JP2003528577A - 身体組織の分化転換方法 - Google Patents
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Abstract
Description
能力を有することが知られている(Goss, Clin. Orhtop., 1980, 151:270-282;
Kawamura and Fujiwara, Sem. Cell Biol., 1995, 6:117-126; Tsonis, Devel.
Biol., 2000, 221:273-284)。したがって、無脊椎動物は小片から全身体を再構
築し得る(Kawamura and Fujiwara、同上)。脊椎動物における再生の例として
は、(i)その耳にあけられた穴を塞ぎ得るウサギおよびコウモリ、(ii)切
断後に完全肢を再生し得る成体サンショウウオ、ならびに(iii)最終関節の
遠位で切断された場合に前肢指の先端を元に戻し得るマウスが挙げられる(Goss
and Grimes, Am. Zool., 1972, 12:151; Neufeld and Zhao, pp.243-252, In:L
imb Development and Regeneration, Fallon ed., John Wiley and Sons, 1993
)。
れている(Goss、同上;Illingworth, J. Ped. Surg., 1974, 9:853-858)。2
つの因子がこの再生のために重要であることが示されている:即ち(1)切断部
位の縁から生じる表皮性上皮に覆われ得る新しい創傷の開存表面(Stocum, pp.3
2-53, In:Regulation of Vertebrate Limb Regeneration, Sicard ed., Oxford
Univ. Press, 1985)と(2)創傷表面での適切な神経供給(Singer et al., An
at. Embryol., 1987, 177:29-36)である。
存された特徴が存在すると思われる。脊椎動物では、再生が起こる2つの方向が
存在する。いくつかの組織においては、多能性静止性幹細胞は損害により活性化
されて、いくつかの異なる最終的分化表現型の新規の細胞を産生するようになる
。あるいは、それらが多数のその分化特徴を失い、他の表現型の新規の完全分化
細胞を生成するために増殖し得るよう、機能的完全分化細胞の表現型の変化が存
在し得る。この後者の過程が、「分化転換(transdifferentiation)」と呼ばれて
きた(Okada, pp.349-380, In:Current Topics in Developmental Biology, Den
is-Donini et al. eds., Acad. Press, 1980; Okada, Trans-differentiation,
Oxford Sci. Publ., 1991)。
生過程の一例を示す。したがって、真骨上目魚類は、損害後の新規の網膜ニュー
ロンの供給源として作用し得る網膜前駆幹細胞の集団を含有する(Hitchcock an
d Raymond, Trends Neurosci., 1992, 15:103-108)。これに対比して、両生類
および鶏胚は、神経網膜前駆への色素上皮(RPE)中の細胞の分化転換を包含
する過程によりそれらの網膜を再生し得る(Reh and Pittack, Sem, Cell Biol.
, 1995, 6:137-142)。
たので、長い間、疑問視されており、その分化の古典的見解によれば、いったん
獲得された細胞表現型は遺伝子発現パターンにおける不可逆的変化のために固定
されると考えられていた。しかしながら、in vitro細胞培養系の開発は、分化転
換による再生の明白な実験的実証を可能にした。したがって、成体イモリ虹彩の
培養完全分化色素上皮細胞が分化し、増殖して新しい組織である水晶体を生成す
る能力を有することが示されている(Eguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 1974, 70:5052-5056; Abe and Eguchi, Dev. Growth Diff., 1977, 19:309-
317)。
成成分との相互作用により引き起こされる遺伝子発現(例えば選択的遺伝子活性
化および/または無症状化)における細胞質シグナルおよび変化が細胞分化転換
の制御において重要であることを実証している(Kodama and Eguchi, Sem. Cell
Biol., 1995, 6:143-149; Rao and Reddy, 同書151-156)。したがって、ラッ
トにおける銅欠乏は膵臓の腺房細胞の細胞−細胞相互作用の損失、微細環境変化
および全体的アポトーシスを生じ、これが次に卵形および管状膵臓細胞を活発に
増殖させて、その結果肝臓肝細胞へのそれらの分化転換を引き起こすことが示さ
れた(Rao and Reddy、同上)。アホロートル(メキシコサンショウウオAmbysto
ma mexicanum)の神経堤由来色素皮膚細胞(色素胞)を用いて実行された別のシ
リーズの実験において、グアノシンの添加はこれらの細胞を色素細胞型から別の
型への分化転換させ得ることが示された(Frost et al., Pigm. Cell Res., 198
7, 1:37-43; Thibaudeau and Holder, Pigm. Cell Res., 1998, 11:38-44)。
分化転換により起こると考えられる(Goss、同上)。したがって、真再生性再生
中、表皮損傷治癒の後には、創傷表皮下の脱分化再生芽細胞の蓄積が起こる。こ
れらの再生芽細胞は、断端組織の間葉細胞およびシュワン細胞の脱分化により生
じ(Brockes, Science, 1984, 225:1280-1287)、これが次に再分化して肢組織
を再構築する(Singer et al., Anat. Embyol., 1987, 177:29-36)と思われる
。
ような細胞の使用に向けられる。最終的分化に代表的な形態学的および機能的特
徴を示す細胞は、他の細胞型に変化するよう誘導される。これらの細胞は、複数
の生物体から、そしてあらゆる身体組織から得られる。
させて、脱分化細胞を産生する工程、 (b)工程(a)の脱分化細胞を、脱分化細胞の分化転換を引き起こす、分化
転換のための有効量の剤と接触させる工程、 (c)工程(b)からの細胞を、工程(b)で産生された細胞の安定化を生じ
させる、安定化のための有効量の剤と接触させる工程、および (d)安定化分化転換細胞を回収する工程 を包含する、前記方法を提供する。
レムナント中に発生領域を再生または作製するための方法であって: (a)構造のレムナントを脱分化する工程、 (b)工程(a)の構造のレムナントを分化転換する工程、および (c)工程(b)の構造のレムナントを安定化し、それによりレムナント中に
発生領域を作製する工程 を包含する、前記方法を提供する。
細胞への癌の分化転換を引き起こすのに有効な量の剤と癌を接触させることを包
含する、前記方法を提供する。
抑制方法であって: (a)自己免疫襲撃下にある型の患者から細胞を得る工程、 (b)細胞を正常表現型に変換するのに有効な量の分化転換剤と細胞を接触さ
せる工程、 (c)変換細胞をin vitroで培養して細胞を増幅させる工程、 (d)血液は進入させるが細胞を保持する膜上に細胞を固定する工程、および (e)固定化細胞を患者の血液と接触させ、それにより患者の血液から抗体を
除去する工程 を包含する、前記方法を提供する。
いる哺乳類の身体中の組織または器官を再生する方法であって: (a)脱分化有効量の脱分化剤を投与することにより損傷部位での細胞を脱分
化する工程、 (b)分化転換有効量の分化転換剤と細胞を接触させることにより工程(a)
の脱分化細胞を分化転換する工程、および (c)安定化有効量の安定剤と細胞を接触させることにより工程(b)の分化
転換細胞を安定化する工程 を包含する、前記方法を提供する。
とメラノサイトを接触させる工程、および (c)幹細胞を回収する工程 を包含する、前記方法を提供する。
範囲に鑑みて、当業者には明らかであろう。
内容が参照により本明細書中に援用される。一致しない場合は、定義を含めた本
発明の説明が統制する。
完全分化細胞のものに変えるある型の分化細胞の能力を指す。
は脱活性化することによる分化細胞の表現型特徴の損失を指す。
ることによる分化細胞の表現型特徴の保持を指す。
臓、肝臓)または付属器官(例えば肢、尾)を生じる能力を有する細胞の一群を
