ES2827250T3 - Mejora de órganos para trasplante - Google Patents

Abstract

Un método ex vivo para preparar un órgano para trasplante en un receptor, el método que comprende exponer el órgano a células madre exógenas antes del trasplante, en donde las células madre son células no embrionarias, no germinales que expresan una o más de oct4, telomerasa, rex-1 o rox-1 y/o pueden diferenciarse en tipos de células de al menos dos de las capas germinales endodérmicas, ectodérmicas y mesodérmicas.

Description

DESCRIPCIÓN

Mejora de órganos para trasplante

Campo de la invención

El campo de la invención es el trasplante de órganos y proporciona métodos y composiciones que mejoran el éxito del trasplante de órganos. Los métodos y composiciones están dirigidos a exponer un órgano deseado, antes de o durante el trasplante, a células madre. En un caso, las células madre reducen los efectos nocivos de la isquemia en un órgano designado para ser recolectado para trasplante o que ha sido recolectado para trasplante. En otro caso, el órgano es un pulmón. En otro caso en el que un órgano designado para trasplante se perfunde ex vivo, el método implica reducir la lesión por reperfusión isquémica perfundiendo el órgano con un medio que contiene células madre. Antecedentes de la invención

El trasplante de órganos representa la preparación y cosecha de un órgano de un donante o un sitio donante (si el donante y el receptor son el mismo), y la implantación, mantenimiento y/o uso del órgano en o por el receptor del órgano donado. Se ha calculado que se realizan más de 50,000 trasplantes de órganos al año en los principales mercados sanitarios (por ejemplo, Estados Unidos, Europa y Japón) y que hay más de 170,000 pacientes en listas de espera para trasplantes de órganos. La demanda de órganos sanos supera significativamente la oferta.

Un desafío importante en el trasplante de órganos ha sido el rechazo del trasplante, que puede provocar complicaciones importantes en la función del órgano o el fracaso del trasplante. En general, esto se ha abordado mediante la compatibilidad de donantes y receptores que tienen serotipos muy similares y mediante el uso de fármacos inmunosupresores para controlar la respuesta inmunológica subyacente al rechazo del trasplante.

Otro desafío importante ha sido la preservación de la viabilidad del órgano antes y durante el procedimiento de implantación. La extracción, almacenamiento y trasplante de un órgano pueden afectar profundamente la estructura interna y la función del órgano y pueden influir significativamente en el grado en que se retrasa o previene el retorno de la función normal del órgano después de que se completa el trasplante. Dicha lesión del órgano se produce principalmente como resultado de isquemia e hipotermia, pero también puede estar relacionada con la reperfusión del órgano ex vivo o durante la implantación. Las técnicas para la conservación de órganos, incluida la perfusión ex vivo, sirven para minimizar este daño y promover la supervivencia y función óptimas del injerto. Pero, incluso con estas técnicas, la salud de los órganos se deteriorará en muchos casos, lo que afectará el resultado del trasplante y, en algunos casos, la disminución es tan significativa que los órganos donados se rechazan antes del trasplante como no viables.

Una tecnología que aborde estos importantes desafíos en el trasplante de órganos debería tener un impacto sustancial en la calidad de vida y la supervivencia del paciente, y en el tratamiento de las complicaciones asociadas con el trasplante.

El documento EP2377542 describe una composición farmacéutica para tratar enfermedades óseas o contrarrestar la inflamación que contiene células madre de cartílago como un ingrediente activo. El documento EP2241617 describe un tipo de célula multipotente que es de origen celular progenitor endotelial que puede diferenciarse en varios tipos de células. El documento WO 99/47163 describe un método para reducir una respuesta inmune a un trasplante en un receptor mediante el tratamiento de dicho receptor con una cantidad de células madre mesenquimales eficaz para reducir o inhibir el rechazo del trasplante por parte del huésped. Dirk Van Raemdonck et al. "Machine perfusion in organ transplantation", Current Opinion in Organ Transplantation, (2013), vol. 18, no. 1, páginas 24-33 describe la perfusión mecánica en el trasplante de órganos como una herramienta potencial para el acondicionamiento de injertos ex vivo con células madre mesenquimales.

Sumario de la invención

Aquí se divulga un método que comprende trasplantar un órgano que ha estado expuesto a células madre exógenas antes, durante y/o después del trasplante. La exposición a las células madre puede mejorar la probabilidad de un trasplante de órganos exitoso. Los aspectos de la invención para los que se busca protección se definen en las reivindicaciones.

De acuerdo con un primer aspecto, la invención proporciona un método ex vivo para preparar un órgano para trasplante en un receptor, comprendiendo el método exponer el órgano a células madre exógenas antes del trasplante, en donde las células madre son no embrionarias, células no germinales que expresan una o más de oct4, telomerasa, rex-1 o rox-1 y/o pueden diferenciarse en tipos celulares de al menos dos capas germinales endodérmicas, ectodérmicas y mesodérmicas.

Las células madre pueden haber experimentado al menos 10-40 duplicaciones de células o pueden haber experimentado al menos 30-35 duplicaciones de células. La concentración de células madre expuestas al órgano puede ser de aproximadamente 1 x 106 células/ml a aproximadamente 10 x 106 células/ml. Las células madre pueden exponerse al órgano durante aproximadamente 2-4 horas. Las células madre pueden estar contenidas en un fluido para perfusión en el órgano o en un portador para administración intraórgano o contenidas en un medio en el que se baña el órgano antes del trasplante.

El órgano se puede seleccionar del grupo que consiste en pulmón, riñón, corazón, hígado, páncreas, timo, tracto gastrointestinal y aloinjertos compuestos. La exposición a las células madre reduce la inflamación en el órgano o, en donde la exposición a las células madre reduce la aparición de células inflamatorias en el órgano o, en donde la exposición a las células madre reduce las citocinas inflamatorias en el órgano.

De acuerdo con un segundo aspecto, la invención proporciona una composición que comprende un órgano ex vivo en contacto con células madre exógenas, en donde las células madre son células no embrionarias, no germinales que expresan uno o más de oct4, telomerasa, rex-1 o rox-1 y/o pueden diferenciarse en tipos de células de al menos dos de las capas germinales endodérmicas, ectodérmicas y mesodérmicas.

De acuerdo con un tercer aspecto, la invención proporciona un uso de células madre exógenas en un método ex­ vivo para preparar un órgano para trasplante en un receptor, en donde las células madre son células no embrionarias, no germinales que expresan una o más de oct4, telomerasa, rex-1 o rox-1 y/o pueden diferenciarse en tipos de células de al menos dos de las capas germinales endodérmicas, ectodérmicas y mesodérmicas.

De acuerdo con un cuarto aspecto, la invención proporciona un órgano que ha sido expuesto a células madre exógenas, para uso en el trasplante a un receptor, en donde las células madre son células no embrionarias, no germinales que expresan una o más de oct4, telomerasa, rex-1 o rox-1 y/o pueden diferenciarse en tipos de células de al menos dos de las capas germinales endodérmicas, ectodérmicas y mesodérmicas. Opcionalmente, la exposición a las células madre reduce la lesión por reperfusión isquémica.

Las células madre pueden expresar telomerasa. Las células madre pueden expresar oct4. Las células madre pueden expresar oct4 y telomerasa. Las células madre pueden diferenciarse en tipos de células de al menos dos de las capas germinales endodérmicas, ectodérmicas y mesodérmicas. Las células madre pueden diferenciarse en tipos celulares de capas germinales endodérmicas, ectodérmicas y mesodérmicas. Las células madre pueden ser humanas. Las células madre pueden ser células madre derivadas de la médula ósea humana. Las células madre pueden ser células alogénicas no compatibles con HLA.

El método divulgado aquí puede implicar la tolerancia del órgano poniendo en contacto el órgano con células madre exógenas antes de, durante y/o después del trasplante. Al crear tolerancia del órgano, ese órgano está mejor preparado para ser aceptado por un receptor sin una interferencia inmunológica significativa. La tolerancia se puede lograr, por ejemplo, mediante la inducción de células T reguladoras en el órgano (ver, por ejemplo, Eggenhofer et al., Stem Cells Translation Medicine 2013;2:000-000).

También se divulga aquí un método para reducir la lesión en un órgano ex vivo poniendo en contacto el órgano con un medio que contiene células madre exógenas antes de, durante y/o después del trasplante.

En un caso, la lesión se produce como resultado de una lesión por reperfusión isquémica.

En un caso, el método está dirigido a reducir la degradación general de tejidos o células en el órgano que se va a trasplantar. Esto puede resultar de factores que incluyen, pero no se limitan a, isquemia, hipotermia y reperfusión. Por consiguiente, en un caso, el método divulgado aquí está dirigido a reducir las lesiones como un resultado de uno o más de estos eventos. Tales eventos pueden ser causados, al menos en parte, por uno o una combinación de los siguientes: (1) inmunomodulación de células T TH1 a células T TH2; (2) inmunomodulación de macrófagos M1 a macrófagos M2 (por ejemplo, provocando un cambio de una respuesta proinflamatoria a una respuesta antiinflamatoria); (3) inhibir la infiltración de neutrófilos (por ejemplo, reduciendo los receptores de la superficie celular); (4) hacer que los neutrófilos pasen de ser proinflamatorios a antiinflamatorios; y (5) efectos citoprotectores o antiapoptóticos generados por las células madre exógenas.

Los eventos descritos aquí pueden resultar en inflamación, otra respuesta inmunológica, producción de citocinas, apoptosis celular y otros eventos que afectan la viabilidad de un órgano y la idoneidad para el trasplante. Por consiguiente, en un caso, el método divulgado aquí está dirigido a reducir los efectos nocivos de estos eventos administrando células madre exógenas a un órgano que está sujeto a estos eventos o en el que estos eventos ya han ocurrido.

Ejemplos de eventos que pueden resultar en inflamación, otra respuesta inmunológica, producción de citocinas, apoptosis celular y otros eventos que afectan la viabilidad de un órgano y la idoneidad para el trasplante pueden incluir, pero no se limitan a, aquellos asociados con la respuesta endotelial, especies reactivas a oxígeno, complemento y leucocitos. Los eventos asociados con la respuesta endotelial pueden incluir, pero no se limitan a, la expresión de ciertos productos génicos proinflamatorios (por ejemplo, moléculas de adhesión de leucocitos, citocinas) y/o agentes bioactivos (por ejemplo, endotelina, tromboxano A² ) y/o represión de otros productos génicos "protectores" (por ejemplo, óxido nítrico sintasa constitutivo, trombomodulina) y/o agentes bioactivos (por ejemplo, prostaciclina, óxido nítrico). Los eventos asociados con especies reactivas de oxígeno (por ejemplo, (O2-), (OH-), (HOCl), (H2O2) y peroxinitrito derivado del óxido nítrico) pueden incluir, pero no se limitan a, daño directo a membranas celulares por peroxidación de lípidos, estimulando la activación de leucocitos y quimiotaxis mediante la activación de la fosfolipasa A2 de la membrana plasmática para formar ácido araquidónico (tromboxano A2 y leucotrieno B4) y/o aumentando la activación de leucocitos, quimiotaxis y adherencia leucocitaria-endotelial después de reperfusión isquémica. Los eventos asociados con la activación del complemento, como C3a, C5a, iC3b, C5b9 (C5a es el más potente) pueden incluir, pero no se limitan a, la formación de varios mediadores proinflamatorios que alteran la homeostasis vascular, por ejemplo, comprometiendo el flujo sanguíneo a un órgano isquémico mediante la alteración de la homeostasis vascular y el aumento de la adherencia leucocitaria-endotelial. Los eventos asociados con leucocitos pueden incluir, pero no se limitan a, activación de leucocitos, quimiotaxis, adhesión y transmigración de células endoteliales a leucocitos, que pueden conducir a una obstrucción mecánica, ya que los leucocitos liberan ROS tóxicos, proteasas y elastasas, lo que da como resultado un aumento de la permeabilidad microvascular, edema, trombosis y muerte de las células parenquimatosas.

En una realización, el órgano se selecciona del grupo que incluye, pero no se limita a, pulmón, riñón, corazón, hígado, páncreas, timo, tracto gastrointestinal y aloinjertos compuestos, tales como miembros, caras y similares, y tejidos que incluyen, pero sin limitarse a, córnea, piel, venas, arterias, huesos, tendones y válvulas, tales como válvulas cardíacas y similares.

En una realización, las células madre reducen la inflamación en el órgano. Por ejemplo, el órgano puede exponerse a las células madre durante un tiempo y una dosis suficiente para reducir la inflamación en el órgano.

En una realización, las células madre reducen la aparición de células inflamatorias en el órgano. Por ejemplo, el órgano puede exponerse a las células madre durante un tiempo y con una dosis suficiente para reducir la aparición de células inflamatorias en el órgano.

En una realización, las células madre reducen las citocinas inflamatorias en el órgano. Por ejemplo, el órgano puede exponerse a las células madre durante un tiempo y con una dosis suficiente para reducir las citocinas inflamatorias en el órgano.

En un caso, las células madre reducen la aparición de edema pulmonar. Por ejemplo, el órgano puede exponerse a las células madre durante un tiempo y con una dosis suficiente para reducir la aparición de edema pulmonar.

En un caso, las células madre aumentan la aparición de expresión de IL-10 (proteína y/o ARNm) en tejido pulmonar. Por ejemplo, el órgano puede exponerse a las células madre durante un tiempo y con una dosis suficiente para aumentar la aparición de la expresión de IL-10 en tejido pulmonar.

En un caso, la lesión resulta de hipoxia en el órgano.

En un caso, las células madre reducen los efectos de hipoxia en el órgano.

En un caso, las células madre se administran en cualquier momento entre la extracción del órgano del donante y el trasplante al receptor.

En un caso, las células madre se exponen al órgano durante el procedimiento de trasplante.

En un caso, el órgano puede exponerse a las células madre mientras el órgano todavía está intacto en el donante, pero antes de la extracción del órgano del donante.

En un caso, el órgano puede exponerse a las células madre durante un período de tiempo. El período de tiempo puede depender del órgano en particular. Por ejemplo, el período de tiempo puede ser de aproximadamente 1-2 horas, aproximadamente 2-3 horas, aproximadamente 3-4 horas, aproximadamente 4-5 horas, aproximadamente 5-6 horas, aproximadamente 7-8 horas, aproximadamente 8-9 horas, aproximadamente 9-10 horas, o aproximadamente 10 horas o más. Un ejemplo de un período de tiempo adecuado lo describen Zhao et al., BMC Medicine 2012, 10:3, que enseña un procedimiento ex vivo, que incluye períodos de tiempo adecuados, para un proceso intravenoso de células ex vivo.

