、好ましくは多くて５、２、１、または０．１重量％またはそれ未満の塩基性αケラテインを含むことは、当然理解される。

その他のケラテインの塩基性および酸性画分は、塩基性および酸性αケラテインについて上に記載されるような同様の方法で調製することができる。

ケラチン材料は、限定されるものではないが、羊毛および人毛を含む、任意の適した源から得られる。一実施形態では、ケラチンは、理髪店および美容院から入手した、末端を切断した人毛から得られる。材料は温水および中性洗剤で洗浄し、乾燥させ、さらに非極性有機溶媒（一般にヘキサンまたはエーテル）で抽出して使用前に残留油を除去する。

ケラトース。ケラトース画分は任意の適した技法により得られる。一実施形態では、それらはアレクサンダーと共同研究者らの方法を用いて得られる（Ｐ．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４６，２７−３２（１９５０））。基本的に、１０パーセント未満の濃度の過酢酸の水溶液と毛とを室温にて２４時間反応させる。溶液を濾過し、α−ケラトース画分を約４のｐＨまで無機酸を添加することにより沈殿させる。α−ケラトースを濾過により分離し、付加的な酸で洗浄し、それに続いてアルコールで脱水し、次いでフリーズドライさせる。純度の増加は、ケラトースを変性溶液、例えば７Ｍ尿素、水酸化アンモニウム水溶液、または２０ｍＭトリス塩基緩衝液（例えば、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基）に再溶解し、再沈殿させ、再溶解し、脱イオン水に対して透析し、そして、ｐＨ４にて再沈殿させることにより実現することができる。

ケラトースを製造するための好ましい方法は、過酸化水素、過酢酸、または過ギ酸での酸化によるものである。最も好ましい酸化剤は、過酢酸である。好ましい濃度範囲は、１〜１０重量／容量パーセント（ｗ／ｖ％）であり、最も好ましいのは約２ｗ／ｖ％である。当業者であれば、濃度をわずかに変更して様々な程度の酸化をもたらすことができ、同時に反応時間、温度および液体対固体比の変更を行ってもよいことを認識する。また、過ギ酸は、過酢酸と比較して、ペプチド結合の切断が最小限であるという利点をもたらすことも、Ｃｒｅｗｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．により考察されている。しかし、過酢酸はコストと利用可能性の点で利点をもたらす。好ましい酸化温度は、０〜１００度の間の摂氏温度（℃）である。最も好ましい酸化温度は３７℃である。好ましい酸化時間は、０．５〜２４時間の間である。最も好ましい酸化時間は１２時間である。好ましい液体対固体比は、５〜１００：１である。最も好ましい比は２０：１である。酸化の後、多量の蒸留水を用いて毛をすすぎ、残留酸化剤を取り除く。

ケラトースは、変性剤の水溶液を用いて酸化した毛から抽出することができる。タンパク質変性剤は当分野で周知であるが、好ましい溶液としては、尿素、遷移金属水酸化物（例えば水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウム）、水酸化アンモニウム、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス塩基）が挙げられる。好ましい溶液は、０．０１〜１Ｍの濃度範囲のＴｒｉｚｍａ（登録商標）塩基（トリス塩基のブランド）である。最も好ましい濃度は０．１Ｍである。当業者であれば、濃度をわずかに変更して様々な程度の酸化をもたらすことができ、同時に反応時間、温度および液体対固体比の変更を行ってもよいことを認識する。好ましい抽出温度は、０〜１００度の間の摂氏温度である。最も好ましい抽出温度は、３７℃である。好ましい抽出時間は、０．５〜２４時間の間である。最も好ましい抽出時間は、３時間である。好ましい液体対固体比は、５〜１００：１である。最も好ましい比は、４０：１である。トリス塩基または脱イオン（ＤＩ）水の希釈溶液を用いて続いて抽出し、さらなる収量を得ることができる。抽出後、遠心分離および／または濾過により残留固体を溶液から除去する。

粗抽出物は、まずその溶液をｐＨ７．０〜７．４の間に中和することにより単離することができる。最も好ましいｐＨは、７．４である。残留変性剤は、ＤＩ水に対する透析により除去する。透析保持液を濃縮した後、凍結乾燥または噴霧乾燥して、γ−およびα−ケラトースの両方の乾燥粉末混合物を得る。
あるいは、溶液のｐＨが約４．２に達するまで酸を１滴ずつ添加することにより、α−ケラトースを抽出溶液から単離する。好ましい酸としては、硫酸、塩酸、および酢酸が挙げられる。最も好ましい酸は濃塩酸である。α画分の沈殿はｐＨ６．０前後で始まり、約４．２になるまで続く。分別沈殿を利用して異なる等電性をもつ異なる範囲のタンパク質を単離することができる。固体α−ケラトースは、遠心分離または濾過により回収することができる。

αケラトースは、変性溶液に固体を再溶解することによりさらに精製することができる。抽出に利用したものと同じ変性溶液を用いてよいが、好ましい変性溶液はトリス塩基である。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を加えて、毛の中に見出された微量金属を錯化させ、除去することができる。好ましい変性溶液は、２０ｍＭトリス塩基と２０ｍＭ ＥＤＴＡまたはＤＩ水と２０ｍＭ ＥＤＴＡである。微量金属の存在が意図される用途に有害でない場合、ＥＤＴＡを除外してもよい。約４．２の最終ｐＨまで塩酸を１滴ずつ添加することにより、α−ケラトースをこの溶液からを再沈殿させる。固体の単離は、遠心分離または濾過による。このプロセスを数回繰り返して、α−ケラトースをさらに精製してもよい。

γケラトース画分は、ｐＨ４で溶液中に残り、これを、アルコールなどの水混和性有機溶媒に添加し、続いて濾過することにより単離し、付加的なアルコールで脱水し、フリーズドライさせる。純度の増加は、ケラトースを変性溶液、例えば７Ｍ尿素、水酸化アンモニウム水溶液、または２０ｍＭトリス塩基緩衝液に再溶解し、無機酸の添加によりｐＨを４に低下させ、生じる固体を除去し、上清を中和し、アルコールでタンパク質を再沈殿させ、再溶解し、脱イオン水に対して透析し、そして、アルコールに添加することにより再沈殿させることによって実現することができる。これらの段階で消費されるアルコールの量は、最初に蒸留によってケラトース溶液を濃縮することにより、最小限にすることができる。

αケラトースの除去後、典型的な抽出溶液からのγケラトースの濃度は約１〜２％である。γケラトース画分は、水混和性非溶媒に添加することにより単離することができる。沈殿を生じさせるために、過剰な水を蒸発させることによりγ−ケラトース溶液を濃縮してよい。この溶液は、９０％の水を除去することにより、約１０〜２０％に濃縮することができる。これは、真空蒸留を用いて、または流下膜式蒸発によって行うことができる。濃縮後、γ−ケラトース溶液を、過剰な冷非溶媒に１滴ずつ添加する。適した非溶媒としては、エタノール、メタノール、アセトンなどが挙げられる。最も好ましい非溶媒は、エタノールである。最も好ましい方法は、γケラトース溶液を約１０ｗ／ｖ％タンパク質に濃縮し、それを８倍過剰の冷エタノールに１滴ずつ添加する方法である。沈殿したγケラトースは、遠心分離または濾過によって単離し、乾燥させてよい。適した乾燥のための方法としては、フリーズドライ（凍結乾燥）、空気乾燥、真空乾燥、または噴霧乾燥が挙げられる。最も好ましい方法は、フリーズドライである。

ケラテイン。ケラテイン画分は、Ｂｒａｄｂｕｒｙ ａｎｄ Ｃｈａｐｍａｎによる方法（Ｊ．Ｂｒａｄｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１７，９６０−７２（１９６４））およびＧｏｄｄａｒｄ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌｉｓによる方法（Ｄ．Ｇｏｄｄａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１０６，６０５−１４（１９３４））の組合せを用いて得ることができる。基本的に、過剰な加水分解を避け、第２段階で皮質のジスルフィド結合を効率よく還元するために毛繊維のキューティクルを超音波によって除去する。毛をジクロロ酢酸の溶液に入れ、超音波プローブでの処理に供した。この方法のさらなる改良により、８０％ジクロロ酢酸、固体対液体比１：１６、および１８０ワットの超音波出力を用いる条件が最適であることが示されている（Ｈ．Ａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｎ’ｉ Ｇａｋｋａｉｓｈｉ ３１（３），Ｔ８１−８５（１９７５））。固体断片を濾過により溶液から除去し、すすぎ、空気乾燥させ、その後篩いにかけて、取り除いたキューティクル細胞から毛繊維を単離する。

一部の実施形態では、キューティクルの超音波除去の後、剥皮された繊維とメルカプトエタノールの反応によりα−およびγケラテインを得る。具体的には、低加水分解法を酸性ｐＨで用いる（Ｅ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１５，７５７−６８（１９６２））。典型的な反応では、０．０２Ｍ酢酸緩衝液および０．００１Ｍ界面活性剤を含有する脱酸素水中に少量の水酸化カリウムを添加することによって既にｐＨ５に調整された４Ｍメルカプトエタノールで、２４時間毛を抽出する。

溶液を濾過し、約４のｐＨまで無機酸を添加することによりαケラテイン画分を沈殿させる。αケラテインを濾過により分離し、付加的な酸で洗浄し、それに続いてアルコールで脱水し、次いで真空乾燥させる。純度の増加は、ケラテインを変性溶液、例えば７Ｍ尿素、水酸化アンモニウム水溶液、または２０ｍＭトリス塩基緩衝液に再溶解し、再沈殿させ、再溶解し、脱イオン水に対して透析し、そして、ｐＨ４にて再沈殿させることにより実現することができる。