指す。形態形成領域はあるいは、「発生領域」または「真再生領域」または「始
原領域」と呼ばれ得る(Hopper and Hart, Foundations of Animal Development
, Oxford Univ. Press, 1980, p.314)。
またはそうでないこともある。毒素の例としては以下のもの:(a)重金属、例
えばカドミウム、銅および亜鉛、(b)強酸または塩基、例えば塩酸(<pH5
)または水酸化ナトリウム(>pH8)、(c)ATP阻害剤、例えばATPア
ーゼ、ならびに(d)膜を脱安定化する毒素、例えば洗剤が挙げられるが、これ
らに限定されない。
外胚葉由来細胞を指す(LeDouarin, The Neural Crest, Cambridge Univ. Press
, 1982)。胚神経堤の細胞は広範な組織を生じ、その例としては、以下のものが
挙げられる:(a)末梢神経系の細胞、(b)皮骨、(c)頭部結合組織、(d
)色素細胞、(e)カルシトニン分泌細胞、(f)髄膜、(g)シュワン細胞、
(h)象牙芽細胞、ならびに(i)副腎髄質。
細胞を指す。色素胞の各々は、小胞体由来の色素含有細胞小器官を有する。これ
らの細胞小器官内に含入される色素の種類に基づいて定義される3種類の色素胞
、即ち、黒色素胞、黄色素胞および虹色素胞が存在する(Ide, Curr. Topics De
v. Biol., 1986, 20:79-87; Bagnara, The Neural Crest as a Source of Stem
Cells, pp.57-87, In:Developmental and Evolutionary Aspects of the Neural
Crest, Maderson ed., John Wiley and Sons, 1987)。
ノソームと呼ばれる細胞小器官に含入される。
プテリジンと呼ばれる環式化合物の一種である。グアノシントリホスフェートに
由来するプテリジンは、プテリノソームと呼ばれる細胞小器官中に含入される。
黄色素胞は、カロチノイド小滴と呼ばれる細胞小器官も含有することがある。
物は、細胞小器官が光を散乱し、反射するためにそう名付けられた反射小板と呼
ばれる細胞小器官中に含入される。
後に残存する構造の一部である。
るか、または(b)構造を構成する細胞の内部パターンおよび数が損害されるか
または殺害される一方、いくつかの痕跡細胞および/またはパターンが残存する
構造(例えば組織器官または付属器官、例えば肢)を指す。
のその他の原因のために失われているかあるいは損害された身体組織、器官、構
成成分または構造の復位のために分化転換により細胞を産生するのに用いられる
ということが意図される。
の一部を再生するために用いられる。
り癌の治療のために用いられる。
を提供するために用いられる。
胞の分化転換に関して詳述した本方法は、「形態形成領域」と呼ばれる生物学的
存在物の2つの相補的な、絡み合った、そして不可欠な態様を示す。本明細書中
に記載した方法は、形態形成領域の再構成、ならびにいくつかの場合には、創造
を生じる。
)組織学的、細胞化学的、微細構造的および分子的表現型の分化転換だけでなく
、(3)それらの適正位置における部分の内在的認識および復元を可能にする。
言い換えれば、形態形成領域は、肢を再生するための本来の前方/後方、腹側/
背側および右/左軸を保存する。「位置情報」または時としては「利き手(hande
dness)」といったように様々に呼ばれるこの特性は、特定の形態形成領域を支配
する適切な遺伝プログラムの発現の一機能である(French et al., Science, 19
76, 193:969-981; Wolpert, J. Theor. Biol., 1969, 23:1-47)。選択的遺伝子
活性化に関するプログラムの進行を示す前記の(1)および(2)に関して本明
細書中に記載した方法は、特定の形態形成領域(例えば右前肢)に充当し、した
がってその構成成分の正確な位置情報による構造の(3)復元も内在的に成し遂
げる。例えば、肢が右前肢の遠位上腕骨で切断される場合、再生する橈骨および
尺骨は、右前肢に関しては適切な位置にあるが、左前肢に関してはそうではない
。
生)、そしていくつかの情況においては、創生(creation)(例えば膵臓レムナン
トから肝臓)を提供する。
位置で)実施され得る。
れる。したがって、好ましい一実施形態では、7日間供給培地を含入する自己分
解性プラスチック容器中に平板培養した細胞培養物中で種々の剤で処理し、次に
肝血管に隣接して縫い合わされるとこれが新組織を血管形成し、肝臓にそれを組
み入れることにより、ヒト膵臓細胞が再生され、肝細胞に分化転換される。
保し、そして、医療に用いられる場合には、免疫抑制の必要性をなくし、移植片
拒絶の機会を低減することにより、多大の利益を提供する。
は脱分化する工程、(b)脱安定化細胞を分化転換する工程、および(c)分化
転換細胞を安定化して、それらを分化させる工程を包含する。
胚葉、神経堤または外胚膜から得られる。
: 1.損傷部位のまたは培養中の細胞への剤の投与。 脱安定化を誘導するための剤としては、レチノイド(例えばレチノイン酸)、
12−O−テトラデカノイルホルボール−13アセテート(TPA)、0.1M
塩酸(pH<5)、高張食塩水(飽和NaCl)、銅キレート化剤(例えばトリ
エチレンテトラミンテトラヒドロクロリド)および重金属、例えば銅、亜鉛また
はカドミウムが挙げられるが、これらに限定されない。投与される毒素の量は、
毒素によって変わるが、しかし一般には1〜100μg/細胞培養物1mlであ
る。 2.細胞外マトリックスの崩壊(例えばヒアルロニダーゼまたはコラゲナーゼ
の投与による)。 3.機械的または酵素的方法(例えばトリプシン処理、EDTA処理または反
復的針外傷)による細胞の物理的分離。 4.外傷(下記参照)。
の性質およびそれを一緒に保持する構成成分に依存している。例えば、皮膚細胞
の脱安定化を実施する場合、基底膜のトリプシン処理がしばしば選択される方法
である。
えばUVA)光、X線照射、感染、毒素または免疫応答により引き起こされる損
傷を含めたあらゆる種類の外傷は、多数の組織において脱安定化を引き起こすの
に非常に有効である傾向がある。実際、外傷は、器官および身体部分を自然に再
生し得る動物における最も一般的な天然脱安定化因子である(例えばトカゲの尾
または両生類の肢を切断する捕食者)。したがって、外傷は、再生過程の出発段
階として用いられ得る。外傷が脱安定化を刺激する様式のいくつかを以下に挙げ
る: (1)上皮の外傷は、通常は基底膜を崩壊させて、フィブロネクチンおよびラ
ミニンのような基底膜構成成分の変化を生じる。これらの変化は次に、タンパク
質、mRNAおよびDNAの合成に影響を及ぼすことが知られている(Cell Bio
logy of Extracellular Matrix, Hay ed., Plenum Press, 1981)。 (2)外傷は、成長因子、サイトカイン、免疫グロブリンまたは検討中の細胞
の分化状態に影響を及ぼすその他の物質を分泌する隣接細胞に影響を及ぼすこと
により、細胞のミクロ環境における変化を生じ、そしてそれを分化させて、おそ
らくは正常レベルのこれらの因子の非存在下で増殖させ得る。さらに外傷は、そ
れらが普通は接触するようにならない種類の細胞または体液と接触するようにさ
せ得るが、これは脱安定化も引き起こし得る。細胞のミクロ環境に及ぼすこれら
の作用はすべて、細胞内シグナル伝達経路の変化を生じて、タンパク質合成およ
び遺伝子発現における変化を引き起こす。 (3)外傷は、細胞ミクロ環境の変化により、細胞形状の変化(例えば平坦化
対円形化)をもたらして、タンパク質および核酸合成の変化を引き起こし(Cell
Biology of Extracellular Matrix、同上)、したがって細胞の分化状態に影響
を及ぼす。細胞形状の変化は、表面(例えば細胞膜、細胞外マトリックス、その
他の周囲細胞)の接着特徴といった因子に依存し得る。 (4)外傷は、脱安定化を引き起こし得る「創傷ホルモン」と呼ばれる物質の
放出を生じ得る。
の例は、下記の例18において提供される
分化転換剤の例としては、グアノシン、フェニルチオウレアまたはTPAが挙げ
られるが、これらに限定されない。
β−カロチン、レチノイド、リボフラビンおよびプテリジンが挙げられるが、こ
れらに限定されない。
えばSigma Chemical, St. Louis, MOから)。
)中で約1〜約100μg/mlまたはレシピエント動物の体重当たりで約0.