En un caso, la concentración de células madre expuestas al órgano puede depender del órgano en particular. Por ejemplo, la concentración de células expuestas al órgano puede ser de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5 x 107 células/ml, aproximadamente 1 x 105 células/ml a aproximadamente 5 x 107 células/ml o aproximadamente 10 x 106 células/ml.

En otro caso, la concentración de células madre expuestas al órgano puede ser de aproximadamente 1 x 105 células/kg de órgano a aproximadamente 5 x 105 células/kg de órgano, aproximadamente 5 x 105 células/kg de órgano a 1 x 106 células/kg de órgano a 5 x 106 células/kg de órgano, aproximadamente 5 x 106 células/kg de órgano a 1 x 107 células/kg de órgano, aproximadamente 1 x 107 células/kg de órgano a 1.5 x 107 células/kg de órgano, o aproximadamente 1 x 107 células/kg de órgano a 2 x 108 células/kg de órgano.

En otras realizaciones, las células madre están contenidas en un fluido para perfusión en el órgano o en un portador para administración intraórgano (tal como intrabronquialmente).

En otra realización, las células madre están contenidas en un medio en el que el órgano se pone en contacto antes del trasplante, tal como un medio en el que se baña el órgano en lugar de perfundirse.

Los inventores contemplan el uso de cualquier célula madre deseada en los métodos de la divulgación. Estos incluyen, pero no se limitan a, células madre embrionarias (descritas aquí solo como referencia), células madre multipotentes no embrionarias, células madre mesenquimatosas, células madre neurales, células madre pluripotentes inducidas y similares. En una realización, las células madre pueden ser células alogénicas no compatibles con HLA.

Las células incluyen, pero no se limitan a, células que no son células madre embrionarias ni células germinales, que tienen algunas características de células madre embrionarias, pero que derivan de tejido no embrionario y proporcionan los efectos descritos en esta solicitud. Las células pueden conseguir estos efectos de forma natural (es decir, no modificadas genética o farmacéuticamente). Sin embargo, los expresores naturales pueden modificarse genética o farmacéuticamente para aumentar la potencia.

Las células pueden expresar marcadores de pluripotencia, como oct4. También pueden expresar marcadores asociados con una capacidad replicativa extendida, como la telomerasa. Otras características de pluripotencia pueden incluir la capacidad de diferenciarse en tipos de células de más de una capa germinal, como dos o tres capas germinales embrionarias ectodérmicas, endodérmicas y mesodérmicas. Dichas células pueden inmortalizarse o transformarse en cultivo o no. Las células pueden expandirse mucho sin transformarse y también mantener un cariotipo normal. En una realización, las células madre no embrionarias, no germinales, pueden haber experimentado un número deseado de duplicaciones celulares en cultivo. Por ejemplo, las células madre no embrionarias, no germinales pueden haber experimentado al menos 10-40 duplicaciones de células en cultivo, tales como 30-35 duplicaciones de células, en donde las células no se transforman y tienen un cariotipo normal. Las células pueden diferenciarse en al menos un tipo de célula de cada uno de los dos linajes embrionarios endodérmicos, ectodérmicos y mesodérmicos y pueden incluir diferenciación en los tres. Además, las células pueden no ser tumorigénicas, como no producir teratomas. Si las células se transforman o son tumorigénicas, y es deseable usarlas para infusión, dichas células pueden inhabilitarse para que no puedan formar tumores in vivo, como mediante un tratamiento que previene la proliferación celular en tumores. Dichos tratamientos son bien conocidos en la técnica.

Las células incluyen, pero no se limitan a, las siguientes:

Células madre no embrionarias expandidas aisladas, no germinales, habiendo experimentado las células al menos 10-40 duplicaciones celulares en cultivo, en donde las células expresan oct4, no se transforman y tienen un cariotipo normal que opcionalmente expresan adicionalmente uno o más de telomerasa, rex-1, rox-1 o sox-2 y/o puede diferenciarse opcionalmente en al menos un tipo de célula de al menos dos de los linajes embrionarios endodérmicos, ectodérmicos y mesodérmicos o que pueden diferenciarse en al menos uno tipo de célula de cada uno de los linajes embrionarios endodérmicos, ectodérmicos y mesodérmicos.

Células madre no embrionarias expandidas aisladas, no germinales que se obtienen por cultivo de tejido no germinal no embrionario, habiendo experimentado las células al menos 40 duplicaciones celulares en cultivo, en donde las células no se transforman y tienen un cariotipo normal que opcionalmente expresa uno o más de oct4, telomerasa, rex-1, rox-1 o sox-2 y/o puede diferenciarse opcionalmente en al menos un tipo de célula de al menos dos de los linajes embrionarios endodérmicos, ectodérmicos y mesodérmicos, o que pueden diferenciarse opcionalmente en al menos un tipo de célula de cada uno de los linajes embrionarios endodérmicos, ectodérmicos y mesodérmicos. Células madre no embrionarias expandidas aisladas, no germinales, habiendo experimentado las células al menos 10-40 duplicaciones celulares en cultivo, en donde las células expresan telomerasa, no se transforman y tienen un cariotipo normal que opcionalmente expresan adicionalmente uno o más de oct4, rex-1, rox-1 o sox-2 y/o que pueden diferenciarse opcionalmente en al menos un tipo celular de al menos dos de los linajes embrionarios endodérmicos, ectodérmicos y mesodérmicos, o que pueden diferenciarse opcionalmente en al menos un tipo de célula de cada uno de los linajes embrionarios endodérmicos, ectodérmicos y mesodérmicos.

Células madre no embrionarias expandidas aisladas, no germinales que pueden diferenciarse en al menos un tipo de célula de al menos dos de los linajes embrionarios endodérmicos, ectodérmicos y mesodérmicos, habiendo experimentado dichas células al menos 10-40 duplicaciones celulares en cultivo, que opcionalmente expresan uno o más de oct4, telomerasa, rex-1, rox-1 o sox-2, y/o pueden diferenciarse opcionalmente en al menos un tipo de célula de cada uno de los linajes embrionarios endodérmicos, ectodérmicos y mesodérmicos.

En un caso, se usa un medio acondicionado en lugar de las células madre.

En un caso, el órgano es de un humano.

En vista de la propiedad de las células para lograr los efectos deseados, se pueden establecer bancos de células que contengan células que se seleccionen por tener una potencia deseada (nivel de capacidad) para lograr los efectos. Por consiguiente, la divulgación abarca ensayar las células para esa capacidad. El banco puede proporcionar una fuente para preparar una composición farmacéutica para administrar a un órgano. Las células se pueden usar directamente del banco o expandirse antes de su uso. Especialmente en el caso de que las células se sometan a una expansión adicional, después de la expansión es deseable validar que las células todavía tengan la potencia deseada. Los bancos permiten el uso de células "listas para el uso" que son alogénicas para el donante y el receptor de órganos.

Por consiguiente, la divulgación también se dirige a procedimientos de diagnóstico realizados antes de exponer las células madre a un órgano. Los procedimientos incluyen evaluar la potencia de las células para lograr los efectos descritos en esta solicitud. Las células pueden tomarse de un banco de células y usarse directamente o expandirse antes de la administración. En cualquier caso, las células podrían evaluarse para determinar la potencia deseada. Especialmente en el caso de que las células se sometan a una expansión adicional, después de la expansión es deseable validar que las células todavía tengan la potencia deseada.

Aunque las células seleccionadas para los efectos se ensayan necesariamente durante el procedimiento de selección, puede ser preferible y prudente volver a ensayar las células antes de la administración a un sujeto para el tratamiento, para confirmar que las células aún logran los efectos a niveles deseados. Esto es particularmente preferible donde las células se han almacenado durante cualquier período de tiempo, como en un banco de células, donde las células, muy probablemente, se congelan durante el almacenamiento.

Entre el aislamiento original de las células y la administración a un órgano, puede haber múltiples ensayos (es decir, secuenciales) de los efectos. Esto es para confirmar que las células aún pueden lograr los efectos, en los niveles deseados, después de las manipulaciones que ocurren dentro de este período de tiempo. Por ejemplo, se puede realizar un ensayo después de cada expansión de las células. Si las células se almacenan en un banco de células, se pueden ensayar después de haber sido liberadas del almacenamiento. Si están congeladas, pueden ensayarse después de descongelarlas. Si las células de un banco de células se expanden, se pueden ensayar después de la expansión. Preferiblemente, se puede ensayar una porción del producto celular final (que se administra físicamente al órgano).

Dado que las células madre pueden proporcionar los efectos descritos aquí por medio de moléculas secretadas, los diversos casos descritos aquí para la administración de células madre se pueden realizar mediante la administración de una o más de las moléculas secretadas, como podría ser en medio de cultivo condicionado.

La divulgación también se dirige a composiciones que comprenden una población de las células que tienen una potencia deseada para lograr los efectos deseados. Dichas poblaciones se pueden encontrar como composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un órgano y/o en bancos de células a partir de los cuales las células pueden usarse directamente para la administración o expandirse antes de la administración. En un caso, las células tienen una potencia mejorada (aumentada) en comparación con la población de células anterior (original). Las células originales son como se definen aquí. La mejora puede realizarse mediante la selección de expresores naturales o mediante factores externos que actúan sobre las células.

Las células se pueden preparar mediante las condiciones de aislamiento y cultivo descritas aquí. En un caso específico, se preparan mediante condiciones de cultivo que se describen aquí que implican concentraciones de oxígeno más bajas combinadas con suero más alto, como las que se utilizan para preparar las células denominadas "MultiStem®".

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Esquema del diseño del estudio.

Figura 2. Aspecto macroscópico representativo del lóbulo inferior derecho (RLL) y el lóbulo inferior izquierdo (LLL) del pulmón 2 después de la reperfusión. El LLL tratado con MAPC parece normal mientras que el RLL tratado con vehículo parece edematoso e inflamado.

Figura 3. La puntuación semicuantitativa demuestra una disminución significativa de la inflamación general en el LLL tratado con MAPC en comparación con el RLL tratado con vehículo en 4 de 5 pulmones y en conjunto. Se representan las medias ± SD de las observaciones agrupadas de 3 observadores cegados.

Figuras 4A-B. Las fotomicrografías representativas del pulmón 1 demuestran una inflamación mínima o nula en el LLL tratado con MAPC frente al engrasamiento del tabique alveolar, edema e infiltrados de células inflamatorias perivasculares (Figura 4A) y peribronquiales (Figura 4B). Mag original 200X.

Figuras 5A-C. Disminución del recuento total de células del fluido BAL en el LLL tratado con MAPC en pulmones 3-5 (Figura 5A). No se evaluaron los recuentos totales de células en pulmones 1 o 2. La instilación de MAPC también dio como resultado una disminución significativa en los números elevados de neutrófilos y eosinófilos totales del fluido BAL en todos los 5 pulmones (Figuras 5B-C). Los datos representan las medias ± SEM de observaciones agrupadas de 3 observadores cegados.

Figura 6. Los análisis representativos de citocinas del fluido BAL del pulmón 4 demuestran un aumento significativo de IL-10 en el LLL tratado con MAPC, pero ningún cambio significativo en iNOS, STC-1 o TSG-6. Los datos representan medias desviaciones estándar de determinaciones por triplicado de cada muestra de LLL o RLL. Figura 7. Análisis de citocinas del tejido pulmonar. El análisis de qPCR se realizó en las muestras de tejido pulmonar recolectadas del LLL y RLL de los pulmones 2-5 en t = 0, 2 y/o 4 horas. Las veces de expresión representan los niveles del gen diana en comparación con el valor t = 0. Todos los datos se normalizaron a un gen de mantenimiento, GAPDH. Los datos representan medias desviaciones estándar de las muestras de LLL y RLL de los pulmones 2-5.

Descripción detallada de la invención

Los títulos de las secciones se utilizan aquí únicamente con fines organizativos y no deben interpretarse de ninguna manera como una limitación del tema descrito.

Los métodos y técnicas de la presente solicitud se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describen en diversas referencias generales y más específicas que se citan y discuten a lo largo de la presente especificación a menos que se indique lo contrario. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1990).

Definiciones

"Un" o "uno, una" significa aquí uno o más de uno; al menos uno. Cuando se usa aquí la forma plural, generalmente incluye el singular.

Un "banco de células" es la nomenclatura de la industria para las células que se han cultivado y almacenado para uso futuro. Las células se pueden almacenar en alícuotas. Se pueden usar directamente fuera del almacenamiento o se pueden expandir después del almacenamiento. Esto es conveniente para que haya células “listas para usar” disponibles para la administración. Las células ya pueden estar almacenadas en un excipiente farmacéuticamente aceptable para que se puedan administrar directamente o se puedan mezclar con un excipiente apropiado cuando se liberen de almacenamiento. Las células pueden congelarse o almacenarse de otro modo en una forma para preservar la viabilidad. En un caso de la divulgación, se crean bancos de células en los que las células se han seleccionado para una potencia mejorada para lograr los efectos descritos en esta solicitud. Después de sacar de almacenamiento, y antes de la administración, puede ser preferible volver a ensayar la potencia de las células. Esto se puede hacer usando cualquiera de los ensayos, directos o indirectos, descritos en esta solicitud o conocidos en la técnica. Entonces, las células que tienen la potencia deseada pueden ser administradas. Los bancos se pueden hacer usando células autólogas (derivadas del donante o receptor del órgano). O los bancos pueden contener células para usos alogénicos.

"Coadministrar" significa administrar en combinación uno con otro, juntos, coordinadamente, incluida la administración simultánea o secuencial de dos o más agentes.

"Comprender" significa, sin otra limitación, incluido el referente, necesariamente, sin ninguna calificación o exclusión sobre qué más se puede incluir. Por ejemplo, "una composición que comprende x e y" abarca cualquier composición que contenga x e y, sin importar qué otros componentes puedan estar presentes en la composición. Así mismo, "un método que comprende la etapa de x" engloba cualquier método en el que se lleve a cabo x, ya sea que x sea la única etapa en el método o sea solo una de las etapas, sin importar cuántas otras etapas puedan haber y no importa cuán simple o complejo sea x en comparación con ellos. "Compuesto por y frases similares que usan palabras de la raíz "comprende" se usan aquí como sinónimos de "que comprende" y tienen el mismo significado.

"Compuesto por" es un sinónimo de "que comprende" (ver más arriba).

El término "contacto", cuando se usa en relación con una célula madre y un órgano que se va a trasplantar, puede significar que, tras la exposición al órgano, la célula madre toca físicamente el órgano. En tales casos, la célula madre está en contacto directo con el órgano. En otros casos, la célula madre puede tener contacto indirectamente con el órgano donde una o más estructuras (por ejemplo, otra célula) y/o fluidos (por ejemplo, sangre) intervienen físicamente entre la célula madre y el órgano.