γケラテイン画分は、ｐＨ４で溶液中に残り、これを、アルコールなどの水混和性有機溶媒に添加し、続いて濾過することにより単離し、付加的なアルコールで脱水し、真空乾燥させる。純度の増加は、ケラテインを変性溶液、例えば７Ｍ尿素、水酸化アンモニウム水溶液、または２０ｍＭトリス塩基緩衝液に再溶解し、無機酸の添加によりｐＨを４に低下させ、生じる固体を除去し、上清を中和し、アルコールでタンパク質を再沈殿させ、再溶解し、脱イオン水に対して透析し、そして、アルコールに添加することにより再沈殿させることによって実現することができる。これらの段階で消費されるアルコールの量は、最初に蒸留によってケラチン溶液を濃縮することにより、最小限にすることができる。

代替法では、ケラテイン画分は、毛とチオグリコール酸ナトリウム水溶液を反応させることによって得られる。

ケラテインの製造のための好ましい方法は、毛をチオグリコール酸またはβメルカプトエタノールで還元することによる。最も好ましい還元剤は、チオグリコール酸（ＴＧＡ）である。好ましい濃度は、１〜１０Ｍの範囲であり、約１．０Ｍが最も好ましい。当業者であれば、濃度をわずかに変更して様々な程度の還元をもたらすことができ、同時にｐＨ、反応時間、温度および液体対固体比の変更を行ってもよいことを認識する。好ましいｐＨは、９〜１１の間である。最も好ましいｐＨは、１０．２である。還元溶液のｐＨは、塩基を付加することにより変更される。好ましい塩基としては、遷移金属水酸化物、水酸化ナトリウム、および水酸化アンモニウムが挙げられる。最も好ましい塩基は、水酸化ナトリウムである。ｐＨ調整は、水中の水酸化ナトリウムの飽和溶液を還元剤溶液に１滴ずつ添加することによって達成される。好ましい還元温度は、０〜１００℃の間である。最も好ましい還元温度は３７℃である。好ましい還元時間は、０．５〜２４時間である。最も好ましい還元時間は１２時間である。好ましい液体対固体比は、５〜１００：１である。最も好ましい比は、２０：１である。前に説明した酸化反応とは異なり、還元は塩基性ｐＨで行う。そういうわけで、ケラチンは還元媒質に高溶解性であり、抽出されると予期される。そのため、還元溶液をその後の抽出溶液と混合し、適宜に処理する。

還元ケラチンは、その対応する酸化物ほど親水性でない。そのため、還元毛繊維は、酸化した毛がそうなるように膨潤したり、割けて開いたりせず、その結果、比較的収率が低くなる。還元／抽出プロセスの動態に影響を及ぼすもう一つの因子は、ケラテインの相対溶解度である。水への相対溶解度順位は、溶解性の高いものから低いものまで、γ−ケラトース＞α−ケラトース＞γ−ケラテイン＞α−ケラテインである。結果的に、還元毛繊維からの抽出収率はそれほど高くない。そういう状況であるので、その後の抽出は付加的な還元剤に変性剤溶液を加えて行う。その後の抽出に好ましい溶液としては、ＴＧＡ＋尿素、ＴＧＡ＋トリス塩基、またはＴＧＡ＋水酸化ナトリウムが挙げられる。抽出後、ケラトースについて説明した手順を用いて、α−およびγ−ケラテインの粗画分を単離することができる。しかし、γ−およびα−ケラテインの沈殿は、酸素に暴露されるとそのシスチン架橋を再形成する。そのために、精製段階中に溶け難くなることを回避するために沈殿を瞬時に再溶解するか、酸素の不在下で沈殿させる。

残留還元剤および変性剤は、透析によって溶液から除去することができる。典型的な透析条件は、２４〜７２時間、ＤＩ水に対して透析される、ケラテインの１〜２％溶液である。当業者であれば、透析に加えて、その他の低分子量混入物質を除去するための方法が存在することを理解する（例えば、精密濾過法、クロマトグラフィー、および同類のもの）。トリス塩基の使用は、ケラテインの最初の可溶化にのみ必要である。ひとたび溶解すると、ケラテインは変性剤がなくとも溶液中で安定している。そのため、ｐＨが中性またはそれを上回ったままである限り、ケラテインの沈殿を結果として生じることなく、変性剤を除去することができる。これらの精製溶液中のケラテインの終濃度は、水の添加／除去により調整することができる。

ケラチンの形態（すなわち、ケラトースまたはケラテイン）に関わらず、さらなる精製に向けてのいくつかの異なるアプローチをケラチン溶液に対して用いることができる。しかし、ケラチンの特有の溶解特性に役立つ技法を選択するように注意しなければならない。最も単純な分離法の１つは、等電沈殿法である。この方法では、溶液のｐＨを調整し、沈殿した材料を除去することにより、等電点の異なるタンパク質を単離することができる。ケラチンの場合、γ−形態とα−形態の両方が、ｐＨ＞６．０で可溶性である。しかし、ｐＨが６より下に低下すると、α−ケラチンは沈殿し始める。所定のｐＨで沈殿を停止させ、遠心分離および／または濾過によりその沈殿を分離することによりケラチン画分を単離することができる。約４．２のｐＨでは、本質的にすべてのα−ケラチンは沈殿している。これらの別個の画分を中性ｐＨの水に再び溶解し、透析し、濃縮し、凍結乾燥または噴霧乾燥によって粉末にすることができる。しかし、ケラテイン画分は、架橋を回避するために、酸素不在下または希釈液中で保存しなければならない。

ケラチンを分離するためのもう１つの一般的な方法は、クロマトグラフィーである。サイズ排除もしくはゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、等電点電気泳動、ゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィーおよびイムノアフィニティークロマトグラフィーを含む、数種類のクロマトグラフィーを用いて、ケラチン溶液を分画することができる。これらの技法は当分野で周知であり、かつ、分子量、化学官能性、等電点、電荷または特異的抗体との相互作用の特徴によってタンパク質を含む化合物を分離することができ、かつ、単独で、または任意の組合せで、高度の分離および得られる純度をもたらすことができる。

好ましい精製方法は、イオン交換（ＩＥｘ）クロマトグラフィーである。ＩＥｘクロマトグラフィーは、一般にはタンパク質、特にケラチンの両親媒性によるタンパク質分離に特に適している。溶液の出発ｐＨ、および保持する予定の所望画分によって、カチオン性ＩＥｘまたはアニオン性ＩＥｘ（それぞれ、ＣＩＥｘまたはＡＩＥｘ）のいずれかの技術を用いることができる。例えば、６以上のｐＨでは、γ−ケラチンとα−ケラチンの両方が可溶性であり、それらの等電点より上である。そのため、それらはアニオン性であり、アニオン交換樹脂に結合させることができる。しかし、ケラチンの細画分は、弱アニオン交換樹脂に結合せず、それどころか、かかる樹脂が充填されたカラムを通過することが見出された。ＡＩＥｘクロマトグラフィーに好ましい溶液は、０〜５重量／容量％の間の濃度の精製水中の、既に記載されるように単離された精製または分画ケラチンである。好ましい濃度は、０〜４ｗ／ｖ％の間である。最も好ましい濃度は、約２ｗ／ｖ％である。ＡＩＥｘカラムへの結合を促進するために、該溶液のイオン強度を最初は非常に低く保つことが好ましい。これは、最少の量の酸を用いてケラチンの精製水溶液をｐＨ６〜７の間に滴定することによって達成される。最も好ましいｐＨは６である。この溶液は、ＡＩＥｘカラム、例えば、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂またはＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂カラムに負荷することができる。好ましいカラム樹脂は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂である。カラムを通過する溶液を回収し、既に記載されたようにさらに処理して、酸性ケラチン粉末の画分を単離することができる。

一部の実施形態では、ケラチンを製造するためにＡＩＥｘカラムを使用することによってケラチンマトリックスの活性を強化し、それにより細胞接着を促進する。特定の理論に縛られることを望むものではないが、アニオンカラムを通過する画分、すなわち、酸性ケラチンは、細胞付着を促進すると想定される。

もう一つの画分は、容易に結合し、当分野で公知の塩析技術を用いてカラムから洗い出すことができる。好ましい溶離媒質は、塩化ナトリウム溶液である。好ましい塩化ナトリウム濃度は、０．１〜２Ｍの間である。最も好ましい濃度は、２Ｍである。この溶液のｐＨは、６〜１２の間であることが好ましい。最も好ましいｐＨは、１２である。溶離プロセス中、安定なｐＨを維持するために、緩衝塩を添加してもよい。好ましい緩衝塩は、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基である。当業者であれば、塩濃度およびｐＨをわずかに変更して様々な特性をもつケラチン画分の溶離をもたらすことができることを認識する。異なる画分を生じるために、異なる塩濃度およびｐＨを順次使用すること、または塩および／またはｐＨ勾配を使用することも可能である。しかし、採用するアプローチに関わらず、カラム溶離剤を回収し、既に記載されたようにさらに処理して、塩基性ケラチン粉末の画分を単離することができる。

