PT2552457E - Biomaterial proveniente da gelatina de wharton do cordão umbilical - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

BIOMATERIAL PROVENIENTE DA GELATINA DE WHARTON DO CORDÃO

UMBILICAL

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um biomaterial, especificamente a um hidrogel, formado a partir da matriz extracelular do cordão umbilical para a sua aplicação em medicina regenerativa. A invenção refere-se particularmente a um biomaterial composto essencialmente dos glicosaminoglicanos presentes exclusivamente na gelatina de Wharton (WJ) do cordão umbilical, e também aos métodos para a produção e a utilização dos mesmos. As formas de realização do produto podem ser usadas por si só ou em combinação com terapias à base de células.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os biomateriais formados por polímeros desempenham um papel central na medicina regenerativa, uma vez que proporcionam âncoras temporárias tridimensionais para a adesão, a proliferação e a diferenciação de células transplantadas. Esta estrutura tridimensional proporciona uma plataforma apropriada para a comunicação intercelular e a relação das células com os componentes do biomaterial. A biointeração que ocorre entre a matriz e as células ao longo do tempo determina a capacidade proliferativa das células, a sua organização para a formação de um novo tecido, a sua diferenciação e a secreção de moléculas sinalizadoras que dirigem o processo de regeneração (Dawson et ai., 2008).

Para que estes fenómenos ocorram, é necessário que o biomaterial permaneça no local de aplicação durante um tempo limitado até a sua reabsorção, conservando a sua estrutura tempo suficiente para uma ação celular apropriada com consequências regenerativas.

Os hidrogéis, um tipo específico de biomaterial, têm um número de propriedades que os tornam adequados para a sua aplicação em engenharia de tecidos.

Os hidrogéis são estruturas formadas por polímeros hidrofílicos interligados de natureza natural ou sintética, com a capacidade de conter uma grande quantidade de água no interior da sua estrutura, a partir de 10 - 20 % até centenas de vezes o seu próprio peso. Estes géis apresentam uma morfologia semissólida com uma estrutura tridimensional que é um candidato ideal para a formação de uma matriz estrutural capaz de atuar como um apoio. Esta estrutura tridimensional pode ser formada tanto por reticulação física como por reticulação química. A reticulação física conduz a hidrogéis reversíveis cuja estrutura pode ser invertida de acordo com a aplicação final, enquanto que a reticulação química covalente conduz a hidrogéis permanentes cuja estrutura irá ser mantida ao longo de toda a aplicação (Coburn et ai., 2007). Portanto, os hidrogéis são materiais de polímero (de natureza natural ou sintética) reticulados sob a forma de uma rede tridimensional que incha em contato com a água, formando materiais elásticos macios, e que retêm uma fração significativa da mesma na sua estrutura sem se dissolverem.

Os hidrogéis têm uma série de caraterísticas particulares, tais como: 1. Natureza hidrofílica: devido à presença na sua estrutura de grupos solúveis em água (-OH, -COOH, -CONH2, -CONH, SO3H) . Têm um elevado teor de água semelhante ao dos tecidos nativos (Elisseeff et ai., 2005). 2. Insolúvel em água: devido à existência de uma rede de polímero tridimensional coesiva na sua estrutura. 3. Têm uma consistência gelatinosa que é determinada pelo monómero hidrofílico de partida e a baixa densidade de reticulação do polímero. Têm a capacidade de inchar na presença de água ou de soluções aquosas, aumentando consideravelmente o seu volume até atingir o equilíbrio físico-químico, mas sem perderem a sua forma. Esta capacidade para inchar proporciona um microambiente aquoso comparável ao que as células estão sujeitas em tecidos moles. A presença de água e de uma estrutura porosa também permite o fluxo de solutos de baixo peso molecular e de nutrientes, que são cruciais e essenciais para a viabilidade celular, assim como o transporte de resíduos celulares para fora do hidrogel (Torres et al., 2000).

Os glicosaminoglicanos (GAG), também conhecidos como mucopolissacáridos, são heteropolissacáridos encontrados em organismos, ligados a um núcleo de proteínas formando macromoléculas referidas como proteoglicanos. Estes podem ser encontrados na superfície das células ou na matriz extracelular e realizar funções importantes para as interações célula célula e célula - matriz extracelular. Estão em formas sulfatadas e não sulfatadas, com uma porção molecular caraterística comum envolvendo uma sequência repetida de dissacáridos formados por dois açúcares diferentes: um deles é geralmente um hexuronato enquanto que o outro é uma hexosamina. A variação configuracional na ligação dos dissacáridos e a posição de sulfatação conduzem a um aumento da diversidade nas propriedades físicas e químicas destas cadeias. O elevado teor de sulfato e a presença de ácido urónico conferem aos GAG uma grande carga negativa, de modo a que a grande quantidade de GAG na WJ tornam este tecido num tecido extremamente hidrofílico.

Existem vários tipos de GAG, que estão diretamente envolvidos nas funções celulares básicas, não só devido à sua estrutura, mas também por serem sítios de ancoragem para várias moléculas de sinalização celular. O ácido hialurónico é o mais abundante nos GAG da WJ. É o único membro não sulfatado da família de GAG que funciona in vivo como um hidrato de carbono livre, consistindo a sua estrutura em repetições de um dissacárido: ácido D-glucorónico e (1 — β — 3) N-acetil-D-glucosamina (Goa et al. , 1994; Laurent et al., 1992) . É sintetizado por vários tipos de células e é segregado para o espaço extracelular onde interage com outros componentes da matriz extracelular para criar a estrutura de apoio e de proteção em torno das células (Collins et al., 2008) . É um polímero linear polianiónico grande, que possui moléculas individuais que podem ter um peso molecular de 100.000 a 5 x 106 Da (Toole et ai., 2004; Bertolami et ai., 1992). Tem uma estrutura enrolada que ocupa um qrande volume, o que leva a soluções de elevada viscosidade. As moléculas individuais de ácido hialurónico associam-se umas com as outras formando redes ou reticulados. No desenvolvimento de tecidos, o ácido hialurónico é considerado a principal macromolécula estrutural envolvida na proliferação e miqração celular. O ácido hialurónico tem sido envolvido em vários processos, tais como na vascularização, na morfoqénese, e na inteqridade qeral e reparação da matriz extracelular. Sabe-se que uma qrande quantidade de ácido hialurónico contido no fluido amniótico favorece a reparação de feridas fetais (Lonqaker et ai., 1989). Para além disso têm sido observadas variações nas suas propriedades moleculares entre a pele saudável e cicatrizes, sendo o ácido hialurónico das cicatrizes típicas diferente do das cicatrizes hipertróficas (Ueno et ai., 1992). O sulfato de condroitina é um polímero linear formado por um dímero de ácido D-glucorónico e repetição N-acetilgalactosamina. A sua utilidade tem sido testada em terapias dirigidas contra doenças das articulações por meio de inibição da atividade das enzimas responsáveis pela degradação da matriz dos componentes da cartilagem. Pode atuar como um anti-inflamatório, por meio da inibição do complemento e é útil no tratamento de distúrbios tromboembólicos, em cirurgia e clínicas oftalmológicas. O sulfato de dermatano, também conhecido como sulfato de condroitina B, é um potente anticoagulante devido ao seu efeito inibidor seletivo sobre a trombina por meio do cofator II da heparina, sendo muito eficaz in vivo devido ao seu menor risco de hemorragia (Trowbridge et ai., 2002).