Las "células EC" se descubrieron a partir del análisis de un tipo de cáncer llamado teratocarcinoma. En 1964, los investigadores observaron que una sola célula en los teratocarcinomas podía aislarse y permanecer indiferenciada en cultivo. Este tipo de célula madre se conoció como célula de carcinoma embrionario (célula EC).

"Cantidad eficaz" generalmente significa una cantidad que proporciona el efecto local o sistémico deseado, por ejemplo, eficaz para mejorar los efectos indeseables de inflamación, incluida la consecución de los efectos deseados específicos descritos en esta solicitud. Por ejemplo, una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para lograr un resultado clínico beneficioso o deseado. Las cantidades eficaces se pueden proporcionar todas a la vez en una única administración o en cantidades fraccionadas que proporcionan la cantidad eficaz en varias administraciones. La determinación precisa de lo que se consideraría una cantidad eficaz puede ser con base en factores individuales de cada órgano, incluido el tipo de órgano, enfermedad o lesión que se está tratando, la forma en que se procesó el órgano, período de tiempo desde la recolección, etc. Una persona experimentada en la técnica podrá determinar la cantidad eficaz para un órgano dado con base en estas consideraciones que son rutinarias en la técnica. Como se usa aquí, "dosis eficaz" significa lo mismo que "cantidad eficaz".

"Ruta eficaz" generalmente significa una ruta que proporciona la administración de un agente a un compartimento, sistema o ubicación deseados. Por ejemplo, una ruta eficaz es aquella a través de la cual se puede administrar un agente para proporcionar en el sitio de acción deseado una cantidad del agente suficiente para lograr un resultado clínico beneficioso o deseado (en el presente caso, trasplante eficaz).

Las "células madre embrionarias (ESC)" son bien conocidas en la técnica y se han preparado a partir de muchas especies de mamíferos diferentes. Los ESC se describen aquí solo como referencia. Las células madre embrionarias son células madre derivadas de la masa celular interna de un embrión en etapa temprana conocido como blastocisto. Pueden diferenciarse en todos los derivados de las tres capas germinales primarias: ectodermo, endodermo y mesodermo. Estos incluyen cada uno de los más de 220 tipos de células en el cuerpo adulto. Las células ES pueden convertirse en cualquier tejido en el cuerpo, excluida la placenta. Solo las células de la mórula son totipotentes, capaces de convertirse en todos los tejidos y en una placenta. Algunas células similares a las ESC pueden producirse por transferencia nuclear de un núcleo de células somáticas a un óvulo fertilizado enucleado. El término "exógeno", cuando se usa en relación con una célula madre, generalmente se refiere a una célula madre que es externa al órgano y que ha estado expuesta a (por ejemplo, en contacto con) un órgano destinado a trasplante por una ruta eficaz. Una célula madre exógena puede ser del mismo sujeto o de un sujeto diferente. En un caso, las células madre exógenas pueden incluir células madre que han sido cosechadas de un sujeto, aisladas, expandidas ex vivo y luego expuestas a un órgano destinado a trasplante por una ruta eficaz.

El término "exponer" puede incluir el acto de administrar una o más células madre a un órgano destinado a trasplante. La administración al órgano puede realizarse ex vivo o in vivo (por ejemplo, mediante perfusión en un sujeto).

El uso del término "incluye" no pretende ser limitante.

"Incrementar" o "incrementando" significa inducir un evento biológico por completo o aumentar el grado del evento. Las "células madre pluripotentes inducidas (células IPSC o IPS)" son células somáticas que han sido reprogramadas, por ejemplo, mediante la introducción de genes exógenos que confieren a la célula somática un fenotipo menos diferenciado. Se puede entonces inducir a estas células a diferenciarse en una progenie menos diferenciada. Las células IPS se han obtenido usando modificaciones de una metodología descubierta originalmente en 2006 (Yamanaka, S. et al., Cell Stem Cell, 1:39-49 (2007)). Por ejemplo, en un caso, para crear células IPS, los científicos comenzaron con células de la piel que luego fueron modificadas mediante una técnica de laboratorio estándar utilizando retrovirus para insertar genes en el ADN celular. En un caso, los genes insertados fueron Oct4, Sox2, Lif4 y c-myc, conocidos por actuar juntos como reguladores naturales para mantener las células en un estado tipo células madre embrionarias. Estas células se han descrito en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Wernig et al., PNAS, 105:5856-5861 (2008); Jaenisch et al., Cell, 132:567-582 (2008); Hanna et al., Cell, 133:250-264 (2008); y Brambrink et al., Cell Stem Cell, 2:151-159 (2008). Estas referencias enseñan IPSC y métodos para producirlas. También es posible que dichas células se puedan crear mediante condiciones de cultivo específicas (exposición a agentes específicos).

El término "lesión por reperfusión isquémica" se entiende en la industria y se describe, por ejemplo, en http://emedicine.medscape.com/article/431140-overview#aw2aab6b3 (sobre la preservación de órganos), así como de Groot, H. et al., Transplant Proc. 39(2):481-4 (marzo de 2007), que enseñan la lesión por reperfusión isquémica y sus detalles mecanicistas.

La "isquemia" ocurre en dos fases. La primera fase se denomina fase isquémica caliente e incluye desde el momento en que se extrae el órgano donante y se interrumpe la circulación hasta el momento en que se administra el órgano con una solución de conservación hipotérmica. La fase isquémica fría ocurre cuando el órgano se conserva en un estado hipotérmico antes del trasplante y recirculación normal en el receptor.

El término "aislado" se refiere a una célula o células que no están asociadas con una o más células o uno o más componentes celulares que están asociados con la célula o células in vivo. Una "población enriquecida" significa un aumento relativo en números de una célula deseada en relación con uno o más de otros tipos de células in vivo o en cultivo primario.

Sin embargo, como se usa aquí, el término "aislado" no indica la presencia de sólo las células de la divulgación. Más bien, el término "aislado" indica que las células de la divulgación se eliminan de su entorno de tejido natural y están presentes en una concentración más alta en comparación con el entorno de tejido normal. Por consiguiente, una población de células "aislada" puede incluir además tipos de células en adición a las células de las células de la divulgación y puede incluir componentes de tejido adicionales. Esto también se puede expresar en términos de duplicaciones de células, por ejemplo. Una célula puede haber experimentado 10, 20, 30, 40 o más duplicaciones in vitro o ex vivo para que se enriquezca en comparación con sus números originales in vivo o en su entorno de tejido original (por ejemplo, médula ósea, sangre periférica, placenta, cordón umbilical, sangre del cordón umbilical, tejido adiposo, etc.).

"MAPC" es un acrónimo de "célula progenitora adulta multipotente". Se refiere a una célula que no es una célula madre embrionaria o una célula germinal pero que tiene algunas características de estas. MAPC se puede caracterizar en una serie de descripciones alternativas, cada una de las cuales confirió novedad a las células cuando se descubrieron. Por tanto, pueden caracterizarse por una o más de esas descripciones. Primero, tienen capacidad de replicación extendida en cultivo sin ser transformada (tumorigénica) y con un cariotipo normal. En segundo lugar, pueden dar lugar a una progenie celular de más de una capa germinal, como dos o las tres capas germinales (es decir, endodermo, mesodermo y ectodermo) tras la diferenciación. En tercer lugar, aunque no son células madre embrionarias o células germinales, pueden expresar marcadores de estos tipos de células primitivas de modo que las MAPC puedan expresar uno o más de Oct 3/4 (es decir, Oct 3A), rex-1 y rox-1. También pueden expresar uno o más de sox-2 y SSEA-4. Cuarto, al igual que una célula madre, pueden autorrenovarse, es decir, tener una capacidad de replicación extendida sin transformarse. Esto significa que estas células expresan telomerasa (es decir, tienen actividad de telomerasa). En consecuencia, el tipo de célula que se denominó "MAPC" puede caracterizarse por características básicas alternativas que describen la célula a través de algunas de sus propiedades novedosas.

El término "adulto" en MAPC no es restrictivo. Se refiere a una célula somática no embrionaria. Las MAPC son cariotípicamente normales y no forman teratomas in vivo. Este acrónimo se utilizó por primera vez en la patente de Estados Unidos No. 7,015,037 para describir una célula pluripotente aislada de la médula ósea. Sin embargo, las células con marcadores pluripotenciales y/o potencial de diferenciación se han descubierto posteriormente y, para los fines de esta invención, pueden ser equivalentes a aquellas células designadas en primer lugar como "MAPC". Las descripciones esenciales del tipo de célula MAPC se proporcionan en el Resumen de la Invención anterior. MAPC representa una población de células progenitoras más primitiva que MSC (Verfaillie, C.M., Trends Cell Biol 12:502-8 (2002), Jahagirdar, B.N., et al., Exp Hematol, 29:543-56 (2001); Reyes, M. and C.M. Verfaillie, Ann N YAcad Sci, 938:231-233 (2001); Jiang, Y. et al., Exp Hematol, 30896-904 (2002); y Jiang, Y. et al., Nature, 418:41-9. (2002)).

El término "MultiStem®" es el nombre comercial de una preparación celular con base en las MAPC de la Patente de Estados Unidos No. 7,015,037, es decir, una célula madre no embrionaria, no germinal como se describe anteriormente. MultiStem® se prepara de acuerdo con los métodos de cultivo celular divulgados en esta solicitud de patente, particularmente, menos oxígeno y más suero. MultiStem® es altamente expandible, cariotípicamente normal y no forma teratomas in vivo. Puede diferenciarse en linajes celulares de más de una capa germinal y puede expresar una o más de telomerasa, oct3/4, rex-1, rox-1, sox-2 y SSEA4.

El término "órgano" puede usarse de acuerdo con su significado habitual y entendido en la industria como un órgano entero intacto que ha sido extraído del donante para trasplante o está destinado a ser extraído del donante para trasplante en un receptor. Aunque en esta solicitud se enfatiza el término "órgano", los métodos se aplican a tejidos que pueden no constituir órganos completos. Es decir, a partes de órganos como los divulgados en otra parte de esta solicitud. Por tanto, cuando sea apropiado, el término "tejido" puede sustituirse apropiadamente por el término "órgano".

"Portador farmacéuticamente aceptable" es cualquier medio farmacéuticamente aceptable para las células utilizadas en la presente divulgación. Tal medio puede retener isotonicidad, metabolismo celular, pH y similares. Es compatible con la administración a un órgano y, por lo tanto, se puede utilizar para la administración y el tratamiento de células.

El término "potencia" se refiere a la capacidad de las células para lograr los efectos descritos en esta solicitud. En consecuencia, la potencia se refiere al efecto en diversos niveles, que incluyen, pero no se limitan a, aumentar la probabilidad de un trasplante exitoso, retardar el deterioro de un órgano pretrasplante, reducir la actividad inflamatoria en el órgano, proporcionar tolerancia al órgano, aumentar la producción de citocinas antiinflamatorias en el órgano, aumentar la presencia de células T neuroprotectoras en el órgano, disminuir la presencia de células T reactivas en el órgano, reducir el nivel de citocinas proinflamatorias en el órgano, reducir los efectos de hipoxia en el órgano, revertir el nivel de edema en el órgano y reducir los efectos de hipotermia en el órgano. La lesión que se sufre durante la recuperación, conservación y trasplante se produce principalmente por isquemia e hipotermia. Estos pueden afectar a los órganos de diversas formas. Estos se describen en la referencia de Medscape citada anteriormente y el enlace se proporciona en esta solicitud. De acuerdo con esa referencia, los mecanismos de lesión tisular incluyen una pérdida de integridad en la estructura celular, interrupción de la composición iónica de la célula, interrupción en la generación de ATP y, como resultado de la reperfusión, el daño puede ocurrir durante reperfusión por la acumulación tóxica de radicales libres de oxígeno.

Con respecto a la integridad de la estructura celular, la integridad puede verse interrumpida por pérdida de la integridad estructural en la membrana celular. Mantener la integridad de la membrana celular depende del control de temperatura, pH y osmolaridad. La isquemia y conservación de órganos alteran todos estos parámetros.

Las "células germinales embrionarias primordiales" (células PG o EG, descritas aquí sólo como referencia) pueden cultivarse y estimularse para producir muchos tipos de células menos diferenciadas.

Las "células progenitoras" son células producidas durante la diferenciación de una célula madre que tienen algunas, pero no todas, las características de su progenie diferenciada terminalmente. Las células progenitoras definidas, como las "células progenitoras cardíacas", están comprometidas con un linaje, pero no con un tipo celular específico o diferenciado terminalmente. El término "progenitor" como se usa en el acrónimo "MAPC" no limita estas células a un linaje particular. Una célula progenitora puede formar una célula progenie que esté más altamente diferenciada que la célula progenitora.

El término "reducir", como se usa aquí, significa prevenir así como disminuir. En el contexto del tratamiento de órganos, "reducir" es prevenir o mejorar el rechazo de órganos. Esto incluye causas o síntomas de rechazo de órganos. Esto se aplica, por ejemplo, a la causa biológica subyacente del rechazo, tal como mejorar los efectos nocivos de la inflamación.

"Seleccionar" una célula con un nivel deseado de potencia puede significar identificar (como por ensayo), aislar y expandir una célula. Esto podría crear una población que tenga una potencia más alta que la población de células originales de la que se aisló la célula. La población de células "originales" se refiere a las células originales de las que se dividieron las células seleccionadas. "Original" se refiere a una relación real P1 ^ F1 (es decir, una célula de progenie). Por tanto, si la célula X se aísla de una población mixta de células X e Y, en la que X es un expresor e Y no lo es, no se clasificaría un simple aislado de X como de expresión mejorada. Pero, si una célula de la progenie de X es un expresor superior, se clasificaría la célula de la progenie como de expresión mejorada.

La selección de una célula que logre el efecto deseado incluiría tanto un ensayo para determinar si las células logran el efecto deseado como también incluiría la obtención de esas células. La célula puede lograr naturalmente el efecto deseado en el sentido de que el efecto no se logra mediante un transgén/ADN exógeno. Pero una célula eficaz puede mejorarse incubando con o exponiendo a un agente que aumenta el efecto. Es posible que no se sepa que la población celular de la que se selecciona la célula eficaz tenga la potencia antes de realizar el ensayo. Es posible que no se sepa que la célula logre el efecto deseado antes de realizar el ensayo. Como un efecto podría depender de la expresión y/o secreción de genes, también se podría seleccionar en base a uno o más de los genes que causan el efecto.

