CN102986653A - 牦牛细管冻精制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物的冻精制作领域，特别是涉及牦牛细管冻精的制作方法。本发明所要解决的技术问题是提供一种牦牛细管冻精制作方法。该方法包括以下步骤：a、配制稀释液；b、采精和检查c、稀释；d、灌装；e、冷冻；f、抽检；g、冷冻贮藏：抽检合格批次的细管冻精移入液氮中贮藏。在本领域采用本发明方法制作牦牛细管冻精，在原精液质量满足要求的情况下，解冻后活率能达0.6以上，用此精液进行人工授精配怀率会更高，可提高所产牦牛质量。
Description
技术领域
本发明涉及牦牛的冻精制作方法，特别是涉及牦牛细管冻精的制作方法。
技术背景
牦牛是生活在我国高海拔、高寒牧区的高原偶蹄目牛科特有物种，耐高寒、高海拔缺氧气候。牦牛的生存能力极强，但生产性能较低，周期长，繁殖技术落后，种公畜利用年限短，加之牦牛性情粗野，活畜引种困难，一直阻碍着牦牛生产的发展。近三十年来人工授精技术已成为家畜繁殖和品种保护的一门先进技术，但是牦牛人工授精技术的关键节点之一牦牛精液的冷冻保存至今仍是一个难题。成年牦种公牛的射精量、精液密度、精子活力、耐冻性都与黄牛、奶牛的有较大区别，难以使用这些牛类的现有方法。如能开发出合适高效的细管冻精制作方法，将会极大地促进牦牛产业的发展。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种牦牛细管冻精制作方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案为提供一种牦牛细管冻精制作方法。该方法包括以下步骤：
a、配制稀释液；
b、采精和检查：采取种公牛的精液，并对精液进行常规检查，合格者用于制作细管冻精；
c、稀释：在25～30℃条件下，在待冷冻的精液中加入稀释液并搅拌；
d、灌装：灌装进冻精细管后，放到冷冻架上，控制温度在0～5℃，持续1～2小时进行平衡；
e、冷冻的细管冻精：先使冷冻柜启动后至4℃，停留5分钟；待温度恒定在4℃后将冻精细管移入冷冻箱；从4℃降至-10℃后停留时间为5分钟，此为精液移入冷冻箱后的过渡平衡期；然后冷冻箱从-10℃至-100℃后设定冷冻时间为40分钟；从-100℃至-140℃后设定冷冻时间为20分钟；细管结束冷冻进入液氮中保存备用，其液氮中的温度在-140℃至-193℃；
f、镜检：冷冻结束后，抽检精液活率，解冻抽检活率达到0.6以上移入液氮贮藏罐中冷冻贮藏备用。
其中，上述方法中的牦牛细管冻精制作方法，其特征在于：所述步骤C的稀释方法为，镜检合格的原精，在25-30℃条件按照1∶1的比例加入25-30℃的A液进行稀释，稀释液沿盛原精容器壁缓慢加入，轻轻搅拌；
检测精液浓度，再按每细管中的目标精子数和吸管容积，计算出需添加的B液量，并加入盛原精容器，稀释好后用于后继的灌装细管步骤；
所述稀释液A液的配方为：每100mL蒸馏水+2.97g柠檬酸钠，然后再每100毫升中加入10mL卵黄得稀释液A液；
所述稀释液B液的配方为：每41.75mL A液+7mL甘油+2.5g果糖。
其中，上述方法中所述稀释液中加入青毒素至1000单位/毫升，加入链毒素至1000微克/毫升。
其中，上述方法步骤b要求采集的精液直观检测合格无异状，在35-38℃条件下镜检精子活力达0.7以上者，以及每毫升精液精子数达8亿以上者和畸形率为15％以下才可用于后继步骤。
其中，上述方法步骤C的稀释步骤一般要求按每细管容纳2000万个左右的精子数的要求进行稀释。检测精子浓度一般常用分光光度法。