Os glicosaminoglicanos, em geral, e a heparina em particular, têm a capacidade de modular a atividade de cascata do plasma, aumentando a inibição da via de coagulação intrínseca e inibindo a via clássica de ativação do complemento em diferentes pontos (Rabenstein, 2001). Outras funções conhecidas da heparina são a inibição da angiogénese, o crescimento humoral e a sua atividade antiviral. 0 sulfato de heparano tem uma estrutura que está intimamente relacionada com a heparina. Está amplamente distribuído nos tecidos animais e entre as suas funções, a adesão celular e a regulação da proliferação celular, são fundamentais. Tem um efeito protetor contra a degradação de proteínas, regulando o seu transporte através da membrana basal e intervindo também na internalização das mesmas (Rabenstein, 2001).

Existem vários documentos de patentes relativos a mucopolissacáridos obtidos a partir de origem humana ou animal. O documento US 3 887 703 refere-se a misturas de mucopolissacáridos obtidos a partir de tegumentos cutâneos e de cordões umbilicais de uma fonte bovina fetal ou ovina fetal. O processo para obter os mucopolissacáridos na patente mencionada acima não descreve a remoção de membrana, células, e componentes vasculares dos cordões umbilicais. O produto de extração é obtido na forma de um pó sem uma compreensão clara da composição ou quantidade dos mucopolissacáridos individuais nele contidos. Os produtos ativos são identificados pela quantidade de hexosaminas que estão presentes na mistura. As composições, tanto nas formas injetáveis como de ingestão oral para o tratamento do couro cabeludo e cabelo oleoso, e de inflamações, são preparadas com os extratos. O documento da patente US 5 814 621 refere-se a uma composição que consiste essencialmente de um fármaco que é mais solúvel numa mistura de solvente orgânico - água do que em água, e um mucopolissacárido que faz parte de um fármaco, em que os cristais ou partículas do fármaco são distribuídos sobre a superfície das partículas do mucopolissacárido e, em que o referido fármaco dissolve-se em água mais rapidamente do que se estivesse por si só. A referida composição pode estar na forma de grânulos. 0 pedido de patente WO 2008/021391 Al descreve biomateriais que compreendem a membrana do cordão umbilical. Para além disso, pode compreender adicionalmente um ou mais vasos do cordão umbilical e/ou gelatina de Wharton. O biomaterial é de preferência seco e pode ser plano, tubular ou moldado para encaixar numa estrutura particular. A invenção também proporciona métodos de preparação do biomaterial que compreende pelo menos uma camada da membrana do cordão umbilical, bem como os métodos para a obtenção dos referidos biomateriais e a utilização dos mesmos para a reparação de tecidos ou órgãos. A descrição carateriza o biomaterial do cordão umbilical. Descreve que a composição do material referido compreende colagénio (tipo I, III e IV, sendo estes de 75 - 80 % da percentagem da matriz do biomaterial), fibronectina e glicosaminoglicanos.

Também é mencionado que o biomaterial pode também compreender colagénio que não provém de cordões umbilicais e tem uma origem comercial, ou que tenha sido isolado a partir de outros tecidos e métodos conhecidos no estado da tecnologia. Os autores também adicionam que o biomaterial pode compreender compostos não estruturais, tais como fatores de crescimento, hormonas, antibióticos, fatores imunomoduladores, etc. A patente espanhola ES 8600613 descreve um processo para o tratamento de tecidos do corpo, para a separação de membranas celulares, ácidos nucleicos, lípidos e componentes citoplasmáticos e formação de uma matriz extracelular, sendo o componente principal da mesma o colagénio, e para fazer o tecido corporal adequado para ser usado como um enxerto corporal, que compreende a extração do tecido referido com pelo menos um detergente sendo ao mesmo tempo mantido com um tamanho e forma adequados para o enxerto do mesmo no corpo. O documento da patente ES2180653T3 descreve métodos para a transformação de materiais biológicos em substâncias que sofreram autólise para eliminar, pelo menos, 70 % das células e métodos para o tratamento do material referido para inibir a sua mineralização após a implantação num humano ou animal.

Reivindica que o material biológico de partida pode ser, entre outros, o cordão umbilical; embora se relacione especificamente com uma válvula aórtica de um porco. No entanto, a descrição não contém qualquer detalhe no que respeita à sua realização com cordão umbilical. 0 biomaterial resultante é utilizado para criar uma válvula cardíaca bioprostética. 0 documento da patente US 4 240 794 refere-se à preparação de cordões umbilicais de humanos ou de outros animais para a sua utilização como um substituto vascular. O documento descreve especificamente uma técnica para desidratar o cordão umbilical em álcool seguido por um método para o fixar na configuração desejada. É descrito que uma vez que o cordão umbilical tenha sido limpo de eventuais restos de outros tecidos, é montado sobre um mandril e é imerso numa solução específica de álcool etílico durante o tempo necessário para o desidratar. Após a desidratação, o cordão é imerso numa solução de aldeído a 1 % para fixação. O documento da patente FR 2 563 727 descreve um método para a produção de um enxerto de pele de tecido conjuntivo desprogramado impregnado com gelatina de Wharton e armazenado a temperaturas de congelação. Os autores descrevem um dispositivo que é ancorado ao tecido umbilical e é expandido por meio de uma cânula que injeta ar comprimido. É descrito que o cordão umbilical é então cortado e isolado, mas o produto resultante deste processo não é composto exclusivamente de WJ.