La selección podría ser de células en un tejido. Por ejemplo, en este caso, las células se aislarían de un tejido deseado, se expandirían en cultivo, se seleccionarían para lograr el efecto deseado y las células seleccionadas se expandirían más.

La selección también podría ser de células ex vivo, tales como células en cultivo. En este caso, se analizaría una o más de las células en cultivo para lograr el efecto deseado y las células obtenidas que lograran el efecto deseado podrían expandirse más.

Las células también podrían seleccionarse por la capacidad mejorada de lograr el efecto deseado. En este caso, la población celular de la que se obtiene la célula mejorada ya tiene el efecto deseado. El efecto mejorado significa una cantidad promedio más alta por célula que en la población original.

La población original de la que se selecciona la célula mejorada puede ser sustancialmente homogénea (el mismo tipo de célula). Una forma de obtener tal célula mejorada de esta población es crear células individuales o conjuntos de células y ensayar esas células o conjuntos de células para obtener clones que naturalmente tienen el efecto mejorado (mayor) (en lugar de tratar las células con un modulador que induce o aumenta el efecto) y luego expandir aquellas células que son mejoradas naturalmente.

Sin embargo, las células se pueden tratar con uno o más agentes que inducirán o aumentarán el efecto. Por tanto, se pueden tratar poblaciones sustancialmente homogéneas para potenciar el efecto.

Si la población no es sustancialmente homogénea, entonces, es preferible que la población de células originales a tratar contenga al menos 100 del tipo celular deseado en el que se busca un efecto mejorado, más preferiblemente al menos 1,000 de las células, y aún más preferiblemente, al menos 10,000 de las células. Después del tratamiento, esta subpoblación puede recuperarse de la población heterogénea mediante técnicas de selección de células conocidas y expandirse adicionalmente si se desea.

Por lo tanto, los niveles de efecto deseados pueden ser aquellos que son más altos que los niveles en una población precedente dada. Por ejemplo, las células que se colocan en cultivo primario de un tejido y se expanden y aíslan mediante condiciones de cultivo que no están diseñadas específicamente para producir el efecto pueden proporcionar una población original. Una población original de este tipo puede tratarse para mejorar el efecto promedio por célula o cribarse para una célula o células dentro de la población que expresen mayores grados de efecto sin tratamiento deliberado. Estas células se pueden expandir luego para proporcionar una población con una expresión más alta (deseada).

La "autorrenovación" de una célula madre se refiere a la capacidad de producir células madre hijas replicadas que tienen un potencial de diferenciación idéntico al de aquellas de las que surgieron. Un término similar utilizado en este contexto es "proliferación".

“Célula madre” significa una célula que puede experimentar autorrenovación (es decir, progenie con el mismo potencial de diferenciación) y también producir células progenie que tienen un potencial de diferenciación más restringido. Dentro del contexto de la invención, una célula madre también abarcaría una célula más diferenciada que se ha desdiferenciado, por ejemplo, mediante la introducción de factores de transcripción específicos o mediante cultivo bajo condiciones específicas. Fuera del contexto de la invención, la desdiferenciación también puede ocurrir por transferencia nuclear o por fusión con una célula madre más primitiva. Véase, por ejemplo, Wilmut et al., Nature, 385:810-813 (1997); Ying et al., Nature, 416:545-548 (2002); Guan et al., Nature, 440:1199-1203 (2006); Takahashi et al., Cell, 126:663-676 (2006); Okita et al., Nature, 448:313-317 (2007); y Takahashi et al., Cell, 131:861-872 (2007).

La desdiferenciación también puede ser causada por la administración de ciertos compuestos o la exposición a un ambiente físico in vitro o in vivo que causaría la desdiferenciación. Las células madre también pueden derivarse de tejido anormal, como un teratocarcinoma y algunas otras fuentes, como los cuerpos embrioides (aunque estas pueden considerarse células madre embrionarias en el sentido de que se derivan del tejido embrionario, aunque no directamente de la masa celular interna). Las células madre también se pueden producir mediante la introducción de genes asociados con la función de las células madre en una célula no madre, como una célula madre pluripotente inducida.

"Sujeto" significa un vertebrado, como un mamífero, como un humano. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, humanos, perros, gatos, caballos, vacas y cerdos.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un agente determinado para producir cualquier respuesta terapéutica en un mamífero. Por ejemplo, los agentes terapéuticos antiinflamatorios eficaces pueden prolongar la supervivencia del paciente y/o inhibir los síntomas clínicos evidentes. Los tratamientos que son terapéuticamente efectivos dentro del significado del término como se usa aquí, incluyen tratamientos que mejoran la calidad de vida de un sujeto incluso si no mejoran el resultado de la enfermedad per se. Dichas cantidades terapéuticamente eficaces las puede determinar fácilmente una persona experimentada en la técnica. Por lo tanto, "tratar" significa administrar tal cantidad. Por lo tanto, el tratamiento puede prevenir o mejorar cualquier síntoma patológico.

El término "tolerancia" o "tolerar" se refiere al tratamiento del órgano pretrasplante (injerto) con las células madre para reducir la inmunogenicidad del injerto para permitir o facilitar el desarrollo de tolerancia del órgano por parte del receptor. El término se refiere ampliamente al concepto de reducir la inmunogenicidad del órgano trasplantado, lo que permite o facilita el desarrollo de tolerancia por parte del receptor. Por lo tanto, crear tolerancia al órgano hace que el receptor lo tolere. En otras palabras, el término puede referirse a hacer que el sistema inmunológico sea incapaz de provocar una respuesta inmunitaria a una célula o tejido que normalmente provoca una respuesta inmunitaria. Un ejemplo de esto es cuando una célula T reguladora secreta factores que suprimen una célula T activada, de modo que esta ya no puede secretar citocinas proinflamatorias.

Esto podría lograrse mediante un tratamiento ex vivo antes del trasplante, o incluso mediante la administración local antes de la recolección.

"Tratar", "tratando" o "tratamiento" se utilizan ampliamente en relación con la divulgación y cada uno de estos términos abarca, entre otros, prevenir, mejorar, inhibir o curar una deficiencia, disfunción, enfermedad u otro proceso nocivo, incluidos los que interfieren y/o resultan de una terapia.

"Validar" significa confirmar. En el contexto de la divulgación, se confirma que una célula es un expresor con una potencia deseada. Esto es para que luego se pueda usar esa célula (en tratamiento, banco, detección de fármacos, etc.) con una expectativa razonable de eficacia. En consecuencia, validar significa confirmar que las células, habiéndose encontrado originalmente/establecido que tienen la actividad deseada, de hecho, retienen esa actividad. Por lo tanto, la validación es un evento de verificación en un proceso de dos eventos que involucra la determinación original y la determinación de seguimiento. El segundo evento se denomina aquí "validación".

Células madre

La presente invención se puede poner en práctica utilizando células madre únicamente como se define en las reivindicaciones, que pueden ser de especies de vertebrados, tales como humanos, primates no humanos, animales domésticos, ganado y otros mamíferos no humanos. Los tipos de células madre (aquellas que son células madre embrionarias y células germinales quedan fuera del alcance de las reivindicaciones y por consiguiente, están marcadas como "para referencia") se describen a continuación.

Células madre embrionarias (para referencia)

La célula madre mejor estudiada es la célula madre embrionaria (ESC) ya que tiene un potencial ilimitado de autorrenovación y diferenciación multipotente. Estas células se derivan de la masa celular interna del blastocisto o se pueden derivar de las células germinales primordiales de un embrión postimplantación (células germinales embrionarias o células EG). Las células ES y EG se han derivado, primero de ratón y luego de muchos animales diferentes y, más recientemente, también de primates no humanos y humanos. Cuando se introducen en blastocistos de ratón o blastocistos de otros animales, los ESC pueden contribuir a todos los tejidos del animal. Las células ES y EG pueden identificarse mediante tinción positiva con anticuerpos contra SSEA1 (ratón) y SSEA4 (humano). Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nos.

5,453,357; 5,656,479; 5,670,372; 5,843,780; 5,874,301; 5,914,268; 6,110,7396,190,910; 6,200,806; 6,432,711; 6,43 6,701, 6,500,668; 6,703,279; 6,875,607; 7,029,913; 7,112,437; 7,145,057; 7,153,684; y 7,294,508 cada uno de los cuales enseña células madre embrionarias y métodos para producirlas y expandirlas. Por consiguiente, los ESC y métodos para aislarlos y expandirlos son bien conocidos en la técnica.

Se han identificado varios factores de transcripción y citocinas exógenas que influyen en el estado de potencia de las células madre embrionarias in vivo. El primer factor de transcripción que se describirá que participa en la pluripotencia de las células madre es Oct4. Oct4 pertenece a la familia de factores de transcripción POU (Pit-Oct-Unc) y es una proteína de enlace al ADN que es capaz de activar la transcripción de genes, que contiene una secuencia octamérica llamada "motivo octámero" dentro de la región promotora o potenciadora. Oct4 se expresa en el momento de la etapa de escisión del cigoto fertilizado hasta que se forma el cilindro del huevo. La función de Oct3/4 es reprimir los genes que inducen la diferenciación (es decir, FoxaD3, hCG) y activar genes que promueven la pluripotencia (FGF4, Utf1, Rex1). Sox2, un miembro de los factores de transcripción de caja del grupo de alta movilidad (HMG), coopera con Oct4 para activar la transcripción de genes expresados en la masa celular interna. Es fundamental que la expresión de Oct3/4 en las células madre embrionarias se mantenga entre ciertos niveles. La sobreexpresión o la subrregulación de > 50 % del nivel de expresión de Oct4 alterará el destino de las células madre embrionarias, con la formación de endodermo/mesodermo primitivo o trofectodermo, respectivamente. In vivo, los embriones deficientes en Oct4 se desarrollan hasta la etapa de blastocisto, pero las células de la masa celular interna no son pluripotentes. En cambio, se diferencian a lo largo del linaje de trofoblasto extraembrionario. Sall4, un factor de transcripción Spalt de mamíferos, es un regulador corriente arriba de Oct4 y, por lo tanto, es importante mantener niveles apropiados de Oct4 durante las fases tempranas de embriología. Cuando los niveles de Sall4 caen por debajo de un cierto umbral, las células trofectodérmicas se expandirán ectópicamente hacia la masa celular interna. Otro factor de transcripción necesario para la pluripotencia es Nanog, que lleva el nombre de una tribu celta "Tir Nan Og": la tierra de los siempre jóvenes. In vivo, Nanog se expresa a partir de la etapa de la mórula compactada, se define posteriormente a la masa celular interna y se subrregula por la etapa de implantación. La subrregulación de Nanog puede ser importante para evitar una expansión incontrolada de células pluripotentes y para permitir la diferenciación multilinaje durante la gastrulación. Los embriones nulos de Nanog, aislados en el día 5.5, consisten en un blastocisto desorganizado, que contiene principalmente endodermo extraembrionario y sin epiblasto discernible.

Células madre no embrionarias

Se han identificado células madre en la mayoría de los tejidos. Quizás la mejor caracterizada sea la célula madre hematopoyética (HSC). Las HSC son células derivadas del mesodermo que pueden purificarse utilizando marcadores de superficie celular y características funcionales. Se han aislado de la médula ósea, sangre periférica, sangre del cordón, hígado fetal y saco vitelino. Inician la hematopoyesis y generan múltiples linajes hematopoyéticos. Cuando se trasplantan a animales irradiados letalmente, pueden repoblar el conjunto de células de neutrófilos-macrófagos eritroides, megacariocitos y linfoides hematopoyéticas. También se les puede inducir a que se sometan a cierta división celular de autorrenovación. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,635,387; 5,460,964; 5,677,136; 5,750,397; 5,681,599; y 5,716,827. La patente de Estados Unidos No.

5,192,553 reporta métodos para aislar células madre o progenitoras hematopoyéticas neonatales o fetales humanas. La Patente de Estados Unidos No. 5,716,827 reporta células hematopoyéticas humanas que son progenitoras Thy-1+ y medios de crecimiento apropiados para regenerarlas in vitro. La patente de Estados Unidos No. 5,635,387 reporta sobre un método y dispositivo para cultivar células hematopoyéticas humanas y sus precursores. La Patente de Estados Unidos No. 6,015,554 describe un método de reconstitución de células dendríticas y linfoides humanas. Por consiguiente, las HSC y los métodos para aislarlas y expandirlas son bien conocidos en la técnica.

Otra célula madre que es bien conocida en la técnica es la célula madre neural (NSC). Estas células pueden proliferar in vivo y regenerar continuamente al menos algunas células neuronales. Cuando se cultivan ex vivo, se puede inducir la proliferación y la diferenciación de células madre neurales en diferentes tipos de neuronas y células gliales. Cuando se trasplantan al cerebro, las células madre neurales pueden injertarse y generar células neurales y gliales. Véase, por ejemplo, Gage F.H., Science, 287:1433-1438 (2000), Svendsen S.N. et al., Brain Pathology, 9:499-513 (1999), y Okabe S. et al., Mech Development, 59:89-102 (1996). La patente de Estados Unidos No.

5,851,832 reporta sobre células madre neurales multipotentes obtenidas a partir de tejido cerebral. La patente de Estados Unidos No. 5,766,948 reporta sobre la producción de neuroblastos a partir de hemisferios cerebrales de recién nacidos. Las Patentes de Estados Unidos No. 5,564,183 y 5,849,553 reportan el uso de células madre de la cresta neural de mamíferos. La patente de Estados Unidos No. 6.040,180 reporta la generación in vitro de neuronas diferenciadas a partir de cultivos de células madre del CNS multipotenciales de mamíferos. Los documentos WO 98/50526 y WO 99/01159 reportan sobre la generación y aislamiento de células madre neuroepiteliales, precursores de oligodendrocitos-astrocitos y precursores neuronales de linaje restringido. La patente de Estados Unidos No.

5,968,829 reporta sobre células madre neurales obtenidas del prosencéfalo embrionario. Por consiguiente, las células madre neurales y los métodos para fabricarlas y expandirlas son bien conocidos en la técnica.

Otra célula madre que se ha estudiado extensamente en la técnica es la célula madre mesenquimal (MSC). Las MSC se derivan del mesodermo embrionario y se pueden aislar de muchas fuentes, incluida la médula ósea adulta, sangre periférica, grasa, placenta y sangre umbilical, entre otras. Las MSC pueden diferenciarse en muchos tejidos mesodérmicos, incluidos músculo, hueso, cartílago, grasa y tendón. Existe una bibliografía considerable sobre estas células. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos No.

5,486,389; 5,827,735; 5,811,094; 5,736,396; 5,837,539; 5,837,670; y 5,827,740. Véase también Pittenger, M. et al., Science, 284:143-147 (1999).