5〜約1,000mg/kgの広範な範囲である。
されるということに留意すべきである。その場で再生を受ける哺乳類においては
、脱安定化および分化転換剤の好ましい投与経路は、局所的である。処置される
器官または組織が内部にある場合、直接投与は、針またはカテーテルにより、あ
るいは全身的になされる。
吸入により、エアゾールにより、直腸的などの形で投与される。
の変わりに実質的に同時に投与され、例えばグアノシンはβ−カロチンと一緒に
投与される。好ましくは2つの剤は、数時間または数日間の間投与される。
化工程のために用いられる(例えば、相対的に多量のレチノイン酸[細胞培養物
中10−4M])。この実施形態では、脱分化工程(例えば機械的外傷、刃また
は針突刺しによる切断)は、分化転換/安定化剤の添加に先行する。
および標的組織に依存して、完了までに数時間〜数日を要する。例えば、哺乳類
における肢再生を刺激するために、イモリ用にRoseにより開発された高張食塩水
レジメン(J. Exp. Zool., 1944, 95:149-170)または25ゲージ針による反復
突刺したがって、切断後3日間、1日3回用いられる。
、および/または生化学的にモニタリングされ得る)は、細胞が、それらの表現
型を限定する形態学的および生化学的特徴を失った時に完了すると考えられる。
これらの細胞は、再生芽細胞に似てくる(即ち、それらは高い核対細胞質比を有
し、および/または分化細胞の形態学的特徴を欠く)。例えば、切断肢の基部で
は、このような細胞は、イモリTriturus viridescensでは切断後約2週間観察さ
れる。
学的特徴のいくつかを獲得したときに完了すると考えられる。例えば、特徴的縞
表現型が推定筋肉細胞中に認められた時、または軸索および樹状突起が推定ニュ
ーロン中に認められた時である。
的特徴のすべてを獲得した時に(例えば顕微鏡的および/または生化学的に、安
定化/分化剤、例えばカロチノイド小滴、リボフラビンの堆積物を含有する内部
貯蔵細胞小器官、またはプテリノソーム中のプテリジンを検出し得た時)、完了
すると考えられる。
有する新規の化合物の同定方法を提供する。候補化合物に関する好ましいスクリ
ーニング系としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない:(a)
水晶体に分化転換するイモリまたは哺乳類の眼の眼杯由来網膜色素上皮(RPE
)細胞、(b)網膜ニューロンに分化転換するイモリまたは哺乳類眼のRPE、
(c)肝細胞に分化転換する膵臓細胞、(d)別の色素沈着細胞型に分化転換す
る神経堤由来アホロートル色素胞、および(e)別の種類の神経堤誘導体に分化
転換する哺乳類最終的分化神経堤由来細胞(例えばニューロンへのメラノサイト
、骨への頭部結合組織、ニューロンまたは骨へのシュワン細胞等)。アホロート
ルを用いる好ましいスクリーニング系は、下記の例5に示される。
化合物(例えばアホロートル色素胞系における、イモリにおけるおよび哺乳類R
PE系におけるグアノシン;哺乳類膵臓−肝細胞および哺乳類RPE系における
銅枯渇)の能力に基づいて、任意の実験系における分化転換および/または再生
を引き起こす任意の剤が、他の組織および他の動物における分化転換および再生
を引き起こすための候補である。さらに、細胞(例えば神経堤細胞)を胚形成中
の特定の経路に沿って分化させる剤は、成体における分化転換剤の候補である。
イトを神経幹細胞に変換するそれらの能力に関して検査される。用量応答曲線は
、別個のバイアル中で、約10−3μg/ml〜約100μg/mlの範囲の濃
度(半対数単位濃度増大)で培養細胞を被験物質とともに同時にインキュベート
することにより生成される。細胞は、1〜21日間、被験化合物とともにインキ
ュベートされる。用いられる幹細胞および所望の新細胞型に応じて分化転換の判
定規準を用いて、光学および電子顕微鏡、生化学的試験および免疫学的ラベリン
グにより、細胞は分化転換の証拠に関して検査される。例えば、神経堤幹細胞へ
のメラノサイトの分化転換は、メラノソームおよびメラニンの損失として観察さ
れる。
えばニューロン、シュワン細胞、軟骨細胞および繊維芽細胞に変換するそれらの
能力に関してステージII候補化合物が試験される。用量応答曲線は、別個のバ
イアル中で約10−3μg/ml〜約100μg/mlの範囲の濃度(半対数単
位濃度増大)で、先に分化転換された培養細胞を第二の被験物質とともに同時に
インキュベートすることにより生成される。細胞は、1〜21日間、被験化合物
とともにインキュベートされる。用いられる幹細胞および所望の新細胞型に応じ
て分化転換の判定規準を用いて、光学および電子顕微鏡、生化学的試験および免
疫学的ラベリングにより、細胞は再分化の証拠に関して検査される。
びピリミジン、ヌクレオシドおよびそれらの誘導体、レチノイド、カロチノイド
、ラミニン、フィブロネクチン、成長因子、サイトカイン、オモクロム、チオウ
レア、キレート化剤および金属(例えば亜鉛、銅、カドミウム)が挙げられる。
培地中に普通に存在する物質の枯渇または補給も、前記の方法によりスクリーニ
ングされ得る(Brent et al., Am. J. Pathol., 1999, 137:1121-1142)。
基づいて、グアノシンは、本発明における分化転換剤として用いるための特に好
ましい化合物である。したがって、アレチネズミにおいて、下記の例1に示すよ
うに、水晶体の外科的除去後のグアノシン(分化転換剤)とその後のβ−カロチ
ン(安定剤)の経口投与は、RPEからの水晶体の再生をもたらした。この場合
、脱安定化/脱分化因子は、水晶体を除去するために用いた手術により引き起こ
された外傷であった、ということに留意すべきである。
ト(GMP)、グアノシンジホスフェート(GDP)、グアノシントリホスフェ
ート(GTP)、アデノシン、シトシン、チミジン、ウリジンおよびそれらのリ
ン酸塩、あるいはカテコールアミン(例えばノルエピネフリンおよびエピネフリ
ン)に置換され得る。
めのもう一つの好ましい化合物である。したがって身体中(および特定組織中)
の銅レベルに影響を及ぼす剤は、分化転換剤としての活性も有し得る。銅レベル
の変化を引き起こす物質のいくつかの例としては、以下のものが挙げられる: (I)金属、例えば亜鉛、カドミウムおよび鉄(Linder and Hazegh-Azam, Am
. J. Clin. Nutr, 1996, 63:797S-811S)、 (II)銅キレート化剤、例えばトリエン(Rao and Reddy、同上)、ペニシ
ラミン(Brewer, Copper Transport and Its Disorders, Leone and Mercer eds
., Plenum Publishers, 1999)、 (III)酢酸亜鉛のような銅の吸収に影響を及ぼす剤(Brewer、同上)、 (IV)銅の代謝および/またはそれらの補因子としての銅の使用に影響を及
ぼす酵素(例えばチロシナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ヒアルロニダ
ーゼ);銅結合タンパク質(例えばセルロプラスミンまたはメタロチエイン)(
Linder and Hazegh-Azam、同上)、 (V)銅結合タンパク質/酵素の合成または分解に影響を及ぼす物質(例えば
レチノイン酸(Song and Levenson, Int. J. Vitam. Nutr. Res., 1997, 67:141
-144))、 (VI)銅結合非タンパク質様化合物(例えばアスコルベート(Itoh and Egu
chi, Dev. Biol., 1986, 115:353-362; Droudin et al., Free Radic Biol Med,
1996, 21:261-273))、種々のチオウレア(Masuda and Eguchi, Cell Structu
re and Function, 1984, 9:25-35)、グアノシン、アデノシン(Masuda and Egu
chi, Inorganic Chemistry, 1990, 29:3631)、シトシン(Palaniandavar et al
., J. Chemical Soc., 1996, 7:1333)およびそれらのリン酸塩。
の銅枯渇培地(Percival and Layden-Patrice, J. Nutr., 1992, 122:2424-2429
)は、銅レベルを変えるための他の方法である。
分化細胞に特徴的な物質を生成する酵素(例えば、メラニンの産生を導くチロシ
ナーゼ)の補因子としてのその作用による。銅は、遊離グアノシンの量に影響を
及ぼすことにより(Tu and Friederich, Biochem., 1968, 7:4367-4372; Maskos
, Acta Biochemica Polonica, 1978, 2:101-111)、DNAおよびRNAに直接
結合し(Iyengar, Acta Anat., 1983, 115:357-360; Wong et al., Can. J. Bio
chem., 1974, 52:950-958; Sorokin et al., J. Inorg. Biochem., 1996, 63:79
-98)、これがそれらの分解をもたらす(即ち、鎖切断および断片化;Yamafuji
et al., Enzymologia, 1971, 40:107-119; Dowjar et al., BioMetals, 1996, 9
:327-335)ことにより分化転換を引き起こすとも考えられる。最後に、銅は血管
形成性であり(Brem et al., Am. J. Pathol., 1990, 137:1121-1142; Yoshida
