KR101726906B1 - 와튼 젤리 탯줄로 만든 신규의 생체 재료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 탯줄의 세포외 매트릭스를 베이스로 하는 재생 의료에 이용하기 위한 생체 재료, 특히 히드로겔에 관한 것이다. 본 발명은 특히 탯줄의 와튼 젤리(조합 요법으로서 세포에 임의로 조합시킬 수 있음)에만 존재하는 글리코사미노글리칸으로부터 생성되는 생체 재료, 및 그의 제조 방법 및 이용 방법에 관한 것이다.

Description

와튼 젤리 탯줄로 만든 신규의 생체 재료{NEW BIOMATERIAL FROM WHARTON'S JELLY UMBILICAL CORD}

본 발명은 재생 의료에 적용하기 위한 탯줄의 세포외 매트릭스로 제조된 생체재료, 구체적으로 히드로겔에 관한 것이다. 본 발명은 특히 본질적으로 탯줄의 와튼 젤리(WJ)에만 존재하는 글리코사미노글리칸으로부터 생성된 생체 재료, 및 그것의 제조 방법 및 이용 방법에 관한 것이다. 제품의 구현예는 단독으로 또는 세포-기재 치료법과 결합하여 사용될 수 있다.

중합체에 의해 형성된 생체 재료들은 재생 의료에 중추적 역할을 하는데 그 이유는 이들이 일시적으로 이식 세포의 접착, 증식 및 분화를 위한 3차원 고정장치(anchor)를 제공하기 때문이다. 이러한 3차원 성질은 세포 간 전달을 위한 적절한 플랫폼을 제공하고 세포와 생체 재료의 성분들과의 유연관계를 제공한다. 시간이 지나면서 매트릭스와 세포 간에 일어나는 생체상호작용은 세포의 증식 능력, 새로운 조직 형성을 위한 이들의 조직화, 이들의 분열화 및 재생과정을 지휘하는 신호전달 분자의 분비를 결정한다.(Dawson et al., 2008).

이러한 현상들이 일어나도록 하기 위해서, 본 생체 재료는 재흡수될 때까지 한정된 시간 동안 적용지점에 머무르면서, 재생 효과를 비롯하여 적절한 세포 작용이 일어나기에 충분히 오랫동안 그 구조를 유지할 필요가 있다.

특정 유형의 생체 재료인 히드로겔은 조직공학에 적용하기에 적합한 수많은 특성을 갖는다.

히드로겔은 그들의 구조 내부에 자체 무게의 10~20%에서 수백 배에 이르기까지 많은 양의 물을 함유하는 함수능력을 가진 천연 또는 합성의 상호연결된 친수 중합체들로 형성된 구조이다. 이러한 겔은 지지체로서 역할을 할 수 있는 구조적 매트릭스를 형성하기에 이상적인 후보물질인 3차원 격자의 반-고체 형태를 나타낸다. 3차원 구조는 물리적 가교와 화학적 가교 모두에 의해 형성될 수 있다. 물리적 가교는 그 구조가 최종 적용에 따라 가역적일 수 있는 가역성 히드로겔을 생성하는 반면, 화학적 가교는 그 구조가 모든 적용에서 유지되는 영구적 히드로겔을 형성한다(Coburn et al ., 2007). 따라서, 히드로겔은 물과 접촉할 때 팽창하여 부드러운 탄성 물질을 형성하는 3차원 망상 형태로 가교된 (천연 또는 합성질) 중합체이고, 그것의 상당한 분획을 용해 없이 그 구조로 유지한다.

히드로겔은 다음과 같이 일련의 특별한 특성이 있다:

1. 친수성: 그 구조에 수용성 작용기(-OH, -COOH, -CONH₂, -CONH, SO₃H)가 존재하기 때문. 따라서 이들은 살아 있는 조직의 수분함량과 유사한 높은 수분 함량을 갖는다(Elisseeff et al., 2005).

2. 불수용성: 이들의 구조에 3차원 중합체 그물망이 존재하기 때문.

3. 이들은 매끄럽고 탄력적인 경도를 갖고, 이 경도는 친수성 개시 단량체와 가교 중인 저밀도의 중합체에 의해 결정된다.

이들은 물 또는 수성용액의 존재 하에, 화학적-물리적 평형 상태에 도달할 때까지 부피를 상당히 증가시키지만, 형태를 잃지 않으면서 팽창하는 능력을 갖는다. 이러한 팽창 능력은 세포들이 연성 조직에서 겪는 환경과 비교되는 수성 미세환경을 제공한다. 물과 다공성 구조의 존재 역시 저분자량 용매 및 세포 생존에 중요하고 필수적인 영양분의 흐름뿐만 아니라, 히드로겔 밖으로 세포 배설물의 운반을 가능하게 한다(Torres et al., 2000).

점질다당류로도 불리는 글리코사미노글리칸류(GAGs)는 프로테오글리칸으로 불리는 거대분자를 형성하는 핵단백질에 결합된 유기체에서 발견되는 헤테로 다당류이다. 이들은 세포 표면 또는 세포외 매트릭스에서 발견될 수 있고, 세포-세포 및 세포-세포외 매트릭스의 상호작용에 중요한 역할을 수행한다. 이들은 두 가지 다른 당에 의해 형성된 이당류의 반복적 서열을 포함하는 통상의 특성의 분자 모이어티를 갖는 황산화 및 비-황산화 형태로 존재한다. 둘 중 하나는 일반적으로 헥수론산염인 반면, 나머지 하나는 헥소사민이다. 이당류의 결합 및 황산화의 위치의 배열상 변화는 이들 사슬의 물리적 및 화학적 특성에 있어서 다양성의 증가로 이어진다. 고함량 황산염 및 우론산의 존재는 GAGs에 큰 음전하를 제공하고, 그래서 와튼 젤리에서의 다량의 GAGs는 이 조직을 극도로 수화시킨다.

여러 유형의 GAGs가 있고, 이들은 그들의 구조 때문만이 아니라 분자에 신호를 보내는 여러 세포를 위한 고정장치 자리이기 때문에 기본적인 세포 기능에 직접적으로 관여한다.

히알루론산은 와튼 젤리에서 가장 풍부한 GAGs이다. 이것은 생체 내에서 유리 탄수화물처럼 작용하는 GAGs 군의 유일한 비-황산화 요소로, 이것의 구조는 이당류: D-글루쿠론산 및 (1-β-3) N-아세틸-D-글루코사민의 반복으로 이루어진다(Goa et al., 1994; Laurent et al., 1992). 이것은 여러 세포 유형에 의해 합성되고, 세포 주변의 지지 및 보호 구조물을 생성하기 위해 세포외 매트릭스의 다른 구성요소들과 상호작용하는 세포외 공간으로 분비된다(Collins et al., 2008). 이것은 분자량이 100,000~5.10⁶ Da일 수 있는 단일분자를 소유하는 거대 다가-음이온성 선형 중합체이다(Toole et al., 2004; Bertolami et al., 1992). 이것은 큰 부피를 차지하는 코일형 구조를 갖기 때문에, 점도가 높은 용액을 만든다. 히알루론산의 개별 분자들은 서로 결합하여, 망상구조 또는 격자구조를 형성한다. 조직 발달에서, 히알루론산은 세포 증식 및 이동에 관여하는 주요한 구조적 거대분자로 여겨진다.

히알루론산은 세포외 매트릭스의 혈관신생, 형태형성(morphogenesis), 일반 무결성 및 회복(repair)과 같은 여러 처리 과정에 관여한다. 양수에 히알루론산이 다량으로 함유된 것이 태아기 상처의 치료에 유리하다는 것이 알려져 있다(Longaker et al., 1989). 건강한 피부와 흉터 사이의 분자 특성의 변화들이 추가로 관찰된 바 있고, 일반 흉터의 히알루론산은 비대성 흉터(hypertrophic scars)의 그것과는 확실히 다르다(Ueno et al., 1992).

콘드로이틴 설페이트는 D-글루쿠론산 이합체와 N-아세틸갈락토스아민이 반복하여 형성되는 선형 중합체이다. 이것의 유용성은 연골성분 매트릭스의 퇴화에 관련된 효소들의 활동을 억제하는 것에 의한 관절 질환에 대한 치료에서 시험된 바 있다. 이것은 또한 보체의 억제에 의해 항-염증제 역할을 하기도 하고, 혈전색전증 치료, 외과수술 및 안과 치료에서 유용하다.

콘드로이틴 설페이트 B로도 알려진 데르마탄 설페이트는 헤파린 보조인자 II를 통해 트롬빈에 선택적 방해 효과를 나타내기 때문에 강력한 항응고제이고, 출혈 위험이 낮기 때문에 생체 내에서 아주 효과적이다(Trowbridge et al ., 2002).

일반적으로 글리코사미노글리칸류 및 특별히 헤파린은 혈장 캐스케이드 활성을 조절하는 능력이 있어서, 서로 다른 시점에서 내재성 응고 경로의 억제를 강화하고 전형적인 보체 활성 경로를 억제한다(Rabenstein, 2001). 헤파린의 알려진 다른 기능은 혈관신생의 억제, 체액성 성장 및 그것의 항바이러스 활성이다.

헤파란 설페이트는 헤파린과 밀접하게 관련된 구조를 갖는다. 이것은 동물 조직에 널리 분포되어 있고, 이것의 기능들 중에는 세포 접착 및 세포 증식 조절이 두드러진다. 이것은 단백질의 퇴화를 저해하는 보호 효과가 있어서, 기저막을 통한 단백질의 운송을 조절하고 또한 이들의 내재화에 개입한다(Rabenstein, 2001).

사람 또는 동물 유래(由來)로부터 얻은 점액다당류에 관한 여러 개의 특허 문건이 있다. 문헌 US 3,887,703은 소 또는 양의 태아의 피부 표피와 탯줄에서 얻은 점액질 다당류에 관한 것이다. 상기 특허에서 점질다당류를 얻기 위한 과정은 탯줄의 막, 세포 및 관류의 제거를 언급하지 않았다. 추출 산물은 그 안에 함유된 개개의 점질다당류의 조성 또는 존재량에 대한 언급 없이 분말 형태로 얻어진다. 활성 산물은 혼합물에 존재하는 헥소스아민의 양에 의해 동정된다. 오일성 두피와 머리카락의 치료를 위한 그리고 염증 치료를 위한 주입용 및 경구 섭취용 두 가지 형태의 조성물이 추출물로 제조된다.

특허 문헌 US 5,814,621은 본질적으로 물에서보다 유기 용매-물 혼합물에서 용해도가 더 큰 약물과 약물의 일부를 형성하는 점액질 다당 물질로 이루어진 조성물에 관한 것으로, 여기서 약물의 결정 또는 입자는 점액질 다당 물질 입자의 표면에 분산되고, 상기 약물은 단독으로 있을 때보다 물에서 더 빨리 분해된다. 상기 조성물은 과립 형태로 존재할 수 있다.

특허 출원 WO 2008/021391 A1은 탯줄 막을 포함하는 생체 재료를 기술한다. 더욱이, 이 생체 재료는 부가적으로 한 가지 이상의 탯줄 혈관 및/또는 와튼 젤리를 포함할 수 있다. 본 생체 재료는 바람직하기는 건조하고, 납작하거나 튜브형이거나 특정 구조에 알맞은 형태일 수 있다. 본 발명은 또한 탯줄 막의 한 층 이상을 포함하는 생체 재료의 제조방법뿐만 아니라, 상기 생체 재료를 얻는 방법 그리고 조직 또는 장기를 회복하기 위한 생체 재료의 이용 방법을 제공한다.

본 명세서는 탯줄로 만든 생체 재료를 특징으로 한다. 본 명세서는 상기 재료의 조성물이 콜라겐(I형, III형 및 IV형, 이들은 생체 재료 매트릭스의 75~80%를 차지한다), 피브로넥틴 및 글리코사미노글리칸을 포함함을 기술한다.

본 생체 재료는 또한 탯줄에서 유래되지 않고 상업적 출처를 갖는 콜라겐을 포함할 수 있고, 또는 이것은 종래 기술에 알려진 다른 조직 및 방법으로부터 분리된 바 있음이 또한 언급되었다. 저자들은 또한 본 생체 재료가 성장인자, 호르몬, 항생제, 면역조절 인자 등과 같은 비-구조적 화합물을 포함할 수 있다는 것을 덧붙인다.

스페인 특허 ES 8600613은 생체 조직을 처리하고, 세포막과 핵산, 지질 및 세포질 성분을 분리하며, 콜라겐을 주성분으로 하는 세포외 매트릭스를 형성하고, 그리고 콜라겐을 생체이식편으로 사용하기에 적합한 생체 조직으로 만드는 과정을 기술하고, 이 과정은 상기 조직을, 생체 내에서 그것의 조직 이식에 적합한 크기와 형태를 유지하면서 동시에 하나 이상의 세척제로 추출하는 것을 포함한다.

특허 문헌 ES 2 180 653 T3은 생물학적 재료들을 세포의 70% 이상을 제거하기 위해 자기분해되었던 물질로 변환시키는 방법과 사람 또는 동물에 이식수술 후 그것이 무기질화 하는 것을 억제하기 위한 상기 재료의 처리 방법을 기술한다. 본 문헌은 출발 생물학적 재료는 비록 구체적으로 돼지의 대동맥 판막에 관한 것이지만, 다른 것들 중에서 탯줄일 수 있음을 주장한다. 그럼에도 불구하고, 본문에는 탯줄로 이것을 실행하는 것에 관한 어떤 상세한 내용도 포함되지 않았다. 생성된 생체 재료는 생체인공심장판막을 생성하는 데 사용된다.

특허 문헌 US 4,240,794는 혈관 대체물로 사용하기 위한 사람 또는 동물 탯줄의 제조에 관한 것이다. 본 문헌은 구체적으로 알코올에서 탯줄을 탈수시키는 기법을, 이어서 이 탯줄을 원하는 형태로 고정시키는 방법을 기술한다. 일단 탯줄에서 남아 있을 수 있는 다른 조직들을 없애고 나면, 이 탯줄은 굴대(mandrel)에 놓여 탈수에 필요한 시간 동안 특정 에틸알코올에 담근다. 탈수 후, 탯줄은 고정을 위해 1% 알데히드 용액에 담근다.