Otro ejemplo de una célula madre adulta son las células madre adultas derivadas de tejido adiposo (ADSC) que se han aislado de grasa, típicamente mediante liposucción seguida de liberación de las ADSC utilizando colagenasa. Las ADSC son similares en muchos aspectos a las MSC derivadas de la médula ósea, excepto que es posible aislar muchas más células de la grasa. Se ha reportado que estas células se diferencian en hueso, grasa, músculo, cartílago y neuronas. Se ha descrito un método de aislamiento en la publicación de patente de Estados Unidos No.

2005/0153442 A1.

Otras células madre que se conocen en la técnica incluyen células madre gastrointestinales, células madre epidérmicas y células madre hepáticas, que también se han denominado "células ovaladas" (Potten, C., et al., Trans R Soc Lond B Biol Sci, 353:821-830 (1998), Watt, F., Trans R Soc Lond B Biol Sci, 353:831 (1997); Alison et al., Hepatology, 29:678-683 (1998).

Otras células no embrionarias de las que se ha reportado que son capaces de diferenciarse en tipos de células de más de una capa germinal embrionaria incluyen, pero no se limitan a, células de sangre del cordón umbilical (ver la publicación de Estados Unidos No. 2002/0164794), placenta (ver la publicación de Estados Unidos No.

2003/0181269, matriz de cordón umbilical (Mitchell, KE et al., Stem Cells, 21:50-60 (2003)), células madre pequeñas de tipo embrionario (Kucia, M. et al., J Physiol Pharmacol, 57 Suppl 5:5-18 (2006)), células madre de líquido amniótico (Atala, A., J Tissue Regen Med, 1:83-96 (2007)), precursores derivados de la piel (Toma et al., Nat Cell Biol, 3:778-784 (2001)), médula ósea (ver las publicaciones de patente de Estados Unidos Nos. 2003/0059414 y 2006/0147246), células adultas inducibles multilinaje (MIAMI) aisladas de médula ósea (ver PCT/US2004/002580) y células endometriales (ver la Publicación de Estados Unidos No. 2013/0156726), cada una de las cuales enseña estas células.

Estrategias de reprogramación de células somáticas (para referencia)

Se han empleado varias estrategias diferentes, tales como trasplante nuclear, fusión celular y reprogramación inducida por cultivo para inducir la conversión de células diferenciadas en un estado embrionario. La transferencia nuclear implica la inyección de un núcleo somático en un ovocito enucleado que, tras la transferencia a una madre sustituta, puede dar lugar a un clon ("clonación reproductiva") o, tras la explantación en cultivo, puede dar lugar a células madre embrionarias (ES) genéticamente compatibles ("transferencia nuclear de células somáticas", SCNT). La fusión celular de células somáticas con células ES da como resultado la generación de híbridos que muestran todas las características de células ES pluripotentes. La explantación de células somáticas en cultivo selecciona líneas celulares inmortales que pueden ser pluripotentes o multipotentes. En la actualidad, las células madre espermatogoniales son la única fuente de células pluripotentes que pueden derivarse de animales postnatales. La transducción de células somáticas con factores definidos puede iniciar la reprogramación a un estado pluripotente. Estas metodologías experimentales se han revisado extensamente (Hochedlinger and Jaenisch, Nature, 441:1061-1067 (2006) y Yamanaka, S., Cell Stem Cell, 1:39-49 (2007)).

Transferencia nuclear (para referencia)

El trasplante nuclear (NT), también denominado transferencia nuclear de células somáticas (SCNT), denota la introducción de un núcleo de una célula somática de un donante en un ogocito enucleado para generar un animal clonado como la oveja Dolly (Wilmut et al., Nature, 385:810-813 (1997). La generación de animales vivos por NT demostró que el estado epigenético de células somáticas, incluido el de las células diferenciadas terminalmente, aunque es estable, no es fijo irreversible, sino que puede reprogramarse a un estado embrionario que es capaz de dirigir el desarrollo de un nuevo organismo. Además de proporcionar una metodología experimental emocionante para dilucidar los mecanismos epigenéticos básicos involucrados en el desarrollo embrionario y enfermedad, la tecnología de clonación nuclear es de interés potencial para la medicina de trasplantes específicos para pacientes.

Fusión de células somáticas y células madre embrionarias (para referencia)

Se ha demostrado la reprogramación epigenética de núcleos somáticos a un estado indiferenciado en híbridos murinos producidos por fusión de células embrionarias con células somáticas. Híbridos entre diversas células somáticas y células de carcinoma embrionario (Solter, D., Nat Rev Genet, 7:319-327 (2006), germen embrionario (EG) o células ES (Zwaka y Thomson, Development, 132:227-233 (2005)) comparten muchas características con las células embrionarias originales, lo que indica que el fenotipo pluripotente es dominante en dichos productos de fusión. Al igual que con el ratón (Tada et al., Curr Biol, 11:1553-1558 (2001)), las células ES humanas tienen el potencial para reprogramar núcleos somáticos después de la fusión (Cowan et al., Science, 309:1369-1373 (2005)); Yu et al., Science, 318:1917-1920 (2006)). La activación de marcadores de pluripotencia silenciosos como Oct4 o la reactivación del cromosoma X somático inactivo proporcionó evidencia molecular para la reprogramación del genoma somático en las células híbridas. Se ha sugerido que la replicación del ADN es esencial para la activación de los marcadores de pluripotencia, que se observa por primera vez 2 días después de fusión (Do and Scholer, Stem Cells, 22:941-949 (2004)), y que la sobreexpresión forzada de Nanog en células ES promueve la pluripotencia cuando se fusionan con células madre neurales (Silva et al., Nature, 441:997-1001 (2006)).

Reprogramación inducida por cultivo

Las células pluripotentes se han derivado de fuentes embrionarias como blastómeros y la masa celular interna (ICM) del blastocisto (células ES), el epiblasto (células EpiSC), células germinales primordiales (células EG) y células madre espermatogoniales postnatales ("maGSCsm” células "tipo ES"). Las células aisladas de células madre embrionarias y células germinales se describen solo como referencia. Las siguientes células pluripotentes, junto con su tejido/célula donante, son las siguientes: las células ES partogenéticas se derivan de ovocitos murinos (Narasimha et al., Curr Biol, 7:881-884 (1997)); las células madre embrionarias se han derivado de blastómeros (Wakayama et al., Stem Cells, 25:986-993 (2007)); células de masa celular interna (fuente no aplicable) (Eggan et al., Nature, 428:44-49 (2004)); células germinales embrionarias y de carcinoma embrionario se han derivado de células germinales primordiales (Matsui et al., Cell, 70:841-847 (1992)); GMCS, maSSC y MASC se han obtenido de células madre espermatogoniales (Guan et al., Nature, 440:1199-1203 (2006); Kanatsu-Shinohara et al., Cell, 119:1001-1012 (2004); y Seandel et al., Nature, 449:346-350 (2007)); las células EpiSC se derivan de epiblastos (Brons et al., Nature, 448:191-195 (2007); Tesar et al., Nature, 448:196-199(2007)); las células ES partogenéticas se han derivado de ovocitos humanos (Cibelli et al., Science, 295L819 (2002); Revazova et al., Cloning Stem Cells, 9:432-449 (2007)); las células madre embrionarias humanas se han derivado de blastocistos humanos (Thomson et al., Science, 282:1145-1147 (1998)); las MAPC se han obtenido de médula ósea (Jiang et al., Nature, 418:41-49 (2002); Phinney and Prockop, Stem Cells, 25:2896-2902 (2007)); células de sangre de cordón (derivadas de sangre de cordón) (van de Ven y col., Exp Hematol, 35:1753-1765 (2007)); células derivadas de neuroesferas derivadas de células neurales (Clarke et al., Science, 288:1660-1663 (2000)). Se sabe que las células donantes del linaje de células germinales, como las PGC o las células madre espermatogoniales, son unipotentes in vivo, pero se ha demostrado que las células pluripotentes tipo ES (Kanatsu-Shinohara et al., Cell, 119:1001-1012 (2004)) o maGSCs (Guan et al., Nature, 440:1199-1203 (2006), pueden aislarse después de un cultivo in vitro prolongado. Si bien la mayoría de estos tipos de células pluripotentes eran capaces de diferenciación in vitro y formación de teratomas, solo ES, EG, EC, y las maGCS derivadas de células madre espermatogoniales o células tipo ES eran pluripotentes según criterios más estrictos, ya que podían formar quimeras postnatales y contribuir a la línea germinal. Recientemente, las células madre espermatogoniales adultas multipotentes (MASCs) se derivaron de células madre espermatogoniales testiculares de ratones adultos, y estas células tenían un perfil de expresión diferente al de las células ES (Seandel et al., Nature, 449:346-350 (2007)) pero similar a las células EpiSC, que se derivan del epiblasto de embriones de ratón postimplante (Brons et al., Nature, 448:191-195 (2007); Tesar et al., Nature, 448:196-199 (2007)).

Reprogramación por factores de transcripción definidos

Takahashi y Yamanaka han reportado de la reprogramación de células somáticas de regreso a un estado tipo ES (Takahashi and Yamanaka, Cell, 126:663-676 (2006)). Reprogramaron con éxito fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) y fibroblastos adultos a células tipo ES pluripotentes después de la transducción mediada por virus de los cuatro factores de transcripción Oct4, Sox2, c-myc y Klf4 seguido de la selección para la activación del gen diana Oct4 Fbx15. Las células que habían activado Fbx15 se acuñaron células iPS (madre pluripotente inducida) y se demostró que eran pluripotentes por su capacidad para formar teratomas, aunque no podían generar quimeras vivas. Este estado pluripotente dependía de la expresión viral continua de los genes transducidos Oct4 y Sox2, mientras que los genes endógenos Oct4 y Nanog no se expresaban o se expresaban a un nivel más bajo que en las células ES, y se encontró que sus respectivos promotores eran en gran parte metilados. Esto es coherente con la conclusión de que las células Fbx15-iPS no se correspondían con las células ES pero pueden haber representado un estado de reprogramación incompleto. Si bien los experimentos genéticos habían establecido que Oct4 y Sox2 son esenciales para la pluripotencia (Chambers and Smith, Oncogene, 23:7150-7160 (2004); Ivanona et al., Nature, 442:5330538 (2006); Masui et al., Nat Cell Biol, 9:625-635 (2007)), el papel de los dos oncogenes c-myc y Klf4 en la reprogramación es menos claro. De hecho, algunos de estos oncogenes pueden ser prescindibles para la reprogramación, ya que tanto las células iPS humanas como las de ratón se han obtenido en ausencia de transducción de c-myc, aunque con baja eficacia (Nakagawa et al., Nat Biotechnol, 26:191-106 (2008); Werning et al., Nature, 448:318-324 (2008); Yu et al., Science, 318:1917-1920 (2007)).

MAPC

Las MAPC humanas se describen en la patente de Estados Unidos 7,015,037. Se han identificado MAPC en otros mamíferos. Las MAPC murinas, por ejemplo, también se describen en la patente de Estados Unidos 7,015,037. Las MAPC de rata también se describen en la patente de Estados Unidos No. 7,838,289.

Estas referencias describen MAPC aisladas por primera vez por Catherine Verfaillie.

Aislamiento y crecimiento de MAPC

Los métodos de aislamiento de MAPC se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 7,015,037 y estos métodos, junto con la caracterización (fenotipo) de MAPc . Las MAPC se pueden aislar de múltiples fuentes, que incluyen, pero no se limitan a, médula ósea, placenta, cordón umbilical y sangre de cordón, músculo, cerebro, hígado, médula espinal, sangre o piel. Por lo tanto, es posible obtener aspirados de médula ósea, biopsias de cerebro o hígado y otros órganos, y aislar las células utilizando técnicas de selección positiva o negativa disponibles para las personas experimentadas en la técnica, dependiendo de los genes que se expresan (o no se expresan) en estas células (por ejemplo, mediante ensayos funcionales o morfológicos tales como los divulgados en las solicitudes mencionadas anteriormente).

Las MAPC también se han obtenido con los métodos modificados descritos en Breyer et al., Experimental Hematology, 34:1596-1601 (2006) y Subramanian et al., Cellular Programming and Reprogramming: Methods and Protocols; S. Ding (ed.), Methods in Molecular Biology, 636:55-78 (2010).

MAPC de la médula ósea humana como se describe en la patente de Estados Unidos 7,015,037

Las MAPC no expresan el antígeno leucocitario común CD45 ni la glicoforina A específica de eritroblastos (Gly-A). La población mixta de células se sometió a una separación de Ficoll Hypaque. A continuación, las células se sometieron a selección negativa usando anticuerpos anti-CD45 y anti-Gly-A, agotando la población de células CD45+ y Gly-A+, y luego se recuperó el aproximadamente 0.1 % restante de células mononucleares de la médula. Las células también se podrían sembrar sobre placa en pozos recubiertos con fibronectina y cultivadas como se describe a continuación durante 2-4 semanas para agotar las células de células CD45+ y Gly-A+. En cultivos de células de médula ósea adherentes, muchas células estromales adherentes experimentan senescencia replicativa alrededor de la duplicación de células 30 y una población de células más homogénea continúa expandiéndose y mantiene telómeros largos.

Alternativamente, la selección positiva podría usarse para aislar células mediante una combinación de marcadores específicos de células. Tanto las técnicas de selección positiva como las negativas están disponibles para las personas experimentadas en la técnica, y también están disponibles en la técnica numerosos anticuerpos monoclonales y policlonales adecuados para propósitos de selección negativa (ver, por ejemplo, Leukocyte Typing V, Schlossman, et al., Eds. (1995) Oxford University Press) y están disponibles comercialmente de varias fuentes. Las técnicas para la separación de células de mamíferos a partir de una mezcla de poblaciones de células también han sido descritas por Schwartz, et al., en la Patente de Estados Unidos No. 5,759,793 (separación magnética), Basch et al., 1983 (cromatografía de inmunoafinidad) y Wysocki and Sato, 1978 (clasificación de células activadas por fluorescencia).

Las células se pueden cultivar en medio de cultivo con bajo contenido de suero o sin suero. El medio sin suero utilizado para cultivar MAPC se describe en la patente de Estados Unidos 7,015,037. Los factores de crecimiento comúnmente usados incluyen, pero no se limitan a, factor de crecimiento derivado de plaquetas y factor de crecimiento epidérmico. Ver, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nos.

7,169,610; 7,109,032; 7,037,721; 6,617,161; 6,617,159; 6,372,210;6,224,860; 6,037,174; 5,908,782; 5,766,951; 5,39 7,706; y 4,657,866; todos enseñan células en crecimiento en medio sin suero.