Existem documentos de patentes que utilizam o cordão umbilical para obter células de interesse, e para esse efeito realizam processos para a separação da gelatina de Wharton e eliminação, obtendo assim as células referidas. Por exemplo, o documento PCT 98/17791 descreve o isolamento de pré-condrócitos provenientes do cordão umbilical, os quais são subsequentemente utilizados terapeuticamente para produzir cartilagem. Do mesmo modo, no documento WO 2004/072273 Al as células progenitoras são extraídas a partir da gelatina de Wharton, que se situa dentro da região perivascular do cordão umbilical e são usadas para reparar tecidos humanos.

Ao contrário de outros biomateriais semelhantes, o biomaterial da presente invenção é constituído por uma combinação de GAG diferentes presentes na WJ do cordão umbilical. É na sua maioria composto por ácido hialurónico, mas, para além disso, ao contrário de outros compostos de GAG, contém sulfato de dermatano, sulfato de heparano, heparina, sulfato de queratano, condroitina-4-sulfato e condroitina-6-sulfato. A combinação específica dos diferentes GAG tal como presentes na WJ do cordão umbilical melhora a bioatividade do biomaterial, uma vez que cada um deles leva a cabo funções de regulação do comportamento celular. Por exemplo, sabe-se que o sulfato de heparano e a heparina são os principais locais de ligação para o FGF e o EGF (Kanematsu et ai., 2003; Ishihara et ai., 2002), que os protegem contra a proteólise, e permitem concentrações locais destes fatores no ambiente da célula, criando o microambiente molecular apropriado para a ativação de células grandes (Malkowski et ai., 2007).

No entanto, tanto quanto sabemos, não existe nenhum documento que mencione um biomaterial formado por GAG derivados da gelatina de Wharton do cordão umbilical que seja: 1) livre de membrana e de vasos sanguíneos do cordão umbilical, 2) que possa formar um hidrogel com viscosidade sintonizável, 3) que seja aplicável a uma ampla gama de patologias humanas. Para além disso, os exemplos das patentes mencionadas acima contêm produtos derivados do cordão umbilical que diferem significativamente da forma de realização corrente apresentada neste documento. O biomaterial da presente invenção baseia-se nos glicosaminoglicanos que formam exclusivamente a matriz extracelular do cordão umbilical referida como WJ. Assim, apesar de serem encontradas na literatura numerosas tentativas de sintetizar a matriz extracelular, ainda não foi alcançada uma composição exata que simula as condições naturais de um tecido específico. O biomaterial desenvolvido na presente invenção pode oferecer uma estrutura tridimensional que tem aplicações potenciais como uma matriz de base para engenharia de tecidos. Para além disso, quando aplicado diretamente ou em combinação com células como uma construção numa patologia, intervém no processo regenerativo, exercendo um efeito quimiotático sobre as células do tecido circundante proporcionando, assim, um ambiente favorável para a ativação dos processos celulares. A combinação de GAG presentes neste biomaterial fornece um número de locais de ligação de moléculas de sinalização especificas que permitirá no local de aplicação, alta ativação das células do tecido em si para a síntese de níveis elevados de matriz extracelular que vai regenerar e reparar o defeito tratado.

Para além disso, a origem do biomaterial da invenção fornece um produto natural de origem animal de uma área não imunogénica. Este material é eliminado por meio de processos de biodegradação naturais no corpo, impedindo, assim, as reações indesejáveis ou efeitos secundários causados por outros biomateriais. Por exemplo, alguns biomateriais sintéticos podem causar inflamação, induração (endurecimento de tecidos de órgãos), aparecimento de granulomas, necrose em mucosas, complicações de tecidos devido à toxicidade das substâncias utilizadas na produção dos mesmos.

Uma das funções mais importantes dos GAG do cordão umbilical é proporcionar força, elasticidade e resistência para a proteção do sistema vascular localizado no mesmo de perturbações físicas externas (por exemplo, a torção do cordão seria fatal para o feto) . De facto, a deficiência na síntese destas moléculas está envolvida em patologias importantes durante a gravidez (Gogiel et ai., 2005). Portanto, acredita-se que um biomaterial constituído pelos 7 tipos diferentes de GAG que fazem parte do cordão umbilical possuiria um elevado grau de versatilidade por ser portador das seguintes capacidades: recapitulação da bioatividade que ocorre no organismo, a posse das mesmas propriedades mecânicas que beneficiam o cordão umbilical e a posse da aptidão para posterior processamento e modificação (tal como reticulação).

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: Caraterização e quantificação dos GAG presentes no biomaterial da invenção. 0 gráfico de barras mostra os diferentes tipos de GAG presentes no biomaterial da invenção, bem como a contribuição da percentagem de composição de cada. HA: ácido hialurónico, KS: sulfato de queratano, C6S: condroitina-6-sulfato, HS: sulfato de heparano, C4S: condroitina-4-sulfato, DS: sulfato de dermatano, H: heparina.

Figura 2: Verificação da presença de GAG na amostra e da aparente falta de células e ADN / ARN na mesma por meio de coloração histológica. As imagens do lado esquerdo mostram as amostras com as células e as imagens do lado direito mostram a coloração do biomaterial sozinho. A, B: marcação com hematoxilina - eosina; C, D: marcação com metil verde pironina; E, F: marcação com alcian blue.

Figura 3: Imagens da estrutura tridimensional interna do biomaterial da invenção por microscopia de varrimento de eletrões. A imagem mostra a estrutura interna do biomaterial da invenção a duas ampliações diferentes (A: 10 pm e B: 5 pm), em que podem ser vistas as unidades dos GAG interligadas umas às outras, oferecendo uma estrutura porosa muito homogénea.

Figura 4: Resultados do estudo de toxicidade das células no biomaterial da invenção. Os gráficos mostram as curvas de citotoxicidade das células AMSC (células estaminais mesenquimais derivadas de tecido adiposo) (Figura A) , dos fibroblastos de ratinho (Figura B9) , de L929 (Figura C) , dos osteoblastos (Figura D), dos condrócitos (Figura E) e dos queratinócitos (Figura F) . Os resultados são dados em relação a um controlo (células sem o biomaterial) e com um controlo positivo (células num biomaterial tóxico, tal como determinado de acordo com a norma ISO-10993, PVC) . Tal como pode ser observado nos gráficos, o biomaterial não causa toxicidade em nenhum dos tipos de células testadas, uma vez que a atividade mitocondrial das células dispostas sobre o biomaterial não mostra diferenças em relação às células do controlo (em condições padrão de cultura).