本发明的有益效果是：在本领域采用本发明制作出来的牦牛细管冻精，在原精液质量满足要求的情况下，解冻后活率能达0.6以上，远好于颗粒冻精等方法，好于现有的其他技术。用此精液进行人工授精配怀率高，能有效提高牦牛质量，克服活畜引种在生态方面的不适应和饲养管理方面的困难，也为本领域提供了一种新的选择，这对牦牛的资源利用来说具有尤其重要的意义。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明进行详细的说明。
结合上面的检测方法，本发明方法包括以下步骤：
a、配制稀释液。
b、采精和检查：按常规方法采取种公牛的精液，并对精液进行常规检查，要求直观检查无异状，在35-38℃条件下镜检精子活力达0.7以上者，以及每毫升精液精子数达8亿以上者和畸形率为15％以下者方可用于制作细管冻精。
c、稀释：在25～30℃条件下，在待冷冻的精液中加入稀释液并搅拌。
d、灌装：灌装进冻精细管后，即放到冷冻架上，控制温度在0～5℃，持续1～2小时进行平衡。(平衡温度优选4℃)
e、冷冻：先使冷冻柜启动后至4℃，停留5分钟；待温度恒定在4℃后将细管精液移入冷冻箱；从4℃降至-10℃后停留时间为5分钟，此为精液移入冷冻箱后的过渡平衡期；然后冷冻箱从-10℃至-100℃后设定冷冻时间为40分钟；-100℃至-140℃后设定冷冻时间为20分钟；细管结束冷冻进入液氮中保存备用，其液氮中的温度在-140℃至-193℃。
f、镜检：冷冻结束后，抽检精液活率，解冻抽检活率达到0.6以上合格，才能移入液氮贮藏罐中冷冻贮藏备用。
g、冷冻贮藏：合格细管冻精移入液氮中贮藏。
其中，上述方法中的牦牛细管冻精制作方法，其特征在于：所述步骤C的稀释方法为，镜检合格的原精，在25-30℃条件按照1∶1的比例加入25-30℃的A液进行稀释，稀释液沿盛原精容器壁缓慢加入，轻轻搅拌；
用分光光度法检测精液浓度，再按每细管中的目标精子数和吸管容积，计算出需添加的B液量，并加入盛原精容器，稀释好后用于后继的灌装细管步骤；
所述稀释液A液的配方为：每100mL蒸馏水+2.97g柠檬酸钠制成解冻液，然后每100毫升+10mL卵黄得稀释液A液；
所述稀释液B液的配方为：每41.75mL A液+7mL甘油+2.5g果糖。
其中，上述方法中所述稀释液中加入青毒素至1000单位/毫升，加入链毒素至1000微克/毫升。
其中，上述方法步骤C的稀释步骤一般要求按每细管容纳2000万个左右的精子数的要求进行稀释。
在进行本发明的细管冻精方法之前，需要获取适用的牦牛精液。一般的要求是选取健壮适龄公牦牛，使用常规方法取精。获取的精液一般要求，直观检查无异状，在35-38℃条件下镜检精子活力达0.7以上者，以及每毫升精液精子数达8亿以上者和畸形率为15％以下者作为合格精液，用于制作细管冻精。精子数过少或畸形率过高会影响受胎率。
牦牛精液的获取和检测一般会涉及如下操作：
采精制冻用种公牛要求特级或一级以上种公牛，按常规方法采集种公牛精液。对精液进行常规检查有如下方法可以选用：
(一)一般直观检查
1、色泽：正常的精液为乳白色或略带黄色，凡是淡黄色、褐色或黄绿色均不能使用。
2、气味：正常的精液无味或略呈牦牛精液固有的青草腥味。
3、镜下状态：良好的精液用肉眼观察时，可看到精液有“云雾”或“旋风”式的活动状态。
(二)精子活力测定
1、测定精子活力
取滴精液于载坡片上，加上盖坡片，置于显微镜下检查精子运动状况(在37-38℃)，并估计前进运动的精子占整个视野内精子的百分数。如全部精子呈直线运动为1.0级，如其中90％的精子呈直线运动，则评为0.9级，以下依此类推。如牦牛精子密度较大，可稀释后评定。