ＣＩＥｘ技術を用いることにより、補完的な（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）手順も実行可能である。つまり、ケラチン溶液をカチオン交換樹脂、例えば、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂（強カチオン性）またはＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂（弱カチオン性）に添加し、塩基性画分を通過させて回収することができる。保持された酸ケラチン画分は、既に記載されたように塩析によって単離することができる。

メタケラチン。メタケラチンは、実質的に同じ手順を用いてケラテインのα画分とγ画分の両方から合成する。基本的に、ケラテインを変性溶液、例えば７Ｍ尿素、水酸化アンモニウム水溶液、または２０ｍＭトリス緩衝液に溶解する。純粋な酸素で溶液をバブリングして、システイン基の酸化カップリング反応を開始させる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて測定される分子量の増加により反応の進行をモニターする。２倍増または３倍増の分子量に達するまで反応溶液を酸素で継続的にバブリングする。無機酸の添加により、変性溶液のｐＨを中性に調整して、タンパク質の加水分解を回避してよい。

ケラチン中間径フィラメント。人毛繊維のＩＦは、Ｔｈｏｍａｓおよび共同研究者の方法を用いて得られる（Ｈ．Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．８，２５８−６４（１９８６））。これは本質的に、ＩＦを適所に「接着する」のに役立つケラチンマトリックスを反応させて除去し、それによりＩＦを後に残す、化学エッチング法である。典型的な抽出プロセスでは、キューティクルの膨潤および基質タンパク質の亜硫酸分解は、０．２Ｍ Ｎａ_２ＳＯ_３、８Ｍ尿素中０．１Ｍ Ｎａ_２Ｏ_６Ｓ_４、およびｐＨ９の０．１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液を使用することにより達成される。抽出は室温にて２４時間進行する。濃縮後、溶解したマトリックスケラチンおよびＩＦを、酢酸亜鉛溶液を約６のｐＨまで添加することにより沈殿させる。次に、０．０５Ｍ四ホウ酸塩溶液に対して透析することにより、ＩＦをマトリックスケラチンから分離する。純度の増加は、透析した溶液を酢酸亜鉛で沈殿させ、ＩＦをクエン酸ナトリウムに再溶解し、蒸留水に対して透析し、次いでサンプルをフリーズドライすることにより得ることができる。

ケラチン調製品のさらなる考察は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００６／００５１７３２号（Ｖａｎ Ｄｙｋｅ）に見出すことができる。

組成物および製剤。乾燥粉末は、フリーズドライ（凍結乾燥）などの公知の技法に従って、上記のようなケラチン誘導体から形成することができる。一部の実施形態では、本発明の組成物は、該ケラチン誘導体が可溶化されている電解質溶液を含む組成物を製造するため、そのような乾燥粉末組成物形態と水溶液を混合して製造され得る。混合段階は任意の適した温度、一般に室温で実行されてよく、さらに、任意の適した技法、例えば攪拌、振盪、かき混ぜなどにより実行されてよい。電解質溶液の塩およびその他の構成成分（例えば、ケラチン誘導体と水を除く全ての成分）は、完全に乾燥粉末中に含まれていてもよいし、完全に水性組成物の中に含まれていてもよいし、または乾燥粉末と水性組成物の間に分布していてもよい。例えば、一部の実施形態では、電解質溶液の少なくとも一部の構成要素は乾燥粉末に含まれている。

上に記載されるものなどのケラチン材料を含むマトリックスの形成は、当業者には明らかな、当分野で長く確立された技法またはその変形形態に従って行うことができる。一部の実施形態では、ケラチン調製物は乾燥され、使用前に再水和される。例えば、Ｌｕｓｔｉｇ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第２，４１３，９８３号、Ｓｃｈｏｌｌｋｉｐｆ ｅｔ ａｌ．に対する同第２，２３６，９２１号、およびＡｎｋｅｒに対する同第３，４６４，８２５号を参照されたい。好ましい実施形態では、マトリックス、またはヒドロゲルは、凍結乾燥材料の適した溶媒、例えば水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）での再水和により形成される。ゲルは、例えば、Ｃｏ６０源を用いるγ線照射（８００ｋｒａｄ）により、滅菌することができる。ケラチンマトリックスを形成するその他の適した方法としては、限定されるものではないが、米国特許第６，２７０，７９３号（Ｖａｎ Ｄｙｋｅ ｅｔ ａｌ．）、同第６，２７４，１５５号（Ｖａｎ Ｄｙｋｅ ｅｔ ａｌ．）、同第６，３１６，５９８号（Ｖａｎ Ｄｙｋｅ ｅｔ ａｌ．）、同第６，４６１，６２８号（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．）、同第６，５４４，５４８号（Ｓｉｌｌｅｒ− Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、および同第７，０１，９８７号（Ｖａｎ Ｄｙｋｅ）に見出されるものが挙げられる。

一部の組成物実施形態では、ケラチン誘導体（特にαおよび／またはγケラテインならびにαおよび／またはγケラトース）は、約１０〜７０または８５または１００キロダルトンの平均分子量を有する。その他のケラチン誘導体、特にメタケラチンは、それよりも大きい平均分子量、例えば、２００または３００キロダルトンまでを有し得る。一般に、ケラチン誘導体（この用語は、誘導体の組合せを含む）は、約０．１、０．５または１重量％から、３、４、５、または１０重量％までの量で組成物に含めることができる。組成物は、混合した場合、約１または１．５〜４、８、１０または２０センチポイズの粘度を有することが好ましい。どのような濃度の粘度も、α対γケラトースの比を変えることにより調節することができる。

ケラチン誘導体組成物または製剤は、増殖または治癒を促進する、疼痛の軽減をもたらす、細菌などの微生物の増殖を阻害する、血液凝固を促進または阻害する、細胞もしくは組織接着を促進または阻害するなどのために、所望により、１以上の有効成分、例えば１以上の増殖因子、鎮痛薬、抗菌剤、付加的な血液凝固薬などを（例えば、ケラチン誘導体（１または複数）を含む組成物の０．００００００１〜１または５重量％の範囲の量で）含んでよい。適した増殖因子の例としては、限定されるものではないが、神経成長因子、血管内皮増殖因子、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子、テストステロン、ガングリオシドＧＭ−１、カタラーゼ、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子ガレクチン−１、およびそれらの組合せが挙げられる。例えば、Ｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第６，５０６，７２７号およびＨｏｒｉｅ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第６，８９０，５３１号を参照されたい。

本明細書において、「増殖因子」には、組織の再生、増殖および生存を促進する分子が含まれる。本発明の一部の実施形態で用いられる増殖因子は、ケラチン抽出物中に天然に見出されるものであってもよいし、あるいは、ケラチン抽出物に付加された、またはケラチンマトリックスを形成した、添加剤の形態であってもよい。増殖因子の例としては、限定されるものではないが、神経成長因子（ＮＧＦ）およびその他のニューロトロフィン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ９）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ２）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、および、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が挙げられる。増殖因子の大きなファミリーを構成する、構造的かつ進化的に関連するタンパク質は多くあり、多数の増殖因子ファミリー、例えば、ニューロトロフィン（ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、および、ＮＴ３）がある。ニューロトロフィンは、とりわけ、神経組織の増殖および生存を促進する分子のファミリーである。ニューロトロフィンの例としては、限定されるものではないが、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、および、ニューロトロフィン４（ＮＴ−４）が挙げられる。Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊｒ． ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第５，８４３，９１４号、Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．に対する同第５，４８８，０９９号、Ｂａｒｄｅ ｅｔ ａｌ．に対する同第５，４３８，１２１号、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．に対する同第５，２３５，０４３号、および、Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．に対する同第６，００５，０８１号を参照されたい。

例えば、増殖因子は、様々な組織の再生、増殖および生存を促進するために効果的な量でケラチンマトリックス組成物に加えることができる。増殖因子は、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で提供される。より好ましくは、増殖因子は、１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、最も好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で提供される。Ｕｒｓｏに対する米国特許第６，０６３，７５７号を参照されたい。

組成物は好ましくは無菌であり、かつ非発熱性である。組成物は、予成形され、適した容器、例えば柔軟なポリマー製のバッグもしくはボトル、または箔容器に無菌包装されて提供されてもよいし、あるいは、使用直前に混合するための、１つの容器中の滅菌乾燥粉末と、別の容器中の滅菌水溶液のキットとして提供されてもよい。予成形され、滅菌容器に包装されて提供される場合、組成物は、実質的な粘度の喪失（例えば、１０または２０パーセントを上回る）および／またはケラチン誘導体の実質的な沈殿（例えば、目視検査で検出可能な沈降）の前に、好ましくは室温にて少なくとも４または６ヶ月（多くて２または３年あるいはそれ以上）の有効期間を有する。キットには単一の単位用量の活性ケラチン誘導体を含めてよい。単一の単位用量は、その意図する使用に応じて、０．１または０．５または１〜１００または２００または３００グラムのケラチン誘導体であってよく、またはそれよりも多くてもよい。

本開示のケラチン調製品と同様に利用することのできる天然ポリマーのその他の例としては、限定されるものではないが、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブリン、ムチン、エラスチン、ナイドジェン（エンタクチン）、プロテオグリカンなどが挙げられる。（例えば、Ｋａｔｓｕｅｎ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第５，６９１，２０３号を参照）。