Figura 5: Imagem ampliada do biomaterial tridimensional. É mostrada a estrutura tridimensional macroscópica do biomaterial sólido da invenção após liofilização, para o que foi usada como molde uma placa padrão de cultura de 24 poços.

Figura 6: Imagem de microscopia de luz invertida que mostra a viabilidade de células de cartilagem articular (condrócitos) e MSC coradas com MTT, em co-cultura no biomaterial da presente invenção. A coloração é tanto no dia 3 como 7. As células marcadas a preto são viáveis e metabolicamente ativas.

Figura 7: Uma comparação da capacidade proliferativa de condrócitos humanos no biomaterial da presente invenção e em ácido hialurónico. Os dados no gráfico mostram um aumento significativo na capacidade de proliferação dos condrócitos mantidos no biomaterial da presente invenção em relação aos cultivados em ácido hialurónico.

Figura 8: Taxa de proliferação dos fibroblastos L-929 em contato com o biomaterial da presente invenção e ácido hialurónico. 0 gráfico mostra um aumento significativo na proliferação de células dispostas no biomaterial da presente invenção quando em comparação com as células cultivadas em ácido hialurónico.

Figura 9: Imagem de microscopia de fluorescência invertida de células semeadas em plástico de cultura de células, com o biomaterial da presente invenção, e hidrogéis de ácido hialurónico colocados em contato com a superfície da cultura de células. Nestas imagens, as células em contato com o biomaterial da presente invenção podem ser observadas a separar-se da superfície da cultura de células e a formar aglomerados dentro do biomaterial da presente invenção.

Figura 10: RT-PCR da expressão de colagénio II e versicano.

Resultados do varrimento densitométrico dos géis de agarose. Os dados são expressos como unidades arbitrárias de intensidade em relação ao valor de controlo (C) e são a média ± SEM, n = 3. (*p < 0,05, **p < 0,01) . A imagem mostra o início da expressão de colagénio do tipo II e o declínio de versicano nas AMSC dispostas sobre o biomaterial da presente invenção. Estas caraterísticas de expressão são indicativas das células no processo de diferenciação para um fenótipo de condrócitos e síntese de matriz extracelular correspondendo a cartilagem articular madura.

Figura 11: Resultados de módulos de armazenamento para três concentrações diferentes do biomaterial da presente invenção derivado de fontes de suíno e de humano. Os dados foram recolhidos a partir de uma única frequência de excitação / estirpe derivada das respetivas regiões viscoelásticas lineares das amostras. Uma varredura de temperatura ao longo de temperaturas delimitando valores fisiológicos produziu uma relação de temperatura viscoelástica para todas as amostras.

Figura 12: Resultados de módulos de perda para três concentrações diferentes de histogel derivado de fontes de suíno e de humano. Os dados foram recolhidos a partir de uma única frequência de excitação / estirpe derivada das respetivas regiões viscoelásticas lineares das amostras. Uma varredura de temperatura ao longo de temperaturas delimitando valores fisiológicos produziu uma relação de temperatura viscoelástica para todas as amostras.

Figura 13: Resultados de módulos de perda para três concentrações diferentes do biomaterial da presente invenção derivado de fontes de suíno e de humano. Os dados foram recolhidos a partir de uma única frequência de excitação / estirpe derivada das respetivas regiões viscoelásticas lineares das amostras. Uma varredura de temperatura ao longo de temperaturas delimitando valores fisiológicos produziu uma relação de temperatura viscoelástica para todas as amostras.

Figura 14: Imagens de microscopia ótica que mostram o recrutamento celular a partir de tecidos circundantes (quimiotaxia) nos dias 1 (a) , 3 (b) e 4 (c) ; em que (i) corresponde ao controlo positivo, (ii) corresponde ao desenho experimental para o ácido hialurónico, (iii) corresponde ao controlo negativo e (iv) corresponde ao desenho experimental para o biomaterial da invenção.

Figura 15: Imagens de microscopia ótica após a realização de um ensaio vivo / morto para determinar se as células que migram para a superfície dos fragmentos de cartilagem eram ou não viáveis. A imagem mostra que a grande maioria das células a emergirem dos fragmentos de cartilagem são viáveis.

Figura 16: Imagens de microscopia ótica que mostram o recrutamento celular a partir de tecidos circundantes (quimiotaxia) nos dias 5 (a) e 6 (b) ; em que (i) corresponde ao controlo positivo, (ii) corresponde ao desenho experimental para o ácido hialurónico, (iii) corresponde ao controlo negativo e (iv) corresponde ao desenho experimental para o biomaterial da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 0 cordão umbilical contém grandes quantidades de GAG (sulfatados e não sulfatados) que fazem parte do tecido conjuntivo mole referido como a WJ. Entre estes GAG, o principal GAG não sulfatado é o ácido hialurónico (Hadidian et ai., 1948; Jeanloz et ai., 1950), embora também sejam detetadas menores proporções de GAG sulfatados (Danishefsky et ai., 1966) . Para além disso, estudos histológicos do cordão umbilical sugeriram a presença de heparina (Moore et al., 1957) . É também muito provável que o cordão umbilical possua GAG sulfatados mais pequenos que ainda não foram identificados. A presente invenção refere-se a um hidrogel injetável constituído pelos GAG presentes exclusivamente na WJ do cordão umbilical. Este hidrogel é completamente livre de células e de quaisquer outros componentes vasculares presentes no cordão umbilical a partir do qual o biomaterial pode ser obtido, de modo a que tem pouca ou nenhuma imunogenicidade. O biomaterial da invenção, quer na sua forma combinada com células ou sozinho, é útil para tratamentos terapêuticos e cosméticos.