et al., Neurosurgery, 1995, 37:287-293)、したがって銅の補給は組織の成長
および分化を促進する。したがって、銅と同様の方式で作用する他の物質は分化
転換剤の候補であると結論づけられる。
素(例えばメラニン、オモクロム、ヘモシアニン、カロチノイド、フラボノイド
およびプテリジン)を生成する生化学的経路に関与する物質が挙げられる。本発
明によれば、これらの化合物を試験するための好ましい実験系は、アホロートル
色素胞系、または幹細胞が神経堤誘導体の完全系統に分化するクッパー(Kupffer
)幹細胞系である(Nozue, Acta Anat., 1990, 107:188-197; Labat et al., Bio
med. Pharmacother., 2000, 54:146-162)。
定化化合物は、それらの有効性および薬学的許容可能性に関してさらに検査され
得る。好ましい剤は、以下の判定規準を満たす: 1.元のものとほとんど同様に機能する、反復毒性または外傷性損傷から組織
/器官を生成または再生する能力(例えばアレチネズミにおける水晶体の再生で
、これは透明性、幾何学的形状、光を集束し、調節する能力において元のものと
ほとんど同様である)、 2.最少局所性および全身性毒性(例えばグアノシンおよびβ−カロチン)、 3.迅速に、かつ相対的に少量で作用する能力、 4.易投与性医薬組成物に製造される能力。
存している。大量のプリン、プテリジンおよびカロチノイドまたはこれらの化合
物の各々の前駆体を含む食物を摂取する生物体は、分化転換をより容易に受け得
る多能性細胞を保持する。分化転換に及ぼす食餌の影響は、幼生(草食)から成
体(肉食)への両生類の成熟のような再生能力の損失により、そしてカロチノイ
ド含有食物を欠いた食餌を摂る脊椎動物の損失した身体部分を再生する能力の大
幅な低減により例示される。
適条件としては、以下のものが挙げられる: 6.損傷前に1か月間、9シス異性体、ならびにその他のカロチノイド、例え
ばルテイン、およびゼアキサンチンを含むβ−カロチン(1000mg/kg)
を補充した食餌。これらの条件下で、高カロテン蓄積体である哺乳類(例えばア
レチネズミおよびヒト)において、最適再生が観察される。大量のカロチノイド
含有野菜を消費するヒト患者は、本明細書中に開示した方法のための特に良好な
候補である。 7.電気的特性を促すための飽和HCl溶液の創傷表面への限局的局所適用に
よる(例えば、1日2回、1時間の高張食塩水中への指基部の浸漬による)再生
の部位の調製、 8.再分化工程中のUVスペクトルを含む天然光源を用いた、組織および種に
応じて24時間当たり8〜16時間の光期間。
ベルで事故により切断された幼児の指または足指のような、高密度の色素胞を有
する小構造物において観察される。
安定化、脱分化、分化転換、安定化の間の各剤の曝露時間を選択する必要がある
。
用のマトリックスが作製される。例えば、特定の種類の脊髄運動ニューロンを生
成したい場合には、分化転換のための剤としてレチノイン酸を用いる。レチノイ
ン酸が異なる半対数増分濃度で、例えば10−9モル〜10−4モルの範囲で試
験され、他の因子は一定に保持されるマトリックスが設定される。これらの培養
試験管の各々に関して、安定化期から生じた細胞は、脊髄運動周囲の特徴に関し
て組織化学的に検査される。このようにして特定濃度のレチノイン酸が選択され
れば、本方法は、系統的に増大される曝露時間、例えば1日増分での1日から7
日までの用量の曝露時間を有するマトリックスを設定することにより微調整され
る。脱安定化および安定化期中の剤は、特定の種類の細胞を生じるための真に適
正の剤、その用量および曝露時間を選択するよう同様に変えられる。
が何らかの種類の細胞培養中で用いられると報告されたことがあった場合、出発
容量は文献に報告された用量とほぼ同じである。剤が細胞培養に用いられたこと
がない場合には、この出発用量は、細胞培養に用いられた文献中に報告された任
意の同様の化学物質の用量である。剤が報告されたことがない場合、系統的増分
範囲は、モル濃度でまたは重量で、選択される。細胞が特定用量で死亡した場合
には、用量が高すぎる。
式での結果を一括し、手順を反復することにより、適正用量が選択される。
る。例えば、因子がメスの使用により作られた外傷である場合、切開のサイズは
マトリックス中で系統的に変更され、他の因子は一定に保持され、その結果生じ
る細胞型が組織化学的または免疫細胞化学的に同定され、分類される。
色腫細胞)の分化転換を誘導するそれらの能力を試験することにより抗癌剤をス
クリーニングするための方法を提供する。好ましい実施形態では、特定患者由来
のin vitro培養癌細胞を用いて、最少毒性および最高効率分化転換剤が先ず選択
される。次に選定剤は患者に投与され、標準技法により癌の退行がモニタリング
される。このようにして、最適個別化抗癌治療が達成される。
よび重症筋無力症)の進行の抑制方法を提供する。前記の方法は、これらの抗体
に反応性のマトリックス含有固定化患者細胞による血液の定期的透析により、自
己免疫疾患に罹患した患者の血中に存在する自己反応性抗体の力価を低下させる
ことを包含する。本発明によれば、このような固定化細胞の非限定的供給は、同
一患者由来の培養細胞のin vitro分化転換により得られる。これらは患者自身の
細胞であるため、新規の望ましくない抗体は生成されず、副作用は最小限にされ
る。
おり、本発明の範囲を限定するものではない。
ンゴルネズミ(Meriones unguiculatus)で調べた。 動物:4週齢モンゴルネズミ(Charles River Laboratories, Wilmington,MA
) 一般条件: 温度: 1〜23日目: 22℃ 24日目: 26℃ 25日目: 29℃ 26日目: 32℃ 27〜61日目: 35℃ 光期間:12時間明期;12時間暗期
餌)、C=正常銅の30%を含有する銅欠乏餌(正常銅=6mg/餌1kg;銅
欠乏=30%正常=1.8mg銅/餌1kg)、T=0.5%トリエチレンテト
ラミンテトラヒドロクロリド(トリエン)、B=通常量の2倍のビタミンKを含
有する1%Dunaliellaβ−カロチン(正常Vit.K=0.75mgVit.K
/餌1kg;二倍Vit.K=1.5mg/餌1kg)、G=1%グアノシン。
のように概算する。グアノシンを含有する食餌に関しては、1000mg/kg
/日のグアノシンを各動物に消費させた。β−カロチンを含有する食餌に関して
は、1000mg/kg/日のβ−カロチンを各動物に消費させた。 動物実験室場所:PSL, East Brunswick, NJ 組織学実験室:Colorado Histo-Prep, Inc., Fort Collins, CO
体への虹彩上皮の分化転換を導いた。標準AIN餌を摂食した対照群を含めた。
実験を通して、毎日、免許取得獣医が動物を検査した。
35℃の温度に達した時点で手術をした。各群から1匹の動物を27日目に屠殺
して、ホルマリン中に保存した。
。 3.ダイアモンドナイフ(Accutome, Malvern, PA)を用いて、右眼の角膜中
で切断を実行し、これをVanas鋏(Miltex, Bethpage, NY)を用いて拡張し、切
開周縁を約180〜270°にした。 9.手袋をはめた指で眼球上を静かに押して、Tyrell Loop(Miltex, Bethp
age, NY)で水晶体を取り出した。 10.取り出した水晶体をホルマリン中に保持した。
、AB餌を介してβ−カロチンの摂取を続けた。手術後、動物が餌をとるために
ワイヤケージの蓋まで来なくてもよいように、いくつかのペレットをケージに入
れた。
の動物は暗色眼を有するため、詳細はほとんど確かめ得なかった。
ッドソン固定液中に18時間入れた後、中性緩衝化ホルマリンに切り換えた。体
部を中性緩衝化ホルマリン中で固定した。
た50匹の動物からの全頭部をColorado Histoprepに送った。施術眼を切断し、
およそ中矢状平面までの連続5μ矢状切片を回転ミクロトームで切断した。全検
体に関して、中矢状面積からの少なくとも50の5μ連続切片を調製した。組織
学検査のためにルーチンにスライドを処理し、ヘマトキシリンおよびエオシンで
染色した。
翌月にわたって閉じられたままであった。しかしながら、いくつかの動物の目は
次第に平坦でなくなり、いくつかはほぼ正常に突出するように見えた。
。これらはしばしば、虹彩色素上皮にそれらを連結する柄(イモリ水晶体再生で
観察されるような)、ならびに明らかにメラノソームを含入した個々の水晶体細
胞を示したが、これは、それらが色素上皮に由来したと同定する。多数の組織学
的切片にわたって拡張されたこれらの水晶体は、発生学的に観察されるような、
繊維形成の種々の段階における組織化水晶体細胞を含有する十分に形成された水
晶体を示した。それらは一般に、嚢胞性または壊死性物質を伴わなかった。抽出
ホルマリン固定全水晶体を検査し、各動物に関する再生水晶体の組織学的知見と
比較した場合、実際にすべての場合において、少量の水晶体上皮以外はおそらく
ほとんど全水晶体が除去されており、再生水晶体は増殖していた残存物質に因る
とは考えられなかった。虹彩色素上皮に対する柄、ならびに色素上皮からの誘導
を示すメラノソームを含有する個々の細胞は、再生を確証した。
のものは、術後に明らかに保持されていた水晶体物質を示した(水晶体上皮の2
〜3の細胞でさえ残存しないよう全水晶体を取り出すのはしばしば不可能である
ということは、ヒト白内障手術、ならびに実験モデルから周知である。これは、
残存水晶体上皮が増殖し、水晶体移植片の機能を複雑にすることが知られている
ため、臨床的に問題である)。残存水晶体物質は、それが一般的に壊死性、嚢胞
性であり、成熟水晶体繊維を示し、虹彩色素上皮との連結を有さず、2〜3枚の
連続切片に及ぶだけであったため、そして他の組織学的判定規準により、組織学