특허 문헌 FR 2,563,727은 와튼 젤리를 함침시키고 동결 온도에서 보관된 탈프로그램(deprogrammed) 연결 조직으로부터 피부 이식편을 생산하는 방법을 기술한다. 저자들은 탯줄에 고정된 장치를 기술하고, 이것은 압축 공기를 주입하는 캐뉼라에 의해 팽창된다. 탯줄은 그 후 절단되고 분리되지만, 이 과정에서 얻은 생성물은 와튼 젤리 독점적으로 구성되지 않는다고 기재되어 있다.

관심세포를 얻기 위해 탯줄을 사용하는 특허 문헌이 있다. 이러한 목적을 위해, 와튼 젤리를 분리하고 제거한 뒤, 상기 세포를 얻는 과정이 실행된다. 예를 들어, PCT 문헌 98/17791은 탯줄에서 연골세포 전구체의 분리를 기술한다. 이들 전구체는 추후에 치료를 위해 연골을 생성하는 데 사용된다. 이와 유사하게, WO 2004/072273 A1 문헌에서, 전구세포는 탯줄 주위에 있는 와튼 젤리로부터 추출되고, 사람 조직의 회복에 사용된다.

다른 유사한 생체 재료와 달리, 본 발명의 생체 재료는 탯줄의 WJ에 존재하는 다양한 GAGs의 결합으로 이루어진다. 이것은 주로 히알루론산으로 제조되지만, 더욱이 다른 GAG 화합물과 달리, 데르마탄 셀페이트, 헤파란 설페이트, 헤파린, 케라탄 설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트 및 콘드로이틴-6-설페이트를 함유한다. 탯줄의 WJ에 존재하는 다양한 GAGs의 특정 결합은, 그들 각각이 세포 행동 조절 기능을 수행하므로, 생체 재료의 대생물작용을 개선한다. 예를 들면, 헤파란 설페이트와 헤파린은 FGF 및 EGF의 주요 결합부위이고 (Kanematsu et al., 2003; Ishihara et al., 2002), 이것은 이들을 단백질 가수분해로부터 보호하고 세포 환경에서 이들 인자의 국소적 집중을 허용하고, 거대 세포 활성에 적합한 분자 미세환경을 생성한다 (Malkowski et al., 2007).

그러나, 본 발명자들이 아는 한, 1) 탯줄막과 혈관이 없는, 2) 저장가능한 점도를 갖는 히드로겔을 형성할 수 있고, 3) 광범위한 사람 병리학에 적용할 수 있는: 탯줄의 와튼 젤리로부터 유래된 GAGs로 형성된 생체 재료를 언급한 문헌은 없다. 더욱이, 상기 특허는 본 문헌에 존재하는 구현예와 상당히 다른 태(umbilical)-유래 산물을 함유한다. 본 발명의 생체 재료는 WJ로도 불리는 탯줄의 세포외 매트릭스를 배타적으로 형성하는 글리코사민글리칸을 기재로 한다. 그러므로, 비록 세포외 매트릭스를 합성하기 위한 수많은 시도가 문헌에서 발견되었지만, 특정 조직의 천연 조건을 가상한 정확한 조성물은 얻어지지 않았다.

본 발명에서 개발된 생체 재료는 조직 공학의 기본 매트릭스로서의 사용을 허용하는 3차원 구조를 제공하고, 더 나아가 질병에 직접 적용되었거나 또는 세포와 함께 적용되었을 때, 본 생체 재료는 재생 과정에 개입하여 주변 조직의 세포들에 주화성 효과를 행사하고, 그러므로 세포 활성화 과정에 유리한 환경을 제공한다.

본 생체 재료에 존재하는 GAGs의 조합물은 다수의 특이적 신호전달 분자 결합지점을 제공하는데, 이것은 적용 지점에서 치료받은 결함을 재생하고 회복시킬 세포외 매트릭스를 다량 합성하기 위한 조직 자체의 세포의 높은 활성을 허용한다.

더욱이, 본 발명의 생체 재료의 유래는 비-면역원성 영역의 사람 유래의 천연 구조를 제공한다. 이 물질은 신체에서 천연 생물분해 과정을 통해 제거되고, 그러므로 다른 생체 재료에 의해 발생할 수 있는 원하지 않는 반응 또는 부작용을 예방한다. 예를 들면, 몇몇 합성 생체 재료는 염증, 경결(induration)(장기 조직의 경화), 육아종 발발, 점막에서 괴사 및 그것의 생성에 사용된 독성 물질로 인한 조직 합병증을 일으킬 수 있다.

탯줄에서 GAGs의 가장 중요한 기능 중 하나는 외부 물리적 방해 (예를 들면,탯줄의 꼬임은 태아에 치명적일 수 있다)로부터 그 안에 위치한 혈관계를 보호하기 위한 내구성과 탄력성 그리고 저항성을 제공하는 것이다. 사실, 이러한 분자들의 합성에서의 결함은 임신 기간 중의 심각한 질병과 관련된다(Gogiel et al., 2005). 그러므로, 탯줄의 일부분을 형성하는, 7가지 서로 다른 유형의 GAGs로 제조된 생체재료는 다음의 능력을 소유함으로써 커다란 다양성을 소유할 것이다: 유기체 중 발생하는 대생물작용의 발생 반복, 탯줄에 유익한 동일한 기계적 성질의 소유, 및 추가 공정 및 (가교와 같은)변형을 위한 안정성의 소유.

도 1: 본 발명의 생체 재료에 존재하는 GAGs의 특성 및 정량화. 막대 그래프는 본 발명의 생체 재료에 존재하는 서로 다른 유형의 GAGs 및 그들 각각의 백분율을 나타낸다. HA: 히알루론산, KS: 케라탄 설페이트, C6S: 콘드로이틴-6-설페이트, HS: 헤파란 설페이트, C4S: 콘드로이틴-4-설페이트, DS: 데르마탄 설페이트, H: 헤파린.
도 2: 조직 염색에 의한, 샘플에서의 GAGs의 존재 및 세포 및 DNA/RNA의 부재의 검증. 좌측 영상은 세포가 있는 샘플을 나타내고 우측 영상은 생체 재료만의 염색을 나타낸다. A, B: 헤마톡실린-에오신 염색; C, D: 메틸 그린-피로닌 염색; E, F: 알시안 블루 염색.
도 3: 주사 전자 현미경에 의한 본 발명의 생체 재료의 내부 3차원 구조 영상. 본 영상은 서로 다른 두 개의 배율(A: 10mm 및 B: 5mm)에서의 본 발명의 생체재료의 내부 구조를 나타내고, 여기서 서로 결합된 GAG 단위들을 볼 수 있고, 상당히 균일한 다공성 구조를 제공한다.
도 4: 본 발명의 생체 재료에 존재하는 세포의 독성 연구의 결과. 본 그래프는 AMSC 세포(지방-유래 간엽 줄기세포)(도 A), 마우스 섬유 아세포(도 B), L929(도 C), 조골세포(도 D), 연골세포(도 E) 및 각질형성세포(도 F)의 세포독성 곡선을 나타낸다. 이러한 결과들은 대조군(생체 재료에 없는 세포들)과 양성 대조군(ISO-10993 표준에 따라 결정된 독성 생체 재료(PVC)에 존재하는 세포들)에 대해 제공된다. 그래프에서 관찰되는 바와 같이, 생체 재료는 생체 재료에 배열된 세포들의 미토콘드리아 활성이 대조군 세포들(표준 배양 조건에서)과 관련해 차이점을 보이지 않으므로, 검사된 어떤 유형의 세포에서도 독성을 일으키지 않는다.
도 5: 3차원 생체 재료의 확대 영상. 본 도면은 몰드로서 표준 24-웰 배양 플레이트를 사용한, 본 발명의 고형 생체 재료의 냉동건조 후의 현미경 3차원 구조를 나타낸다.
도 6: 본 발명의 생체 재료에서 공생 배양에서 관절 연골세포와 MTT로 염색된 AMSC의 생존능력을 나타내는 역광현미경 영상. 제3일과 제7일 모두에 염색하였다. 검게 염색된 세포는 생존성이고 대사활성이다.
도 7: 본 발명의 생체 재료와 히알루론산에서 사람 연골세포의 증식 성능의 비교. 그래프의 자료는 히알루론산에서 배양된 것과 비교하여 본 발명의 생체 재료에서 유지된 연골세포의 증식 성능이 상당히 증가함을 나타낸다.
도 8: 본 발명의 생체 재료 및 히알루론산과 접촉한 섬유아세포 L-929의 증식률. 그래프는 히알루론산에서 배양된 세포와 비교했을 때, 본 발명의 생체 재료에 배열된 세포의 증식이 상당히 증가했음을 나타낸다.
도 9: 본 발명의 생체 재료, 및 세포 배양 표면과 접촉하여 놓인 히알루론산 히드로겔을 갖는 세포 배양 플라스틱에 접종된 세포의 역형광 현미경 영상. 이들 영상에서, 본 발명의 생체 재료와 접촉된 세포가 세포 배양 표면으로부터 분리되고 그리고 본 발명의 생체 재료 내에 클러스터를 형성하는 것을 관찰할 수 있다.
도 10: 콜라겐 II 및 베르시칸의 발현의 RT-PCR. 아가로스 겔의 농도계 스캐닝의 결과. 자료는 대조값 (C)에 대한 강도를 임의 단위로 표시하였고 평균 ±s.e.m, n=3. (*p < 0.05, **p < 0.01)이다. 영상은 본 발명의 생체 재료에 배열된 AMSC에서 II형 콜라겐 발현의 개시 및 베르시칸의 점감(waning)을 나타낸다. 이들 발현 특성은 연골세포 표현형을 향한 분화 및 관절연골을 성숙시키는데 상응하는 세포외 매트릭스의 합성 공정 중의 세포에 있음을 나타낸다
도 11: 돼지 및 사람 유래로부터 유래된 본 발명의 생체 재료의 3가지 다른 농도에서의 저장 탄성률 결과. 자료는 샘플들의 각각의 선형 점탄성 영역으로부터 유래된 단일 여기 주파수/변형률(strain)로부터 얻었다. 생리적 값을 시간대분할 한(bracketing) 시간에 대해 온도 스위프는 모든 샘플에 대한 점탄성 온도 관계를 산출하였다.
도 12: 돼지와 사람 유래로부터 유래된 히스토겔의 3가지 다른 농도에서의 손실 탄성률 결과. 자료는 샘플들로부터 각각의 선형 점탄성 영역으로부터 유래된 단일 여기 주파수/변형률로부터 수집하였다. 생리적 값을 시간대분할 한 온도에 대한 온도 스위프는 모든 샘플에 대해 점탄성 온도관계를 산출한다.
도 13: 돼지와 사람 유래로부터 유래된 본 발명의 생체 재료의 3가지 다른 농도에서의 손실 탄성률 결과. 자료는 샘플들의 각각의 선형 점탄성 영역으로부터 유래된 단일 여기 주파수/변형률로부터 수립하였다. 생리적 값을 시간대분할 한 온도에 걸친 온도 스위프는 모든 샘플에 대해 점탄성 온도 관계를 산출한다.
도 14: 제1일 (a), 제3일 (b) 및 제4일 (c)에 주변 조직으로부터 세포 보충(주화성)을 나타내는 광학 현미경의 영상으로: 여기서 (i)는 양성 대조에 해당하고, (ii)는 히알루론산 실험 설치에 해당하고, (iii)는 음성 대조에 해당하고, 그리고 (iv)는 본 발명의 생체 재료 실험 설치에 해당한다.
도 15: 연골 단편의 표면으로 이동하는 세포가 생존가능한지 여부를 결정하는 생/사멸 분석을 수행한 후 나타낸 광학 현미경 영상. 영상은 연골 단편으로부터 나온 세포의 대부분이 생존가능하다는 것을 나타낸다.
도 16: 제5일(a) 및 제6일(b)에 주변 조직으로부터 세포 보충(주화성)을 나타내는 광학 현미경의 영상으로: 여기서 (i)는 양성 대조에 해당하고, (ii)는 히알루론산 실험 설치에 해당하고, (iii)는 음성 대조에 해당하고, 그리고 (iv)는 본 발명의 생체 재료 실험 설치에 해당한다.

탯줄은 와튼 젤리라고 불리는 연성 연결 조직 부분을 형성하는 (황산화 및 비-황산화) GAGs를 다량 함유한다. 이들 GAGs 중에서, 주요 비-황산화 GAG는 히알루론산이지만(Hadidian et al., 1948; Jeanloz et al., 1950), 소량의 황산화 GAGs도 검출된다(Danishefsky et al., 1966). 게다가, 탯줄의 조직학적 연구는 헤파린의 존재를 암시해왔다(Moore et al., 1957). 또한 탯줄에 아직 확인되지 않은 더 많은 소수(minor)의 황산화 GAGs가 있을 가능성이 크다.

본 발명은 탯줄의 와튼 젤리에 배타적으로 존재하는 GAGs로 제조된 주사 가능한 히드로겔에 관한 것이다. 본 히드로겔은, 생체 재료를 얻을 수 있는 탯줄에 존재하는 세포 및 관류 성분이 전혀 없고, 따라서 면역원성을 거의 갖지 않는다. 본 발명의 생체 재료는 세포와 결합한 형태로 또는 단독으로, 치료 또는 미용 치료에 유용하다.

본 발명의 문맥에서, 다음의 용어가 정의된다:

"히드로겔"은 분산상(콜로이드)가 연속상(물)과 결합하여 점성 젤리형 물질을 생산하는 콜로이드의 형성을 말한다. 콜로이드는 통상적으로 합성 또는 천연 산물의 친수성 필라멘트들의 상호침입(interpenetrating) 망상이다.