2、精子活率计算
计算非前进运动的精子数：将盖玻片推盖在计数板上，使其互相粘连呈密合状态，先用低倍镜找到计算室(方格)，用红血球稀释管收取公牛精液到刻度0.5处，擦去管端附着的精液，而后吸至膨大部，吸入0.9％Nac1溶液到刻度101处(即将原精液稀释成200倍)，以拇指和中指紧按两端，充分摆动混匀。弃掉稀释管内最初两滴，然后将管中已稀释妥的精液滴一滴，至盖玻与计算板之间的空隙边缘，使液体弥散至计算室中，放大200-400倍进行观察，计算一定方格内死亡、颤动、圆圈运动的精子数，即非前进运动的精子数。
计算精子总数：将上述精子非前进运动精子数后，再加热(放于恒温干燥箱内100℃，2分钟)使精子全部死亡，计算精子总数。
精子活率＝(总精子数-非前进运动精子数)/总精子数
(三)精子密度检查
(1)、目测法
取原精液用点滴压片法镜检精子密度，可粗略分为密、中、稀三级。如在多个视野中看不到精子，可评为“无”或“O”。
(2)、计算法
将盖玻片推盖在计算室上，使其互相粘连呈密合，先用低倍镜找到计算室后，以血球稀释管准确吸取公牛精液至刻度0.5处，用纱布擦去管端附着的精液，然后将此精液吸至膨大部。再吸入3％Nac1溶液至刻度11处，充分摇动，混合均匀，弃掉管内最初几滴，然后滴一滴稀释的精液至计算器盖玻片边缘，待其自行进入计算室内(滴加精液不能过多或过少，不能使计算室内产生气泡)，放大200-400倍计数。计算5个中方格内的精子数，四角各查一个，中间再查一个，而后推算，1毫升原精内的精子数。
计算公式为：
1毫升原精液中精子数＝(X/80)×400×1000×稀释倍数×10
其中：X为五个中方格(80个小方格)的精子数。400为一个大方格，即1平方毫米内有400个小方格。1000为一立方毫米。10为盖玻片与计数的实际高度(1/1000毫米)。稀释倍数：200倍数稀释(以吸取精液0.5处至101处为200倍稀释)；100倍稀释(以取精液0.5处至1.0处为稀释100倍)。
上式可简化为：1毫升原精液中精子数＝X×稀释倍数×50000
使用此方法检测，1毫升原精液中精子数应达到8亿以上的牦牛精液为佳。
(四)精子畸形率的测定
1、方法
以玻璃棒沾一滴精液于洁净载玻片之一端，另一载玻片以30°角自载玻片另一端拖向该滴精液，使其边缘与精液充分接触后向反方向推去，如此即制成均匀的精液抹片。抹片不宜太厚，牛精液可预先在载坡片上滴上生理盐水稀释。待抹片自然干燥后以0.5％龙胆紫酒精溶液数滴染色3分钟。再以蒸馏水缓慢冲去染料，待干燥后即可镜检。
2、计算
将抹片置高倍镜下(400-600倍)检查500个精子以上，计算其中畸形精子所占比例。畸形精子指：核厚帽、赤道板、顶体损害等不正常精子。
计算公式：畸形率＝畸形精子数/精子总数×100％
实施例使用本发明方法进行牦牛的细管冻精制
由于牦牛的生物特性和繁殖性能有别与黄牛和奶牛，成年牦种公牛的射精量、精液密度、精子活力、耐冻性都与黄牛、奶牛的有较大区别。因此，使用相关设备进行冷冻处理的各项条件，特别是冷冻曲线和稀释液，均要优化建立。本发明在大量的前期研究的基础上，获得了关键的突破，建立起本发明方法。
1、原精液镜检后的要求
按常规方法采取种公牛的精液，并对其精液进行常规检查，直观检查合格，且在35-38℃条件下镜检精子活力达0.7以上者，以及每毫升精液精子数达8亿以上者和畸形率为15％以下者方可用于制作细管冻精。
2、配制牦牛吸管冻精专用稀释液和解冻液