ケラチンバイオマテリアルを含有する、凝固組成物および出血を制御するための方法。本発明の一態様は、創傷出血に苦しむ被験体において出血を治療するための方法であり、ケラチン誘導体を出血を治療するために有効な量で創傷出血に適用することを含む。一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、上に記載されるものなどのケラテイン、αケラテイン、γケラテイン、酸性αケラテイン、塩基性αケラテイン、またはその組合せを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。出血は、例えば、短時間の多量の大量出血を生じる重度の外傷に関連するものであってよく、それには、限定されるものではないが、外科手術、刺創および銃創などの穿通性外傷、自動車による外傷、ならびに大量出血の部位に近づく明確な手段があるまたはない、頭部、頚部、胸部および腹部の大量出血が含まれる。

多くの異なる組成物が、限定されるものではないが、ケラチン誘導体をはじめとする止血剤を含み得る。止血剤のその他の例としては、限定されるものではないが、フィブリンまたはフィブリノゲン、トロンビン、第ＸＩＩＩ因子、カルシウム、キトサン（脱アセチル化したポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン）、ゼオライト（ケイ素、アルミニウム、ナトリウム、マグネシウム、および石英の酸化物）、キチン（アセチル化ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン）、ウシ凝固因子、非ゼオライト鉱物（例えば、疎水性ポリマーおよびカリウム塩）、および植物源由来のモレキュラーシーブ材料（例えば、ＴｒａｕｍａＤＥＸ（商標）、Ａｒｉｓｔａ（商標）ＡＨなど、Ｍｅｄａｆｏｒ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を含むものが挙げられる。しかし、これらの止血剤が全て、あらゆる種類の出血の治療に勧められるとは限らず、当業者は本開示の組成物および方法で用いる止血剤を適宜選択しなくてはならないことに注意すべきである。例えば、ゼオライトは外用のみを対象とする。

本発明の一部の実施形態では、ケラチン誘導体を含有するゲルが使用される。これらの実施形態のゲルは組織に付着し、親水性である。一部の実施形態では、創傷の出血面の上に置くと、ゲルは、たとえ活動性の出血があっても、十分に付着して洗い落とすことができない。一部の実施形態では、ゲルは血液から液体を吸収し、さらに一層付着するようになる（例えば、投与後数分以内に）。血液を伴う一部の実施形態のゲルの接触は、おそらく血小板の活性化および／または凝固因子の濃度によって、血栓形成を引き起こし得る。また、特定の理論に縛られることを望むものではないが、一部の実施形態の付着ゲルは、創傷部位に物理的なシールを形成することができ、凝血によく似た、細胞浸潤および肉芽様組織形成のための多孔質スキャフォールドをもたらすと考えられる。

一部の実施形態では、ケラチン組成物は直接出血部位に適用される。一部の実施形態では、ケラチン組成物は、例えば、大量出血の部位への明確な接近手段がない場合に、被験体の身体に注射されて出血の内部部位を治療する。

ケラチンバイオマテリアルを含有する創傷治癒組成物および創傷治癒を促進する方法。本発明の態様は、創傷を治療するために有効な量で創傷にケラチン誘導体を局所適用することを含む、治療を必要とする被験体において、創傷（例えば、熱傷、擦過傷、裂傷、切開、褥瘡、穿刺創、貫通創、銃創、圧挫損傷など）を治療する方法である。一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、上に記載されるものなどの、ケラトース、αケラトース、γケラトース、酸性αケラトース、酸性γケラトース、塩基性αケラトース、塩基性γケラトース、ケラテイン、αケラテイン、γケラテイン、酸性αケラテイン、酸性γケラテイン、塩基性αケラテイン、塩基性γケラテインなど、またはその組合せを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。

ケラチン誘導体は、乾燥粉末製剤として局所適用することができ、または、一部の実施形態では、水性担体中で（例えば、ゲルの形態で）適用することができる。一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、軟膏（乳濁液中の油の量が水の量を上回る油中水調製物）中に提供されてもよいし、クリーム（乳濁液中の水の量が油の量に等しいかそれを上回る水中油調製物）中に提供されてもよい。一部の実施形態では、ケラチン誘導体は、損傷の内部部位に達するように皮膚の下に注射される。

本明細書に記載される方法および組成物で処理される「被験体」（または「患者」）には、ヒト被験体と獣医学目的の動物被験体（特に、イヌ、ネコ、ウマ、サルなどのその他の哺乳類被験体）の両方が含まれる。ヒト被験体が特に好ましい。被験体は雄性であっても雌性であってもよく、新生児、乳児、年少児、青少年、成人、および高齢者被験体を含む、あらゆる年齢であってよい。

本発明で治療することのできる創傷の例には、熱傷創が含まれる。熱創傷は、熱、化学物質、日光、電気、放射線などに起因する組織損傷である。熱に原因する熱傷（または温熱熱傷）が、最も一般的である。化学熱傷は温熱熱傷に似ている。熱傷創は皮膚に生じる傾向が最も多いが、その他の身体構造が罹患する可能性もある。例えば、重度の熱傷は脂肪、筋肉または骨まで浸潤する可能性がある。

創傷は、損傷の深さで特徴付けられる場合が多い。例えば、熱傷の程度は、損傷した組織の深さによって、Ｉ度、ＩＩ度またはＩＩＩ度として特徴付けられる。Ｉ度の熱傷では、皮膚の上層（表皮）のみが損傷している。ＩＩ度の熱傷では、皮膚の中層（真皮）が損傷している。最後に、最も重度な種類のＩＩＩ度の熱傷では、損傷は皮膚の内（脂肪）層に影響を及ぼすのに十分深い。同様に、皮膚の褥瘡は、ステージＩ（皮膚が赤く、損傷はない、徐圧しても紅斑が薄くならない）、ステージＩＩ（表皮が損傷され、多くの場合真皮への浸潤を伴う）、ステージＩＩＩ（真皮の損傷）、およびステージＩＶ（皮下組織が露出）として特徴づけられる。

褥瘡創傷では、圧迫によって生じる局所毛細血管の収縮の結果、罹患した皮膚に虚血が生じる。同様に、熱傷創は関連する毛細血管の血栓症に起因する虚血である。糖尿病性潰瘍が、灌流不全の創傷のもう一つの例である。血液が容易に利用できず正常な過程の創傷治癒に役立たないこれらの種類の創傷に関して、一部の実施形態では、創傷部位に物理的なシールを提供するためだけでなく、凝血によく似た、細胞浸潤および肉芽様組織形成のための多孔質スキャフォールドをもたらすために、ケラチン誘導体を含有する組成物が有用である。

創傷は、最初の侵襲の後に組織損傷範囲が大きくなるという点で、進化する損傷であり得る。例えば、熱傷創は、一般に、３つのゾーン、壊死のゾーン、損傷のゾーン、および充血のゾーン、に特徴付けられる、進化する損傷であり得る。壊死のゾーンは、外部からの侵襲（例えば、熱または化学的侵襲）を直接受ける範囲であり、不可逆的に損傷した組織を含む。損傷のゾーンは、壊死のゾーンの末梢であって、壊死のゾーンの下位にある。組織は初めは生存可能であるが、脆弱である。典型的な熱傷では、壊死のゾーンの範囲は、損傷のゾーンの組織が損傷してゆくにつれて増加する。用語「創傷変化」は、損傷のゾーンが壊死のゾーンに達し、全体的な創傷の範囲が増加するプロセスを表す。例えば、Ｄａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第５，５８３，１２６号を参照されたい。充血のゾーンは、損傷のゾーンの末梢であって、損傷のゾーンの下位にある。それは細胞損傷は最小限であるが、血管が拡張している。

特定の理論に縛られることを望むものではないが、本明細書に開示されるケラチン誘導体は、創傷変化に起因する創傷の増大を抑制する（例えば、治療を行う、かつ／または治療を行わない、組織損傷の重症度を観察することにより決定される経時的な損傷範囲により測定される）のみならず、創傷治癒を促進、かつ／または加速もする（例えば、測定された創傷範囲は治療とともに経時的により速い速度で減少する、創傷は治療によってより速い速度で治癒されたとみなされる、など）と考えられる。表在性創傷および中間層（ｐａｒｔｉａｌ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）創傷に関する通常の治癒の経過は、軽度の収縮を伴うまたは伴わずに、創傷の表面の既存の基底細胞から上皮が再生することによる。深い創傷は、上皮の再生と収縮の組合せによって治癒する。収縮は創傷の範囲を小さくするのに役立ち、上皮は創傷の周縁部から生成する。

一部の実施形態では、ケラチンバイオマテリアルは、線維芽細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）および／またはケラチノサイト（例えば、上皮ケラチノサイト）の増殖を強化することによって創傷治癒を促進する際に有用である。例えば、Ｂａｅｔｇｅ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第６，６７３，６０３号およびＨｅｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第５，８４０，３０９号を参照されたい。特定の理論に縛られることを望むものではないが、線維芽細胞および／またはケラチノサイトの増殖の強化は、ケラチン調製品の中に天然に見出される増殖因子により促進されると考えられる。

一部の種類の創傷では、治療は出血の制御を含む。例として、擦過傷、裂傷、切開、貫通創、および圧挫損傷などは出血を伴う場合が多い。圧挫損傷は、例えば、開放創（すなわち、皮膚が裂け、組織が環境に露出している場合）、または閉鎖創（すなわち、皮膚は無傷であるが、その下にある組織が損傷している場合）を含み得る。