"주입"은 물질을 공동으로 강제적으로 삽입하는 것을 말한다. 예를 들면, (일반적으로 치료 가치를 갖는) 물질을 상처에, 또는 체강, 순환, 또는 다른 위치에 주입한다. 본 발명의 목적을 위해, 주입은 원하는 위치로의 다양한 양식의 침투로 구성될 수 있다. 예를 들면, 케이지 크기가 0.5mm 내지 15mm인 피하 주사바늘을 포함한다. 관절경 또는 복강경 수술에서, 실린더 포트, 바늘, 또는 기타 유사 물체가 내부 병리를 치료하는데 사용된다. 이러한 형태의 주입에서, 지지체(scaffold)와 같은 치료제는 피하 주사 바늘보다 상당히 게이지 크기가 큰 접근 포드를 통해 강제로 통과된다 (예를 들면, 0.5 cm 내지 4 cm).

"주사 가능한 히드로겔"은 피부 장벽을 침투하는 병리에 대해 주입 기술을 사용하여 히드로겔을 적용하는 작용을 말한다. 예를 들면, 병리는 만성 상처, 손상된 기관, 손상된 조직, 또는 기타의 처리를 필요로 하는 피부 장벽 밑의 상처일 수 있다. 적용 방법은 관절경/복강경 기술을 위한 피하주사로부터 적용된 영역에 물질을 특이적으로 적용하기 위해 고안된 임시 장비까지 광범위하게 달라질 수 있다. 예를 들면, 코킹 건과 유사한 것이 고-점성 물질을 전달하는데 사용될 수 있다; 바늘을 통해 실을 감는 장비가 필라멘트성 중합된 히드로겔 물질을 전달하기 위해 적용될 수 있다; 관절경/복강경 포트가 연골관절 결함에 히드로겔 플러그를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 당업자는 주입 기술에 대한 다수의 가능성을 이해할 수 있다.

"가교된 히드로겔"은 가역적 또는 비가역적인 히드로겔의 이온성 또는 공유적 안정화를 말한다. 가교된 히드로겔은 비-가교 히드로겔보다 점성이 높고, 조작에 적합하고, 안정한 3차원적 형태를 갖고, 그리고 기계적 힘이 적용된 후 파괴될 수 있다.

"3차원 히드로겔"은 구멍과 같은 안정한 미세 3차원 구조를 포함하는 3차원 구조를 유지하는 가교된 히드로겔을 말한다. 반대로, 비-가교된 히드로겔은 그것이 담긴 용기를 채우도록 흐른다. 가교된 히드로겔에서 흐름에 대한 내성은 안정한 3차원 구조를 유지하기 위한 가교된 히드로겔의 안정성의 특성이다.

WJ가 본 발명의 목적을 위해 추출되는 탯줄의 유래는 동물과 사람을 포함하여 포유동물로부터 기인할 수 있다. WJ의 추가의 잠재적 유래는 소, 양, 돼지, 영양, 낙타, 사슴, 염소, 말, 코끼리, 코뿔소, 얼룩말, 들소, 물소, 호랑이, 사자, 표범, 곰 등과 같은 동물의 탯줄이다. 이 생체 재료는 히알루론산, 케라탄 설페이트, 콘드로이틴-6-설페이트, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트, 데르마탄 설페이트 및 헤파린을 포함하는 군으로부터 선택되는 글리코사미노글리칸들의 혼합물에 의해 형성된다.

이 생체 재료는 바람직하기는 다음 조합 및 배율로 GAGs의 혼합물을 형성하는 것으로 알려졌다: 히알루론산(40~80%), 케라탄 설페이트(2~25%), 콘드로이틴-6-설페이트(3~10%), 헤파란 설페이트(1~9%), 콘드로이틴-4-설페이트(0.5~7%), 데르마탄 설페이트(0.1~7%) 및 헤파린(0.05~3%). 더욱 바람직하기는 GAGs의 조합은 다음과 같다: 히알루론산(70%), 케라탄 설페이트(10%), 콘드로이틴-6-설페이트(7%), 헤파란 설페이트(5%), 콘드로이틴-4-설페이트(4%), 데르마탄 설페이트(3%) 및 헤파린(1%).

본 발명은 또한 앞서 기술된 히드로겔로 제조된 생체 재료에 관한 것이고, 이것은 화합물 치료 효과를 위해 선택적으로 세포와 결합한다. 따라서 본 히드로겔의 작용은, 생체 재료가 제품의 효능에 기여할 수 있는 건강한 세포를 갖는다는 사실의 결과로서, 심각하게 손상된 조직 또는 환자에 의해 인 시츄(in situ) 세포 인공주입 가능성이 없는 조직에서의 재생 및 조직 회복과정에서 강화된다. 구축물을 형성하기 위해 생체 재료 지지체에 첨가된 세포는 다른 무엇보다: 미분화된 간엽 줄기세포 또는 또 다른 세포주로 분화된 간엽 줄기세포, 미분화된 조혈 줄기세포 또는 또 다른 세포주로 분화된 조혈 줄기 세포, 연골세포 및 연골모세포, 조골세포 및 골세포, 각질형성세포, 섬유 아세포, 근육세포, 지방세포, 뉴런 또는 신경계로부터의 다른 세포들, 백혈 세포계로부터의 세포들, 각막세포, 내피세포 또는 상피세포일 수 있다.

본 발명과 관련된 다음의 면들을 아래와 같이 나타내었다: (i) 탯줄의 와튼 젤리로부터 GAGs의 추출물을 얻는 단계, (ii) 탯줄의 와튼 젤리로부터 단리된 GAGs로부터 히드로겔을 생산하는 단계, (iii) 얻은 히드로겔을 특징짓는 단계 및 (iv) 생체 재료를 사용하는 단계. 이에 더하여, 연구/실험은 히알루론산(HA)과 비교했을 때 양성 세포 행동 및 상호작용을 수행하는 주사 가능한 히드로겔의 능력을 증명한다.

탯줄의 와튼 젤리로부터 GAGs 의 추출물을 얻는 단계

본 생체 재료를 얻기 위한 방법은 다음 단계를 포함한다:

a. 동물 또는 사람 유래로부터 탯줄을 얻는 단계;

b. 사람 탯줄을 생리 식염수와 항생제로 처리하는 단계;

c. 사람 탯줄 표면으로부터 혈액을 모두 제거하는 단계;

d. 사람 탯줄을 1~2cm의 부분으로 조각내는 단계;

e. 내부에 잔존하는 혈액을 깨끗이 씻어내는 단계;

f. 탯줄 막과 혈관을 제거하는 단계;

g. 와튼 젤리를 포함한 젤라틴성 물질을 분리하는 단계;

h. 얻은 젤라틴성 물질을 효소로 소화시키는 단계; 그리고

i. GAGs를 침전시켜 단리하는 단계.

구체적으로, 탯줄의 와튼 젤리로부터 글리코사미노글리칸들을 분리하기 위해 다음과 같은 방법이 실시된다:

와튼 젤리를 얻는 단계

분만 직후 탯줄을 수집하고, 처리되거나 또는 처리될 때까지 4℃에서 유지시킨다. 이런 상태가 24시간 이상 경과 되면 안 된다.

처리하는 동안, 탯줄은 바람직하기는 바이오안전 II 단계 층류 유동기(laminar flow hood)에서 멸균 상태로 유지된다. 잔존 혈액을 완전히 제거하기 위해 탯줄을 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 용액 또는 항생제(페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신-B) 및/또는 적혈구 라이시스 완충액 혼합물을 포함하는 인산염 완충용액 1X(1X PBS)로 적어도 연속 3회 세척한다.

일단 탯줄의 표면에서 혈액을 깨끗이 씻어내고, 탯줄을 페트리 접시에 옮기고, 1~2cm 크기의 부분으로 조각낸다. 탯줄을 조각으로 자를 때, 탯줄의 혈관에 잔존하던 혈액이 흘러나올 수 있고, 따라서 탯줄 조각을 철저하게 씻는 것이 필요하다.

탯줄은 구조적 측면에서 탯줄 동맥 2개와 탯줄 정맥 1개를 가지며, 이들은 균일한 매트릭스 와튼 젤리에 의해 지지되고 얇은 막으로 덮인다. 와튼 젤리를 독점적으로 얻기 위해서 이 막과 혈관을 기계적으로 제거한다. 이것을 위해, 탯줄 조각을 세로로 길게 절개하고, 메스와 핀셋을 사용하여 탯줄 막과 혈관을 모두 조심스럽게 제거한다. 이러한 기계적 분리의 결과로 얻게 되는 젤라틴성 물질이 와튼 젤리다. 일반적으로 탯줄 25~200g에서 와튼 젤리 20~160g이 얻어진다.

와튼 젤리로부터 GAGs 를 추출하는 단계

파파야 라텍스의 파파인 효소를 사용하는 효소 소화에 의해 연골로부터 GAGs를 얻기 위해(SIGMA, Ref: P-4762) 문헌(Rogers et al ., 2006)에 기술된 절차를 일부 수정하여 사용해서 탯줄의 와튼 젤리로부터 GAGs를 얻었다. 전 단계에서 얻은 와튼 젤리의 완전 소화를 위해 60℃에서 24~48 시간 동안 추출 완충용액(L-시스테인 5mM, Na₂HPO₄완충액 100mM, EDTA 5mM, 파파인 10mg(14 U/mg), pH 7.5) 20㎖에 담궜다.

와튼 젤리가 완전히 소화되고 나면, 불필요한 소화 잔류물을 제거하기 위해 원심분리하였다. 이때, 소화된 부피가 출발 부피보다 큰 것이 관찰되었다. 이러한 증가는 와튼 젤리에 존재하는 GAGs의 용해 그리고 이로써 그들이 축적했던 물의 방출 때문이다.

일단 샘플이 원심분리되면, 상청액을 다른 용기에 옮겨 담고, 이어서 샘플 중의 GAGs는 침전된다.

탯줄의 와튼 젤리로부터 GAGs 를 침전시키고 단리하는 단계

와튼 젤리의 GAGs를 100% 에탄올 5 부피에 침전시킨다. 이 단계에 의해, 샘플의 GAGs뿐만 아니라 샘플에 존재하는 염들도 침전된다. 이러한 침전은 샘플에 존재하는 물 분자들이 에탄올 분자와 상호작용하고, 그러면서 물 분자가 샘플의 GAGs와 상호작용할 수 없게 되어, GAGs가 물에서 불용성이 되고, 그 결과로 침전이 일어난다. 따라서, 에탄올을 첨가하고 시험관을 흔들어준 직후, 백색 침전물이 관찰된다. GAGs가 침전되도록 -20℃에서 12시간 동안 방치한다. 침전되면 원심분리하여 100% 에탄올을 제거하고, 침전물을 75% 에탄올 5 부피로 세척하여 샘플에 침전되었을 잔류염을 제거한다. 샘플을 다시 한 번 원심분리하여 상청액을 완전히 제거한다.

GAGs를 포함한 샘플이 침전되면, 고체 잔류물을 에탄올이 모두 증발될 때까지 실온에서 30분 이상 건조되도록 방치한다. 에탄올이 증발되면, GAGs를 포함한 샘플을 Milli-Q H₂O에서 재현탁시키고 사용할 때까지 4℃에서 보관한다. 이와 같이 얻은 히드로겔은 주사 가능한 혈청과 혼합되고 또는 치료된 영역에 직접 적용될 수 있다. 상기에도 불구하고, 이러한 유형의 물질의 기계적 내성은 낮다: 이들은 복합물을 형성하기 위해 강화재료와 결합하지 않는 한 하중을 견딜 수 없는 것으로 간주된다. 예를 들면, 인산칼슘 지지체가 복합재 내에서 강화 매트릭스로 작용할 수 있다. 이에 더하여, 이러한 주사 가능한 히드로겔을 제조하는 다당류 분자 중 친화력이 매우 높다. 이러한 친화성은 히드로겔 생체 재료의 높은 응집력으로 나타난다. 그러나, 히드로겔에 대한 접착성은 히드로겔을 주입된 곳으로부터 국소 단리하는데 유리하다. 최근, 히드로겔의 다양성은 이것이 단독으로 또는 세포와 결합하여 투여될 수 있다는 것을 나타낸다.

적용 부위의 주변 조직의 세포들 또는 이식 이전에 본 생체 재료에 배열된 세포들에 의한 군집화를 더욱 용이하게 하는 내부 구조를 갖는 좀 더 내성이 있고 안정하고 영구적인 생체 재료를 요구하는 다른 치료적 적용이 있다. 이 경우, 본 발명의 생체 재료는 손상된 조직의 치유와 회복을 유도하는 생체활성 3차원 매트릭스처럼 행동한다.

히알루론산, 콘드로이틴-6- 및 -4-설페이트, 케라탄 설페이트, 데르마탄 설페이트, 헤파란 설페이트 및 헤파린은 세포 활성을 조절하고 새로운 세포외 매트릭스의 합성을 활성화시킨다. 생체 재료에 존재하는 GAGs의 다양성과 조성은 세포 확산 및 분화 과정을 조절하는 성장인자에 특이적인 수많은 결합 부위가 존재할 수 있게 할 뿐만 아니라 세포가 새로운 세포외 매트릭스 및 성장인자를 합성할 수 있는 능력을 갖도록 한다. 이런 효과는 손상된 조직에 대한 더 큰 세포 반응 능력을 가져오고 재생을 가속화시키며, 심지어 만성 궤양의 경우처럼 심하게 손상된 부위의 경우에 치유를 가능하게 한다.

생체 재료를 3차원 지지체로 사용하는 적용을 용이하게 하도록 안정화(가교) 전략이 요구된다. 이와 같은 목적을 달성하기 위해, GAGs는 화학적으로 변형되고 가교되어 본 발명의 주사 가능한 히드로겔을 형성할 수 있다. 이들 화학적 변형(가교, 중합반응)은 통상적으로 알콜 또는 카르복실기를 포함하고, 인 시츄 주입 후, 또는 주입 전에 일어날 수 있다, 이에 더하여 본 과정은 수용성 중합체가 불용성이되는 사슬을 포함한다 (Elisseeff et al., 2005).