No contexto da presente invenção, são definidos os termos que se seguem: "Hidrogel" refere-se à formação de um coloide em que a fase dispersa (coloidal) foi combinada com a fase continua (água) para produzir uma substância gelatinosa viscosa. 0 coloide é tipicamente uma rede interpenetrante de filamentos hidrofilicos de produção sintética ou natural. "Injeção" refere-se à inserção forçada de uma substância dentro de uma cavidade. Por exemplo, uma substância (usualmente de valor terapêutico) é injetada numa ferida, ou na cavidade do corpo, circulação, ou outra localização. Para a finalidade da presente invenção, a injeção pode consistir de vários modos de penetração no local desejado. Por exemplo, a injeção pode envolver agulhas hipodérmicas de tamanhos de calibre que variam de 0,5 mm até 15 mm. Em cirurgia artroscópica ou laparoscópica, é usada uma entrada de cilindro, agulha ou outro objeto semelhante para o tratamento de patologias internas. Nesta forma de injeção, um agente terapêutico, tal como uma estrutura, é passado forçosamente através da entrada de acesso que pode ter um tamanho de calibre consideravelmente maior do que uma agulha hipodérmica (por exemplo, 0,5 cm - 4 cm). "Hidrogel injetável" refere-se ao ato de aplicação de um hidrogel utilizando uma técnica de injeção a uma patologia que penetra a barreira da pele. Por exemplo, a patologia pode ser uma ferida crónica, um órgão danificado, um tecido danificado, ou qualquer outra lesão por baixo da barreira da pele que necessite de tratamento. O método de aplicação pode variar muito desde a seringa hipodérmica até técnicas artroscópicas / laparoscópicas até dispositivos ad hoc projetados especificamente para aplicar materiais a áreas afetadas. Por exemplo, pode ser utilizado um análogo de pistola de calafetar para entregar uma substância de elevada viscosidade; pode ser aplicado um dispositivo de carretéis de linha através de uma agulha para entregar uma substância de hidrogel polimerizado filamentoso; pode ser utilizada uma entrada artroscópica / laparoscópica para entregar um tampão de hidrogel a um defeito côndilo cartilaginoso. Uma pessoa experiente na tecnologia pode apreciar as várias possibilidades de técnicas de injeção. "Hidrogel reticulado" refere-se à estabilização iónica ou covalente de um hidrogel que pode ou não ser reversível. Os hidrogéis reticulados têm viscosidades mais elevadas do que os hidrogéis não reticulados, são apropriados para manipulação, possuem morfologias tridimensionais estáveis, e podem ser rompidos por aplicação de força mecânica. "Hidrogel tridimensional" refere-se a um hidrogel reticulado que mantém uma forma tridimensional incluindo estruturas tridimensionais mais finas, estáveis, tais como os poros. Em contraste, um hidrogel não reticulado irá fluir para encher qualquer recipiente em que seja colocado. Esta resistência ao fluxo num hidrogel reticulado é caraterística da capacidade de um hidrogel reticulado para manter uma estrutura tridimensional estável. A origem dos cordões umbilicais a partir dos quais é extraída a WJ para os fins da presente invenção pode ser de mamíferos, incluindo animais. As potenciais fontes adicionais da WJ são os cordões umbilicais de animais, tais como: vacas, ovelhas, porcos, antílopes, camelos, veados, cabras, cavalos, elefantes, rinocerontes, hipopótamos, girafas, bisontes, búfalos, tigres, leões, leopardos, ursos, etc. 0 biomaterial é formado por uma mistura de glicosaminoglicanos selecionados a partir do grupo que compreende: ácido hialurónico, sulfato de queratano, condroitina-6-sulfato, sulfato de heparano, condroitina-4-sulfato, sulfato de dermatano e heparina. 0 biomaterial é preferivelmente encontrado formando a seguinte combinação e proporção da mistura de GAG: ácido hialurónico (40 - 80 %) , sulfato de queratano (2 - 25 %) , condroitina-6-sulfato (3 - 10 %), sulfato de heparano (1 - 9 %), condroitina-4-sulfato (0,5 - 7 %), sulfato de dermatano (0,1 - 7 %) e heparina (0,05 - 3 %) , mais preferivelmente, a combinação de GAG é: ácido hialurónico (70 %) , sulfato de queratano (10 %), condroitina-6-sulfato (7 %) , sulfato de heparano (5 %) , condroitina-4-sulfato (4 %), sulfato de dermatano (3 %) e heparina (1 %). A presente invenção também se relaciona com o biomaterial composto do hidrogel descrito anteriormente, que é opcionalmente combinado com células para um efeito terapêutico composto. A ação do hidrogel é assim aumentada no processo regenerativo e de reparação de tecido em tecidos severamente danificados ou em tecidos sem a possibilidade de um recrutamento celular in situ pelo paciente, como um resultado do facto de que o biomaterial agora contém células saudáveis que podem contribuir para a eficácia do produto. As células adicionadas à estrutura do biomaterial para formar a construção podem ser, entre outras: células estaminais mesenquimais indiferenciadas ou células estaminais mesenquimais diferenciadas em outra estirpe celular, células estaminais hematopoiéticas indiferenciadas ou células estaminais hematopoiéticas diferenciadas em outra estirpe celular, condrócitos e condroblastos, osteoblastos e osteócitos, queratinócitos, fibroblastos, miócitos, adipócitos, neurónios ou outras células do sistema nervoso, células do sistema de células brancas do sangue, células da córnea, células endoteliais ou células epiteliais.

Os seguintes aspetos relacionados com a presente invenção são apresentados tal como se segue: (i) obtenção de um extrato de GAG a partir da gelatina de Wharton do cordão umbilical, (ii) produção do hidrogel de GAG isolado a partir da gelatina de Wharton do cordão umbilical, (iii) caraterização do hidrogel obtido e (iv) usos do biomaterial de hidrogel. Para além disso, seguem-se estudos / exemplos que demonstram a capacidade do hidrogel injetável para efetuar o comportamento celular positivo e interações quando em comparação com o ácido hialurónico (HA).

Obtenção de um extrato de GAG da WJ do cordão umbilical. 0 processo para a obtenção do biomaterial compreende as etapas que se seguem: a) Obtenção de um cordão umbilical de origem animal; b) Tratamento do cordão umbilical com uma solução salina e antibióticos; c) Eliminação de todo o sangue da superfície do cordão; d) Fragmentação do cordão em secções de 1 - 2 cm; e) Limpeza de todo o sangue retido no interior; f) Eliminação das membranas e dos vasos sanguíneos do cordão umbilical; g) Separação da substância gelatinosa que compreende a gelatina de Wharton; h) Digestão enzimática da substância gelatinosa obtida; i) Precipitação e isolamento dos GAG.

Especificamente, é realizado o seguinte para isolar os glicosaminoglicanos da WJ do cordão umbilical:

Obtenção da gelatina de Wharton. 0 cordão umbilical é recolhido imediatamente após o parto e é processado ou mantido a 4 °C até o processamento. Não devem decorrer mais de 24 horas em tais condições.

Para o processamento, o cordão umbilical é de preferência mantido em condições estéreis numa câmara de fluxo laminar de nível de biossegurança II. É submetido a pelo menos três lavagens sucessivas com uma solução DMEM (Meio de Eagle Modificado por Dulbecco) ou com um tampão de fosfato IX (IX PBS) , com uma mistura de antibióticos (penicilina, estreptomicina, anfotericina-B) e/ou uma solução de tampão de lise de eritrócitos, para remover completamente os resíduos de sangue.