Métodos de cultivo adicionales

En experimentos adicionales, la densidad a la que se cultivan las MAPC puede variar de aproximadamente 100 células/cm2 o aproximadamente 150 células/cm2 a aproximadamente 10,000 células/cm2, incluidas aproximadamente 200 células/cm2 a aproximadamente 1500 células/cm2 a aproximadamente 2000 células/cm2. La densidad puede variar entre especies. Además, la densidad óptima puede variar según las condiciones de cultivo y la fuente de células. Está dentro de la habilidad de la persona de experiencia ordinaria en la técnica determinar la densidad óptima para un conjunto dado de condiciones de cultivo y células.

Además, las concentraciones de oxígeno atmosférico efectivas de menos de aproximadamente el 10 %, incluyendo aproximadamente el 1-5 % y, especialmente, el 3-5 %, se pueden usar en cualquier momento durante el aislamiento, crecimiento y diferenciación de MAPC en cultivo.

Las células se pueden cultivar bajo diversas concentraciones de suero, por ejemplo, aproximadamente 2-20 %. Se puede utilizar suero fetal bovino. Se puede usar más suero en combinación con tensiones de oxígeno más bajas, por ejemplo, aproximadamente del 15-20 %. No es necesario seleccionar las células antes de la adherencia a las placas de cultivo. Por ejemplo, después de un gradiente de Ficoll, las células se pueden sembrar directamente sobre placa, por ejemplo, 250,000-500,000/cm2 Las colonias adherentes se pueden recoger, posiblemente agrupar y expandir. En un caso, usado en los procedimientos experimentales en los Ejemplos, se usaron condiciones de suero alto (aproximadamente 15-20 %) y bajo oxígeno (aproximadamente 3-5 %) para el cultivo celular. Específicamente, las células adherentes de colonias se sembraron sobre placa y se pasaron a densidades de aproximadamente 1700­ 2300 células/cm2 en suero al 18 % y oxígeno al 3 % (con PDGF y EGF).

En un caso específico para MAPC, los suplementos son factores o componentes celulares que permiten que las MAPC retengan la capacidad de diferenciarse en tipos de células de más de un linaje embrionario, como los tres linajes. Esto puede estar indicado por la expresión de marcadores específicos del estado indiferenciado, como Oct 3/4 (Oct 3A) y/o marcadores de alta capacidad de expansión, como telomerasa.

Cultivo celular

Para todos los componentes enumerados a continuación, ver el documento U.S. 7,015,037, que enseña estos componentes.

En general, las células útiles para la invención se pueden mantener y expandir en un medio de cultivo que está disponible y es bien conocido en la técnica. También se contempla la suplementación del medio de cultivo celular con sueros de mamíferos. También se pueden utilizar ventajosamente suplementos adicionales para suministrar a las células los oligoelementos necesarios para un crecimiento y expansión óptimos. Las hormonas también pueden usarse ventajosamente en cultivo celular. Los lípidos y los portadores de lípidos también se pueden utilizar para complementar los medios de cultivo celular, según el tipo de célula y el destino de la célula diferenciada. También se contempla el uso de capas de células alimentadoras.

Las células en cultivo se pueden mantener en suspensión o unidas a un soporte sólido, como componentes de la matriz extracelular. Las células madre a menudo requieren factores adicionales que fomenten su unión a un soporte sólido, como colágeno tipo I y tipo II, sulfato de condroitina, fibronectina, "superfibronectina" y polímeros tipo fibronectina, gelatina, poli-D y poli-L-lisina, trombospondina y vitronectina. Un ejemplo de la presente divulgación utiliza fibronectina. Ver, por ejemplo, Ohashi et al., Nature Medicine, 13:880-885 (2007); Matsumoto et al., J Bioscience and Bioengineering, 105:350-354 (2008); Kirouac et al., Cell Stem Cell, 3:369-381 (2008); Chua et al., Biomaterials, 26:2537-2547 (2005); Drobinskaya et al., Stem Cells, 26:2245-2256 (2008); Dvir-Ginzberg et al., FASEB J, 22:1440-1449 (2008); Turner et al., J Biomed Mater Res Part B: Appl Biomater, 82B:156-168 (2007); y Miyazawa et al., Journal of Gastroenterology and Hepatology, 22:1959-1964 (2007)).

Las células también se pueden hacer crecer en cultivos "3D" (agregados). Un ejemplo es PCT/US2009/31528, presentado el 21 de enero de 2009.

Una vez establecidas en cultivo, las células pueden usarse frescas o congeladas y almacenarse como reservas congeladas, usando, por ejemplo, DMEM con FCS al 40 % y DMSO al 10 %. También están disponibles para las personas experimentadas en la técnica otros métodos para preparar reservas congeladas para células cultivadas.

Formulaciones farmacéuticas

El documento U.S. 7,015,037 enseña formulaciones farmacéuticas. En ciertos casos, las poblaciones de células están presentes en una composición adaptada y adecuada para administración, es decir, fisiológicamente compatible.

Las formulaciones estarían orientadas al grado de efecto deseado, como reducción de inflamación, reducción de apoptosis, edema, etc., sobrerregulación de ciertos factores, etc.

En algunos casos, la pureza de las células para la administración a un órgano es de aproximadamente el 100 % (sustancialmente homogénea). En otros casos, es del 95 % al 100 %. En algunos casos, es del 85 % al 95 %. Particularmente, en el caso de mezclas con otras células, el porcentaje puede ser aproximadamente 10 %-15 %, 15 %-20 %, 20 %-25 %, 25 %-30 %, 30 %-35 %, 35 %-40 %, 40 %-45 %, 45 %-50 %, 60 %-70 %, 70 %-80 %, 80 %-90 % o 90 %-95 %. O el aislamiento/pureza se puede expresar en términos de duplicaciones de células donde las células han sufrido, por ejemplo, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50 o más duplicaciones celulares.

La elección de la formulación para administrar las células dependerá de una variedad de factores. Entre estos se destacarán la especie de donante/receptor, la naturaleza del órgano que se está tratando, la naturaleza de otras terapias y agentes que se están administrando, la vía óptima de administración, supervivencia a través de la vía eficaz, el régimen de dosificación y otros factores que resultarán evidentes para las personas experimentadas en la técnica. Por ejemplo, la elección de portadores adecuados y otros aditivos dependerá de la ruta exacta de administración y la naturaleza de la forma de dosificación particular.

Las formulaciones finales de la suspensión acuosa de células/medio implicarán típicamente ajustar la fuerza iónica de la suspensión a isotonicidad (es decir, aproximadamente 0.1 a 0.2) y al pH fisiológico (es decir, aproximadamente pH 6.8 a 7.5). La formulación final también contendrá típicamente un lubricante fluido.

La persona experimentada en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad de células y aditivos, vehículos y/o portadores opcionales en las composiciones a administrar en los métodos de la divulgación. Normalmente, cualquier aditivo (además de las células) está presente en una cantidad de 0.001 a 50 % en peso en solución, tal como en solución salina regulada con fosfato. El ingrediente activo está presente en el orden de microgramos a miligramos, tal como aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 5 % en peso, preferiblemente aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 1 % en peso, más preferiblemente aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 0.05 % en peso o aproximadamente 0.001 a aproximadamente 20 % en peso, preferiblemente de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 10 % en peso, y lo más preferible de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 5 % en peso.

En algunos casos, las células se encapsulan para administración, particularmente donde la encapsulación mejora la eficacia o proporciona ventajas en la manipulación y/o vida útil. Las células pueden estar encapsuladas por membranas, así como cápsulas. Se contempla que se pueda emplear cualquiera de los muchos métodos de encapsulación de células disponibles.

Puede usarse una amplia variedad de materiales en diversos casos para microencapsulación de células. Dichos materiales incluyen, por ejemplo, cápsulas de polímero, microcápsulas de alginato-poli-L-lisina-alginato, cápsulas de alginato de poli-L-lisina de bario, cápsulas de alginato de bario, fibras huecas de poliacrilonitrilo/cloruro de polivinilo (PAN/PVC) y fibras huecas de polietersulfona (PES).

Las técnicas para la microencapsulación de células que pueden usarse para la administración de células son conocidas por las personas experimentadas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Chang, P., et al., 1999; Matthew, H.W., et al., 1991; Yanagi, K., et al., 1989; Cai Z.H., et al., 1988; Chang, T.M., 1992 y en la patente de Estados Unidos No. 5,639,275 (que, por ejemplo, describe una cápsula biocompatible para el mantenimiento a largo plazo de células que expresan de forma estable moléculas biológicamente activas). Los métodos adicionales de encapsulación se encuentran en la Publicación de Patente Europea No. 301,777 y las Patentes de Estados Unidos Nos. 4,353,888; 4,744,933; 4,749,620; 4,814,274; 5,084,350; 5,089,272; 5,578,442; 5,639,275; y 5,676,943.

Ciertos casos incorporan células en un polímero, como un biopolímero o un polímero sintético. Los ejemplos de biopolímeros incluyen, pero no se limitan a, fibronectina, fibrina, fibrinógeno, trombina, colágeno y proteoglicanos. También se pueden incorporar al polímero otros factores, tales como las citocinas discutidas anteriormente. En otros casos de la divulgación, las células pueden incorporarse en los intersticios de un gel tridimensional. Normalmente, se implantará quirúrgicamente un polímero o gel grande. Un polímero o gel que puede formularse en partículas o fibras suficientemente pequeñas puede administrarse por otras vías comunes no quirúrgicas más convenientes.

La dosificación de las células variará dentro de amplios límites y se ajustará a los requisitos individuales en cada caso particular. El número de células variará dependiendo del tipo, peso y estado del órgano, el número o frecuencia de administraciones y otras variables conocidas por las personas experimentadas en la técnica. Las células se pueden administrar por una vía que sea adecuada para el tejido u órgano. Los ejemplos de vías de administración adecuadas pueden incluir administración intratraqueal (por ejemplo, para pulmón), administración intravenosa, administración intraarterial (por ejemplo, intracoronaria), inyección directa en el órgano y administración por sistema intra linfático.

Las células se pueden suspender en un excipiente apropiado en una concentración de aproximadamente 0.01 a 1 x 105 células/ml, aproximadamente 1 x 105 células/ml a 10 x 106 células/ml, o aproximadamente 10 x 106 células/ml a 5 x107 células/ml. Los excipientes adecuados son aquellos que son biológica y fisiológicamente compatibles con las células y con el órgano receptor, tales como solución salina regulada u otros excipientes adecuados. La composición para administración se puede formular, producir y almacenar de acuerdo con métodos estándar que cumplan con la esterilidad y estabilidad adecuadas.

Dosificación

Las dosis (es decir, el número de células) para humanos u otros mamíferos pueden determinarse sin experimentación indebida por parte de la persona experimentada en la técnica, a partir de esta descripción, los documentos aquí citados y el conocimiento en la técnica. La dosis óptima que se utilizará de acuerdo con diversos casos de la divulgación dependerá de numerosos factores, incluidos los siguientes: la enfermedad que se está tratando y su etapa; la especie del donante, su salud, sexo, edad, peso y rata metabólica; la inmunocompetencia del donante; otras terapias administradas; y complicaciones potenciales esperadas a partir de la historia o el genotipo del donante. Los parámetros también pueden incluir: si las células son singénicas, autólogas, alogénicas o xenogénicas; su potencia; el sitio y/o distribución que se debe direccionar; y características del sitio como la accesibilidad a las células. Los parámetros adicionales incluyen la coadministración con otros factores (como factores de crecimiento y citocinas). La dosis óptima en una situación dada también tendrá en cuenta la forma en que se formulan las células, la forma en que se administran (por ejemplo, perfusión, intraórgano, etc.) y el grado en que las células se localizarán en los sitios diana después de la administración.

En última instancia, los niveles de dosis, momento y frecuencia estarían determinados por la eficacia. Esto se medirá por la salud y la viabilidad del órgano, y posiblemente por la función del órgano y las medidas clínicas post trasplante. Tales medidas variarán según el órgano. En un caso, podrían incluir medidas de función de órganos. Se puede acceder a medidas de viabilidad de órganos para trasplantes a través de la literatura clínica. En otro caso, el nivel o niveles o patrón o patrones de ciertos marcadores (por ejemplo, niveles de ARNm tisular, niveles de citocinas y número de células inflamatorias) se pueden ensayar (por ejemplo, usando qPCR) para determinar la efectividad. Por ejemplo, el nivel de ARNm de IL-10 de tejido pulmonar se puede ensayar mediante qPCR para determinar la eficacia. En otro ejemplo, se podría evaluar la dosis en el pulmón por el impacto en: niveles de citocinas; otros marcadores inflamatorios en fluidos (por ejemplo, obtenidos por lavado broncoalveolar); niveles de edema; medidas hemodinámicas y ventilatorias; y evaluación del intercambio de gases en pulmones ex vivo (re)perfundidos.

En diversos casos, las células/medio pueden administrarse en una dosis inicial y, posteriormente, mantenerse mediante administración adicional. Las células pueden administrarse mediante un método inicialmente y, posteriormente, administrarse mediante el mismo método o uno o más métodos diferentes. Los niveles se pueden mantener mediante la administración continua de las células/medio. Diversos casos administran las células inicialmente o para mantener su nivel en el sujeto o ambos mediante inyección intravenosa. En una variedad de casos, se usan otras formas de administración, dependiendo del tipo y condición del órgano y otros factores, discutidos en otra parte aquí.

Las células/medio se pueden administrar en muchas frecuencias en un amplio intervalo de tiempos. Generalmente, la duración del tratamiento será proporcional a la duración del proceso de recolección y manipulación, la eficacia de las terapias que se aplican y la condición y respuesta del órgano que se está tratando.

En otros casos, las células se pueden administrar (por ejemplo, mediante inyección intravenosa, intraarterial, intratraqueal, directa, etc.) a un sujeto donante antes de la cosecha de órganos. Dependiendo de la vía de administración, las células se pueden administrar durante un período de tiempo adecuado (por ejemplo, de minutos a aproximadamente 1-4 horas, aproximadamente 4-8 horas, aproximadamente 8-12 horas, aproximadamente 12-16 horas, aproximadamente 16-20 horas, aproximadamente 20-24 horas). El órgano se puede cosechar después del período de tiempo mediante técnica o técnicas quirúrgicas convencionales. Después de la cosecha, las células se ponen en contacto (por ejemplo, inmediatamente en contacto) con el órgano durante un tiempo suficiente para permitir que las células se distribuyan por todo el órgano (por ejemplo, menos de aproximadamente 1 hora, aproximadamente 1-2 horas, aproximadamente 2-3 horas, aproximadamente 3-4 horas). Las células se pueden poner en contacto con el órgano mediante infusión y/o inmersión del órgano en un baño que contiene las células. A continuación, el órgano puede almacenarse en hielo y/o unirse a un sistema de reperfusión, después de lo cual el órgano se administra al sitio de trasplante.