擦過創は、皮膚の表皮が剥がれ落ちた表在性の創傷である。擦過創は、例えば、粗い表面の上に転落することにより引き起こされ得る。裂傷は一般に、例えば、硬組織（例えば、骨）の上にある軟組織（例えば、皮膚）への鈍い衝撃により引き起こされる、または、軟組織の断裂（例えば、出産に関連する裂傷）を伴う、不規則な創傷である。裂傷は一般に架橋を示し、そこでは結合組織および／または血管は、その下にある硬組織の表面に対して平らになっている。時には、鋭い物体により引き起こされる損傷も裂傷と呼ばれる。鋭い物体により引き起こされた損傷の場合、結合組織および血管が切断されるので、通常、架橋は存在しない。

切開または切創は通常、清潔な鋭い刃の物体により引き起こされる。表在性の切開（表皮のみを伴う）は、一般に「切り傷（ｃｕｔ）」と呼ばれる。切開は、ナイフ、剃刀、ガラスの破片などにより引き起こされ得るか、または、外科手術またはその他の医療処置中にメスにより引き起こされ得る。貫通創は、身体に侵入する物体（例えば、ナイフ）により引き起こされる。穿刺創は、皮膚を穿通する物体、例えば針または釘により引き起こされる。銃創は、身体に入り、中を通り、時には通り抜ける弾丸により引き起こされる。

創傷損傷は、感染のリスクを有する。一部の実施形態では、創傷治癒組成物には、抗菌剤が含まれる。局所適用することのできる抗菌剤の例としては、限定されるものではないが、バシトラシン（例えば、４００〜５００Ｕ／ｇの軟膏）、硫酸ポリミキシンＢ（例えば、５，０００または１０，０００Ｕ／ｇの軟膏）、ネオマイシン（例えば、３．５ｍｇ／ｇの軟膏）、Ｐｏｌｙｓｐｏｒｉｎ（登録商標）抗生物質（軟膏基剤中の硫酸ポリミキシンＢおよびバシトラシンの混合）、Ｎｅｏｓｐｏｒｉｎ（登録商標）抗生物質（軟膏基剤中のネオマイシン、バシトラシンおよび硫酸ポリミキシンＢの混合）、ポビドンヨード、スルファジアジン銀（例えば、１％のクリーム）、酢酸マフェニド（例えば、０．５％クリームとしての、局所用メチル化スルホンアミド化合物）、ナイスタチン（殺真菌薬）、ニトロフラゾン（例えば、０．２％）およびゲンタマイシン（例えば、０．１％のクリーム）が挙げられる。抗菌溶液としては、これに限定されるものではないが、酢酸（例えば、０．５％または０．２５％）、次亜塩素酸ナトリウム（デーキン液、例えば、０．５％または０．２５％ ＮａＯＣｌ）、硝酸銀（例えば、０．５％）、およびグルコン酸クロルヘキシジン（例えば、０．５％）が挙げられる。一部の実施形態では、創傷治癒組成物には付加的な創傷治癒成分が含まれる。一部の抗菌剤は、殺菌剤または殺真菌薬などとしての効果とは別の機構によって、創傷治癒も促進すると考えられる。例えば、米国において最も慣用されている熱傷の局所治療薬である、スルファジアジン銀は、この二重効果を有するという証拠がある（Ｗａｒｄ ＲＳ ａｎｄ Ｓａｆｆｌｅ Ｊｒ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ １９９５；７５（６）５２６−３８）。

一部の実施形態では、創傷治癒組成物には、疼痛緩和のための鎮痛薬または麻酔薬、界面活性剤、抗炎症薬などが含まれる。例えば、Ｍｉｌｌｅｒに対する米国特許第６，５６２，３２６号を参照されたい。

本明細書に開示されるケラチン組成物は、出血の制御と創傷治癒の促進の両方において有用である。この組成物は開放創と閉鎖創の両方に有用である。閉鎖創の場合、ケラチンは、例えば、シリンジでの注射により、または加圧キャニスタから、創傷部位に適用することができる。鈍的外傷の場合、ケラチン組成物は、例えば、腹部内に皮膚を通じて内出血の部位へ注入することができる。しかし、当業者の理解するように、組織腫脹を考慮して過膨張および起こり得る組織および／または器官の損傷を避けるようにしなければならない。腫脹を軽減する方法、例えば低温（例えば、冷水、氷など）での治療および罹患部位の拳上も用いてよい。

創傷に適用されるケラチン材料の用量は、被っている特定の創傷、被験体の年齢および全体の状態、投与経路などによって決まり、既知の技法に従って最適化することができる。一部の実施形態では、投薬量は、その意図される使用に応じて、ケラチン誘導体の０．１または０．５または１から１００または２００または３００グラム、またはそれ以上（例えば、粉末でまたは水性担体中で）である。一部の実施形態では、ケラチンは０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬ、または０．０１〜５ｍｇ／ｍＬの濃度で提供される。一部の実施形態では、ケラチンは、０．１％〜８０％（ｗ／ｖ）、または１％〜５０％（ｗ／ｖ）、または５％〜３０％（ｗ／ｖ）の濃度で提供される。

一部の実施形態では、創傷は、ゲル、クリームまたは軟膏の形態のケラチン調製物の適用により治療される。創傷（Ｔｈｅ ｗｏｕｌｄ）はまた、ケラチン（および所望によりその他の添加剤）が一般にその粉末形態で水性担体（例えば、蒸留水または生理食塩水）に添加され、包帯材（例えば、ガーゼ）をその水性調製物に浸漬し、創傷の上に置く、「湿潤（ｗｅｔ−ｔｏ−ｍｏｉｓｔ）」包帯法により治療されてもよい。水性調製物は包帯材が乾燥するのを防ぐために必要に応じて再適用されるべきである。あるいは、ケラチン調製物は、Ｂｌａｎｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第６，２７４，１６３号に記載されるようなシート状の創傷被覆材として形成されてもよい。さらなる実施形態では、ケラチン調製物は、スプレー用として製剤される（例えば、エアゾールポンプで創傷の上に噴霧されることのできる水性調製品などの溶液）。

一部の実施形態では、創傷は、例えば、１日に数回、または必要に応じて本開示の組成物を再適用することにより治療される。細菌を除去するための清浄、および壊死組織片を除去するためのデブリードマンも治療の経過中に保証され得る。デブリードマンを補助するために、保湿クリームまたは軟膏を適用して創傷焼痂を軟化してよい。

外科用または救急医療用補助具。本発明のもう一つの態様は、固体の生理学的に許容される支持体および該支持体上のケラチン誘導体を含む、外科用または救急医療用補助具である。「支持体」には、スポンジ、パッキング、創傷被覆材（例えばガーゼまたは包帯）、縫合糸、織物、および補綴材が含まれる。

ケラチン誘導体を含むキット。本発明のもう一つの態様は、容器中のケラチン誘導体を含む、それからなる、またはそれから本質的になるキットである。ケラチン誘導体は、好ましくは滅菌形態で容器に包装されている。キットには、生理学的に許容される支持体、例えばスポンジ、パッキング、創傷被覆材（例えばガーゼまたは包帯）、縫合糸、織物、および補綴材が含まれてよい。

本発明の実施形態は、以下の限定されない例においてさらに説明される。

ケラチン誘導体／画分
ケラトース画分は、Ａｌｅｘａｎｄｅｒおよび共同研究者の方法に基づく方法を用いて得た。しかし、実質的にはこの方法を修正してペプチド結合の加水分解を最小限にした。要するに、地元の理髪店から収集した５０グラムの清浄な乾燥した毛髪を、室温にて１２時間、１０００ｍＬの、２ｗ／ｖ ％過酢酸（ＰＡＡ）水溶液と反応させた。５００ミクロンの篩を用いて酸化した毛髪を回収し、多量のＤＩ水ですすぎ、過剰な水を除去した。１０００ｍＬの１００ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基を用いて、その酸化した毛繊維からケラトースを抽出した。３時間後、毛髪を篩により分離し、塩酸（ＨＣｌ）を１滴ずつ添加することによりその液体を中和した。１０００ｍＬの０．１Ｍ Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基および１０００ｍＬのＤＩ水をそれぞれ用いるその後の２回の抽出で、さらなるケラトースを残っている毛髪から抽出した。各回、毛髪を篩で分離し、その液体をＨＣｌで中和した。３回全部の抽出物を混合し、遠心分離し、濾過によって残留固形材料を除去した。混合した抽出物を、１ＫＤａ公称低分子量カットオフ膜を用いるＤＩ水に対する接線流透析により精製した。溶液を濃縮し、凍結乾燥させて、粗ケラトース粉末を製造した。

ケラテイン画分は、Ｇｏｄｄａｒｄ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌｉｓにより記載される方法の修正法を用いて得た（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９３４；１０６：６０５−１４）。要するに、毛髪を、３７℃にて２４時間、１Ｍ ＴＧＡの水溶液と反応させた。ＴＧＡ溶液のｐＨは、飽和ＮａＯＨ溶液を１滴ずつ添加することにより、ｐＨ１０．２に調整しておいた。抽出溶液を濾過し、還元毛繊維を除去し、保持した。１０００ｍＬのｐＨ１０．２の１００ｍＭ ＴＧＡで２４時間、１０００ｍＬのｐＨ１０．２の１０ｍＭ ＴＧＡで２４時間、そしてｐＨ１０．２のＤＩ水で２４時間、順次抽出することにより、さらなるケラチンを繊維から抽出した。各々の抽出の後、溶液を遠心分離し、濾過し、透析系に付加した。最終的に、全ての抽出物を混合し、１ｋＤａの公称低分子量カットオフ膜でＤＩ水に対して透析した。溶液を濃縮し、ｐＨ７に滴定し、約５％の総タンパク質濃度で４℃にて保存した。あるいは、濃縮した溶液を凍結乾燥させ、窒素下で冷凍保存してもよい。