的に同定され得た。ホルマリン固定抽出水晶体の顕微鏡検査および写真は、ほと
んどが全体的に無傷で取り出されたものの、すべてが少なくとも小上皮欠損を有
することを示し、このことは、いくつかの上皮組織が後に残されていたことを示
唆する。
晶体を示さなかったが、4つは、増殖していた小残存上皮を示した。
体を示した(41%)。
全体的構築および細胞学において最大で、最も正常な外見)であったのは、群1
06(初期グアノシン餌)および群107(初期グアノシンおよびβ−カロチン
餌)からであった。
らなる試験のための実験プロトコールを改良し、組織学的および微細構造分析の
ためのさらなる検体を得た。
A)から入手し、Product Safety Laboratories(East Brunswick, NJ)動物管理
施設で1週間順化させる。高温(35℃)は不必要であると目下考えられている
ため、温度は、実験中はずっと22℃に保持する。それらを12時間明期/暗期
の光期間に保持し、1週間の順化期間中、Purina Rat Chowを摂食させる。各々
12匹の3群を用いる。
以下に示す。酢酸亜鉛は、処方薬(ガルジン、Lemmon Co., Sellersville, PA)
として入手可能である。さらにそれは副作用が少なく、したがってトリエンを有
する銅欠乏餌から観察された死亡率が回避されるはずである。酢酸亜鉛の用量は
、全身の銅を低下させるための齧歯類におけるその使用に関して発表済みの研究
に基づいて選択される(Approved Package for NDA 02458 Galzin Capsules, 19
97, FDA, Rockville, MD)。
最も安全で、かつ最も望ましい麻酔であるメトキシフルランを用いて動物を麻酔
する(Norris, Lab. Anim., 1981, 15:153-155)。例1に記載した手法を用いて
、水晶体除去術を実施した。動物に食餌2を6週間与える。これは、前記のプロ
トコールより2週間長く、前記で実証された水晶体再生法の達成を可能にするは
ずである。
用に、各群から屠殺する。食餌2の終了時に、EM用に4匹を、組織学用に4匹
を、各群から屠殺する。
これは、固定するまでの眼の取扱いを最小限にするので、すぐに眼の切除をする
より好ましく、組織学者がブロック上に眼を適正に配向するのに役立つ。
々6匹の以下の群に分けた。
適しているか否かを研究者に確定させ得る。実験群6〜8は、餌中に提供するの
ではなく、水晶体切除眼中にグアノシンを単にしみ込ませるのが水晶体再生を刺
激するのに適切であるか否かを確定させる。これらの条件は、イモリにおける水
晶体への腹側虹彩のグアノシン誘導体媒介性分化転換に関して発表済みのレジメ
ンと同様である(Eguchi and Watanabe, J. Embryol. Exp. Morphol., 1973, 30
:63-71)。残りのプロトコール(即ち、光期間、食餌1の長さ、水晶体切除術等
)は、前記(パート1)と同一である。食餌2は、常にこの実験用のAINであ
る。
ある。
。
、各群から3匹を屠殺する。食餌2の最初の4週間は、3日毎に3匹を各群から
屠殺する。
様である。検体を前記と同様に組織分析用に調製する。
2つの等群に分ける。
ある。動物には食餌1を2週間与える。次にケタミンおよびキシラジンで動物を
麻酔した後、アレチネズミに関して前記したのと同様に水晶体切除術を実施する
。次に動物に食餌2を6週間与える。食餌1の終了時に、EM用に2匹および組
織学用に2匹を、各群から屠殺する。食餌2の終了時に、EM用に4匹および組
織学用に4匹を屠殺する。
上皮(RPE)から神経網膜を再生することができる(Reyer, pp.309-390, In:
Handbook of Sensory Physiology VII, Crescitelli ed., Springer-Verlag, 19
77)。水晶体を再生できないいくつかの両生類でも、網膜は再生することができ
る(Reyer、同上)。水晶体再生を可能にした同一プロトコールは、網膜(神経
網膜、光受容器)再生も可能にすると考えられる。
つの等群に分けた。
市販されている緑藻類のDunalielaである。前記のプロトコールと同様に、食餌
1を19日間、食餌2を6週間用いる。15日目に、両生類(例えば、Hasegawa
, Embryologia, 1958, 4:1-32; Stone, J. Exp. Zool., 1950, 113:9-32; Keefe
, J. Exp. Zool., 1973, 184:185-206)または哺乳類(例えば、Mervin et al.,
Am. J. Ophthalmol., 1999, 128:155-164; Chon et al., Retina, 1996, 16:13
9-44; Takeuchi et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1995, 36:1298-305
)に関して発表済みの技法あるいはこれらの技法の変法を用いて、実験的網膜剥
離を右目に施す。
。6週間の終了時に、残りの動物すべてを屠殺する。右目を組織学的分析用に調
製する。
よび/または安定剤を発見し、比較するためのアッセイとしてのこの方法の実用
性を実証した。
を示す、本明細書中に提示した証拠は(ラット膵臓における肝細胞分化転換系へ
の分化転換因子であると終結的に実証されているのと同様に)、(1)分化転換
因子は脊椎動物では普遍的である傾向があり、(2)あるアッセイ系で同定され
た因子がすべての脊椎動物において、ならびにいくつかの異なる器官系において
作用すると思われる、という以前に標示された記述を補強する。
ト)、cGMP(グアノシン3’,5’−環状モノホスフェート)ならびに酢酸
亜鉛およびイノシトールの分化転換剤としての同定をもたらした。
層(光学顕微鏡用にゴモリトリクロームで染色した場合は緑色)が存在する。3
種類の細胞のみが真下に存在し、コラーゲン層中にわずかに埋まっている−(a
)繊維芽細胞、これは一般に紡錘形であり、特徴的光学および電子顕微鏡的外観
を有し、(b)黒色素胞、これは、多数の円形または卵形黒色メラノソーム、な
らびにいくつかのプレメラノソームを含有し、そして(c)黄色素胞、これはプ
テリノソームとして知られている細胞小器官を含有する。これらは、光学顕微鏡
では空胞のように見え、電子顕微鏡では小束状または集束性層化物質を有する空
胞のように見える。概して、メラノソームは通常は黒色素胞中にのみ見出され、
プテリノソームは黄色素胞中にのみ見出される。Frostが提示し、Bagnaraが再検
討した証拠は、グアノシンは、幼生アホロートルに与えると、分化転移剤として
作用して、微細構造研究により示されているように、黒色素胞を黄色素胞に変換
させる、ということを示した。
iversity Axolotl Colony, Bloonington, INから入手した。それらをウシ肝臓(
下記の例A)または魚ペレット(Indiana University Axolotl Colony, Bloonin
gton, IN )(下記の例BおよびC)で保持した。
前に毎日取り換え、給餌の1時間後に動物を取り出した。それらにはほぼ毎日給
餌した。1日おきに、実験物質をウシまたは魚ペレットの上にまき散らした。実
験試薬はすべて、Sigma(St. Louis, MO)から入手した。例Aでは、動物を、底
が中央で平坦に盛り上がった0.75クォートステンレススチール皿中に保持し
た。給餌のために、ウシ肝臓を、一部水中で一部水から出た盛り上がった底に置
いた。これにより、水中の餌を動物に感知させるが、ウシ肝臓上に撒かれたcG
MPが洗い落とされないようにさせる。例BおよびCに関しては、動物を、個々
の280mlプラスチック容器中に保持し、これを週2回取り換えた。給餌のた
めに、動物を、一側に勾配を有する小型プラスチック容器(計量カヌー)に移し
た。ペレットを、一部は水中で一部は水から出ている勾配上に置いた。これによ
り、水中の餌を動物に感知させるが、ペレット上に撒かれたcGMPが洗い落と
されないようにさせる。専ら、Deer Park Spring Water(Breingsville, PA)を
用いた。
すぐに(数時間)、そのほとんどを写真撮影した。10%ホルマリン中で動物を
固定し、皮膚の4mmパンチ生検を、Charles River Laboratories(Wilmington
, MA)が組織学検査用にルーチンに処理した(ゴモリトリクローム)。オリンパ
ス(Woodbury, NY)BX40顕微鏡でスライドを検査した。
Trump固定液で24時間固定し、電子顕微鏡用にルーチンに処理した。それらを
2%四酸化オスミウム中で後固定し、アルコールシリーズで脱水して、エポン−
アラルダイト(1:1)中に包埋した。処理および写真撮影は、Electron Imagi
ng Facility, Rutger’s University, Piscataway, NJで実施した。
それは死亡した。ゴモリトリクローム染色皮膚の検査は、いくつかの細胞中でメ
ラノソームおよびプテリノソームの存在を示した。これは、黄色素胞への黒色素
胞のcGMPにより引き起こされた分化転換の証拠である。動物は、検査によっ
て、より明色であることもあった。約1週間後に屠殺した対照動物は、両細胞小
器官を有するいかなる細胞も示さなかった。
の電子顕微鏡検査は、メラノソームおよびプテリノソームの両方が存在する多数
の細胞を示した(図1)。いくつかの細胞は、メラノソームとプテリノソームの
ハイブリッドと思われる細胞小器官を示した(例えば、不規則な空胞構造はプテ
リノソームと類似するが、しかしメラノソーム中に認められるような暗色物質が
存在した)(図2および図3)。このような細胞小器官は、細胞小器官レベルで