가교에 의해 얻은 주사 가능한 히드로겔은 그것을 조직 공학에 유용하게 쓰일 수 있도록 만드는 독특한 특성이 있다: 영양분 또는 노폐물을 운반하기 위한 높은 물 함량, 탄력성 및 3차원 미세환경에서 세포들을 캡슐화하거나 또는 인 시츄 고정능력. 가교 밀도는 주사 가능한 히드로겔의 구멍 크기에 직접적인 영향을 미치고, 그렇기 때문에 예를 들어 물 함량 또는 기계적 저항성과 같은 물리적 특성에 영향을 미친다. 그렇기 때문에 가교 밀도가 높고 따라서 구멍 크기가 아주 작은 히드로겔은 가교도가 낮고 구멍 크기가 큰 히드로겔보다 더 적은 양의 물을 흡수하고 더 큰 기계 저항성을 갖는다.

주입을 위한 가교 히드로겔의 형성은 다음을 포함하는 여러 반응에 의해 수행될 수 있으나 이것으로 제한되는 것은 아니다: 온도변화, 화학 반응 및 광중합에 의해 수행될 수 있다. 가교는 인 시츄 주입 후 표준 피하 주사 방법에 의해 또는 엑스 비보 주입 전에 수행될 수 있고 그러므로 본 명세서에서 초기에 정의된 바와 같은 관절경/복강경에 더 유사하다.

본 발명의 한 구현예에서 가교 반응은 다음과 같이 수행된다: 가교될 중합체의 수성 용액(이 경우, GAGs의 수성 용액)을 얻고 가교를 일으킬 화학약품을 첨가한다. 이 경우에, 안정화된 히드로겔을 얻기 위해 EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필 카르보디이미드 하이드로클로라이드)가 사용되는데, 그 이유는 EDC가 수용액 중의 카르복실 기를 활성화하기 때문이다. 이들 활성화된 카르복실기는 1차 아민 또는 하이드록실기와 반응하여, 결과적으로 아마이드 또는 에스테르 결합을 생성한다. 히드로겔이 형성되면, 남아있을 수 있는 EDC 잔류물을 제거하기 위해 PBS로 여러 차례 세척한다. 이렇게 하여 GAG 분자들은 다량의 물을 흡수할 수 있도록 제조되고, 그 결과 고체 다공성 구조의 히드로겔을 형성한다(Pieper et al ., 1999; Wissink et al ., 2001).

임의로, 주사 가능한 히드로겔은 가교 반응 중 이와 같은 과정을 위해 의도된 몰드에서 고형화되고, 사용된 몰드에 따라 원하는 형태와 크기를 갖게 된다. 이들 히드로겔은 동결건조법으로 불리는 공정에 의해 건조되고 히드로겔에 존재하는 GAG 분자들 사이에 위치하는 물 분자의 제거 덕분에 다공성 구조를 얻을 수 있다(도 5). 더구나, 일단 생체 재료가 동결건조되면, 히드로겔의 3차원 구조는 주사 전자 현미경(SEM)에 의해 특징지어질 수 있다(도 3). 일단 히드로겔이 최종 형태로 얻어지면, 이것은 40분 동안 자외선에 노출하는 방법에 의해 멸균된다. 히드로겔에 대해 실시된 무균 검사는 생체 재료가 최적으로 멸균되었음을 입증한다. 일단 멸균되고 나면, 히드로겔은 즉시 또는 세포에 부착되어 사용될 수 있게 된다. 본 발명의 히드로겔에 대한 세포 부착 분석은 이 생체 재료가 증식 능력 실험으로부터의 결과에 의해 세포독성이 아님을 증명하였다(도 4).

바이오겔의 용도

본 발명의 생체 재료는 세포와 결합된 형태로 또는 단독으로, 관절계 질환 및 미적 치료에 주입가능 형태로 적용될 수 있다. 사용될 수 있는 세포들은 다른 세포들 중에서: 미분화된 간엽 줄기세포 또는 또 다른 세포주로 분화된 간엽 줄기세포, 미분화된 조혈 줄기세포 또는 또 다른 세포주로 분화된 조혈 줄기세포, 연골세포 및 연골모세포, 조골세포 및 골세포, 각질형성세포, 섬유 아세포, 근육세포, 지방세포, 뉴런, 신경계로부터의 다른 세포들, 백혈세포계로부터의 세포들, 각막세포, 내피세포 또는 상피세포이다.

히드로겔은 의도하는 치료 또는 미용 적용에 따라 주입 기법이 달라지고, 히드로겔의 점도는 주입 시스템의 능력에 맞게 조절된다. 본 발명의 히드로겔의 점도는 10~15,000cS이고; 비가교된 히드로겔의 경우는 10~15000 cS이고, 바람직하기는 10~2,000cS이다. 가교된 히드로겔은 15,000~ 150,000의 점도를 가질 수 있다. 히드로겔의 점도는 필요에 따라 가교에 의해 변형될 수 있다.

본 발명의 생체 재료에 기재된 바와 같은 와튼 젤리로부터 유래된 다양한 비-가교 및 가교 히드로겔의 점도값

히드로겔	점도(cS)
5%-10% 사람-/돼지-유래 (가교)	70,000
50% 사람-/돼지-유래	15,000
40% 사람-/돼지-유래	9,100
30% 사람-/돼지-유래	4,900
20% 사람-/돼지-유래	2,000
10% 사람-/돼지-유래	150-580
5% 사람-/돼지-유래	19-58
1% 사람-/돼지-유래	4-6

본 발명에서 개발된 생체 재료는 다음의 치료 및 미용에 유용하다: 연조직 개량, 충전, 또는 재구축, 잔주름, 주름 및 흉터, 화상, 궤양, 연조직 확장, 얼굴 지방위축증, 추간판 탈출증의 치료, 연골, 근골격계 부상, 골관절염 및 주위관절염의 회복; 종양, 질 질환, 뇌 손상의 치료, 골수 회복, 퇴행성 뇌신경질환, 심혈관질환 및 진통제 및 소염제와 같은 윤활 작용.

본 발명의 가교된 주사 가능한 히드로겔은 실질적으로 다공성 구조이다. 한 구현예에서, 구멍 직경은 0.5~1,000㎛, 바람직하기는 0.5~500㎛이고, 15,000cS보다 큰 점도를 가질 수 있다. 상기 생체 재료는 바람직하기는 다음 질병에 적용될 수 있다: 화상, 궤양 및 진피-표피 결함의 치료, 각막 손상, 망막 손상 또는 백내장과 같은 안과 질환의 치료; 연골 회복, 골연골 결손, 골관절염 또는 골 결손의 경우와 같은 골관절계의 치료, 그리고 질 질환의 해결에서 애쥬번트, 치은염 및 치주염의 치료; 세포 배양 시스템의 발생)에서의 사용.

연골 질환은 전 세계적으로 중요한 사회적-경제적 문제이다. 이런 점에서, 발병율을 기록하기는 어렵지만, 5억 명이 관절 손상을 앓고 있는 것으로 추산된다.

연골 질병은 부상 또는 질환의 결과로 발생하고, 만약 치료되지 않을 경우, 골관절염(OA)과 같은 퇴행성 질환에 이를 수 있다.

OA는 가장 일반적인 관절염의 유형 중 하나로, 미국과 유럽에서 3500~4000만 명이 이 질환을 앓고 있다. 이것은 뼈의 무기력이 수반되는 연골의 분해를 일으키는 퇴행성 질환이다. 이 질환은 일반적으로 손과 무릎, 엉덩이, 발 그리고 목에 영향을 미치고, 성인의 경우, 육체적 거동을 못하게 하는 가장 일반적인 원인 중 하나이다.

관절 연골은 상당히 분화된 관다발 조직으로, 관절 표면들 사이에 마찰을 일으키는 중량 및 충격과 연계된 힘으로부터 가동관절의 뼈를 보호한다. 이 조직은 단일 세포 유형인 연골세포에 의해, 그리고 중요하고 풍부한 세포외 매트릭스에 의해 형성된다. 상기 매트릭스는 II형 콜라겐 섬유(주요 분자)의 고밀도 네트워크 및 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트, 히알루론산 및 아그레칸(aggrecan)과 같은 GAGs를 포함하는 이 내트워크 내의 프로테오글리칸의 매크로 응집물들로 이루어진다.

연골의 특수한 구조 및 그것의 제한적인 회복 능력은 이런 유형의 손상의 치료를 아주 복잡하게 만든다. 혈관생성의 부재가 그것의 재생 능력을 아주 제한적으로 만드는데, 그 이유는 줄기 세포들이 손상된 부위에 접근해 재생 과정에 기여할 수 없기 때문이다.

최근 몇 년 사이, 생분해성 생체 재료가 연골 손상의 치료에 쓰여왔다. 이런 점에서, 거시적인 합성 중합체들(젖산, 글리콜산, 카프로락톤)은 가장 중요하고 가장 많은 생체 재료들이 되고 있다. 그러나, 이들 고체 거시재료들은 종래의 외과수술과 같은 적극적 외과적 시술의 사용을 요구한다. 이러한 한계들을 극복하기 위해서, 주사 주입 또는 관절경과 같은 최소한의 침습적(invasive) 기법으로 이식될 수 있는 새로운 생체 매트릭스가 현재 개발 중이다.

따라서, 본 발명의 주입 가능한 생체 재료의 적용방법 중 한 가지는 골관절염의 퇴행성 과정에 의해 손상된 관절 연골의 재생이다. 상기 생체 재료는 관절경과 같은 경피 기법에 의해 또는 어느 주입 장치에 의해 재생될 부위에 손쉽게 투여될 수 있다. 이와 같은 용이한 투여에 더하여, 주입 가능한 히드로겔은 악화된 조직의 크기 및 기하학적 형태에 맞춰진 안정된 임플란트를 형성하는 속성을 갖는다.

본 발명의 생체 재료의 또 다른 적용은 상처 치료용 3차원 생체 재료의 사용이다. 만성 당뇨, 욕창 및 정맥궤양은 미국에서 3~6백만 명이 앓고 있는 중대한 질환이다. 이 질환들은 선진국 인구의 1~3%가 앓고 있고, 병원에 입원한 환자의 15%가 이 질환으로 고통받고 있다. 이런 부상들로 고통받는 다수의 환자들이 상당한 사회적-경제적 그리고 의료상의 반향을 일으키고 있으며, 그래서 높은 치료비가 정립되고, 환자의 삶의 질이 상당히 바뀌고 있다.

궤양은 상당히 복잡한 병태 생리학을 갖는 유기체에 큰 영향을 미치는 외상이다. 섬유 아세포(진피 세포들), 각질형성세포(표피 세포들), 세포외 매트릭스 그리고 혈장-유래 단백질 사이에서 발생하는 복잡한 상승적 상호작용이 상처 기저부에서 발생한다. 다양한 상처 치료 단계들을 통한 진행: 지혈, 염증, 회복 및 개량이 통상적이나, 이들 상처의 만성적 성질 및 재발은 임상적으로 중요하다 발생할 수 있다. 오늘날 사용가능한 치료법과 지지체는 매우 다양하지만, 치유율과 치유 속도가 여전히 매우 낮기 때문에, 따라서 빠른 상처 치료를 달성하는 좀 더 효과적인 치료법이 요구된다. 최근 만성 궤양의 병태 생리학에 대해 획득된 진보적인 지식은 이 질병의 치료에 중요한 진보를 가져온 새로운 외과적 처치법의 개발을 용이하게 하였다. 비록 지금까지, 피부를 덮기 위한 이상적인 지지체가 존재하지 않지만, 이상적 지지체는 다음과 같은 특성, 즉 1) 상처에 대한 빠른 부착, 2)액체 손실에 대한 효과적인 방어막, 3) 기계적 압력에 대한 내성 및 장기적 안정성, 4) 용이한 멸균, 5) 취급 및 운송이 용이, 및 6) 무해하다는 일련의 기본적인 특성들을 준수해야 한다.

요약하면, 본 발명의 생체 재료는 언급된 치료에 효과적인 지지체 또는 희석물에 요구되는 특징들의 대부분을 갖는다. 이런 점에서, 본 발명의 생체 재료의 치료 효과를 평가하기 위해, 실시예 9 및 10에 기재되 바와 같이 인 비보 실험 연구를 수행하였다.

실시예

실시예 1. 와튼 젤리 획득

사람- 및 돼지-유래 탯줄을 사용하여 다음의 실시예를 수행하였다. 각각의 탯줄의 와튼 젤리로부터 GAGs를 단리하기 위해 다음 과정을 수행하였다:

각각의 경우, 분만 직후 탯줄 50g을 농도 1X(H₂O 1L에 대해: NaCl 8g, KCl 0.2g, Na₂HPO₄ 1.44g, KH₂PO₄ 0.24g, H₂O 1L에서 pH=7.4)의 PBS 300㎖와, 1X 농도의 페니실린(30,000 유닛), 스트렙토마이신(30,000㎍), 암포테리신-B(75㎍)항생제들의 혼합물 3㎖(LONZA, Ref: 17-745 E)를 미리 넣어 둔 살균된 병에 수집하였다. 탯줄은 처리할 때까지 4℃에서 24시간 이하의 시간 동안 보관할 수 있지만, 본 실시예에서는 탯줄을 수집 후 즉시 처리하였다.