分画の直前に、ケラトース試料を超純水に再溶解し、希ＨＣｌ溶液を添加することによりｐＨ６に滴定した。ケラテイン試料も同様に希ＨＣｌ溶液を注意深く添加することによりｐＨ６に滴定した。試料を、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（弱アニオン性）またはＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（強アニオン性）交換樹脂（５０〜１００メッシュ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）のいずれかを含有する２００ｍＬフラッシュクロマトグラフィーカラムに、穏やかな圧力で負荷し、フロースルー（酸性ケラチン）を回収した。ｐＨ６の少量の１０ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基（約２００ｍＬ）を用いて試料を完全に洗浄した。ｐＨ１２の１００ｍＭトリス塩基＋２Ｍ ＮａＣｌを含むカラムから塩基性ケラチンを溶出させた。各々の試料を別々に中和し、１ＫＤａのＬＭＷＣＯを用いる接線流透析を用いてＤＩ水に対して透析し、回転蒸発によって濃縮し、フリーズドライした。

既に記載されるように、α−ケラトースのサンプルを製造し、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＩＥｘカラムで酸性および塩基性画分に分離し、ＰＢＳに溶解し、ｐＨを７．４に調整した。これらの溶液を５重量パーセント濃度で調製し、その赤血球（ＲＢＣ）凝集特性を、新鮮なヒト全血を用いて１：１比で混合することにより肉眼で見て評価した。２０分後に試料を採取し、光学顕微鏡により評価した。イオン交換クロマトグラフィーは、凝集現象の分離に非常に有効であった（データは示さず）。塩基性α−ケラトースには、血液細胞との相互作用が本質的になく、一方、酸性α−ケラトースは、過剰な凝集をもたらした。

酸性および塩基性α−ケラトース、未分画のα＋γ−ケラテイン、未分画のα＋γ−ケラトースおよびβ−ケラトース（キューティクルから得たもの）の試料を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中、約４ｗ／ｖ％およびｐＨ７．４にて調製した。試料を粘度およびＲＢＣ凝集について試験した。これらの結果を表１に示す。

動物モデルにおける細胞増殖および創傷治癒
いくつかの生体内および生体外研究を行ってケラチンバイオマテリアルの生物活性を実証した。それには、人毛に由来するケラチンタンパク質を使用して、酸化および還元反応を用いて、以下の方法に従って、皮質の三次構造を分解し、可溶性タンパク質を抽出することが含まれた。

人毛に由来するケラチンバイオマテリアルは、皮膚成分細胞の増殖挙動を媒介した。細胞培養実験では、ある種のケラチンが線維芽細胞およびケラチノサイトに対して分裂促進性であった。ケラチンに基づくヒドロゲルは、マウスおよびブタモデルにおいて、それぞれ、化学熱傷および温熱熱傷を不動態化することができることが示された。

ケラトース。清浄な乾燥した毛髪を小さな繊維に切断し、過酢酸で酸化させた。遊離タンパク質を、変性溶液を用いて抽出し、中和し、透析により精製し、濃縮し、凍結乾燥により単離した。ヒドロゲルを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で再水和することにより形成した。

ケラテイン。清浄な乾燥した毛髪を小さな繊維に切断し、チオグリコール酸で還元させた。遊離タンパク質を、変性溶液を用いて抽出し、透析し、中和し、濃縮した。濃縮の際、粘稠なヒドロゲルが空気に曝されて生じた。

細胞増殖。ケラトース粉末（未分画のケラトース、α＋γ）を、数種類の濃度の血清を含むまたは含まない媒質に溶かし、ヒト皮膚線維芽細胞およびケラチノサイトを培養するために用いた。細胞を血清含有培地で約５０％のコンフルエンシーまで増殖させ、ケラチン含有溶液に暴露する前の２４時間、血清を欠乏させた。ケラチン含有培地での２４時間の培養の後、ミトコンドリア代謝アッセイを用いて（ＭＴＴアッセイ）細胞増殖を評価した。ケラチノサイトおよび線維芽細胞を用いる細胞増殖アッセイは、ケラトース処理群に統計上有意な増加を示した（図１）。

創傷治癒。免疫適格マウスを脱毛し（ｄｅ−ｈａｉｒｅｄ）、フェノールを用いて両肩の間に化学熱傷を誘導した。創傷を２０分後にケラチンヒドロゲルと密封包帯で処置した。使用したケラチンは未分画の（α＋γ）ケラトースであった。包帯は最大１０日間、３日おきに交換した。創傷のデジタル写真を撮影し、組織学検査のために創傷範囲を切除することができるように様々な時点で動物を犠牲にした。マウスにおける創傷治癒調査により、化学熱傷の興味深い不動態化が実証された。図２は、最初に創傷範囲が増大する、密封包帯だけで処置した創傷における創傷の進行の正常な過程を示す。これは、末梢組織の血管による支持が破壊され、その後、創傷の周縁部での壊死が続くことに起因する。この結果、創傷範囲の特徴的な増殖が起こる。しかし、ケラチン処置群では、損傷の発生時に創傷範囲が安定化する傾向があった。これは、罹患率、および／または、最初の血管の支持の喪失に対向する血管形成の迅速な誘導を制限する防御機構に起因すると考えられた。

その後の大型動物実験において、ブタを清浄して剃毛し、加熱した真鍮製のブロックを用いて背側正中線に沿って一連の深い中間層熱傷（ｐａｒｔｉａｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｂｕｒｎ）を作り出した。創傷は最大２７日間、３日おきに処置した。用いたケラチンは、未分画の（α＋γ）ケラトースおよび未分画の（α＋γ）ケラテインであった。創傷のデジタル写真を撮影し、組織学検査のために創傷範囲を切除することができるように様々な時点で動物を犠牲にした。この大型動物実験において、対照群と比較して、ケラチン処置が創傷の増大を抑制し、治癒を加速するという、上に詳述されるマウス実験から得た以前の知見が確認された（図３）。

動物モデルにおける出血の制御
ケラチンゲルの止血可能性を中程度に検証する（ｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｇ）動物モデルにおいて評価した。ケラチンゲルは未分画のケラテイン（α＋γ）を含んだ。肝臓損傷は、肝臓のサイズも創傷のサイズも増大するため、解決の難しいことで有名である。このウサギモデルは、大量および致死性の出血の両方を作り出すことができる。制御された肝臓の切離を、処置されない場合（陰性対照）であれば瀉血をもたらすが、慣習的な止血剤が適用されると（陽性対照）被験動物の回復をもたらす、一貫した一組の条件を確立する手段として使用した。注目すべきは、この実験で陽性対照として用いた止血剤が局所創傷に適応され、同時に圧することを必要とすることである。止血剤は、この実験では圧迫せずに適用された。これは、ケラチンゲルとともに使用されなかったときに圧迫によって加わる寄与が交絡することを避けるために行われた。

合計１６匹のニュージーランドウサギ（平均３．７ｋｇ）をこの実験に使用した。動物は、左中心葉の約３分の１の切離からなる標準化された肝臓損傷を受け、次いで４つの群のうちの１群に無作為化された。４匹の動物は陰性対照としての役割をして処置を受けず、４匹の動物はＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）止血剤での処置を受け、４匹の動物は、ＨｅｍＣｏｎ（登録商標）止血用包帯で処置され、さらに、４匹の動物は、ケラチンゲルで処置された。蘇生液は与えられず、全ての動物は外科手術の間厳重にモニターされた。１時間後、手術創が閉じられ、動物は収容施設に移された。全ての生存している動物は７２時間後に犠牲になった。屠殺の時点で、肝臓組織は組織学的分析のために回収された。

外科手術および術後の処置。全ての手順は、規制および認定機関のガイドラインを包含する、ウェイク・フォレスト大学の実験動物委員会のガイドラインに従って行った。動物は外科手術の直前に秤量した。全ての動物を、ケタミン１０ｍｇ／ｋｇとキシラジン４ｍｇ／ｋｇの組合せを用いて筋肉内注射を通じて鎮静させ、挿管し、手順の残りを２〜３％イソフランで維持した。次に、動物を背臥位に置き、剃毛し、監視装置に接続した。全ての動物に、ＥＣＧリード、尾部のパルスオキシメーター・カフ、および温度モニター用の食道内プローブを接続した。無菌で準備を行い、覆い布をかけた後、腹部の切開を行って肝臓を露出させた。肝臓損傷の前に、動物の腹部大動脈を露出させ、データ取得のためのＰｏｗｅｒＬａｂ（登録商標）（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）システムに次々に接続されている、圧力トランスデューサ（Ｌａｂ−ｓｔａｔ，ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．Ｃａｓｔｌｅ Ｈｉｌｌ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に接続された２３ゲージ針を用いてカニューレ処置した。この手順の間、平均動脈圧（ＭＡＰ）を継続的に記録した。全ての動物を数分間モニターして、肝臓損傷の前に安定した状態にあることを確かめた。肝臓の中葉は十分な大きさがあり接近が容易であるので、それを損傷用に用いた。