の分化転換を実証すると考えられる。第2の動物は、ゴモリトリクローム染色光
学顕微鏡切片において、プテリノソームとメラノソームの両方を含有する細胞の
存在により分化転換の明らかな証拠を示した(図4)。これらの動物は、検査に
よって顕著により明るく、黄色の色相を有した。やはり67日目に屠殺した対照
動物は、概して、ハイブリッド細胞小器官を有する細胞または両型の細胞小器官
を含有する細胞は伴わなかった。
匹は12日後に死亡した。対照動物は、2匹目の亜鉛供給動物死亡から1週間後
に屠殺した。ゴモリトリクローム染色スライドは、メラノソームおよびプテリノ
ソームの両方を有する細胞を明示し、したがって酢酸亜鉛が黒色素胞の黄色素胞
への分化転換を引き起こしたという証拠を提供した。対照動物は、概して、ハイ
ブリッド細胞小器官を有する細胞または両型の細胞小器官を含有する細胞は伴わ
なかった。
クロリド)、グアノシンおよびシトシンを給餌する同様の実験を実施した。肉眼
的観察および動物全体の写真に基づいて、グアノシン(Frostにより前に報告さ
れたように)、トリエンおよびミオ−イノシトールは黒色素胞を黄色素胞に分化
転換する剤であるが、一方シトシンは黄色素胞を黒色素胞に分化転換すると思わ
れる。
対象物に衝突することに飼い主は気づいた。経験を積んだ眼科獣医は、以下の検
査において以下の観察を行った後、突発性網膜変性との診断を下した(O’Toole
et al., Veterinary Record, 1992, 130:157-161; Miller et al., J. Vet Res
., 1998, 59:149-152)。イヌは全盲として振る舞った。瞳孔は完全に拡張した
。緑内障、損傷または代謝性疾患の適応症は認められなかった。犬にグアノシン
(Sigma; St. Louis, MO)を茶さじ1/2杯/日(2.5g/日、約250mg
/体重1kg/日)およびベタテン(Henkel、7.5%Dunaliellaβ−カロチン
)茶さじ1/2杯/日(2.5g/日、約18.75mg/体重1kg/日)の
投与を開始した。
、明るい集束光で刺激するとわずかに収縮することを明示した。グアノシンおよ
びベタテンの投与を続けた。
あった。眼科医がイヌの2〜3フィート前に綿の小片を落とすと、イヌはほとん
どの場合それらが床に落ちるのを目で追った。綿は音も臭いもせず、感知もでき
ないので、イヌがそれを見ることができたのは明らかだった。
織学的には、棒細胞および円錐細胞外部セグメントの急速な損失とその後の網膜
層の変性が認められる。文献に出現した多くの遺伝的イヌ網膜変性に対比して、
網膜の異なる帯域は同様には影響を受けない。
かな改善のために、本明細書中に前記した分化転換プロトコールがこのイヌの視
力の実証可能な改善に関与したと、眼科獣医は結論した。この例では、網膜の変
性は(SARDの最終的病因であるものは何でも)、脱安定化(脱分化)因子と
して働いた。グアノシンは神経網膜へのRPEの分化転換剤として、そしてβ−
カロチン(ベタテン7.5%として)は安定剤として働いた。 したがって、前記の方法は、神経網膜への網膜色素上皮の分化転換を導き、網膜
を再生し、網膜変性により盲目になったイヌに、測定可能程度に視力を回復した
。
ることができる、と飼い主は確信した。眼科獣医はイヌを検査し、同意した。イ
ヌの前に綿片を落とすと、イヌはほとんどの場合に綿を目で追った。イヌは、標
準検査室の光では、弱い光の場合のように高頻度に綿を眼で追うことはなかった
。
視覚機能は以前の検査より目に見えて良好になった、と眼科獣医は結論した。
)を個体から切除する。Githens等(In Vitro Cell. Dev. Biol., 1994, 30A:62
2-635)と同様の培養方法を用いて、細胞をin vitroで培養する。次に、レチノ
イン酸(1〜10μg/ml)の添加により、細胞を脱安定化する。グアノシン
(1〜100μg/ml)の添加により、分化転換を成し遂げる。次に安定剤と
してカロチノイドを投与する(テトラヒドロフラン中1〜30μg/ml)。そ
の結果生じた島細胞を培養物中で増殖させる。次に、血流または膵臓血管への注
射により、島細胞を患者の身体中に再移植する。島細胞の自系性は、免疫抑制の
必要性を無くす。好ましくは、5歳以下の併発疾患を有さない幼児または小児が
、この手法のための対象である。
体から切除する。細胞をin vitroで培養する。次に、レチノイン酸(1〜100
μg/ml)の添加により、細胞を脱安定化する。グアノシン(1〜100μg
/ml)の添加により、分化転換を成し遂げる。次に安定剤としてカロチノイド
を投与する(β−カロチン1〜100μg/ml)。その結果生じた肝細胞を培
養物中で増殖させる。次に、肝細胞を患者の身体中に再移植する。肝細胞の自系
性は、免疫抑制の必要性を無くす。好ましくは、5歳以下の併発疾患を有さない
幼児または小児が、この手法のための対象である。
し、種々の剤で処理して、他の細胞型、例えばメラノサイト、骨、結合組織、ニ
ューロンへのそれらの分化転換を促す(Sichel et al., Pigm. Cell Res., 1997
, 10:271-289; Labat et al., 2000、同上)。
他の神経堤由来最終的分化細胞への分化転換を誘導する。好ましい例としては、
メラノサイトまたは松果体細胞のニューロン、骨または筋肉への、頭部結合組織
の骨への、シュワン細胞のニューロンまたは骨への分化転換等が挙げられる。
たはTPA(1〜100μg/ml)と接触させる。次に細胞を分化剤、例えば
β−カロチン、レチノイド、リボフラビンまたはプテリジン(0.1〜100μ
g/ml)と接触させる。
た神経細胞の脳移植片を用いて治療する。メラノサイトを収穫し、患者の背中か
ら採取した成人ヒト皮膚の生検から培養する。環状グアノシンモノホスフェート
(cGMP)を20μg/mlの濃度で含有する培地中で1週間のインキュベー
ションにより、細胞を脱分化させる。1週間の終了時に、細胞はメラノソームお
よびメラニンの損失を含めた脱色素沈着の証拠を示す。塩基性繊維芽細胞増殖因
子(30ng/ml;Sigma, St. Louis, MO)を含有する培地中でのインキュベ
ーションにより、細胞を分化転換させ、安定化させる。1週間後、培養中の神経
および神経膠細胞の外観を顕微鏡的および/または生化学的および/または免疫
学的に確証する。次に神経細胞を収穫し、胚細胞移植片に関して実証された方法
(Brundin et al., Brain, 2000, 123:1380-1390)を用いて、パーキンソン病患
者における自系脳移植片のために用いる。
換える。メラノサイトを収穫し、患者の背中から採取した成人ヒト皮膚の生検か
ら培養する。銅枯渇培地中で1週間のインキュベーションにより、細胞を脱分化
させる。次に細胞を、アスコルビン酸0.2mMを含有する培地中で1週間のイ
ンキュベーションにより、水晶体細胞に分化転換させる。培養中の水晶体細胞の
外観をクリスタリンに関して免疫染色により同定する。新しい水晶体細胞を収穫
し、白内障のために眼内レンズを必要とする患者における自系移植片のために用
いる。
える。メラノサイトを収穫し、患者の腕から採取した皮膚生検から培養する。細
胞を先ず、トリエチレンテトラミンテトラヒドロクロリド1〜100μM/lの
存在下でそれらを1週間培養することにより、神経堤幹細胞に脱分化させる。次
に、トランスフォーミング増殖因子β(TGF−β;Sigma, St. Louis, MO)を
含有する培地中でのインキュベーションにより、細胞を軟骨細胞に分化転換させ
る。新しい自系軟骨組織を患者に移植する。
により、あるいは皮膚への局所適用により、または食餌により、黒色素胞の虹色
素胞への形質転換を誘導する。
傷神経の再生を可能にする。グアノシン(1〜100μg/ml)を用いてメラ
ノソーム含有色素細胞を先ず黄色素胞に、次にレチノイン酸(供給組織、培養条
件および所望のニューロンの種類によって、10−9〜10−3M)を用いてニ
ューロンに分化転換させる。
換を誘導することにより、癌(例えば黒色腫または肉腫)を治療する。患者から
得た培養癌細胞を用いて、一群の標準分化転換剤をスクリーニングして、悪性細
胞を良性細胞に(例えば黒色腫細胞を良性黄色素胞に)転換するのにどの剤が最
低毒性かつ最も効率的であるか否かを確定する。好ましい方式で、分化転換剤、
例えばグアノシン(およびその他のプリン)、銅枯渇剤、フェニルチオウレアま
たはTPAを、分化剤、例えばカロチノイド(例えばβ−カロチン、カンタキサ
ンチン)、レチノイド、リボフラビンまたはプテリジンとともに、癌細胞を分化
転換し、増殖停止を引き起こすそれらの能力に関して試験する。その結果生じる
分化転換細胞の良性表現型を、生化学的および免疫学的方法により、ならびに有
糸分裂活性、増殖および転移能力の接触抑制を検定することにより、確証する。
次に選定分化転換剤(単数または複数)を患者の腫瘍に局所的に、注射により、
または全身的に適用する。個々の患者の黒色腫はin vitroスクリーニングのため
に用いられるため、腫瘍の治療は最適化される。
レベル(4〜1,000mg/kg)の分化転換および安定化剤、例えばそれぞ
れグアノシンおよびβ−カロチン(各物質に関して4〜1,000mg/食餌1
kgまたは食餌の1%)を摂取することにより誘導される。子孫は、それらの再
生能力増大を反映する多数の分化転換化またはハイブリッド色素胞を有すると予
測される。前記の子孫の再生能力増大を、前記例に記載したその場および/また
はin vitro組織再生アッセイ(単数または複数)を用いて検査し、分化転換およ
び安定化剤を摂取しなかった妊娠雌由来の子孫の再生能力と比較する。
レチネズミまたはフェレットでは、1%Dunaliellaβ−カロチン(Henkel Corp.