처리를 위해, 탯줄을 바이오안전 II 단계 층류 유동기에서 멸균 상태로 보존하였고, 탯줄에 함유된 혈액 잔류물을 완전히 제거하기 위해 일련의 연속 세척을 실시하였다. 이를 위하여, 탯줄을 2개의 용기에 넣고, 페니실린(30,000 유닛), 스트렙토마이신(30,000㎍), 암포테리신-B(75㎍) 항생제들의 혼합물 3㎖를 함유하는 1X PBS(H₂O 1L에 대해: NaCl 8g, KCl 0.2g, Na₂HPO₄ 1.44g, KH₂PO₄ 0.24g, H₂O 1L에서 pH=7.4) 300㎖(LONZA, Ref: 17-745 E)를 첨가하였다. 병을 수직으로 기울여서 10초 동안 5회 손으로 흔든 뒤 용액을 버렸다. 이런 작업을 혈액의 대부분이 제거될 때까지 적어도 3회 이상 반복하였다. 그런 다음, 탯줄을 1X 농도(H₂O 1L에 대해 NH₄Cl 8.99g, KHCO₃ 1g, EDTA 37mg, pH 7.3)의 혈구 용해 용액 500㎖로 혈액 잔류물이 완전히 제거될 때까지 세척하였다.

탯줄 표면에서 혈액을 깨끗이 씻어낸 뒤, 10cm 페트리 접시에 옮겨 담아 살균 가위로 1~2cm의 조각들로 잘랐다. 탯줄을 조각으로 자르는 동안 혈관에 남아 있는 혈액이 방출되었기 때문에, 항생제(10,000 유닛), 스트렙토마이신(10,000㎍)과 암포테리신-B(25㎍)의 혼합물 1㎖를 함유하는 1X PBS 10㎖를 첨가하여 상기 조각들을 철저히 씻은 뒤, 조각의 표면을 받침대(support surface)에 대고 눌러, 멸균 메스를 조각의 길이를 따라 수평으로 이동시켰다. 내부로부터 혈액 잔류물이 모두 제거될 때까지 이 과정을 반복하였다. 완전히 깨끗해진 탯줄 조각을 멸균 시험관에 옮겨 담고, 그 즉시 처리하였다. 그러나 필요한 경우, -80℃에서 무기한 저온보존할 수 있다.

그리고 나서 탯줄을 둘러싼 막과 그 안에 위치한 혈관들을 기계적으로 제거하였다. 이것을 위해, 탯줄 조각들을 세로로 가르고 메스와 핀셋을 사용하여 탯줄 막과 혈관을 모두 조심스럽게 제거하였다. 이런 기계적 분리의 결과로 얻어진 젤라틴성 물질이 와튼 젤리이다. 와튼 젤리 25g을 얻었다.

실시예 2. 와튼 젤리로부터 GAGs 의 추출

사람- 및 돼지-유래 탯줄로 다음의 실시예를 수행하였다. 사람 연골로부터 GAGs를 얻기 위해 기술된 절차를 몇 군데 수정하여 탯줄의 와튼 젤리로부터 GAGs를 얻는 데 사용하였다(Rogers et al., 2006).

실시예 1에서 얻은 와튼 젤리 둘 다를 추출 완충 용액(200mM L-시스테인 242㎕, 704mM Na₂HPO₄ 완충용액 1.42㎖, 0.5M EDTA 100㎕, pH 7.5인 파파인 10mg(14 U/mg))(SIGMA, Ref: P-4762) 20㎖에 담그고, 이들을 와튼 젤리를 완전히 소화시키기 위해 24시간 동안 60℃로 유지시켰고, 일단 소화된 후, 샘플을 5분 동안 1,500 g에서 원심분리하여 소화 잔류물을 제거하였다. 소화 후 부피는 시작 부피인 20㎖보다 약 10㎖ 많은 양인 30㎖인 것이 관찰되었고, 이것은 와튼 젤리에 존재하는 GAGs의 용해 때문이고, 그에 따라 이들이 축적했던 물의 방출 때문이다.

샘플을 원심분리한 후, 상청액을 다른 시험관에 옮겨 담았고, 샘플에 존재하는 GAGs를 침전시켰다.

실시예 3. 탯줄의 와튼 젤리로부터 GAGs 의 침전 및 단리

상청액에 존재하는 와튼 젤리의 GAGs를 100% 에탄올 5 부피로 침전시켰다. 이 단계에 의해, 이 샘플의 GAGs는 물론이고 샘플에 존재했던 염들이 침전되었다. 이것은 샘플에 존재하는 물 분자들이 에탄올 분자들과 상호작용하고, 따라서 물 분자들이 샘플의 GAGs와 상호작용할 수 없다는 점에 기인한다. 침전을 위해 GAGs를 -20℃에서 12시간 방치하였다. 침전 후, 샘플을 5분 동안 1500g에서 원심분리하였다. 이렇게 하여, 100% 에탄올을 모두 제거하였다. 침전물을 75% 에탄올 5 부피로 세척하여 샘플에 침전되었을 수 있는 잔류성 염을 제거하였다. 이어서 1500g에서 5분간 원심분리하여, 상청액을 완전히 제거하였다.

샘플이 침전된 뒤, 고체 잔류물을 건조시키기 위해 에탄올이 모두 증발할 때까지 실온에서 30분 동안 방치하였다. 와튼 젤리 약 25g을 함유한 샘플로부터 시작해 침전된 GAGs의 양은 시작 물질에 따라, 50~300mg 사이다. 이 특정의 경우에, GAG 침전물 250mg을 얻었다. 본 발명의 히드로겔을 얻기 위해, GAG 침전물을 Milli-Q H₂O 1㎖에 재현탁하고 4℃에서 보관하였다.

실시예 4. 탯줄의 와튼 젤리의 GAGs 를 함유하는 주입 가능성 히드로겔 의 생성

히드로겔의 수분 함량은 적용에 필요한 점도에 따라, 히드로겔 중량의 10% ~ 100배일 수 있다.

침전된 GAGs를 H₂O 1㎖에 재현탁시킨 후 얻은 히드로겔을 1000cS의 점도를 제공하기 위해 주입 가능한 생리학적 혈청 용액에 재현탁시키고, 이것이 완전히 용해 및 균질화 될 때까지 보텍스(vortex)에서 부드럽게 교반하면서 유지하였다. 일단 히드로겔이 용해되면, 4℃에서 보관하였다.

실시예 5. 가교된 탯줄의 와튼 젤리로부터의 GAGs 를 함유하는 고체 히드로겔 의 생성

더욱 일관성 있고 안정한 히드로겔을 생산하기 위해 문헌(Cui et al ., 2006)에 기술된 방법은 다음과 같다. 실시예 3에 따라 와튼 젤리로부터 얻은 GAGs 추출물로부터 수용액을 제조하였다. 구체적으로 농도 1%인 H₂O 중의 GAGs 용액을 생성하였다. 이를 위해, H₂O 10㎖를 침전 및 단리 후 얻은 GAGs (실시예 3) 200mg에 첨가하였다. 아디프산 디하이드라지드(ADH) 1.2g을 용액에 첨가하고, 용액의 pH를 0.1N HCl을 사용하여 pH=3.5로 조절하였다. pH가 조절되고 나면, 고정액 EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필 카르보디이미드 하이드로클로라이드)(SIGMA, Ref: E6383) 0.6g을 용액에 첨가했다. 이 혼합물을, 고체 히드로겔을 얻을 때까지, 실온에서 지속적인 교반 하에 30분~1시간 동안 보관하였다.

일단 안정한 히드로겔이 형성되면, 1X PBS (H₂O 1L에 대해: NaCl 8g, KCl 0.2g, Na₂HPO₄ 1.44g, KH₂PO₄ 0.24g, H₂O 1L에서 pH=7.4)로 1회 5분씩 3회 세척하여 EDC 초과량을 제거하였다. 히드로겔의 물리적 형태와 관련하여, 히드로겔은 자신이 굳어진 주형의 형태를 갖는데, 그렇기 때문에 표준 96, 48, 24, 12 및 6-웰 배양판, 페트리 접시 또는 그 밖의 다른 원하는 형태의 용기를 사용할 수 있다.

부가적으로, 히드로겔은 비이커와 같은 큰 용기에서 고체화될 수 있고, 그래서 히드로겔은 고체화된 후 특징적인 형태와 두께로 자를 수 있다. 구체적으로, 본 실시예에서, 본 히드로겔은 24-웰 배양판의 웰에서 고체화시켰고, 일단 고체화된 후에 1X PBS 500㎖로 5분 동안 3회 세척하였다.

이 경우, 24-웰 배양판에서 가교된 히드로겔을 표준 기술에 따라 저온처리하였다.

이 실시예에서, 주사 전자 현미경(SEM)으로 이 히드로겔의 3차원 구조를 분석하였다. 히드로겔을 저온살균한 후, 다음 단계를 수행하였다: 저온살균된 히드로겔의 일부분을 잘라낸 후, 이 부분을 AUTOSAMDRI-814 건조기에서 CO₂로 임계점까지 건조시켰다. 그리고 나서 스퍼터(SPUTTER)에서 금으로 도금했다. 생성물들을 전압 20 kV의 JEUL 주사 전자 현미경(JSM35)에서 관찰하였다.

탈수된 히드로겔의 SEM 분석(도 3)은 히드로겔이 균일한 다공성 구조를 갖는다는 것을 나타내었다. 현미경 사진은 구멍 직경이 0.5~500㎛인 고다공성 3-차원 구조의 존재를 나타내고, 이 범위의 구멍들은 마이크로다공성 및 매크로다공성의 존재를 포함한다. 적절한 세포 군집화가 발생하기 위해 매크로다공(300~500㎛)이 필요하고, 그럴 때 많은 수의 세포들이 한곳에 모이고, 이때 서로 다른 유형의 세포들이 공존한다. 이것은 예를 들면 구조화된 조직의 형성에 유리하므로, 유관 망상조직이 형성될 수 있다. 중간 크기의 구멍들은 세포 통합을 가능하게 한다. 마이크로다공(0.5-50㎛)은 세포 생존에 필요한데, 이들이 가스, 영양분의 올바른 확산과 세포 대사 결과로 생성된 폐기물의 제거를 수행하는 역할을 하기 때문이다. 구멍 크기는 주사 전자 현미경에 의해 얻은 도량 규정에 기반하여 측정된다.

이 생체 재료는 좀 더 높은 구조적 민감성을 나타내는데, 이것은 생체활성 성질과 영양 작용을 추구할 뿐만 아니라, 다른 무엇보다 궤양 및 기타 진피-표피 질환의 치료, 연골 회복 및 안과 질환 치료와 같은 조직 회복이 수행될 때까지 임시로 세포들을 수용할 수 있는 구조 또한 추구하는 적용들을 나타낸다. 생체 재료에 함유된 세포들은 군집화를 다룰 수 있는 이식 부위 근처의 조직들의 세포들일 수 있고 또는 임상 적용에 앞서 생체 재료의 엑스 비보에 배열된 세포들일 수 있는데, 그러면 생체 재료의 재생 작용은 증진된다.

이 생체 재료는 0.5~1000㎛ 범위의 크기를 갖는 구멍들이 균일하게 분포되어 있고, 이것은 주사 전자 현미경 기법에 의해 확인된다. 이 다공성 범위는 구조 전체에 걸친 가스 및 영양분의 확산, 그리고 세포의 대량서식 모두에 적합하다.

실시예 6. 본 발명의 생체 재료 중에 존재하는 GAGs의 특징 규명 및 정량화

본 발명의 생체 재료에 존재하는 서로 다른 GAGs를 질량 분석(ESI/MS) 기법으로 분석 및 정량화하였다. 이 기법에 의해 분자량이 200~2000 돌턴인 분자만 측정될 수 있고, GAG 분자들은 대부분이 이 범위를 초과한다는 점을 감안하여, 우선 분자량이 200~2000 Da인 GAG 사슬들을 얻기 위해 샘플을 효소로 소화시켰다.

GAGs의 동정 및 정량화를 위한 표준으로, 농도를 알고 있는 각각의 GAG의 표준 상업 화합물을 사용하였다. 구체적으로 GAGs의 정량화를 수행하기 위해 사용한 표준은 다음과 같았다: 히알루론산의 경우 히알루론산 칼륨염(SIGMA, Ref: 53750); 콘드로이틴 설페이트의 경우 콘드로이틴 설페이트 나트륨염(SIGMA, Ref: C4384); 데르마탄 설페이트의 경우 데르마탄 설페이트 나트륨염(SIGMA, Ref: C3788); 케라탄 설페이트의 경우 케라탄 설페이트(CHEMOS, Ref: 7295); 헤파린의 경우 헤파린 나트륨염(SIGMA, Ref: H8537); 그리고 헤파란 설페이트의 경우 헤파란 설페이트 나트륨염(SIGMA, Ref 51541).

사용된 각 GAG 표준에 대해 얻은 결과를 기반으로 본 샘플에 존재하는 GAGs의 정량화의 값을 얻었다.

GAGs의 효소 소화를 수행하기 위해, 문헌에 기술된 방법은 다음과 같았다(Mahoney et al ., 2001). 이러한 취지로, 각각의 GAG의 소화에 특이적인 효소들을 사용하였다.

히알루론산의 경우, 히알루로니다아제(SIGMA, Ref: H3506)를 사용하였고; 콘드로이틴 설페이트의 경우, 콘드로이티나제(SIGMA, Ref: C2780)를 사용하였고; 데르마탄 설페이트의 경우, 콘드로이티나제 B(SIGMA, Ref: C8058)를 사용하였고; 헤파린의 경우, 헤파리나제 I(SIGMA, Ref: H2519)를 사용하였고; 헤파란 설페이트의 경우, 헤파리나제 I(SIGMA, Ref: H2519)를 사용하였고; 케라탄 설페이트의 경우, 케라타나제(K2876)를 사용하였다.

이들 효소들은 다음의 완충용액 10㎖에 상응하는 효소 440U를 재현탁시켜서 제조하였다: 100mM 인산염 완충용액(pH=7.77) 2㎖, 1M NaCl 770㎕, BSA 1mg 및 H₂O 7.23㎖.