モデル開発中の予備データは、未処置のまま放置すると死に至るが、対照材料で処置すると動物を救出することのできる、一貫した肝臓損傷の断面積を作り出すことができたことを示した。２．０ｃｍ^２の表面積のリングを用いて、リングを通して左中心葉を引き出し、リングに直接隣接して外科用の刃で切断することにより、一貫したサイズの損傷を肝臓に負わせた。ＭＡＰ、温度、心拍数、Ｏ_２飽和、および脱血血液を、この手順全体にわたって、３０秒、５、１５、３０、４５および６０分の時点で記録した。脱血血液は、肝臓損傷の下に置かれた、事前に秤量した滅菌外科用ガーゼを用いて、各時点で測定した。加えて、耳静脈からＣＢＣ用の血液試料を採取した。

全ての動物の４つの実験群に無作為化した。陰性対照群は処置を全く施さず、損傷を負わせた後、分単位で死亡時刻を記録した。その他の実験群については、ＭＡＰが出発値の半分まで下がらない限り、５分の時点で処置を投与した。標準化のため、適用した止血材料を測定または秤量した。ケラチンゲルは圧迫を必要としないため、結果を混乱させないようにその他の処置群のいずれにおいても圧迫を用いなかった。ＨｅｍＣｏｎ（登録商標）止血用包帯処置群では、４．５×２．５ｃｍ包帯片をこの手順全体にわたって肝臓の出血面の上に置き、閉鎖の前に除去した。ＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）止血剤処置群では、動物１匹あたり２．５グラムのオートクレーブ滅菌材料を用いた。材料を出血面に広げ、閉鎖後も生存動物の体内に放置した。ケラチン処置群の場合、動物１匹当たり２ｍｌのゲルを用いた。滅菌ケラチンゲルを、１ｍｌシリンジによって出血面に適用した。

ケラチンも、動物の縫合後に適所に放置した。これらのパラメータは、創傷部位の完全な被覆に基づいて最初のモデル開発中に決定された。生存動物に関して、６０分間モニターを継続し、その後その動物は最初の外傷から生き残り、出血が停止したとみなされた。ＨｅｍＣｏｎ（登録商標）止血用包帯で処置された動物は、製造業者に指示されるように腹腔内に放置することができなかったので材料を除去しなければならなかった。大動脈カニューレを取り外し、挿入部位での止血が確立された。大動脈出血は、剖検の時点でいずれの動物においても観察されなかった。腹部の筋膜および皮膚を２層に縫合した。腹部の完全縫合後、動物に回復させる時間を与え、収容施設に移動させた。そこで動物を麻酔から完全に回復するまでは１５分おきに、その後３日間は１日３回モニターした。ＣＢＣ分析のために、毎日全ての生存動物から血液試料を採取した。７２時間の時点で犠牲にする際、各々の動物の肝臓を組織評価のために回収した。

提示される全てのデータは平均値および対応する標準偏差として表される。統計分析のため、ＳＰＳＳ ｖ．１１（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を用いた。異常値は、修正ｚスコア（絶対偏差の中央値）を用いて、＋３．０より大きい（ｌａｒｇｅｒ ｔｈｅｎ）または−３．０より小さいｚスコアを有するものと規定した。全ての時点のデータを一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により分析した。有意なＦ値が見出された場合、それらの群をフィッシャーの最小有意差検定（ＬＤＳ）によりさらに分析した。ｐ＜０．０５のαは、有意と見なした。タイプＩエラーの確率を、限定比較により最小化し、陰性対照対３処置群のみを行った。死亡動物（すなわち、６０分の手術時間終了前に失血した動物）の早期脱落によって生じた偏りを補うために、既知の病態エンドポイントへの多項式回帰を用いて、最初の６０分の間の値を推定した。一部の群で統計的関連性に達した失血パーセントグラフのデータ（図５）に関して、値は平均とそれらの対応する標準誤差として表される。

陰性対照動物（すなわち、処置なし）は、予想通り、６０分の手術時間内に失血した（３１±１９分）。ＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）止血剤群の２匹の動物と、ＨｅｍＣｏｎ（登録商標）止血用包帯群の１匹は、最初の６０分の手術時間を生き延びられなかった。また、ＨｅｍＣｏｎ（登録商標）止血用包帯群において、獣医学スタッフのアドバイスに基づいて、１匹の動物を手術後２４時間の時点で安楽死させた。この動物は、歩行することができず、飲食できなかった。ケラチン群の１匹の動物も４８時間の時点で犠牲にした。この動物は、そのケージの中を自由に動いていたが、飲食しなかった。剖検時、これらの動物は、手術時間後にさらに出血した形跡を示さなかった。無事に回復した他のすべての生存動物は、２４時間以内にケージの中を自由に動き回って、７２時間までに正常なＣＢＣを有した（データは示さず）。生存データの概要を図４に示す。

平均動脈圧。平均動脈圧（ＭＡＰ）は、腹部大動脈の下部に配置した２３ゲージ針を用いて記録した。針は、ＰＥ５０チューブに接続され、それは次に、圧力記録用のＰｏｗｅｒＬａｂシステムに接続された圧力トランスデューサ（Ｌａｂ−ｓｔａｔ）に接続された。この手順の全過程中、または動物が死亡するまで、ＭＡＰを継続的にモニターした。ＭＡＰおよび心拍数の変化の有意性をさらに評価するために、ショック指数を用いた。ショック指数は、外傷患者を迅速に評価するための十分に確立された臨床採点システムである。心拍数をＭＡＰ（ｍｍＨｇ）で除算することにより、修正ショック係数を算出した。

腹部大動脈の平均動脈圧を６０分間記録した。ケラチンおよびＨｅｍＣｏｎ（登録商標）止血用包帯群の動物は、７５％の出発値で５分後に安定なＭＡＰを達成することができた。ＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）止血剤および対照群は、ＭＡＰを安定させることができず、６０分後に出発値の４５％まで低下した（図６）。しかし、これらのデータは、群間の統計的有意性には達しなかった。

失血の重症度についての予測スコア評点システムである、ショック指数（ＳＩ）は、最初の６０分を通して低い値を有するケラチン群に対して有益な結果を示した（図７）。ＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）止血剤の高い値は、最初の２０分の観察中の２匹の早期死亡に合致し、この尺度の予測的性質を裏付ける。傾向に注目したが、これらのデータは、本実験において統計的有意性には達しなかった。

温度、ＥＣＧおよび心拍数。手術室モニターに接続された食道プローブを用いて、中心温度を記録した。この手順全体にわたって動物の体温を継続的にモニターし、前述の時点で記録した。ＥＣＧおよび心拍数は、手術室モニターに接続された３つのリードシステムを用いてモニターし、全手順を通して維持した。フラットライン、または電気機械解離での不規則な電気活動を用いて死亡時間を定義した。

この実験に用いた肝臓損傷モデルは、有意で急速な失血を伴う重度の外傷を示した。肝切離は致死的損傷を生じ、一般に直径約１ｍｍの１または２本の大血管および０．５〜１．０ｍｍの範囲の直径の数本を含んだ。損傷の重症度は、未処置のウサギ全てが、６０分の手術時間内に失血するようなものであった。これらの動物はいずれも、血液量の喪失を心拍数の増加によって補償することができなかった。全ての動物が２６３ｂｐｍから、３０分後には１８８ｂｐｍおよび１時間後には１５４ｂｐｍへの、匹敵する減少を示した。群間に統計上の有意差はなかった。しかし、ケラチン群は、補償および回復に向かう傾向を示し、３０分〜６０分の手術時間の後半に心拍数が増加した。全ての動物の体温は、同様に降下し、最初の５分間に０．８℃、そして６０分にわたって合計２．７℃の段階的降下であった。実験群間に統計上の有意差はなかった。

脱血血液。脱血血液は、事前に計量したガーゼの重量を減算した後の重量で測定した。各時点で重量を記録し、肝臓損傷の下に新しいガーゼを置いた。脱血血液は、各々の動物のもとの体重に対するパーセントとして表した。ＣＢＣは、ＨＥＭＡＶｅｔ（登録商標）多種血液検査システム（ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｅｓ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ｓｙｓｔｅｍ）（Ｍｏｄｅｌ ９５０ＦＳ，Ｄｒｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）を用いて、耳静脈より採取した試料から決定した。

止血不能の出血実験において予測されたように、全ての動物が大量出血の初期相に続いて、ＭＡＰの降下につれて出血速度の低い線形相を示した（図５）。ケラチンおよびＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）止血剤群の陰性対照に対する比較は、３０、４５および６０分の時点での失血量の有意な低下を示す（ケラチン対陰性対照に関するｐ値は、それぞれ、０．０１８、０．０１１および０．００７であり、ＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）止血剤対陰性対照に関するｐ値は、それぞれ、０．００９、０．００５および０．００４であった）。

予想されるように、動物の生存性は、たとえ離断した総表面積を制御したとしても動物ごとに一貫しない、損傷部位の脈管解剖学に依存すると思われる。単一の非常に大きな出血血管（＞１ｍｍ）、または多数の大きな出血血管（１ｍサイズ範囲のもの、＞２〜３）が損傷範囲内に発生した場合、その動物が生存する可能性は、ＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）止血剤およびＨｅｍＣｏｎ（登録商標）止血バンデージ群ではごくわずかであった。特にＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）止血剤群では、単一の非常に大きな出血血管または２〜３本を越える大きな出血血管は、確実に致死性である。しかし、留意すべきは、製造業者の指示に従って、圧迫を伴って使用した場合、その他の実験は、ＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）止血剤およびＨｅｍＣｏｎ（登録商標）止血用包帯を用いてより良好な生存率を示していることである。同様に圧迫せずに用いたケラチンゲルでの処置の場合は全て、切断された血管のサイズに関わらず、動物は少なくとも２４時間生存した。全ての試験群において少数の動物が用いられたが（ｎ＝４）、これらの結果は有望である。