Assim que a superfície do cordão umbilical esteja limpa de sangue, este é transferido para uma placa de Petri e fragmentado em secções de 1 - 2 cm. Ao cortar o cordão em fragmentos é possível que o sangue retido no interior dos vasos sanguíneos do cordão umbilical seja libertado, por isso vai ser necessário, neste caso, lavar cuidadosamente os fragmentos do cordão. 0 cordão umbilical possui a nivel estrutural duas artérias umbilicais e uma veia umbilical, sustentadas por uma matriz consistente que é a WJ e cobertas com uma membrana fina. A fim de se obter exclusivamente a WJ, a membrana e os vasos sanguíneos são removidos mecanicamente. Para este fim, os fragmentos do cordão umbilical são seccionados longitudinalmente e com o auxílio de um bisturi e pinça tanto a membrana do cordão umbilical como os vasos sanguíneos são cuidadosamente removidos. A substância gelatinosa que é obtida como uma consequência desta separação mecânica é a WJ. De um modo geral, são obtidas entre 20 e 160 g de gelatina de Wharton a partir de 25 a 200 g de cordão umbilical.

Extração de GAG a partir da gelatina de Wharton.

Foi utilizado, com algumas modificações, o protocolo descrito na literatura (Rogers et ai., 2006) para a obtenção de GAG de cartilagem por meio de digestão enzimática com a enzima papaína de Papaya latex (SIGMA, Ref: P4762) para obter GAG da WJ do cordão umbilical. A WJ obtida no ponto anterior é imersa em 20 ml da solução do tampão de extração (5 mM de L-cisteína, 100 mM de solução tampão de Na2HP04, 5 mM de EDTA, 10 mg (14 U/mg) de papaína, pH 7,5) durante 24 - 48 horas a 60 °C para a digestão completa.

Assim que a WJ tenha sido totalmente digerida, é centrifugada para remover os resíduos inúteis de digestão. Neste ponto, observa-se que o volume de digestão é maior do que o volume de partida. Este aumento é devido à dissolução dos GAG presentes na WJ e, por conseguinte, à libertação da água que estes acumulam.

Assim que a amostra é centrifugada, o sobrenadante é transferido para outro recipiente e os GAG presentes na amostra são em seguida precipitados.

Precipitação e isolamento de GAG da WJ do cordão umbilical.

Os GAG da WJ são precipitados com 5 volumes de etanol a 100 %. Por meio desta etapa, os GAG da amostra, bem como os sais ai presentes são precipitados. A precipitação ocorre devido ao facto de as moléculas de água presentes na amostra interagirem com as moléculas de etanol, de tal modo que as moléculas de água não podem interagir com os GAG da amostra, tornando-se os últimos insolúveis em água, e portanto precipitando. Portanto, logo após a adição do etanol e a agitação do tubo, é observado um precipitado esbranquiçado. Os GAG são deixados a precipitar durante 12 horas a -20 °C. Uma vez precipitados, são centrifugados para remover o etanol a 100 % e o precipitado é lavado com 5 volumes de etanol a 75 % para remover os sais residuais possíveis que precipitaram da amostra. A amostra é centrifugada mais uma vez para remover completamente o sobrenadante.

Assim que a amostra de GAG tenha precipitado, o resíduo é deixado a secar durante pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente até todo o etanol se ter evaporado. Assim que o etanol se tenha evaporado, a amostra de GAG é ressuspendida em H2O Milli-Q e é armazenada a 4 °C até à sua utilização. O hidrogel assim obtido pode ser misturado com um soro injetável e ou aplicado diretamente à área a tratar. Não obstante o anterior, a resistência mecânica deste tipo de material é baixa; não é considerado para suportar cargas, a menos que seja combinado com um material de reforço para formar um compósito. Por exemplo, um suporte de fosfato de cálcio poderia servir como uma matriz de reforço no interior de um material compósito. Para além disso, existe uma afinidade muito elevada entre as moléculas de polissacárido que compõem este hidrogel injetável. Esta afinidade é aparente na alta coesão do biomaterial de hidrogel. No entanto, existe também um caráter adesivo substancial ao hidrogel que é benéfico para o isolamento local do hidrogel onde injetado. Por último, a versatilidade do hidrogel dita que este pode ser administrado sozinho ou em combinação com células.

Existem outras aplicações terapêuticas que requerem um biomaterial de hidrogel injetável mais resistente, estável e permanente, com uma estrutura interna que facilita melhor a colonização por células a partir quer dos tecidos adjacentes no local de aplicação quer por células específicas dispostas no biomaterial antes da sua implantação. Neste caso, o biomaterial da presente invenção iria atuar como uma matriz tridimensional bioativa para induzir a cura e reparação de uma ferida de tecido. 0 ácido hialurónico, a condroitina-6-sulfato, a condroitina-4-sulfato, o sulfato de queratano, o sulfato de dermatano, o sulfato de heparano e a heparina regulam a atividade celular e ativam a síntese de uma nova matriz extracelular. A diversidade e a composição dos GAG presentes no biomaterial permitem a existência de um número de locais de ligação específicos para fatores de crescimento que regulam os processos de proliferação e diferenciação celular, assim como a capacidade das células para a síntese de uma nova matriz extracelular e fatores de crescimento. Este efeito conduz a uma maior capacidade de resposta celular nos tecidos afetados e acelera a regeneração e permite mesmo a cura, no caso de áreas muito degradadas, tal como é o caso das úlceras crónicas. A estratégia de estabilização (reticulação) é requerida a fim de facilitar as aplicações em que o biomaterial é para funcionar como uma estrutura tridimensional estável. A fim de alcançar este objetivo, os GAG podem ser quimicamente modificados ou reticulados para formar o hidrogel injetável da presente invenção. Estas modificações químicas (reticulação, polimerização) envolvem, tipicamente, o álcool ou grupos carboxílicos, e podem ocorrer in situ após a injeção, ou antes da injeção. Para além disso, este processo envolve as cadeias de um polímero solúvel em água, tornando-se insolúvel (Elisseeff et al., 2005).