Al llegar al lugar del trasplante, el órgano se puede colocar en un sistema de reperfusión (si aún no se ha hecho) que contiene las células. Después, el órgano se puede infundir con las células durante un período de tiempo (por ejemplo, menos de aproximadamente una hora, aproximadamente 1-2 horas, aproximadamente 2-3 horas, aproximadamente 3-4 horas) dependiendo del órgano y del sistema de reperfusión. Durante el trasplante, las células pueden ponerse en contacto con el órgano mediante infusión en el receptor (por ejemplo, por vía intravenosa), inyección directa en el órgano y/o aplicación directa a una superficie del órgano. La infusión se puede realizar, por ejemplo, antes del cierre del vaso o vasos que entran y salen del órgano. Durante el trasplante de hígado, por ejemplo, se pueden infundir células en la vena porta hepática antes de la unión de la vena al hígado trasplantado. Adicional o alternativamente, las células se pueden administrar al órgano después del trasplante (por ejemplo, después del cierre del vaso o vasos que entran y salen del órgano) durante un período de tiempo adecuado (por ejemplo, de minutos a aproximadamente 1-4 horas, aproximadamente 4-8 horas, aproximadamente 8-12 horas, aproximadamente 12-16 horas, aproximadamente 16-20 horas, aproximadamente 20-24 horas) dependiendo del sistema de administración y del órgano.

Composiciones

La divulgación también se dirige a poblaciones de células con potencias específicas para lograr cualquiera de los efectos descritos aquí. Como se describió anteriormente, estas poblaciones se establecen seleccionando las células que tienen la potencia deseada. Estas poblaciones se utilizan para preparar otras composiciones, por ejemplo, un banco de células que comprende poblaciones con potencias deseadas específicas y composiciones farmacéuticas que contienen una población de células con una potencia deseada específica.

Ejemplo

Métodos

Recolección de pulmón y perfusión ex vivo

Tras el consentimiento de investigación obtenido por la Agencia local de obtención de órganos, LifeGift, los pulmones donados desechados se obtuvieron para este estudio bajo un protocolo IRB establecido en e1Houston Methodist (IRB(2) 1111-0205). Los pulmones de cada uno de los cinco pacientes se obtuvieron de forma estándar con Perfadex anterógrado (Vitrolife AB, Gotemburgo, Suecia) 60 ml/kg de lavado más perfusión retrógrada de Perfadex a través de las venas pulmonares. A continuación, los pulmones se almacenaron en bolsas de plástico que contenían 1 litro de Perfadex y se mantuvieron en hielo durante el transporte. Una vez que los pulmones llegaron al Houston Methodist, se almacenaron en un refrigerador a 4 ° C durante un total de 8 horas de almacenamiento estático en frío para inducir una lesión isquémica por frío.

La perfusión pulmonar ex vivo (EVLP) se realizó con el Vivoline LS1 marcado con CE (Vivoline Medical AB, Lund, Suecia) (Figura 1) (Wierup, P. et al., Ann Thorac Surg 2006; 81(2):460-6; Ingemansson, R. et al., Ann Thorac Surg 2009;87(1):255-60; y Cypel, M. et al., N Engl J Med 2011;364(15):1431-40). El sistema se cebó con 2.5 l de solución Steen (XVIVO Perfusión). Se evitó el uso de glóbulos rojos lavados o sangre para disminuir el número de variables en el estudio de viabilidad. Se añadieron al perfundido 100 mg de meropenem (AstraZeneca AB, Sodertalje, Suecia) y 10,000 U de heparina (LEO Pharmaceutical, Copenhagen, Dinamarca). Antes de conectar los pulmones a la unidad EVLP, el pH de la solución se corrigió entre 7.35 y 7.45 usando trometamol (Addex-THAM, Fresenius Kabi AB, Uppsala, Suecia). En un caso donde también se obtuvo el corazón, se suturó un injerto de dacrón a las ramas de la arteria pulmonar divididas para reconstituir la integridad de la arteria pulmonar (PA) y facilitar la conexión del pulmón al circuito EVLP. La tráquea se conectó al ventilador mecánico mediante un tubo de silicona de tamaño que coincidía con el diámetro de la tráquea. Se colocó una sonda de temperatura dentro de la aurícula izquierda. Inicialmente, para eliminar el aire del circuito, los pulmones se perfundieron a una rata de flujo de 0.5 l/minuto. La derivación para eliminar el aire en la cánula de entrada se mantuvo abierta hasta que el órgano alcanzó los 32 ° C y luego se cerró durante el resto de la sesión. A continuación, se aumentó el flujo al 100 % del gasto cardíaco estimado para el conjunto específico de pulmones. A continuación, se calentaron los pulmones durante 30 minutos hasta un objetivo de 36 ° C y no se permitió que la diferencia de temperatura entre la entrada y salida de sangre pulmonar supere los 8 ° C. A continuación, se aumentó gradualmente la rata de flujo hasta un nivel objetivo de 70 ml/minuto por kilogramo de peso del donante, durante el cual se midió la presión de PA de forma continua y se limitó a 15 mm Hg. El recalentamiento se logró en 20-30 minutos. Cuando la temperatura del perfundido alcanzó 32 ° C, se inició la ventilación mecánica en modo controlado por volumen a un volumen total de la respiración inicial de 3 ml por kilogramo de peso del donante con un nivel de presión espiratoria final positiva (PEEP) de 5 cm H²O, una rata de 7­ 10 respiraciones/minuto y una FO² de 0.5. A continuación, se aumentó gradualmente el volumen total de la respiración hasta un máximo de 7 ml por kilogramo de peso del donante. Las muestras de perfundido para análisis de gases en sangre se extrajeron del puerto dedicado del sistema.

Células

Las MAPC derivadas de médula ósea humana (Human MultiStem®, Athersys Inc., Cleveland) se aislaron de un solo aspirado de médula ósea, obtenidos con el consentimiento de un donante sano y procesados de acuerdo con los métodos descritos anteriormente (Penn, MS et al., Circ Res 2012;110(2):304-11; Maziarz, RT et al., Biology of Blood and Marrow Transplantation 2012;18(2 Sup):S264-S265; y clinicaltrials.gov #NCT01436487, #NCT01240915 y #NCT01841632). En resumen, las MAPC se cultivaron en matraces de cultivo de tejido de plástico recubiertos con fibronectina bajo baja tensión de oxígeno en una atmósfera humidificada de CO² al 5 %. Las células se cultivaron en medio de cultivo MAPC (DMEM bajo en glucosa [Life Technologies Invitrogen] suplementado con FBS (Atlas Biologicals, Fort Collins, CO), suplemento de medio líquido ITS [Sigma], MCDB [Sigma], factor de crecimiento derivado de plaquetas (R&D Systems, Minneapolis, Mⁿ ), factor de crecimiento epidérmico (R&D Systems), dexametasona ([Sigma], penicilina/estreptomicina [Life Technologies Invitrogen], ácido 2-fosfo-L-ascórbico [Sigma, St. Louis, MO) y ácido linoleico-albúmina (Sigma). Las células fueron pasadas cada 3-4 días, cosechadas usando tripsina/EDTA (Life Technologies Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células fueron positivas para CD49c y CD90 y negativas para MHC clase II y CD45 (todas las Abs fueron de BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Posteriormente, las células se congelaron a una duplicación de población 30-35 en crioviales en la fase de vapor de nitrógeno líquido a una concentración de 1-10 x 106 en 1 ml (PlasmaLyte, HSA al 5 % y DMSO al 10 %) Inmediatamente antes de su uso, las MAPC se descongelaron y se usaron directamente.

Inoculaciones celulares, incubaciones pulmonares y análisis de tejidos y fluidos de lavado broncoalveolar (BAL)

Cuando la temperatura medida por la sonda intraauricular alcanzó aproximadamente 32 ° C, se descongelaron viales MultiStem de 1 ml, se diluyeron en 19 ml de solución salina estéril y se administraron mediante broncoscopio en la porción proximal del bronquio LLL. Se inoculó de forma similar un volumen similar de vehículo (20 ml de solución salina estéril) en la porción proximal del bronquio RLL. Cinco minutos después de la administración de MultiStem, los pulmones se conectaron a un ventilador mecánico Hamilton-C2. Después de 2 o 4 horas de perfusión en el sistema Vivoline, se detuvieron los experimentos. Cinco minutos antes de detener la perfusión, los mismos subsegmentos de RLL y LLL que se habían inoculado previamente con células o vehículo se lavaron con 60 ml de solución salina. A continuación, el líquido BAL recuperado se separó en alícuotas de líquido BAL crudo para evaluar el recuento celular total y los diferenciales celulares o se centrifugó (1200 g x 10 minutos a 4 ° C) y el sobrenadante se recolectó en tubos separados, se congeló instantáneamente y se almacenó a - 70 ° C (Lathrop, MJ et al., Stem Cells Translational Medicine (in press); y Goodwin, M. et al., Stem Cells 2011:29(7):1137-48). Para un pulmón, también se obtuvieron muestras de fluido BAL durante la fase de recalentamiento antes de iniciar la ventilación, justo antes de la administración de MAPC o del vehículo.

Se determinó el número total de células de fluido BAL usando un analizador de hematología ADVIA® (Siemens Diagnostics, Johnson City, TN). Se prepararon centrifugados celulares utilizando 5 x 104 células centrifugadas en portaobjetos de vidrio prelimpiados y pretratados (Corning Incorporate, Corning, NY) a 800 rpm durante 8 minutos, se secaron durante la noche y se tiñeron con DiffQuick (Hema 3 Stain Set, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Las poblaciones celulares se determinaron mediante el recuento manual ciego de 200 células realizado por tres individuos separados (Lathrop, MJ et al., Stem Cells Translational Medicine (in press); y Goodwin, M. et al., Stem Cells 2011:29(7): 1137-48). El contenido de proteínas en el fluido BAL sin diluir se evaluó mediante el ensayo de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA). Se utilizó el kit Human Cytokine Array, Panel A (R&D Systems, Minneapolis, MN) para examinar los sobrenadantes del fluido BAL en busca de citocinas solubles, quimiocinas y otras sustancias, incluidas C5/Ca, CD40L, CD54, CXCL1, CXCL10, G-CSF, Gro-1a, IL-1a, IL-1p, IL-1RA, IL-6, IL-8, IL-10, IL-16, IL-23, IP-10, I-TAC, MCP-1, MIF, PAI-1, RANES, serpin E1, sICAM, sTREM-1, TNFa y la cantidad relativa de citocina en comparación con los controles internos determinados en un sistema de bioimagen UVP (Upland, CA). Elisas para otras citocinas específicas se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante, IL-10 (R&D Systems, Minneapolis, MN, Cat #:D1000B) y STC1, TSG-6 e iNOS (MyBioSource, San Diego, CA, Cat#s: MBS946255, MBS926793, MBS723617).

Evaluaciones histológicas

Después de BAL al final del período de perfusión, los pulmones se fijaron posteriormente por gravedad con formalina al 10 % a temperatura ambiente durante 1 hora. Los pulmones fijados se disecaron y las áreas donde se instilaron células se almacenaron en formalina al 10 % antes de la fijación con parafina. Luego se evaluó el aspecto histológico de las secciones montadas de 5 pm. La inflamación pulmonar se puntuó en 10 vías respiratorias por animal, de forma cegada por tres individuos, en función de la presencia e intensidad de infiltrados de células peribronquiales en comparación con los controles positivos y negativos conocidos utilizando un sistema de puntuación semicuantitativo establecido, utilizando un intervalo de 0-3 e incrementos de escala de 0.5 como se describió anteriormente (Lathrop, MJ et al., Stem Cells Translational Medicine (en prensa); y Goodwin, M. et al., Stem Cells 2011:29(7):1137-48).

Análisis qPCR de marcadores inflamatorios tisulares

Se obtuvieron muestras de biopsia de pulmón de los pulmones 2-5 usando una grapadora automática (Covidien GIA™ DST Series™ de 80 mm) de la periferia del LLL y RLL justo antes de la infusión de células o vehículos a las 2 y 4 horas después de la infusión de célula o vehículo y al final del experimento. Las muestras se congelaron instantáneamente y posteriormente se homogeneizaron y se determinaron los niveles de expresión de ARNm de citocinas inflamatorias mediante qPCR (véanse los detalles a continuación).

Se homogeneizaron las muestras en regulador de lisis de ARN y se extrajo el ARN usando el kit RNeasy (Qiagen, Germantown, MD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó un tratamiento adicional con ADNasa utilizando el kit DNA-free (Life Technologies, Carlsbad, CA). La concentración de ARN se midió con NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Waltham, MA) y se realizó una transcripción inversa de 1 pg de ARN utilizando transcriptasa inversa M-MLV (Promega, Madison, WI) seguida de tratamiento con ARNasa utilizando RNace-it Cocktail (Agilent, Santa Clara, CA). Se analizaron muestras negativas de transcriptasa inversa y agua como controles. Se mezclaron 5 |j| del ADNc con SYBR green (Promega) y cebadores (IDT) y se analizaron en el sistema ABI 7500 FAST (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las muestras se normalizaron a GAPDH y se expresaron como porcentaje de referencia humana (Agilent) /- desviación estándar.

Las secuencias de los cebadores fueron las siguientes:

VEGFA-F1 (SEQ ID NO:1);

VEGFA-R1 (SEQ ID NO:2);

IGF1-F4 (SEQ ID NO:3);

IGF1-R4 (SEQ ID NO:4);

EGF-F1 (SEQ ID NO:5);

EGF-R1 (SEQ ID NO:6);

IL-10-F2 (SEQ ID NO:7);

IL-10-R2 (SEQ ID NO:8);

FGF2-F1 (SEQ ID NO:9);

FGF2-R1 (SEQ ID NO:10);

HGF-F1 (SEQ ID NO:11);

HGF-R1 (SEQ ID NO:12);

CCL5-F1 (SEQ ID NO:13);

CCL5-R1 (SEQ ID NO:14);

TGFB1-F1 (SEQ ID NO:15);

TGFB1-R1 (SEQ ID NO:16)

CXCL10-F1 (SEQ ID NO:17);

CXCL10-R1 (SEQ IDNO:18);

NOS3-F2 (SEQ ID NO:19);

NOS3-R2 (SEQ ID NO:20);

STC1-F1 (SEQ ID NO:21);

STC1-R1 (SEQ ID NO:22);

GAPDH-F1 (SEQ ID NO:23);

GAPDH-R1 (SEQ ID NO:24);

ANGPT1-F2 (SEQ ID NO:25);

ANGPT1-R2 (SEQ ID NO:26);

NOS2-F1 (SEQ ID NO:27);

NOS2-R1 (SEQ ID NO:28);

TNFAIP6-F1 (SEQ ID NO:29);

TNFAIP6-R1 (SEQ ID NO:30);

FGF7-F1 (SEQ ID NO:31); y

FGF7-R1 (SEQ ID NO:32).