효소 농도가 160 U/㎖ 인 효소 소화 완충 용액을 다음과 같이 제조하였다: 효소(2000 U) 4.5㎖을 소화 완충용액 7.5㎖, 1M NaCl 1.5㎖, 3M 아세테이트산 나트륨(pH= 5.2) 0.333㎖ 및 H₂O 5.67㎖에 첨가하였다. 효소 소화를 실시할 샘플과 표준을 다음과 같이 제조하였다: 소화 완충용액 500㎕(효소 80U)를 각각의 GAG에 대한 표준 500㎕에 농도 2mg/㎖로 첨가하였고, 그 결과 표준의 최종용액의 농도는 1 mg/㎖였다. 동일한 과정을 GAGs 샘플에 실시하였다: 소화 완충용액(효소 80U) 500㎕를 GAGs의 샘플 500㎕에 첨가하였다.

샘플을 37℃에서 1시간 동안 소화시켰고, 그런 다음 60℃에서 5분 동안 열적 변성에 의해 효소를 불활성화시켰다.

소화를 실시한 다음, 샘플과 표준을 질량분석기로 분석하였다. 질량 분석기는 분석 대상 샘플에 존재하는 특정 이온의 질량-대-전하의 비율을 측정하는 실험적 방법이다. 이 질량분석기는 다음의 세 가지 기본 구성으로 이루어진다: 이온 소스, 질량 분석기 및 검출기. 분석 대상 샘플은 이온 소스에 의해 이온화되고, 이것은 질량 분석기에서 분리되어 질량 스펙트럼을 생성하도록 검출된다. 질량 스펙트럼에서 질량-대-전하 값이 특정 이온의 상대적 풍부함과 비교해 나타난다.

구체적으로, 본 실시예에서는, 다음과 같이 샘플을 질량 분석기에 주입하였다: 샘플 20㎕를 분당 0.2㎖의 흐름 속도로 질량/질량 검출기로 직접 주입하였다(Thermo LCQ 모델). 네거티브(음) 전기분사이온화법(ESI/MS)을 사용하였고, 크로마토그램의 시간을 10분으로 설정하였다. 문헌(Mahoney et al ., 2001)에 따라, GAG 각각의 유형에 대해 인식된 사슬의 분자량에 해당하는 ±6 Da의 범위를 갖는 분자 이온들을 선택했다. 상기 이온들은 표준 GAGs의 샘플 및 분석 대상 샘플 모두에 여전히 존재했고, 그래서 샘플에서의 각 GAG의 존재를 정성적으로 입증하였다. 결과의 재현성을 보장하기 위해, 샘플과 표준을 각각 이중으로 중복하여 주입하였다.

다양한 GAGs의 정량화를 위해, 1mg/㎖에서 각각의 GAG에 대한 표준에 대하여 표준 선을 그렸다. 표준 선을 만드는 데 사용된 표준 GAGs(히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 데르마탄 설페이트, 헤파린, 헤파란 설페이트 및 케라탄 설페이트) 각각의 다음과 같은 농도에서 표준 선을 그렸다: 750㎍/㎖, 500㎍/㎖, 250㎍/㎖, 100㎍/㎖, 0㎍/㎖. H₂O로 표준 선을 희석하였고, 효소 소화 완충용액과 H₂O를 동일한 비율로 함유하는 혼합물을 선의 0점으로 사용하였다.

본 발명의 생체 재료에서 정량화의 결과들과 각각의 GAG의 비율은 다음과 같고, 생체 재료의 유래가 자연발생적임을 감안할 때, 이것은 GAGs의 조성에 적은 변수들이 존재함을 암시한다(도 1):

히알루론산 70%

케라탄 설페이트 10%

콘드로이틴-6-설페이트 7%

헤파란 설페이트 5%

콘드로이틴-4-설페이트 4%

데르마탄 설페이트 3%

헤파린 1%

실시예 7. 생체 재료에서 세포 잔존물(cell rests)의 존재를 결정하기 위한 조직학적 연구

본 발명의 생체 재료는 자연발생적 GAGs의 조합물을 함유한다. 이 자연발생은 이들의 재생 효과 및 세포 활성에 대한 효과를 증진시킨다. GAGs의 구조와 그들간의 상호작용이 생리학적 조건에서 세포외 매트릭스에서 발견되는 방식과 유사하기 때문이다.

탯줄은 면역성을 거의 또는 전혀 갖지 않는 유형의 조직으로, 사실, 와튼 젤리에 함유된 줄기 세포의 이종 유래의 사용은 수많은 연구에서 치료법을 위해 고려된다. 또한 동맥과 정맥 시스템이 탯줄의 맥관구조로부터 발생된 연구들도 있는데, 이것 또한 이종 유래의 사용을 위한 것이다. 그러나, 본 발명의 생체 재료에, 염증 반응을 일으키거나 또는 거부 반응을 일으킬 수 있는 세포와 세포 잔존물이 없다는 것을 보증하기 위해서, 헤마톡실린-에오신, 알시안 블루 및 메틸 그린-피로닌 조직학적 염색을 수행하였다(도 2).

헤마톡실린-에오신: 이것은 조직학적 차원에서 가장 널리 사용되는 조직화학적 염색제다. 이것은 세포와 세포의 구성물들을 관찰할 수 있게 해준다. 헤마톡실린은 세포의 산 성분, 특히 핵산에 대한 친화성을 나타내고, 에오신은 염기성 부위에 대한 친화성을 나타내어, 세포질을 관찰할 수 있게 해준다. GAGs 샘플의 제제(도 2B)를 염색하였고, 세포의 확장물을 양성 대조군으로 사용하였다(도 2A).

다음과 같은 방법으로 헤마톡실린-에오신 염색을 수행하였다: GAG의 샘플을 멸균 면봉을 사용하여 슬라이드 위에 확장시켰다. 그리고 확장물을 적어도 24시간 동안 건조시키기 위해 방치하였다. 슬라이드가 건조된 후, 확장물들을 70% 메탄올로 5분 동안 고정시켰다. 5분 후, H₂O로 세척하여 고정액을 제거하였다. 슬라이드를 헤마톡실린으로 3분 동안 염색하였다(PANREAC, DC Harris 헤마톡실린 용액). 그런 다음, H₂O로 세척하여 과량의 염색제를 제거하였다. 모든 슬라이드를 0.5% HCl을 함유하는 H₂O에 통과시켜 염색제의 비특이적 결합을 제거하였다. 슬라이드를 H₂O로 세척하였다. 이 슬라이드들은 30초 동안 에오신(H₂O에 0.5%)으로 염색하였다. 슬라이드를 H₂O로 세척하여 에오신 초과량을 제거하였다. 플루오로마운트-G 장착 배지(Fluoromount-G mounting medium)(SOUTHERN BIOTECH, Ref: 0100-01) 여러 방울을 슬라이드에 떨어트린 후, 슬라이드 덮개를 씌워 현미경 아래서 관찰하였다.

헤마톡실린-에오신 염색 결과(도 2, 영상 A 및 B)는 분석한 GSGs의 샘플에 세포들의 부재함을 나타낸다.

알시안 블루: 알시안 블루는 주요 양이온성 염색제 중 하나이고(분자상태에서 양전하를 띤다), 프로테오글리칸의 일부를 형성하는 설페이트, 포스페이트 또는 카보네이트라디칼을 함유하는 다당류의 음전하를 갖는 부위에 결합된다. 이러한 정전기적 결합은 배지의 pH에 좌우된다; 중성 pH에서, 알시안 블루 염색제는 중성 라디칼을 가진 프로테오글리칸에 결합되고; 산성 pH에서, 염색제는 설페이티드 프로테오글리칸에 결합되고; 그리고 염기성 pH에서, 염색제는 포스페이트 프로테오글리칸에 결합된다. pH가 1일 때, 알시안 블루는 와튼 젤리의 GAG의 일부를 형성하는 콘드로이틴 설페이트, 데르마탄 설페이트, 헤파란 설페이트 및 케라탄 설페이트를 함유하는 약 또는 강하게 설페이트화된 프로테오글리칸에 결합된다. GAGs 샘플의 제제(도 2F)를 염색하였고, 세포의 확장물을 대조군으로 사용하였다(도 G2 E).

본 실시예에서 다음과 같은 방법으로 알시안 블루 염색을 수행하였다:

GAG의 샘플을 멸균 면봉을 사용하여 슬라이드 위에 확장시켰다. 그리고 확장물을 적어도 24시간 동안 방치하여 건조시켰다. 슬라이드가 건조된 후, 확장물을 70% 메탄올로 5분 동안 고정시켰다. 5분 후, 1X PBS로 세척하여 고정액을 제거하였다. 슬라이드를 0.1N HCl(pH=1)에 5분간 담가 두었다. 그런 다음 0.1N HCl(pH=1)에서 2시간 동안 1% 알시안 블루로 염색하였다. 이 슬라이드들을 0.1N HCl에 5분간 담갔다가, 그 직후 H₂O로 세척하여 과량의 염색제를 제거하였다. 플루오로마운트-G 장착 배지(SOUTHERN BIOTECH, Ref: 0100-01) 여러 방울을 슬라이드에 떨어트린 후, 슬라이드 덮개를 씌워 현미경 아래서 관찰하였다. 알시안 블루를 이용한 염색의 결과들(도 2, 영상 E 및 F)은 생체 재료의 분석 샘플에서 GAGs가 존재함을 나타내었다.

메틸 그린- 피로닌: 이 염색은 조직에 포함된 핵산의 조직학적 조사를 위해 사용되고 뿐만 아니라 림프 세포 및 원형질 세포의 존재를 입증하기 위해 사용된다. 또한 조직 단면과 세포학적 제제에서 원형질 세포 및 RNA의 동정에 유용하다. 피로닌은 원형질 세포의 세포질과 핵소체를 적색으로 염색시킨다. 메틸 그린은 DNA를 청색을 띠는 녹색(자주색)으로 염색시킨다. GAGs 샘플의 제조물들을 염색하고(도 2D) 세포의 확장물을 대조군으로 사용하였다(도 2C).

본 실시예에서 다음과 같은 방법으로 메틸 그린-피로닌 염색을 수행하였다:

각각의 GAG 샘플을 멸균 면봉을 사용하여 슬라이드 위에 확장시켰다. 그리고 확장물을 적어도 24시간 동안 건조되도록 방치하였다. 슬라이드가 건조된 후, 확장물은 70% 메탄올로 5분 동안 고정시켰다. 5분 후, H₂O로 세척하여 고정액을 제거하였다. 슬라이드를 0.1N HCl(pH=1)에 5분간 담가 두었다. 그런 다음 메틸 그린-피로닌(H₂O에 0.012% 메틸 그린, H₂O에 0.01% 피로닌, 0.75% 메탄올)으로 5분간 염색하고, H₂O로 세척하여 과량의 염색제를 제거하였다. 플루오로마운트-G 장착 배지(SOUTHERN BIOTECH, Ref: 0100-01) 여러 방울을 슬라이드에 떨어트린 후, 슬라이드 덮개를 씌워 현미경 아래서 관찰하였다. 메틸 그린-피로닌으로 염색한 결과(도 2, 영상 C 및 D)는 분석된 GAGs 샘플에 핵산의 부재를 나타낸다.

실시예 8. 본 발명의 생체 재료에서 여러 세포 유형으로 시험한 세포독성

이식에 사용될 수 있는 생체 재료 또는 조직 공학용 매트릭스로서 사용될 수 있는 생체 재료에 대한 주요 필수조건은 세포 내 독성의 완전한 부재이다.

본 발명의 생체 재료가 독성 작용을 일으키지 않음을 검증하기 위해, 본 발명의 생체 재료에 배열된 세포들에 대해 MTT 방법(Roche Diagnostics)으로 세포독성을 측정하고, ECVAM(유럽 대안적 방법의 유효성 인증 센터)으로 유효성을 입증하였다. 피부 각질형성세포와 섬유 아세포, 골 조골세포, 연골 연골세포 및 지방 세포-유래 간엽 줄기 세포뿐만 아니라 ISO 10993에서 L929 독성 분석을 위해 지목된 세포주와 같은, 사용된 세포 유형들은 생체 재료가 표적으로 삼는 질병과 연관되어 있다.

MTT 분석은 특정 기질을 다른 2차 대사 산물로 변형시키는, 살아 있는 세포의 미토콘드리아 효소의 능력에 기반을 둔 것이다. 형성된 화합물의 양은 미토콘드리아 탈수소효소의 활성에 의해 좌우되고, 이 화합물의 양은 배양조직에 존재하는 생균의 수를 명확히 나타내는 지표이다.

구체적으로, 이 미토콘드리아 검사, 세포 확산 키트 I (MTT) Cat. No. 1 465 007 Roche는 세포 미토콘드리아 디하이드로게나제 숙시네이트에 의해 수행되는 (노란색) 테트라졸리움 염의 불용성 (청색) 포르마잔 결정으로의 변형을 측정한다. 세포들은 추후에 투과가능해졌고, 형성된 결정들은 용해되었고, 이로써 파장이 550nm일 때 ELISA 마이크로플레이트 판독기로 흡광도를 측정함으로써 정량화 가능한 유색 용액이 생성되었다. 얻어진 결과들을 도 4에 나타내었다.

따라야 할 과정은 다음과 같다:

1. 세포를 부착-방지 96-웰 플레이트에 생체 재료 50㎕와 함께 접종하였고, 각각의 웰의 밀도는 세포 유형에 따라 웰 1개당 2000~5000 개였다. 각각의 세포 유형과 관련해 적절한 세포 농도는 사전에 결정된 바 있다. 섬유 아세포, 조골세포, 연골세포 및 지방세포-유래 간엽 줄기세포 및 사람 유래의 제1차 배양조직으로부터의 모든 세포를 웰 1개당 세포 4000개의 농도로 접종하였다. L929 마우스 섬유 아세포주를 웰 1개당 세포 200개의 농도로 접종하였고, 제1차 배양조직의 사람 피부로부터 얻은 각질형성세포를 웰 1개당 세포 5000개의 농도로 접종하였다.