Os hidrogéis injetáveis obtidos por meio de reticulação têm propriedades únicas, tornando-os potencialmente úteis para engenharia de tecidos: elevado teor de água para o transporte de nutrientes ou de substâncias residuais, elasticidade e a capacidade de encapsular ou imobilizar células in situ num microambiente 3D. A densidade de reticulação afeta diretamente o tamanho do poro do hidrogel injetável e, portanto, as propriedades físicas do mesmo, tais como, por exemplo, o teor de água ou a resistência mecânica. Um hidrogel injetável com uma grande densidade de reticulação e, por conseguinte, um tamanho de poros muito pequeno, vai assim absorver menos água e terá uma maior resistência mecânica do que um hidrogel injetável com um menor grau de reticulação e um tamanho de poro grande. A formação do hidrogel reticulado para injeção pode ser levada a cabo por meio de vários métodos, incluindo, mas não se limitando a: alterações de temperatura, reações químicas e fotopolimerização. A reticulação pode ser realizada in situ após a injeção por metodologias padrão de seringa hipodérmica ou ex vivo antes da injeção e, assim, utilizando técnicas mais semelhante a laparoscopia / artroscopia, tal como definido anteriormente neste documento.

Numa forma de realização da presente invenção, a reação de reticulação é levada a cabo tal como se segue: é obtida uma solução aquosa do polímero a ser reticulado (neste caso, uma solução aquosa de GAG) e é adicionado o reagente químico que provocará a reticulação. Neste caso, para se obter o hidrogel estabilizado, é usado EDC (l-etil-3-(3-dimetilaminopropil carbodiimida cloridrato), porque o EDC ativa os grupos carboxilo em soluções aquosas. Estes grupos carboxilo ativados são capazes de reagir com aminas primárias ou com grupos hidroxilo, resultando em ligações de amida ou de éster. Assim que o hidrogel é formado, é lavado várias vezes com PBS para remover os resíduos de EDC que possam permanecer. (Pieper et ai., 1999; Wissink et ai., 2001) .

Opcionalmente, o hidrogel injetável pode solidificar num molde destinado a esse processo durante a reação de reticulação, de tal modo que adota a forma e tamanho desejados dependendo do molde que é utilizado. Estes hidrogéis podem ser secos por meio do processo referido como liofilização para obter, assim, uma estrutura porosa devido à remoção de moléculas de água intercaladas entre as moléculas de GAG presentes no hidrogel (figura 5) . Para além disso, assim que o biomaterial é liofilizado, a estrutura tridimensional do hidrogel pode ser caraterizada por meio de microscopia eletrónica de varrimento (SEM) (figura 3) . Assim que o hidrogel é obtido na sua forma final, é esterilizado por meio de exposição à radiação ultravioleta por um período de 40 minutos. Os ensaios de esterilidade realizados sobre o hidrogel demonstraram que o biomaterial foi esterilizado de forma ótima. Outras técnicas para a esterilização pode ser o tratamento do gás de óxido de etileno ou a radiação gama, tal como uma pessoa entendida na técnica irá compreender.

Uma vez esterilizado, o hidrogel injetável está pronto para ser utilizado diretamente ou em associação com células. Os ensaios de associação celular com o hidrogel da invenção demonstraram que o biomaterial não é citotóxico, com base nos resultados de experiências de capacidade de proliferação (figura 4) .

Usos do biogel. O biomaterial da invenção, quer na sua forma combinada com células ou sozinho, pode ser aplicado na sua forma injetável em doenças do sistema de articulações e em tratamentos de estética. As células que podem ser utilizadas são, entre outras: células estaminais mesenquimais indiferenciadas ou células estaminais mesenquimais diferenciadas em outra estirpe celular, células estaminais hematopoiéticas indiferenciadas ou células estaminais hematopoiéticas diferenciadas em outra estirpe celular, condrócitos e condroblastos, osteoblastos e osteócitos, queratinócitos, fibroblastos, miócitos, adipócitos, neurónios ou outras células do sistema nervoso, células do sistema de células brancas do sangue, células da córnea, células endoteliais ou células epiteliais.

Dependendo da aplicação terapêutica ou cosmética para a qual o hidrogel irá ser pretendido, a técnica de injeção será diferente e a viscosidade do hidrogel será adaptada ao calibre do sistema de injeção. A viscosidade do hidrogel da presente invenção pode variar de 10 a 150.000 cS; no caso do hidrogel não reticulado é de 10 a 15.000 cS, de preferência entre 10 e 2000 cS. O hidrogel reticulado pode ter uma viscosidade que varia de 15.000 a 150.000 cS. A viscosidade do hidrogel pode ser modificada por reticulação de acordo com as necessidades.

Tabela 1. Valores da viscosidade de vários hidrogéis não reticulados e reticulados derivados da gelatina de Wharton, tal como descrito no biomaterial da presente invenção.

O biomaterial desenvolvido na presente invenção é útil nos tratamentos terapêuticos e cosméticos que se seguem: remodelação, preenchimento ou reconstrução de tecidos moles, tratamento de rugas, pregas e cicatrizes, queimaduras, úlceras, aumento de tecido mole, lipodistrofia facial, doenças do disco intervertebral, reparação da cartilagem, lesões músculo-esqueléticas, osteoartrite e periartrite; tratamento de tumores, doenças vaginais, lesões cerebrais, reparação da medula, doenças neurodegenerativas, doenças cardiovasculares e processos de lubrificação, como um analgésico e anti-inflamatório. O hidrogel injetável reticulado da invenção pode ter uma estrutura substancialmente porosa. Numa forma de realização, o diâmetro do poro é de 0,5 - 1.000 pm, preferencialmente de 0,5 -500 pm, com uma viscosidade maior que 15.000 cS. O biomaterial referido pode ser aplicado de um modo preferido como uma estrutura nas patologias que se seguem: tratamento de queimaduras, úlceras e defeitos dermo-epidérmicos, tratamento de doenças oftalmológicas, tais como lesões da córnea, lesões da retina ou cataratas; reparação de cartilagem, tratamento do sistema osteoarticular, tal como no caso de defeitos osteocondrais, osteoartrite ou defeitos ósseos, e um adjuvante na resolução de doenças vaginais, tratamento de gengivite e periodontite; utilização no desenvolvimento de sistemas de cultura de células.

As doenças condrais são um importante problema socioeconómico a nível mundial. Neste sentido, apesar da dificuldade de registar a sua incidência, estima-se que as lesões nas articulações afetam 500 milhões de pessoas.