①稀释液的配方：
稀释液A液：每100mL蒸馏水+2.97g柠檬酸钠+10mL卵黄；
稀释液B液：每41.75mL A液+7mL甘油+2.5g果糖；
以上各种配方均可加入青毒素至体系中为1000单位/毫升，加入链毒素至体系中为1000微克/毫升。
②配制方法
A、准确称取柠檬酸钠。
B、将柠檬酸钠放入量杯中，加入蒸馏水至需要量，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解。
C、将柠檬酸钠溶液用滤纸或棉球过滤，盛于玻璃瓶中，塞上瓶塞，在瓶塞中央插入一根注射针头，在瓶外对准液面做一标记，然后进行高压或蒸煮消毒30分钟，同时消毒适量备用蒸馏水。
D、将消毒好的溶液和蒸馏水取出，观察瓶外面的标记，如液面低于标记，将消毒好备用的蒸馏水加至标记处。
E、消毒好的柠檬酸钠溶液冷却至25～30℃时，加入卵黄，并用磁力搅拌器搅拌均匀，制出A液。卵黄制备可使用本领域的常规技术，由鸡蛋中取得。
F、取相应A液，加入相应量的甘油、果糖、青霉素和链霉素，并充分搅拌制出B液。置于2～5℃的条件下保存备用。
镜检合格的原精，在25-30℃条件按照1∶1的比例加入25-30℃的A液进行稀释，稀释液沿盛原精容器壁缓慢加入，轻轻搅拌。
用分光光度法检测精液浓度，再按每细管中的目标精子数和吸管容积，计算出需添加的B液量，并加入盛原精容器，稀释好后进行分装细管。一般每细管的精子总数常控制在2千万左右。
3、比色分析精子密度
本操作使用的是法国卡苏公司成套设备中的分光光度计检测精子密度。
4、装入细管和打印牛号
为确认每一细管中精液的来源。使用法国卡苏(IMV)公司的IS4四头打印一体机对细管进行灌装、封口和打印。灌装好后，即将细管放到冷冻用架子上进入制冻制流程。
5、平衡细管精液
(1)、提前打开平衡柜电源，控制温度在4℃。待其温度稳定(此时柜内温度在0～5℃范围内即可)。
(2)、将放好细管的架子放入平衡柜，关闭柜门进行平衡，持续1～2小时。
6、冷冻细管
冷冻仪的操作：
进入卡苏公司Digitcool 5300自动化精液冷冻仪的计算机程序(使用卡苏配套软件-Windows 3T)工作界面后，设定本发明经优化后获得的针对牦牛精液的冷冻曲线。
具体步骤如下：选择Curve Edit(曲线编辑)，New Bovine，然后逐行输入表1中的数值，设定好冷冻曲线。
表1冷冻曲线程序命令和设定数值表
| 序号 | Temperature(温度) | Speed/min | |
| 1 | RAMP(曲线轨迹) | 4℃ | 5 |
| 2 | LOADING PRODUCT(装入精液) | ||
| 3 | RAMP(曲线轨迹) | -10℃ | 5 |
| 4 | RAMP(曲线轨迹) | -100℃ | 40 |
| 5 | RAMP(曲线轨迹) | -140℃ | 20 |
| 6 | UNLOADING PRODUCT(卸载产品) | ||
| 7 | RAMP(曲线轨迹) | 45℃ | 200 |
| 8 | PAUSE(暂停期) | ||
| 9 | RAMP(曲线轨迹) | 20℃ | 10 |
| 10 | END(结束运行) |
具体的的冷冻曲线操作为(对应表1中的10个步骤)：
1、为先使冷冻柜启动后至4℃，停留5分钟；
2、为待温度恒定在4℃后将细管精液移入冷冻箱；
3、为从4℃降至-10℃后停留时间为5分钟，此为精液移入冷冻箱后的过渡平衡期；
4、为冷冻箱从-10℃至-100℃后设定冷冻时间为40分钟；