2. 세포 독성 분석을 시작하기에 앞서 배양조직을 37℃에서 24시간 방치하여 5% CO₂로 안정화시켰다. 이 분석에는 양성 대조군(세포+배지+세포독성을 일으키는 공지의 물질, 이 경우에는, 폴리비닐 폴리클로라이드, 즉 PVC를 사용하였다)과 대조군(세포+표준 배양 배지), 그리고 본 발명의 생체 재료와 접촉하는 세포들을 포함시켰다.

3. 이들의 측정을 수행할 때까지 절차에 표시된 시간 동안 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션 되도록 방치하였다. 이 경우 방치 시간은 접촉 후 24시간, 48시간 및 72시간이었다.

4. 인큐베이션이 끝난 후, MTT 용액(0.5 mg/ml) 10㎕를 각각 배지 100㎕가 든 각각의 웰의 배양조직에 첨가하였다. 그리고 이것을 인큐베이터 안에서 4시간 동안 37℃로 인큐베이션 하였다.

5. 인큐베이션이 끝난 후, 세포 내에 존재하는 포르마잔 결정을 관찰할 수 있다. 각각의 배양조직 또는 각각의 웰에 가용성 용액 100㎕를 첨가하였다. 그리고 인큐베이터에서 37℃로 하룻밤 동안 인큐베이션 하였다. 이에 따라 세포는 투과성이 되고, 결정들은 이와 같이 지시대로 가용화제 100㎕로 가용화하여, 쉽게 정량화할 수 있는 유색 용액으로 만들었다.

6. 결정을 가용화시킨 후, 550nm에서 ELISA 판독기로 플레이트를 읽었다. 검침 전, 플레이트의 아래 표면을 에탄올로 씻는 것이 바람직하다. 도 4에서 관찰할 수 있듯이, 본 발명의 생체 재료는 검사 대상인 세포주 어느 것에도 독성효과를 일으키지 않았고, 대조군과 관련해 별다른 차이가 없었다.

실시예 9. 골관절염 치료를 위한 주입 가능한 형태의 본 발명의 생체 재료의 용도

골관절염(OA)에서 본 발명의 생체 재료의 치료 효과의 생체 내 평가를 위하여, 실시예 3에서 얻은 히드로겔을 사용하였고 이것을 동종이계, 연골-유래 연골세포를 함유하는 주입 가능한 생리학적 혈청 용액에 재현탁시켰다. 실험 모델로 무릎 중 하나에 전방 십자 인대를 절제한 토끼를 사용하였다. 이 인대 절제는 측면 관절 절개술로 실시했다. 그리고 나서, 그 무릎을 불안정하게 만들기 위해, 수 개월 내지 수 주에 이르는 기간을 기다렸고, 그 기간 동안 골관절염과 유사한 연골의 미란(erosions)이 발생했다. 아울러, 무릎에 관절 절개를 하지 않은 동물들을 대조군으로 사용하였다.

부상당한 관절 표면을 세척 및 관절경 수술에 의한 괴사 조직 제거로 처치하고 상처부위를 본 발명의 주입 가능한 세포/생체 재료로 덮었다. 생체 재료를 바르고 4주 후, 실험 동물을 희생시켜 연골을 추출하였다. 얻은 연골을 추후의 조직학적 처리를 위해 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 조직학적 단면을 얻기 위해, 샘플을 파라핀에 포함시켰고, 이러한 목적을 위해 5분 동안 50, 70, 90 및 100% 알코올에서 유지시켰다. 이어서 샘플들을 5분 동안 시트로솔에 놓아두었고, 그 후 고체 덩어리를 얻을 때까지 파라핀에 넣어 두었다. 마이크로톰을 사용해 조직학적 단면 5㎛를 얻었고, 이 단면들을 사용하여 조직학적 염색 및 면역라벨링을 수행하였다.

면역조직화학적 기법에 의해 조직학적 단면에서 연골의 세포외 매트릭스의 서로 다른 표식들을 분석하였다. 연골의 세포외 매트릭스의 특이적 분자들과 연구 대상 분자 표식들은 I형 및 II형 콜라겐, 아그레칸 및 베르시칸이었다. 모노클로날 항체를 사용하여 면역라벨링을 수행하였다. 조직 단면의 라벨링에 사용된 기법은 직접적인 면역라벨링으로, 플루오로크롬으로 표지된 단일 클론 항체를 사용하였다. 공초점 현미경 검사를 사용하여 라벨링을 관찰하였다.

얻은 결과들은 생체 재료/세포 조합물이 다음과 같은 이유로 상처 입은 연골의 재생을 가져옴을 입증하였다:

- 주입가능한 생체 재료와 그것의 세포 성분은 이식된 후 독성을 일으키지 않았고, 예를 들면, 조직학적 단면에서 육안 또는 현미경으로 염증 현상이 관찰되지 않았다.

- 생체 재료는 이식 부위 중 회복되고 저지되어야 할 상처의 기하학적 형태 및 크기에 알맞았다.

- 이식 부위 옆의 건강한 조직의 세포들의 표현형(phenotype)의 변화가 관찰되지 않았다.

- 이식 부위에서 II형 콜라겐과 같이 연골 특이성 세포외 매트릭스 분자의 존재는 원조직의 세포외 매트릭스와 동일한 수준의 새로운 세포외 매트릭스의 형성으로 재생 과정의 시작을 보여준다.

이러한 사실들은 본 발명의 생체 재료가 세포 치료법과 결합하여, 연골 회복의 어떤 조짐도 보이지 않은 대조동물군에서와 달리, 연골 결손의 재생을 촉진함을 입증하였다.

실시예 10. 3차원 생체 재료의 용도

실시예 5에서 얻은 본 발명의 고체 생체 재료는 만성 궤양 치료에 효과적인 드레싱에 필요한 특징들을 대부분 갖고 있다. 이런 점에서, 만성 궤양에서의 치료 효과를 평가하기 위해, 스위스 알비노 마우스를 사용하여 생체내 실험 연구를 실시하였다. 이 마우스의 등 부위의 약 3cm²에 열적 마찰을 일으켰다. 동일한 유형의 상처를 입었으나 시판 중인 히알루론산겔로 치료를 받은 동물을 대조군으로 사용하였다.

본 발명의 생체 재료의 적용을 위해, 유도된 상처의 표면을 세척, 소독, 외과적 괴사조직 제거에 의해 준비하였다. 그리고 나서 생체 재료를 주입에 의해 상처에 적용하였고, 여기서 이것은 감염된 영역을 깊게 그리고 표면상으로 덮고 채웠다. 생체 재료를 놓고 15일 후, 실험 동물을 희생시켜 상처 부위를 적출하고 추후 조직검사를 위해 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 이런 처리과정을 위해, 샘플을 파라핀에 넣어두었고, 이를 위해 50, 70, 90 및 100% 알코올에 5분 동안 유지시켰다. 이어서 샘플을 시트로솔에 5분간 넣어두었고, 고체 덩어리를 얻을 때까지 파라핀에 넣어두었다. 마이크로톰을 사용하여 조직학적 단면 5㎛를 얻었고, 이 단면들을 사용하여 조직학적 염색 및 면역라벨링을 수행하였다.

5 및 10 케라틴과 같은 다양한 표피 표현형 표지자, 인볼루크린 및 로리크린과 같은 분화 표지자, 비멘틴과 같은 진피 표지자, 그리고 라미닌과 같은 매트릭스의 구성성분들을 면역조직화학적 기법에 의해 조직학적 단면에서 분석하였다. 조직 단면을 라벨링 하는데 사용되는 이 기법은 직접적인 면역라벨링으로, 플루오로크롬으로 표지된 모노클로날 항체를 사용한다. 이 라벨링은 공초점 현미경 검사에서 관찰하였다.

얻은 결과들은 본 생체 재료가 다음과 같은 이유로 궤양의 재생에 효과적이었다고 입증하였다:

- 상처에 적용된 생체 재료는 면역학적으로 불활성이고 독성의 조짐이 전혀 나타나지 않았다.

- 생체 재료는 회복되어야 할 상처의 기하학적 형태 및 크기에 알맞았고, 상처 부위를 깊고 그리고 얇게 완전히 덮었다.

- 치유 과정이 진행됨에 따라, 생체 재료는 분해되었고, 진피-표피 구성성분들로 대체되었다.

- 조직학적 단면들은 생체 재료가 섬유 아세포와 각질형성세포의 이동 및 증식을 유도했고, 이것이 단면 내에서 지속됨을 입증하였다.

- 본 발명의 생체 재료는 대조군 동물과 관련하여 효과가 두 배 더 뛰어난 상처 치유를 유도했고, 게다가 흉터의 새 조직은 본 발명의 생체 재료를 적용하지 않은 동물에서의 흉터 조직보다 품질이 훨씬 뛰어났다.

실시예 11: 본 발명의 주입형 생체 재료에서 공동-배양 중인 관절 연골세포 및 간엽성 줄기세포(MSC)의 생존능력 및 대사활성

생존 능력 및 대사활성을 측정하기 위해, 2x10⁶ 세포를 24 웰 플레이트 중에서 10 mg/ml의 본 발명의 생체 재료 800 ㎕에서 배양하였다. 연골세포와 MSCs를 7일 동안 배양물에서 유지하였다. 제3일과 제7일에 MTT 필수 염료로 염색을 수행하고, 이것은 대사활성인 세포를 염색하므로 세포 생존능력을 측정한다.

도 6은 본 발명의 생체 재료에서의 공생 배양에서 관절 연골세포와 AMSC의 MTT로 염색된 생존능력을 나타내는 역광현미경 영상이다. 제3일과 제7일 모두에 염색되었다. 검게 염색된 세포는 생존성이고 대사활성이다. 도 6에 나타난 결과를 근거로 요약하면, 본 발명의 생체 재료는 시험 세포 집합체의 대조군에 비하여 세포 생존능력을 유지하였다.

실시예 12: 히알루론산 ( HA )과 비교한 본 발명에서 성장한 세포의 증식 활성

본 발명의 생체 재료와 HA에서 세포의 증식 능력을 실시예 8에 기재된 기술에 따라, MTT를 사용하여 수행하였다. 시험된 세포는 다음을 포함한다: 사람 연골세포, 섬유아세포 L-929, 사람 섬유아세포, 및 사람 지방조직(AMSC) 감엽 줄기세포. 증식을 배양 24시간, 48시간 및 72시간에 관찰하였다. 도 7 및 8은 둘 다 배양된 세포의 증식과 생존이 유사한 농도에서 HAd에 대하여 비교했을 때, 본 발명의 생체 재료에서 상당히 더 높다는 것을 나타낸다.

실시예 13: 히알우론산 (HA)과 비교한 본 발명의 생체 재료에서 세포 3차원 성장에 대한 친화력 및 성능

본 발명의 생체 재료를 이용하는 목적은 손상에 대한 치료 세포 개체군의 적용을 위한 비히클로서 작용하는 주변 조직으로부터 손상 영역으로의 세포 보충을 강화시키는 것이다. 그러므로, 세포 항상성 유지에서의 본 발명의 생체 재료의 중요성이 나타난다.

본 발명의 생체 재료의 내부에 응집을 형성하는 연골세포의 능력을 측정하기 위해, 본 발명자들은 6웰 플레이트에서 웰당 750k 연골세포를 본 발명의 생체 재료 1.0 또는 2.0 mg/mL로 배양하였다. 배양 개시 72시간 후, 연골세포는 2.0 mg/mL의 농도에서 히드로겔 중에서 연골세포를 형성한 것이 관찰되었으나 히드로겔 1.0 mg/mL에서는 응집이 관찰되지 않았고, 배양 96시간 후, 본 발명의 생체 재료 2.0 mg/mL에서 연골세포는 클러스터에 완전히 응집하였지만, 1.0 mg/mL 히드로겔에서는 클러스터를 형성하기 시작하였다. 다시 말하면, 응집과 클러스터 형성은 대조군과 비교했을 때 본 발명의 재료의 높은 농도에서 쉽게 일어났다.

본 발명의 생체 재료와 접촉하여 배열된 세포들은 표준 세포 배양 플라스틱 표면의 것에 비해 본 발명의 생체 재료에 더 높은 친화력을 나타내었다. 이들은 세포 배양 플레이트로부터 분리되어 그들이 생균 클러스트를 형성하는 본 발명의 생체 재료로 이동한다. 그러나, 대조로서 동일한 농도의 HA를 사용했을 때, 세포는 세포 배양 플라스틱에 더 높은 친화력을 나타내었다. 동일한 농도에서, 본 발명의 생체 재료와 HA 사이에 일정한 실질적인 차이가 있다. HA는 본 발명의 생체 재료 보다 덜 점성이다. 도 9는 HA와 비교하여 본 발명의 생체 재료에 나타난 이러한 이동 효과를 설명한다. 생/사멸 분석을 사용하여 비-생존 (적색) 세포로부터 생존(녹색)세포를 설명하였다. 결론적으로, 본 실험에 사용된 세포는 세포 배양 플라스틱보다 본 발명의 생체 재료에 더 큰 친화력을 가졌고, 이것은 HA와 플라스틱에 대해서는 반복하여 관찰되지 않았다.

실시예 14: HA 에서 배양된 세포 대 본 발명에서 배양된 세포의 기능성 연구

본 실시예에서, 조직 재생과 연관된 표지자의 발현을 측정하였다.

본 발명의 생체적합재료와 대조 HA에서 MSC 중 다양한 연골 표지자들의 발현을 측정하기 위해, 세포를 두 가지 다른 농도의 히드로겔(0.1 및 0.5 mg/mL)과 HA에서 플라스크 당 7.5x 10⁵ 세포로 T75 플라스크에서 배양하였다. 4일 후, 세포를 원심분리하여 샘플로부터 RNA를 추출하였고 이어서 에질런트 토탈 RNA 단리 미니 키트(Agilent technologies, USA)를 사용하여 RNA를 정제하였다. RNA 추출에 이어서, cDNA를 합성하였고 콜라겐 II형 및 베르시칸의 발현을 위해 RT-RNA를 표준 프로토콜에 따라 수행하였다.