ケラチン止血ゲルは、各々の結果判定法、特に脱血血液量、ＭＡＰ、および（重要なことには）生存により、一貫してよく機能した。特に顕著な１つの結果はショック指数であった。出血の大部分の例では、心拍出量が増大して血圧の低下を補う。ひとたびこの機構が支配的になると、ショック指数の値は急速に増大し生存性が疑わしくなる。顕著なことに、ケラチン処置群のショック指数は、初期の効果的な止血に一致して、試験した全ての材料の最低のままであった。

組織学。損傷した肝臓表面を含む組織試料は、安楽死から１時間以内に各動物から取り出した。各々のサンプルをＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｏ．Ｃ．Ｔ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４５８３（Ｓａｋｕｒａ（登録商標））に入れ、液体窒素中で凍結させた。それらの凍結ブロックを、クリオスタット（Ｍｏｄｅｌ ＣＭ１８５０，Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂａｎｎｏｃｋｂｕｒｎ，ＩＬ）を用いて、肝臓の離断部分を含むように８μｍ切片に切片化し、顕微鏡スライドの上に載せた。スライドを固定し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。ＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）止血剤切片とＨｅｍＣｏｎ（登録商標）止血用包帯切片の両方に関して切断の点で技術的困難が生じた。脆弱なＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）止血剤は、水平な切片化を困難にし、切片に空隙を作った。ＨｅｍＣｏｎ（登録商標）止血用包帯は、腹部縫合前に取り外し、そのため、凝固した血液は部分的にしか見えなかった。デジタル画像を様々な倍率で撮って（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ１ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）、止血剤と肝臓の損傷範囲の相互作用を観察した。１００倍の倍率は組織の全体的な応答を示し、一方、２００倍および４００倍の倍率を用いて細胞応答を視覚化した。

離断した肝臓表面を、Ｈ＆Ｅ染色切片の光学顕微鏡法によって調べた。陰性対照群は、組織応答または壊死のない明瞭な切断部を示した（図８Ａ）。さらに、機能性凝固は観察されず、表面に付着した血栓もほとんどなかった。ＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）止血剤試料は、血塊中のこの硬い粒状ゼオライトの存在に起因して加工が困難であった。組織像は、血塊と混ざった壊死組織を示した（図８Ｂ）。透明な範囲は、加工中に除去されたＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）止血剤粒子を表す。ＨｅｍＣｏｎ（登録商標）止血用包帯群は、凝血を含む一部の範囲および隣接する細胞の浸潤を示した（図８Ｃ）。ＨｅｍＣｏｎ（登録商標）止血用包帯は、６０分後に除去したので、大部分の肝臓表面は、血塊の薄層しか有さなかった。ケラチン群は、損傷した肝臓表面に付着したバイオマテリアルの厚い層を示した（図８Ｄ）。細胞浸潤を伴う肉芽様組織が、ケラチンバイオマテリアルゲルの細孔内で形成された（図９）。

ケラチン止血ゲルは、組織に付着し、親水性であった。出血している肝臓表面に置くと、たとえ大量出血があっても、それは十分に付着して洗い落とすことができなかった。このゲルは、血液から液体を吸収し、投与後数分以内にさらに一層付着した。凝固および付着は、ほぼ接触と同時に起こった。興味深いことに、ケラチンゲルは、７２時間までに創傷部位上に肉芽様組織の厚いシールを形成した。組織切片を検査すると、損傷から３日後、ゲルに浸潤している宿主細胞を見ることができた。これらの実験で用いたケラチンゲルは、２つの目的に役立つと考えられる。第一に、このゲルと全血の接触は、おそらく血小板活性化または凝固因子の濃縮により、血栓形成を引き起こす。第二に、この付着性ゲルは、創傷部位に物理的なシールを形成し、凝血によく似た、細胞浸潤および肉芽様組織形成のための多孔質スキャフォールドをもたらす。

前述の内容は本発明を例証するものであり、それを限定するものと解釈されるべきでない。本発明は添付の特許請求の範囲により規定され、特許請求の範囲の均等物もその中に含まれる。

Claims (33)

1. 創傷の治療法を実施するためのヒドロゲル含有組成物であって、前記ヒドロゲルが、ケラトースを含み、
   前記ケラトースは、少なくとも８０質量％の塩基性αケラトースまたは酸性αケラトースを含み、前記塩基性または酸性αケラトースは平均分子量が３０ｋＤａ〜２００ｋＤａである、組成物。
2. 前記ヒドロゲルが、ケラトースから本質的になる請求項１に記載の組成物。
3. 前記ヒドロゲルが、ケラテインをさらに含む請求項１に記載の組成物。
4. 前記組成物が、鎮痛薬、抗菌剤、および付加的な創傷治癒剤からなる群から選択される少なくとも１種類の付加的な有効成分をさらに含む請求項１に記載の組成物。
5. 前記組成物が、前記ケラトースを含むヒドロゲルおよび付加的な有効成分から本質的になり、前記付加的な有効成分が抗菌剤である請求項４に記載の組成物。
6. 前記付加的な有効成分が、バシトラシン、硫酸ポリミキシンＢ、ネオマイシン、硫酸ポリミキシンＢおよびバシトラシンの混合物、ネオマイシン、バシトラシンおよび硫酸ポリミキシンＢの混合物、ポビドンヨード、スルファジアジン銀、酢酸マフェニド、ナイスタチン、ニトロフラゾンならびにゲンタマイシンからなる群から選択される抗菌剤である請求項４または５に記載の組成物。
7. 前記創傷が、熱傷、擦過傷、裂傷、切開、褥瘡、穿刺創、貫通創、銃創および圧挫損傷からなる群から選択される請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 前記ヒドロゲルが、αケラトースから本質的になる請求項２に記載の組成物。
9. 前記ヒドロゲルが、酸性αケラトースから本質的になる請求項８に記載の組成物。
10. 前記ヒドロゲルが、塩基性αケラトースから本質的になる請求項８に記載の組成物。
11. 前記ケラトースが、ヒドロゲルとして再構成するために粉末形態で、水性担体中に提供される請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
12. 前記組成物が、軟膏またはクリームとして提供される請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
13. 前記組成物が、局所適用される請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
14. 前記ヒドロゲルが、前記組成物を前記被験体の体内に注射することにより適用される請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
15. 前記組成物が、創傷変化を阻害するため、創傷閉鎖を促進するため、または創傷変化を阻害し、かつ創傷閉鎖を促進するために有効な量で、前記創傷に適用される請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
16. 前記創傷が、熱傷創である請求項１５に記載の組成物。
17. 前記酸性αケラトースが、酸性および塩基性αケラトースを含む混合物をイオン交換クロマトグラフィーにより分画するプロセスによって製造される請求項９に記載の組成物。
18. 固体の、生理学的に許容される支持体と、
    前記支持体上のケラチン誘導体を含む組成物を含み、
    前記ケラチン誘導体が、少なくとも８０重量％の酸性αケラトースであり、前記ケラトースの平均分子量が３０ｋＤａ〜２００ｋＤａである外科用または救急医療用補助具。
19. 前記支持体が、スポンジ、パッキング、創傷被覆材、縫合糸、織物、および補綴材からなる群から選択される請求項１８に記載の外科用または救急医療用補助具。
20. 前記外科用または救急医療用補助具が滅菌され、かつ、前記外科用または救急医療用補助具が、滅菌容器に包装されている請求項１８または１９に記載の外科用または救急医療用補助具。
21. 前記ケラチン誘導体が、少なくとも８０重量％の酸性αケラトースである請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の外科用または救急医療用補助具。
22. 前記ケラチン誘導体が、酸性αケラトースから本質的になる請求項２１に記載の外科用または救急医療用補助具。
23. 前記酸性αケラトースが、酸性および塩基性αケラトースを含む混合物をイオン交換クロマトグラフィーにより分画するプロセスによって製造される請求項２２記載の外科用または救急医療用補助具。
24. ａ）ケラチン誘導体を含む、創傷の治療法を実施するための組成物、および
    ｂ）容器
    を含むキットであって、前記容器の中に前記ケラチン誘導体が滅菌形態で包装され、前記ケラチン誘導体が、少なくとも８０重量％の酸性αケラトースであり、前記ケラトースの平均分子量が１０ｋＤａ〜２００ｋＤａであるキット。
25. 前記ケラチン誘導体が、水和形態または脱水形態で提供される請求項２４に記載のキット。
26. 前記容器が箔容器を含む請求項２４または２５に記載のキット。
27. 前記容器が真空包装されている請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のキット。
28. 前記ケラチン誘導体が単一の単位用量を含む請求項２４〜２７のいずれか一項に記載のキット。
29. 前記ケラチン誘導体が、０．５〜２００グラムの脱水ケラトースを含む請求項２４〜２８のいずれか一項に記載のキット。
30. 前記ケラチン誘導体が、０．５〜２００ミリリットルの水和ケラトースを含む請求項２４〜２８のいずれか一項に記載のキット。
31. 生理学的に許容される支持体をさらに含む請求項２４〜３０のいずれか一項に記載のキット。
32. 前記支持体が滅菌され、かつ前記支持体が前記容器に滅菌形態で包装されている請求項３１に記載のキット。
33. 前記支持体が、スポンジ、パッキング、創傷被覆材、縫合糸、織物、および補綴材からなる群から選択される請求項３１または３２に記載のキット。

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