5、为冷冻箱从-100℃至-140℃后设定冷冻时间为20分钟；
6为细管结束冷冻进入液氮中保存备用，其液氮中的温度在-140℃至-193℃；
7、为冷冻柜除湿期，以保护设备，设定时间为200分钟。
8、为打开冷冻柜盖子，与外界相通继续除湿。
9、为冷冻柜与外界常温下平衡设定为20℃，所需时间为10分钟。
10、为盖上冷冻柜盖子，结束电脑运行，然后关闭设备电源。
数值输入完毕，存入计算机，再次进入程序即可开始冷冻操作。步骤7至10为设备维护步骤，其具体条件可根据不同季节和室温变化等因素有较大变化空间。
6、冷冻保存
当上述程序中最后的冷冻结束后，镜检抽检精液活率。待检细管冻精在38～40℃温水中解冻3～5秒；抽检的解冻细管精液活率达到0.6以上的批次的细管移入液氮贮藏罐中冷冻贮藏。
在四川省甘孜州九龙县红坝乡牧场选取3头适龄九龙牦牛种公牛，分别采精，分别检测合格后，各次精液分按前述方法制得细管冻精，将制得的细管冻精在液氮中贮存满48小时后，加入解冻液解冻进行检测。试验结果参见表2。
表2以本方法制备牦牛细管冻精的结果
从上述实验可见，使用本发明方法可以明显的提高解冻后的存活率，所采牦牛的合格精液制备成细管冻精后均为合格，且解冻后活率已经远大于0.3的配种基本要求，同时也远好于现有的其他牦牛冻精方法。使用本发明方法可明显降低解冻后的畸形率，提高了解冻后精子活力，也确保了后继配种流程的配怀率和产仔率能有相应的提高，有效提高精液的利用率，这对牦牛的资源利用来说具有尤其重要的意义。
Claims (4)
1.牦牛细管冻精制作方法，其特征在于：其制作步骤包括：
a、配制稀释液；
b、采精和检查：采取种公牛的精液，并对精液进行常规检查，合格者用于制作细管冻精；
c、稀释：在25～30℃条件下，在待冷冻的精液中加入稀释液并搅拌；
d、灌装：将精液灌装进冻精细管后，放到冷冻架上，控制温度在0～5℃，持续1～2小时进行平衡；
e、冷冻的细管冻精：先使冷冻柜启动后至4℃，停留5分钟；待温度恒定在4℃后将冻精细管移入冷冻箱；从4℃降至-10℃后停留时间为5分钟，此为精液移入冷冻箱后的过渡平衡期；然后冷冻箱从-10℃至-100℃后设定冷冻时间为40分钟；从-100℃至-140℃后设定冷冻时间为20分钟；细管结束冷冻进入液氮中保存备用，其液氮中的温度在-140℃至-193℃；
f、镜检：冷冻结束后，抽检精液活率，解冻抽检活率达到0.6以上移入液氮贮藏罐中冷冻贮藏备用。
2.根据权利要求1所述牦牛细管冻精制作方法，其特征在于：所述步骤C的稀释方法为，镜检合格的原精，在25～30℃条件按照1∶1的比例加入25～30℃的A液进行稀释，稀释液沿盛原精容器壁缓慢加入，轻轻搅拌；
检测精液浓度，再按每细管中的目标精子数和吸管容积，计算出需添加的B液量，并加入盛原精容器，稀释好后用于后继的灌装细管步骤；
所述稀释液A液的配方为：每100mL蒸馏水+2.97g柠檬酸钠，然后再每100毫升中加入10mL卵黄得稀释液A液；
所述稀释液B液的配方为：每41.75mLA液+7mL甘油+2.5g果糖。
3.根据权利要求2所述牦牛细管冻精制作方法，其特征在于：所述稀释液中加入青毒素至1000单位/毫升，加入链毒素至1000微克/毫升。
4.根据权利要求3所述牦牛细管冻精制作方法，其特征在于：其中，上述方法步骤b要求采集的精液直观检测合格无异状，在35-38℃条件下镜检精子活力达0.7以上者，以及每毫升精液精子数达8亿以上者和畸形率为15％以下才可用于细管冻精。
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