, La Grange, IL)を有する銅欠乏食餌を1ヶ月間、その後それらの食餌の2%
のβ−カロチンを含有する銅正常食餌を3ヶ月間、動物に給餌することにより、
切断指は再生される。指(好ましくは、他の疾患を伴わない動物の)を切断する
と、数ヶ月内に再成長する。
は、4mg/kgのβ−カロチンを毎日3ヶ月間消費することにより、失った指
を再生する。指基部の先端を先ず局部麻酔下で外科的に切開し(脱安定化/分化
因子として機能する外傷)、指を小室中に35〜40℃で終日保持する。出血を
止める。指は6か月で再生する。
病を有さない)は、失った付属器官を再生する。ウォルフの単細胞皮脂腺を、患
者の手掌から採取した生検から単離し、in vitroで培養する。これらは、プレメ
ラノソームおよび皮脂小滴の両方を含有する手掌、足裏および瞼の皮膚の基底板
中の細胞である(Wolff, Lancet, 1951, 888-889; Pelfin et al., G. It. di D
erm., 1970, 165:1-5)。適切な分裂促進剤(例えば表皮増殖因子)の培地への
添加により、細胞を集密増殖させる。グアノシンを軟膏基剤中で腕基部に局所的
に適用し、3ヶ月間閉鎖包帯をする。これらの3ヶ月間、患者は300mg/日
のβ−カロチンを摂取する。局所麻酔下で再切開した創傷表面に、培養細胞を定
期的に高密度で適用する。手が再生する。
対して向けられる血中の抗体の存在により特性化される)の進行は、筋細胞への
患者のメラノサイトのin vitro分化転換と、その後の患者の血液から自己抗体を
取り除くためのこれら新規生成自系筋細胞の使用により防止される。新しい筋細
胞を先ず、血液は進入させるが、細胞を残存させる膜またはメッシュ中に置く。
これらの固定化細胞を次に、透析機と同様の滅菌装置に入れる。週1回、患者は
透析を受ける。有害抗体は体外筋細胞に付着し、身体に戻らない。このようにし
て、疾患の進行を防止する。
タログ番号CRL−1424、Manassas, VA)から凍結保存状態で購入した。受
理時に、凍結細胞を含入する試験管を、2分未満の間、試験管の底1/3を渦巻
かせて、37℃水浴中で急速解氷した。その後の過程はすべて、滅菌技法の標準
的方法を用いて実行した。細胞を、5mlの予備加温McCoyの5A変法培地(Lif
e Technologies, Rockville, MD)を含入するT−25フラスコに移し、加湿C
O2インキュベーター中で37℃でインキュベートした。約24時間後、元の培
地を除去し、新鮮な培地と取り換えて、細胞を約70〜80%集密度に達するま
で増殖させ、必要な場合は培地を2〜3日毎に取り換えた。この時点で、周知の
トリプシン−EDTA継代培養法を用いて、低細胞密度でLeighton管中で細胞を
継代培養した。継代培養後、細胞の増殖を48時間再確立させた後、薬剤を投与
した。
正常メラノサイト表現型に類似した。検出可能量のメラニンを細胞内に示す細胞
は非常に少なかった。大多数の細胞は、形態的に上皮であると思われた。しかし
ながら、その他の細胞表現型が、繊維芽細胞型細胞、三角形細胞および多核を有
する大型細胞を含む少数で観察された。観察された顕微鏡的表現型異質性は、染
色体数に関して異質集団を示すATCCにより示された核型分析に匹敵した。
して、最終濃度を約33mg/ml(最終濃度0.5%THF)とした。非補充
培地の除去後、この補充培地をLeighton管に添加し、7日間の実験期間中、2日
毎に取り換えた。7日の終了時に、培養物をメタノール中で固定し、カバーガラ
スをギムザ染色した。
較において、出発集団の多数のセグメントが実験期間中に死んだ。残存した細胞
のうち、ほとんどが三角形形態および多数の核を有し、神経細胞と一致し、ある
いは紡錘形で、神経膠細胞または神経線維鞘(シュワン)細胞と一致した。広範
な細胞死は、7日の実験期間の初期に起こり、残存細胞は分裂するように見えな
かった。残存細胞集団中に有糸分裂像は観察されなかった。
表現型への黒色腫細胞の分化転換および安定化を引き起こすと考えられる。良性
表現型に分化転換されなかった悪性細胞は、殺害された。
をMcCoyの5A変法培地に添加して、最終濃度を3mcg/mlとした。この補
充培地を、非補充培地の除去後、Leighton管に添加し、7日間の実験期間中、2
日毎に取り換えた。7日の終了時に、培養物をメタノール中で固定し、カバーガ
ラスをギムザ染色した。
すような全体的集団における表現型変化を誘導した。神経表現型と一致する三角
形細胞、ならびに形態学的に種々の神経膠または神経線維鞘細胞に類似する細胞
の数の増大が認められた。2つの樹状「角」を細胞の一端に、そして長い軸索様
突起を他端に有する神経的形態を示す多数の細胞が観察された。7日の実験期間
終了までに、これらの細胞は数が増え、容易に観察された。初期培養中に存在す
るすべての表現型のいくつかの例は、この用量レベルでのグアノシン処理後にも
存在した。
および神経膠または神経線維鞘細胞になるようこれらの細胞のいくつかを刺激し
たと考えられる。幹細胞が作製されたという事実を支持する因子としては、高核
対細胞質比を示す細胞数の増大、そして下記のように、グアノシンに、その後β
−カロチンに曝露された細胞は形態学的および行動的に、β−カロチンに曝露さ
れただけの細胞とは(そして対照黒色腫細胞と比較して)多少異なる応答を示し
たことが挙げられる。
をMcCoyの5A変法培地に添加して、最終濃度を3mcg/mlとした。この補
充培地を、非補充培地の除去後、Leighton管に添加し、7日間中、2日毎に取り
換えた。THF中のβ−カロチンをMcCoyの5A変法培地に添加して、最終濃度
を33mcg/ml(最終濃度0.5%THF)とした。グアノシン補充培地の
除去後、この補充培地をLeighton管に添加し、さらに7日間の実験期間中、2日
毎に取り換えた。14日の終了時に、培養物をメタノール中で固定し、カバーガ
ラスをギムザ染色した。
しかしながら、その後のβ−カロチン処理は、前記の例14においてβ−カロチ
ン単独で起きたような広範な細胞死を引き起こさなかった。むしろより多数の細
胞が残存し、それらのほとんどが神経形態を有し、大核、三角形細胞体ならびに
樹状細胞および軸索と一致する突起を有した。厳密な観察は、三角形細胞上に存
在する細胞突起がしばしば隣接細胞に対して向けられるか隣接細胞に接触し、神
経網目構造に類似する細胞間の緩やかな網目構造のように見えるものを形成する
ことを明示した。
考えられる。これは、それらの形態的変化だけでなく、より多くの生存に関する
その後のβ−カロチンに対するこれらの細胞の応答が、それらの表現型が変化し
たことを示唆することによっても裏付けられる。理論と結びつけずに考えると、
β−カロチンはさらに、ニューロンならびに神経膠および神経線維鞘細胞に幹細
胞を分化転換させ、次に、これらの細胞が神経網目構造に類似した相互連結突起
の緩い網目構造を確立するよう、これらの表現型を安定化させたことが確信され
る。
ン3が膠細胞へのメラノサイトの転換を誘導し得ることを示した。本例では、培
養中の正常(良性)ヒトメラノサイトを市販供給元(Clonetics, Walkersville,
MD)から入手する。前記の例14に用いた方法を適用して、ニューロンおよび
神経膠または神経線維鞘細胞を得る。その結果生じる細胞の表現型を、電子顕微
鏡および免疫細胞化学的方法により確証する。
15の手法を適用して、ニューロンおよび神経膠細胞を産生する。その結果生じ
た細胞の培養物を、注射のための薬理学的に適切なビヒクル中に入れる。その結
果生じた細胞を、生検を採取したのと同一個体に注射する。移植は、腰椎穿刺ま
たは鞘内による注射(脊髄内)、あるいは神経組織中の外科的移植による。これ
らの細胞は、神経堤由来細胞が非常に運動型であるため、ニューロンまたは神経
膠またはシュワン細胞を欠く領域に移動し得る。細胞の自系性は免疫学的拒絶を
回避し、薬剤またはその他の手段による免疫抑制のいかなる必要性もなくする。
この方法は、パーキンソン病およびアルツハイマー病のような疾患を有する哺乳
類(ヒトを含む)の治療に適用可能で、破壊されたニューロンを取り換え、また
、多発性硬化症のような脱髄性疾患においては、シュワン細胞および神経膠を取
り換える。
。
体的に除去されたためである。
(基部にある)は再生されねばならない。腕が手首で切断された場合には、手全
体が再生されねばならない。
たは化学物質によって脱安定化されねばならない。次に、例えば銅枯渇剤または
食餌の局所的または全身的適用により、基部組織の分化転換が成し遂げられねば
ならない。最後に、例えばβ−カロチンの局所的または全身的適用により、安定
化が達成される。
レベルの遠位性を感知する。それは増殖し、次に、分化転換と共在して、完全発
生領域(例えば足)を回復するのにすべてのレベルに関して適した失われた構造
を提供する。
全抽出は、全水晶体が置換され得る同様の組織の基部として役立ち得る水晶体物
質を全く残さない。その構造およびその発生領域は、完全に欠けている。しかし
ながら、水晶体発生領域は眼の発生領域の一構成成分である。この情況では、眼
の発生領域は、その形成が水晶体発生領域の形成に経時的に先行し、それが水晶
体発生領域を発生学的に生じるため、「母」発生領域と考えられ得る。眼(およ
びその発生領域)の残り部分は、無傷のままである。
分化転換および安定化により成し遂げられる。したがって、眼(母)発生領域の
一部である虹彩の組織は、脱安定化、水晶体細胞への分化転換および水晶体表現
型の安定化の過程を受ける。
器官または特定の身体構造を伴わずに生まれた場合、その構造を作製するのが望
ましい。例えば、ある小児は小脳形成不全で生まれ、協調を制御する脳の小脳を
欠く。小脳を生じる発生領域は、脳発生領域の一構成成分である。この場合、前
記で引用した全発生領域が再生されねばならない場合と同様に、脳領域は母発生
領域である。
安定化である。本適用では、脳の後方(背部)を外科的に曝露させ、少量の組織
に外傷を負わせるかまたは脱安定化化学物質に曝露する。次に、分化転換誘導化
学薬品を局所的に適用する。最後に、安定化剤、例えばβ−カロチンを食餌中に
含入する。
域の再生とは異なる。
の場合である。このような構造は、両生類のような下等動物では容易に誘導し得
る(Goss, 1969)。例えば結紮がイモリの肢の周囲に配置される場合、機能的で
あると考えられる完全形成付加的肢は、結紮の位置で出芽する。
側腹部)の、またはイモリ結紮により生じるような構造自体の発生領域からの組
織の脱安定化、分化転換および安定化である。
天然構造に付加的機能的能力を提供する。
が、獣医の診断を受けた。獣医は、RPEの小レーザー熱焼処置を施した。これ
は、RPE細胞の脱分化および増殖を刺激することが知られている。次にグアノ
シンモノホスフェート(GMP)を1か月間、1g/kg/日で(分化転換剤と
して)食物に添加した。GMPを中断した時に、ベタテン(Henkel, La Grange,
IL、7.5%)を13.5g/日で食物に添加した。
月(RPEのための脱安定化および分化転換剤として)、ならびに1g/kg/
日のβ−カロチン(安定剤として)で治療した。盲目に変化は認められなかった
。次にイヌにRPEのレーザー熱焼を施し、グアノシンおよびβ−カロチンによ
る治療を継続した。1か月後、グアノシンを中止した。2か月後、視力は徐々に
戻っていることが認められた。
わせた(そして脱安定化した)。
ent Epithelium, Function and Disease, Wolfensberger and Marmor eds., 199
8, Oxford Univ. Press)を30mg/kgで静注した。RPEへのこの毒性注
射はRPEの脱安定化および増殖を引き起こした。
脱安定化を刺激するために、肢切断患者は、前記の分化転換および安定化剤の使
用の前に、外科的に切開された肢基部を有する。
、表皮およびコラーゲン瘢痕が最初に創面切除された後に実施する。 [開示情報] 2つの過去の出願が存在する: 1.米国特許仮出願第60/146,272号(1999年7月29日提出)および 2.米国特許仮出願第60/168,555号(1999年12月2日提出)。 添付の国際出願は、前記の出願の両方の主題を含む。付加的主題も本出願には
付加されており、本明細書を通して見出される。 外国通達ライセンスは、本出願の提出と同時に要請されており、35U.S.