도 10은 본 발명의 생체 재료 대 HA 대조에서 배양한 MSC로부터 연골 인자 콜라겐 II와 베르시칸의 유전자 발현 분석의 결과를 나타낸다. II형 콜라겐은 인공 연골 매트릭스의 대부분(90%)을 형성하고 연골세포 표현형을 향한 세포 미분의 표지자가다. 본 발명의 생체 재료에서 배양된 MSCs는 배양 4일 후 II형 콜라겐의 발현을 시작하고, 이들이 HA에서 배양될 때는 이 현상은 나타나지 않는다. 베르시칸은 연골의 세포외 매트릭스에서 부수적 성분이다. 이것은 앞서 연골-형 세포에서 연골세포 표현형의 탈분화 또는 손실의 표지자로 간주된다. 연골 지향 세포가 성숙함에 따라, 이들은 베르시칸을 덜 발현하고, 아그레칸, 콘드로이틴 셀페이트, 및 II형 콜라겐의 발현을 부수적으로 증가시킨다. 농도-일치된 HA에서 세포의 대조 개체군과 비교하여 본 발명의 생체 재료에서의 MSCs는 II형 콜로겐의 증가된 발현과 함께 유전자 베르시칸의 발현의 감소를 증명한다. 그러므로, 본 발명의 생체 재료는 연골세포 표현형의 미분의 유도 또는 관절 연골 재생과 관련된 분자의 합성을 위한 능력을 나타낸다.

실시예 15: 사람 및 돼지 유래로부터 유래된 본 발명의 생체 재료의 혈류 특성화

생체 재료의 기계적 특성을 조직 엔지니어링 지지체에 관한 관련 및 비교 정보 둘 다를 제공하기 위해 정해진 대로 수행하였다. 히드로겔으로 사용하여, 기계적 연구는 다양한 기술을 사용한 주입에 관한 히드로겔의 적합성 또는 가교와 같은 화학적 공정의 완성도에 관한 중요한 정보를 제공할 수 있다.

이 실험에서, 상기와 같이 WJ로부터 단리된 GAG 지지체를 유동학적 계수에 대한 농도 효과를 평가하기 위해 각각 2 ml 부피의 3가지의 백분률 용액 (1%, 5%, 10%)에 분취하였다. 실험에 TA 인스트루먼트 모델 AR2000ex 유량계를 사용하였다. 우선, 각각의 샘플에 대해, 각각의 샘플이 저장 및 손실 탄성률, 및 점도에서 선형 점탄성 범위 (자료는 도시하지 않음) 내에서 시험 된다는 것을 확인하기 위해 변형률 스위프(strain sweep)를 수행하였다.

선형 점탄성 범위의 측정에 이어서, 손실 탄성률, 저장 탄성률, 및 점도를 20℃ 내지 50℃의 범위에서 변하는 생리적으로 관련있는 온도 스위프에 걸쳐 일정 주파수를 사용하여 각각의 샘플에 대해 측정하였다. 자료를 도 11~13에 좌표로 나타내었다.

도 11에서, 사람 10% 농도의 값은 돼지 10% 농도의 값보다 높았다. 사람의 5%에서 값은 돼지의 5%의 값을 초과하였다. 낮은 농도 (둘 다의 경우 1%, 그리고 돼지의 경우 5%)에서의 결과는 점도계 원뿔의 내부 품질로 인해 신호 대 노이즈 비율이 낮았다. 정량적 및 정성적으로, 그램 기준으로 돼지 샘플과 비교한 사람 샘플은 더 큰 계수를 나타내었다. 더욱이, 계수에서의 약간의 감소가 시험된 온도 변화에 걸쳐 관찰되었고, 일정 발진 주파 하에서 변하는 온도에서 점탄성 온도 효과는 일정하다는 것을 발견하였다. 도 12에서, 각각의 농도에서 사람 값의 결과는 돼지 값의 결과를 초과하였다. 낮은 농도(둘 다의 경우 1%, 그리고 돼지의 경우 5%)에서의 결과는 점도계 원뿔의 내부 품질로 인해 낮은 신호 대 노이즈 비율을 가졌다. 저장 탄성률 결과에 따르면, 온도에 따른 계수에서의 예측된 약간의 감소가 나타났다. 손실 탄성률 값은 모든 각각의 경우에서 저장 탄성률 값보다 높았고, 이것은 탄성 효과에 걸친 점성 효과의 우세를 나타낸다. 이것은 단리된 GAG가 고유 흐름 태도를 갖는 비-가교된 히드로겔이라는 것을 고려하면 예상된 결과이다. 손실 탄성률은 돼지와 사람으로부터 유래한 본 발명의 생체 재료의 3 가지 다른 농도에 대한 것이다. 도 13에서, 사람 값의 결과는 각각의 농도에서 돼지 샘플의 결과를 초과하였다. 낮은 농도(둘 다의 경우 1%, 그리고 돼지의 경우 5%)에서의 결과는 점도계 원뿔의 내부 품질로 인해 낮은 신호 대 노이즈 비율을 가졌다. 그램 기준으로는 사람 히드로겔이 일관되게 좀 더 점성이지만, 광범위한 점도가 샘플의 농도 변화를 통해 가능하다. 본 실시예에서 사람 생체 재료의 10% 용액은 피마자유와 유사한 평균 점도를 갖는다.

결론적으로, 추출한 GAG의 농도를 단순히 조정함에 의해 점도 및 탄성률이 매우 다양해질 수 있다.

실시예 16: 주변 조직으로부터의 세포 충원 (주화성)

본 시험의 목적은 조직으로부터 세포에 대한 본 발명의 생체 재료의 주화성 능력을 측정하기 위한 것이다. 이것을 위해, 본 발명자들은 두 명의 다른 사람 환자로부터 사람 연골 샘플을 사용하였다. 2 mg/mL의 농도가 MSC와 연골세포에 대한 생존능력과 증식의 시험에 충분하다는 것이 증명되었으므로, 이 농도를 본 실시예에서 사용하였다. 전-부착 기질의 존재를 피하기 위해 비-점착 플레이트를 사용하였다. 실험을 다음과 같이 구성하였다.

ㆍ음성 대조: DMEM의 단편

ㆍ히알루론산: 2 mg/mL에서 HA의 단편

ㆍ관심 재료: 2 mg/mL까지의 본 발명의 생체 재료의 단편

더욱이, 양성 대조로서, 끈적이는 플라그를 사용하였다. 조직을 10% 소 태야 혈청이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 영상을 매일 수집하였고 도 14에 나타내었다. 결과는 대조 중 어느 것에서 또는 HA-노출된 단편에서는 세포를 나타내지 않았다. 그러나, 본 발명의 생체 재료 중의 단편에서는 다량의 세포가 최초시점으로부터 연골의 외표면으로 이동한다는 것이 관찰되었다. 생/사멸 분석을 사용하여 연골 단편의 표면으로 이동하는 세포가 생존가능한가를 결정하였다. 결과를 도 15에 나타내었고 연골 단편으로부터 나온 세포의 거의 대부분이 생존가능하다는 것을 나타내었다. 그러나, 세포가 연골 단편의 표면으로부터 본 발명의 주변 생체 재료로 이동하는 것은 관찰되지 않았다.

이 결과로부터 본 발명자들은 다음의 결론을 얻을 수 있다:

1. 본 발명의 생체 재료는 천연 조직으로부터 연골 세포를 충원하는 능력을 갖는다.

2. 본 발명의 생체 재료로부터 충원된 연골 세포는 생존가능하다.

여러가지 가능성 있는 구현예들이 상기 발명으로 이루어질 수 있고 여러가지 변화가 상기 구현예에서 이루어질 수 있기 때문에, 본 명세서에 기재된 모든 문제들은 설명에 의해 이해될 것이고 한정된 의미가 아니라는 것을 이해할 것이다.

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- Wissink M. J. B, Beernink R, Pieper J. S, Poot A. A, Engbers G. H. M, Beugeling T, van Aken W. G, Feijen J. 2001. "Binding and release of basic fibroblast growth factor from heparinized collagen matrices" Biomaterials, 22: 2291-2299.

Claims (27)

1. 사람 이외의 동물 탯줄로부터 유래되고, 탯줄 막, 혈관, 및 세포 또는 세포 잔류물을 갖지 않는 글리코사미노글리칸 (GAGs)의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 주사 가능한 히드로겔의 생체 재료.
2. 제1항에 있어서, 히알루론산, 케라탄 설페이트, 콘드로이틴-6-황산, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트, 데르마탄 설페이트 및 헤파린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 글리코사미노글리칸의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 재료.
3. 제2항에 있어서, 히알루론산을 GAGs의 전체 혼합물의 40~80중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 재료.
4. 제2항에 있어서, 케라탄 설페이트를 GAGs의 전체 혼합물의 2~25중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 재료.
5. 제2항에 있어서, 콘드로이틴-6-설페이트를 GAGs의 전체 혼합물의 3~10중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 재료.
6. 제2항에 있어서, 헤파란 설페이트를 GAGs의 전체 혼합물의 1~9중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 재료.
7. 제2항에 있어서, 콘드로이틴-4-설페이트를 GAGs의 전체 혼합물의 0.5~7중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 재료.
8. 제2항에 있어서, 데르마탄 설페이트를 GAGs의 전체 혼합물의 0.1~7중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 재료.
9. 제2항에 있어서, 헤파린을 GAGs의 전체 혼합물의 0.05~3중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 재료.
10. 제2항에 있어서, 사람 이외의 동물 탯줄로부터 유래된 생체 재료로서, 히알루론산 70중량%, 케라탄 설페이트 10중량%, 콘드로이틴-6-설페이트 7중량%, 헤파란 설페이트 5중량%, 콘드로이틴-4-설페이트 4중량%, 데르마탄 설페이트 3중량% 및 헤파린 1중량%을 함유하는 것을 특징으로 하는 생체 재료.
11. 제1항에 있어서, 상기 주사 가능한 히드로겔의 점도는 10 cS ~ 150,000 cS인 것을 특징으로 하는 생체 재료.
12. 제11항에 있어서, 상기 점도는 10 cS ~ 15,000cS인 것을 특징으로 하는 생체 재료.
13. 제12항에 있어서, 상기 점도는 10 cS ~ 2,000cS인 것을 특징으로 하는 생체 재료.
14. 제1항에 있어서, 3차원 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 생체 재료.
15. 제13항에 있어서, 구멍 직경이 0.5~1000㎛인 다공성 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 생체 재료.
16. 제15항에 있어서, 구멍 직경이 0.5~500㎛인 것을 특징으로 하는 생체 재료.
17. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 부가적으로 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 재료.
18. 제17항에 있어서, 상기 세포는 미분화된 간엽 줄기세포 또는 다른 세포주로 분화된 간엽세포, 미분화된 조혈 줄기세포 또는 또 다른 세포주로 분화된 조혈 줄기 세포, 연골세포, 연골모세포, 조골세포, 골세포, 각질형성세포, 섬유 아세포, 근육세포, 지방세포, 뉴런, 신경계로부터의 다른 세포들, 백혈세포계로부터의 세포들, 각막세포, 내피세포 및 상피세포로 이루어진 군으로부터 적어도 하나 선택되는 것을 특징으로 하는 생체 재료.
19. 제1항에 있어서, 상기 생체 재료는 복합 재료를 형성하는 보강재와 조합되는 것을 특징으로 하는 생체 재료.
20. 제1항에 따른 생체 재료를 얻는 방법으로, 상기 방법은 다음 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    a) 사람 이외의 동물 탯줄을 얻는 단계;
    b) 상기 탯줄을 생리 식염수와 항생제로 처리하는 단계;
    c) 상기 탯줄 표면으로부터 혈액을 모두 제거하는 단계;
    d) 상기 탯줄을 1~2cm 크기의 단편으로 절단하는 단계;
    e) 내부에 잔존하는 혈액을 제거하는 단계;
    f) 탯줄 막과 혈관을 제거하는 단계;
    g) 와튼 젤리를 포함하는 젤라틴성 물질을 분리하는 단계;
    h) 얻은 젤라틴성 물질을 효소로 소화시키는 단계; 및
    i) GAGs를 침전시켜서 단리하는 단계.
21. 제20항에 있어서, 상기 방법은 제20항의 단계 i)에서 얻은 GAGs를 용해시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체 재료를 얻는 방법.
22. 제20항에 있어서, 상기 방법은 제20항의 단계 i)에서 얻어진 GAGs를 가교하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체 재료를 얻는 방법.
23. 제22항에 있어서, 공유 결합의 상기 가교가 온도의 변화, 화학 반응 또는 광중합 반응에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 생체 재료를 얻는 방법.
24. 제22항에 있어서, 이온성 가교는 WJ 중에서 단리된 GAG 성분에 대해 측쇄 변이에 의해서 수행되는 것을 특징으로 하는 생체 재료를 얻는 방법.
25. 연조직의 개량, 충전 또는 재구축을 위해 이용하는 제1항에 따른 생체 재료로서, 잔주름, 주름과 흉터, 화상, 궤양, 연조직 확대, 얼굴 지방위축증, 추간판 탈출증의 치료 그리고 연골, 근골격계 부상, 골관절염 및 주위관절염의 회복; 종양, 질 질환, 뇌 손상의 치료, 골수 회복(repair), 퇴행성 뇌신경질환, 심혈관질환 및 진통제 및 소염제와 같은 윤활 작용; 화상, 궤양 및 진피-표피 결함의 치료, 각막 손상, 망막 손상 또는 백내장과 같은 안과 질환의 치료; 연골 회복, 골연골 결손, 골관절염 또는 골 결손의 경우와 같은 골관절계의 치료, 그리고 질 질환의 해결에서 애쥬번트, 치은염 및 치주염의 치료; 세포 배양 시스템의 개발에서의 사용에 이용되는 것을 특징으로 하는 생체 재료.
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