Análisis estadístico

Los grupos se compararon utilizando ANOVA de una vía o de dos vías con una postprueba de LSD de Fishers o mediante análisis directo entre dos grupos mediante la prueba T de Student, utilizando una corrección de Welch para varianzas desiguales, según corresponda (Lathrop, MJ et al., Stem Cells Translational Medicine (en prensa); y Goodwin, M. et al., Stem Cells 2011:29(7):1137-48).

Resultados

Las características clínicas relevantes de los pulmones del donante se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1: Características clínicas de los pulmones donados Características ^edia del donante 2 3 4 5 ^M

_{± SD} Edad 55 56 44 66 50

Sexo Masculino Masculino Masculino Femenino Masculino

Causa de ^la

muerte CVA SH Asfixia IH MVA

PaO² @100

FiO₂ % 150 186 254 443 149 236.4 ± 55.1 Peep 10 10 10 5 10 ^{9.0 ±}

_1.0 Hallazgos Infiltrado- Infiltrado- Infiltrado- Edema: colapso del radiográficos Edema Edema Edema Claro lóbulo inferior derecho,

efusión pleural derecho Apariencia Múltiples

Edematoso Edematoso Edematoso nódulos Contusiones _pulmonar

superficiales edematoso

CVA: accidente cerebrovascular; SH: hemorragia subaracnoidea; IH: hemorragia intracraneal; MVA: accidente automovilístico.

La edad del donante osciló entre 44-66 y tres de los cinco pulmones donados se obtuvieron de pacientes con eventos neurológicos devastadores, uno por asfixia y otro por un accidente automovilístico. Cuatro de los cinco pulmones no se consideraron aptos para trasplante debido a un estado funcional deficiente, incluidos valores bajos de PaO² con una media de 184.75 mmHg con FiO² al 100 % a ± una PEEP de 10 mmHg. Estos pulmones también presentaban anomalías radiográficas, entre las que se incluían contusiones, enfisema significativo o colapso lobular que no respondía a las maniobras de reclutamiento en el quirófano. Cada uno de estos pulmones también tenía signos radiográficos de edema pulmonar, y dos tenían también efusión pleural y se observó que todos estaban edematosos de forma variable después de la extirpación quirúrgica. El pulmón # 5 tuvo colapso del RLL en CXR, pero se expandió después de la extirpación y eliminación broncoscópica de los tapones de moco. Un pulmón (pulmón # 4) era fisiológicamente adecuado para la donación con apariencia normal, CXR clara y buena oxigenación con PEEP de 5 mmHg, pero no se utilizó debido a la presencia de pequeños nódulos superficiales que posteriormente se encontraron benignos en la biopsia.

En la Tabla 2 se presenta un resumen del protocolo utilizado para cada pulmón y también en forma esquemática en la Figura 1.

Tabla 2: Resumen del protocolo experimental

Pulmón donado 1 2 3 4 5 ^Media

_{± SD}

Duración del

almacenamiento 8 8 8 8 8 8.0 ± 0 estático frío (horas)

Tiempo de

recalentamiento 22 25 28 26 24 ^{25.0 ±} (minutos) _1.0

Duración de la

perfusión ex vivo 4 2.5 4 4 4 ^{3.6 ±} (horas) _0.6

107MAPC a 107MAPC a 107MAPC a 106MAPC a 107MAPC

Células o vehículo LLL LLL LLL LLL a LLL

administrado Vehículo a Vehículo a Vehículo a Vehículo a

RLL RLL RLL RLL Vehículo a

RLL

En general, los pulmones tuvieron tiempos similares de almacenamiento en frío (8 horas) y recalentamiento (25 2.2 minutos) y posteriormente tiempos de reperfusión similares (3.7 ± 0.6 horas) después de la administración broncoscópica de células o vehículo. Al final del período de reperfusión, había cierto grado de edema adicional que se había desarrollado en cada pulmón y el pulmón número 4 también había desarrollado recientemente cierto grado de edema. Sin embargo, en general hubo menos edema e inflamación visibles en los lóbulos tratados con MAPC (LLL) frente a los lóbulos tratados con vehículo (RLL), incluso con la dosis más baja de MAPC utilizada en el pulmón # 4. Las imágenes representativas se muestran en la Figura 2.

La evaluación histológica de los pulmones al final del período de reperfusión demostró que, aunque se podían encontrar parches de áreas inflamadas en algunas de los LLL tratados con MAPC, había una inflamación general significativamente menor en 4 de los 5 pulmones y también en promedio en los 5 pulmones, según la evaluación semicuantitativa del edema de los tabiques peribronquial, perivascular y alveolar y por la presencia de infiltrados de células inflamatorias (figura 3). En la figura 4 se muestran fotomicrografías representativas.

Se obtuvieron recuentos de células de fluido BAL total en dos de cada cuatro pulmones (pulmones 3 y 5) que recibieron la dosis de células más alta. En ambos casos, hubo una disminución significativa en el LLL tratado con MAPC en comparación con el RLL tratado con vehículo (Figura 5A). También se observó una tendencia hacia la disminución en los recuentos de células del fluido BAL total en el pulmón que recibió la dosis más baja de MAPC (pulmón 4, figura 5A). Los diferenciales celulares obtenidos en muestras de fluido BAL de los cinco pulmones demostraron un aumento consistente de neutrófilos y eosinófilos en el RLL tratado con vehículo que se mejoró en el LLL tratado con MAPC (Figura 5B). Las mediciones de los niveles de proteína total en el fluido BAL fueron variables entre los pulmones, pero se observó una disminución consistente en la proteína total en el LLL tratado con MAPC frente al RLL tratado con vehículo en los 5 pulmones (Figura 5C).

Se observó un aumento en los niveles de IL-10 en el LLL tratado con MAPC en comparación con el RLL tratado con vehículo (Figura 6). Sin embargo, otros mediadores antiinflamatorios solubles implicados en modelos preclínicos de las acciones de MAPC en la lesión pulmonar y otros modelos, como IL-1RA, STC, TGS-6 e iNOS, no aumentaron de manera confiable en el LLL tratado con MAPc en cualquiera de los 5 pulmones (Figura 6). Los niveles de ARNm tisular se evaluaron en 4 de 5 pulmones (pulmones 2-5) mediante análisis de qPCR de muestras de biopsia obtenidas antes de la administración de células o vehículo y luego después de 2 o 4 horas de período de reperfusión. En general, los patrones de niveles de ARNm tisular fueron más consistentes entre los 4 pulmones. En comparación con los niveles de proteína IL-10 en fluido BAL, hubo un aumento de 3.5 veces en los niveles de ARNm de IL-10 tisular en el LLL tratado con MAPC en comparación con solo un aumento de 1.6 veces en el RLL tratado con vehículo según se evaluó a las 2 horas (Figura 7). También se observaron aumentos similares en LLL frente a RLL a las 2 horas en los niveles de ARNm de Angpt1 y STC1. Curiosamente, tanto para LLL como para RLL hubo un gran aumento en las veces de expresión de TSG6 de 2 a 4 horas.

Discusión

Se han estudiado varios métodos diferentes para mejorar la viabilidad de los pulmones del donante y para disminuir la lesión inflamatoria isquémica fría o caliente. Estos incluyen una solución de lavado con características extracelulares administrada tanto de manera anterógrada como retrógrada y el uso de un sistema de preservación ex vivo portátil actualmente bajo investigación clínica para uso en el transporte de pulmones donados (Machuca, TN et al., Surg Clin North Am 2013;93(6):1373-94). Diferentes áreas de investigación de intervenciones terapéuticas tienen como objetivo modular la respuesta inducida por isquemia y reperfusión. Por ejemplo, los modelos animales experimentales han mostrado un efecto beneficioso de la terapia génica que administra IL-10 (Cypel, M. et al., Sci Transl Med. 2009;1(4):4-9) y de la activación del receptor de adenosina (Fernandez, LG et al., J Thorac Cardiovasc Surg 2013;145(6):1654-9; y Mulloy, DP et al., Ann Thorac Surg 2013;95(5):1762-7). Sin embargo, aunque los datos experimentales son prometedores, es poco probable que la modulación de una de las muchas vías inflamatorias pueda regular un fenómeno que altera varios mecanismos celulares involucrados, como la inmunidad innata y adaptativa, la activación de la cascada del complemento, la disfunción endotelial y la activación de muerte celular. Por el contrario, las MSC derivadas de médula ósea y las MAPC tienen el potencial único de actuar sobre múltiples vías inflamatorias implicadas en la lesión por isquemia/reperfusión.

La perfusión pulmonar ex vivo (EVLP) se diseñó originalmente como un método para evaluar la calidad de los pulmones de la donación después de la muerte cardíaca (DCD) y de otros pulmones de donantes no aceptables (Wierup, P. et al., Ann Thorac Surg 2006;81(2):460-6; e Ingemansson, R. et al., Ann Thorac Surg 2009;87(1):255-60). Esta técnica se encuentra actualmente bajo ensayo clínico para la evaluación y reacondicionamiento de pulmones de donantes potenciales que, bajo los criterios actuales, no se consideran aptos para trasplante (Cypel, M. et al., N Engl J Med 2011;364(15):1431-40). EVLP ofrece además la oportunidad de administrar MSC o MAPC directamente en el pulmón del donante por vía intratraqueal o intravascular antes de la implantación. Usando esta metodología, los inventores eligieron evaluar inicialmente la administración de MAPC en las vías respiratorias en un solo lóbulo con el pulmón contralateral como comparación para evaluar directamente los efectos dentro de cada pulmón individual. El almacenamiento isquémico en frío (8 horas de almacenamiento en frío total) se prolongó más allá de los tiempos reales generalmente aceptados para los pulmones para potenciar cualquier IRI que pudiera desarrollarse y así maximizar las posibles acciones antiinflamatorias de las MAPC. Los inventores también optaron por utilizar MAPC no compatibles con HLA "listos para el uso" como prueba de viabilidad. Además, los inventores demuestran un efecto antiinflamatorio consistente y potente de las MAPC. En particular, el cambio en el perfil de citocinas, en particular el aumento de IL-10, puede ser particularmente beneficioso para IRI.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método ex vivo para preparar un órgano para trasplante en un receptor, el método que comprende exponer el órgano a células madre exógenas antes del trasplante, en donde las células madre son células no embrionarias, no germinales que expresan una o más de oct4, telomerasa, rex-1 o rox-1 y/o pueden diferenciarse en tipos de células de al menos dos de las capas germinales endodérmicas, ectodérmicas y mesodérmicas.

2. El método de la reivindicación 1, en donde:

(a) las células madre han experimentado al menos 10-40 duplicaciones de células o en donde las células madre han experimentado al menos 30-35 duplicaciones de células;

(b) la concentración de células madre expuestas al órgano es de aproximadamente 1 x 106 células/ml a aproximadamente 10 x 106 células/ml;

(c) las células madre se exponen al órgano durante aproximadamente 2-4 horas; o

(d) las células madre están contenidas en un fluido para perfusión en el órgano o en un portador para administración intraórgano o, en donde las células madre están contenidas en un medio en el que se baña el órgano antes del trasplante;

0 cualquier combinación de estos.

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el órgano se selecciona del grupo que consiste en pulmón, riñón, corazón, hígado, páncreas, timo, tracto gastrointestinal y aloinjertos compuestos.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la exposición a las células madre reduce la inflamación en el órgano o, en donde la exposición a las células madre reduce la aparición de células inflamatorias en el órgano o, en donde la exposición a las células madre reduce citocinas inflamatorias en el órgano.

5. Una composición que comprende un órgano ex vivo en contacto con células madre exógenas, en donde las células madre son células no embrionarias, no germinales que expresan uno o más de oct4, telomerasa, rex-1 o rox-1 y/o puede diferenciarse en tipos de células de al menos dos de las capas germinales endodérmicas, ectodérmicas y mesodérmicas.

6. Uso de células madre exógenas en un método ex vivo para preparar un órgano para trasplante a un receptor, en donde las células madre son células no embrionarias, no germinales que expresan uno o más de oct4, telomerasa, rex-1, o rox-1 y/o puede diferenciarse en tipos de células de al menos dos de las capas germinales endodérmicas, ectodérmicas y mesodérmicas.

7. Un órgano que ha estado expuesto a células madre exógenas, para uso en el trasplante a un receptor, en donde las células madre son células no embrionarias, no germinales que expresan uno o más de oct4, telomerasa, rex-1 o rox-1 y/o puede diferenciarse en tipos de células de al menos dos de las capas germinales endodérmicas, ectodérmicas y mesodérmicas.

8. Un órgano para uso como se reivindica en la reivindicación 7, en donde la exposición a las células madre reduce la lesión por reperfusión isquémica.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, la composición de la reivindicación 5, el uso de la reivindicación 6 o el órgano para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8, en donde las células madre expresan telomerasa.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, la composición de la reivindicación 5, el uso de la reivindicación 6 o el órgano para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8, en donde las células madre expresan oct4.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, la composición de la reivindicación 5, el uso de la reivindicación 6 o el órgano para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8, en donde las células madre expresan oct4 y telomerasa.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o 9 a 11, la composición de la reivindicación 5 o 9 a 11, el uso de la reivindicación 6 o 9 a 11, o el órgano para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en donde las células madre pueden diferenciarse en tipos de células de al menos dos de las capas germinales endodérmicas, ectodérmicas y mesodérmicas, opcionalmente en donde las células madre pueden diferenciarse en tipos de células de capas germinales endodérmicas, ectodérmicas y mesodérmicas.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o 9 a 12, la composición de la reivindicación 5 o 9 a 12, el uso de la reivindicación 6 o 9 a 12, o el órgano para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en donde las células madre son humanas.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o 9 a 13, la composición de la reivindicación 5 o 9 a 13, el uso de la reivindicación 6 o 9 a 13, o el órgano para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, en donde las células madre son células madre derivadas de médula ósea humana.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o 9 a 14, la composición de la reivindicación 5 o 9 a 14, el uso de la reivindicación 6 o 9 a 14, o el órgano para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, en donde las células madre son células alogénicas no compatibles con HLA.