C.184および37CFR5.11の規定に従う。
微鏡写真である(例5Bに記載)。左側には黄色素胞の突起が存在する。右側に
は、黒色素胞の突起が存在する。pt=プテリノソーム;m=メラノソーム;p
=プレメラノソーム;*印はプラスチック中の裂け目のための人工物を示す。メ
ラノソームは、内部格子上に作り上げられる卵形または円形の構造物であり、顕
著なプレメラノソームに認められるように一部は多数の小円形体で構成される。
プテリノソームは、小さい束状のまたは同心円上の繊維性物質を有する空胞のよ
うに見える。
ムが同一細胞中に観察される。さらにハイブリッド細胞小器官が写真の底部に認
められる。この細胞は、以下の判定規準に基づいて、分化転換中であると判定さ
れる:(a)同一細胞中の多数のプテリノソームおよびメラノソームの存在、な
らびに(b)メラノソームおよびプテリノソームの両方を示唆する特徴を有する
いくつかの細胞小器官の存在。
。
の写真である(例5Bに記載)。E=表皮;C=基底膜直下の真皮中のコラーゲ
ン帯;M=メラノサイト。2つの矢印は、メラノサイトから黄色素胞に分化転換
中の細胞を示す。小矢印は、メラノソームを示す。大矢印はプテリノソームを指
し、これは白色空胞のように見える。
Claims (16)
- 【請求項1】 哺乳類細胞を分化転換する方法であって: (a)細胞の脱分化を引き起こす、脱分化のための有効量の剤と、細胞を接触
させて、脱分化細胞を産生する工程、 (b)工程(a)の脱分化細胞を、脱分化細胞の分化転換を引き起こす、分化
転換のための有効量の剤と接触させる工程、 (c)工程(b)からの細胞を、工程(b)で産生された細胞の安定化を生じ
させる、安定化のための有効量の剤と接触させる工程、および (d)安定化分化転換細胞を回収する工程 を包含する、前記方法。 - 【請求項2】 脱分化工程(a)が、レチノイドの投与、毒素の投与、細胞
外マトリックスの崩壊、機械的または酵素的方法による細胞の物理的分離、およ
び外傷生成からなる群から選択される方法により成し遂げられる、請求項1に記
載の方法。 - 【請求項3】 分化転換を引き起こす剤が、グアノシン、フェニルチオウレ
ア、12−0−テトラデカノイル−13−ホルボールアセテート、グアノシンモ
ノホスフェート、グアノシンジホスフェート、グアノシントリホスフェート、ア
デノシン、アデノシンモノホスフェート、アデノシンジホスフェート、アデノシ
ントリホスフェート、ウリジン、ウリジンモノホスフェート、ウリジンジホスフ
ェート、ウリジントリホスフェート、チミジン、チミジンモノホスフェート、チ
ミジンジホスフェート、チミジントリホスフェート、エピネフリンおよびノルエ
ピネフリンからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 安定化を生じさせる剤が、β−カロチン、レチノイド、リボ
フラビンおよびプテリジンからなる群から選択される請求項1に記載の方法。 - 【請求項5】 哺乳類における部分的に破壊されていた構造のレムナント中
に発生領域を再生または作製するための方法であって: (a)構造のレムナントを脱分化する工程、 (b)工程(a)の構造のレムナントを分化転換する工程、および (c)工程(b)の構造のレムナントを安定化し、それによりレムナント中に
発生領域を作製する工程 を包含する、前記方法。 - 【請求項6】 脱分化が、レチノイドの投与、毒素の投与、細胞外マトリッ
クスの崩壊、機械的または酵素的方法による細胞の物理的分離、および外傷生成
からなる群から選択される方法により成し遂げられる、請求項5に記載の方法。 - 【請求項7】 分化転換を引き起こす剤が、グアノシン、フェニルチオウレ
ア、12−0−テトラデカノイル−13−ホルボールアセテート ホルバールグ
アノシンモノホスフェート、グアノシンジホスフェート、グアノシントリホスフ
ェート、アデノシン、アデノシンモノホスフェート、アデノシンジホスフェート
、アデノシントリホスフェート、ウリジン、ウリジンモノホスフェート、ウリジ
ンジホスフェート、ウリジントリホスフェート、チミジン、チミジンモノホスフ
ェート、チミジンジホスフェート、チミジントリホスフェート、エピネフリンお
よびノルエピネフリンからなる群から選択される、請求項5に記載の方法。 - 【請求項8】 安定化を生じさせる剤が、β−カロチン、レチノイド、リボ
フラビンおよびプテリジンからなる群から選択される、請求項5に記載の方法。 - 【請求項9】 哺乳類における癌の治療方法であって、良性細胞への癌の分
化転換を引き起こすのに有効な量の剤と癌を接触させることを包含する、前記方
法。 - 【請求項10】 患者における抗体介在性自己免疫疾患の進行を抑制する方
法であって: (a)自己免疫襲撃下にある型の患者から細胞を得る工程と、 (b)細胞を正常表現型に変換するのに有効な量の分化転換剤と細胞を接触さ
せる工程、 (c)変換細胞をin vitroで培養して細胞を増幅させる工程、 (d)血液は進入させるが細胞を保持する膜上に細胞を固定する工程、および (e)固定化細胞を患者の血液と接触させ、それにより患者の血液から抗体を
除去する工程 を包含する、前記方法。 - 【請求項11】 損傷により傷害を受けるか、または失われている哺乳類の
身体中の組織または器官を再生する方法であって: (a)脱分化有効量の脱分化剤を投与することにより損傷部位での細胞を脱分
化する工程、 (b)分化転換有効量の分化転換剤と細胞を接触させることにより工程(a)
の脱分化細胞を分化転換する工程、および (c)安定化有効量の安定剤と細胞を接触させることにより工程(b)の分化
転換細胞を安定化する工程 を包含する、前記方法。 - 【請求項12】 脱分化が、レチノイドの投与、毒素の投与、細胞外マトリ
ックスの崩壊、機械的または酵素的方法による細胞の物理的分離および外傷生成
からなる群から選択される方法によりなされる、請求項11に記載の方法。 - 【請求項13】 分化転換を引き起こす剤が、グアノシン、フェニルチオウ
レア、TPA、グアノシンモノホスフェート、グアノシンジホスフェート、グア
ノシントリホスフェート、アデノシン、アデノシンモノホスフェート、アデノシ
ンジホスフェート、アデノシントリホスフェート、ウリジン、ウリジンモノホス
フェート、ウリジンジホスフェート、ウリジントリホスフェート、チミジン、チ
ミジンモノホスフェート、チミジンジホスフェート、チミジントリホスフェート
、エピネフリンおよびノルエピネフリンからなる群から選択される、請求項11
に記載の方法。 - 【請求項14】 安定化を生じさせる剤が、β−カロチン、レチノイド、リ
ボフラビンおよびプテリジンからなる群から選択される請求項11に記載の方法
。 - 【請求項15】 幹細胞を産生する方法であって: (a)患者の皮膚細胞からメラノサイトを得る工程、 (b)産生に有効な時間および濃度で分化転換を引き起こす剤とメラノサイト
を接触させる工程、および (c)幹細胞を回収する工程 を包含する、前記方法。 - 【請求項16】 幹細胞が、クッパー細胞である、請求項15に記載の方法
。
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