As patologias condrais ocorrem como resultado de lesões ou doenças que, se não forem tratadas, podem resultar em doenças degenerativas, tal como a osteoartrite (OA). A OA é um dos tipos mais comuns de artrite que afeta 35 -40 milhões de pessoas nos Estados Unidos e na Europa. É uma doença degenerativa que provoca a desintegração da cartilagem acompanhada por uma reação nos ossos. Afeta geralmente as mãos, os joelhos, os quadris, os pés e o pescoço, e em adultos, é considerada uma das causas mais comuns de incapacidade física. A cartilagem articular é um tecido avascular altamente especializado que protege os ossos da articulação diartrodial de forças associadas com o peso e os impactos que levam a atritos entre as superfícies das articulações. Este tecido é formado por um único tipo de célula, condrócitos, e por uma matriz extracelular rica e importante. A matriz referida consiste de uma densa rede de fibras de colagénio do tipo II (molécula predominante) , e, dentro desta rede, macro-agregados de proteoglicanos, que contêm os GAG, tal como o sulfato de condroitina, o sulfato de queratano, o ácido hialurónico e o agrecano. A arquitetura especializada de cartilagem e a sua capacidade limitada de reparação tornam o tratamento deste tipo de lesões muito complicado. A ausência de vascularização torna a sua capacidade de regeneração muito limitada um vez que as células estaminais não pode aceder à área danificada para contribuir no processo regenerativo.

Em anos recentes, têm sido utilizados biomateriais biodegradáveis para o tratamento de lesões condrais. Neste sentido, os polímeros sintéticos macroscópicos (ácido láctico, ácido glicólico, caprolatona. . .) tornaram-se os grupos de biomateriais mais importantes e numerosos. No entanto, estes materiais macroscópicos sólidos requerem a utilização de procedimentos cirúrgicos agressivos, tais como a cirurgia convencional. Para o propósito de superar estas limitações, estão atualmente a ser desenvolvidas biomatrizes novas que podem ser implantadas por meio de técnicas minimamente invasivas, tal como por injeção ou artroscopia.

Por conseguinte, uma das aplicações do biomaterial injetável da presente invenção é a regeneração da cartilagem articular danificada nos processos degenerativos da osteoartrite. 0 biomaterial da presente invenção pode ser facilmente administrado na área a ser regenerada por meio de técnicas de injeção percutâneas, tais como a artroscopia, ou por meio de qualquer dispositivo de injeção. Para além da facilidade de administração, o hidrogel injetável tem a propriedade de formar um implante estável, que é ajustado ao tamanho e geometria do tecido deteriorado.

Outra aplicação do biomaterial da presente invenção é no tratamento de feridas. 0 decúbito diabético crónico, e as úlceras venosas são um importante problema que afeta entre 3 e 6 milhões de pessoas nos Estados Unidos. Esta patologia afeta de 1 - 3 % da população dos países desenvolvidos e 15 % dos pacientes internados em hospitais sofrem desta condição. 0 grande número de pacientes que sofrem destas lesões produz repercussões socioeconómicas e de cuidados de saúde consideráveis, sendo assim estabelecido um elevado custo de tratamento, sendo a qualidade de vida do paciente consideravelmente alterada.

As úlceras são traumas que têm um efeito pronunciado sobre o organismo com uma fisiopatologia consideravelmente complexa. Ocorre uma interação sinérgica complexa entre os fibroblastos (células da derme), os queratinócitos (células da epiderme), a matriz extracelular e as proteínas derivadas do plasma no leito da ferida. A progressão através das diferentes fases de cicatrização: hemostasia, inflamação, reparação e remodelação, é típica, mas a natureza crónica e a recorrência destas feridas é de importância clínica. Apesar da grande variedade de tratamentos e estruturas disponíveis hoje em dia, a eficácia de cura e a taxa de cicatrização continuam a ser extremamente baixas, necessitando portanto de tratamentos mais eficazes que possam alcançar uma cicatrização rápida. 0 conhecimento progressivo ganho na fisiopatologia de úlceras crónicas nos últimos anos tem facilitado a geração e desenvolvimento de novas estruturas que são avanços significativos no tratamento desta doença. Embora até agora não exista nenhuma estrutura ideal para cobrir a pele; a estrutura referida deve cumprir uma série de caraterísticas de base, tais como: 1) adesão rápida à ferida, 2) proporcionar uma função de barreira eficaz contra a perda de fluidos, 3) resiliência mecânica e estabilidade a longo prazo, 4) fácil de esterilizar, 5) fácil de manusear e de transportar, e 6), deve ser inócua.

Em resumo, o biomaterial da presente invenção tem a maioria das caraterísticas necessárias para uma estrutura ou um diluente para ser eficaz no tratamento das doenças mencionadas. Neste sentido, com a finalidade de avaliar o efeito terapêutico dos biomateriais referidos, foram realizados estudos experimentais in vivo, tal como descrito nos exemplos 9 e 10.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Obtenção da gelatina de Wharton. O exemplo que se segue foi realizado tanto com cordões umbilicais de humano (não reivindicado) como de fonte suína. Para isolar os GAG da WJ dos respetivos cordões umbilicais, foi seguido o procedimento que se segue.

Em cada caso, foi recolhido um cordão umbilical de 50 g imediatamente após o parto num frasco estéril em que tinham sido anteriormente depositados 300 ml de PBS a uma concentração de IX (para 1 litro de H2O: 8 g de NaCl, 0,2 g de KC1, 1,44 g de Na2HP04, 0,24 g de KH2P04, pH =7,4 em 1 1 de H20) e 3 ml de uma mistura de antibióticos de penicilina (30.000 unidades), estreptomicina (30,000 pg) e anfotericina-B (75 pg) (LONZA, Ref: 17-745E) a uma concentração de IX. Os cordões umbilicais podem ser armazenados a 4 °C durante não mais do que 24 horas até o processamento, mas, neste exemplo, os cordões umbilicais foram processados imediatamente depois de serem recebidos.

Para o processamento, os cordões umbilicais foram mantidas em condições estéreis numa câmara de fluxo laminar de nivel de biossegurança II, e foram submetidos a lavagens sucessivas para remover completamente os resíduos de sangue que contêm. Para esse efeito, foram colocados em dois recipientes, onde tinham sido adicionados 300 ml de PBS a IX (para 1 litro de H20: 8 g de NaCl, 0,2 g de KC1, 1,44 g de Na2HP04, 0,24 g de KH2P04, pH = 7,4 em 1 1 de H20) contendo 3 ml de uma mistura de antibióticos de penicilina (30.000 unidades), estreptomicina (30.000 pg) e anfotericina-B (75 pg) (LONZA, Ref: 17-745 E); estes foram agitados manualmente inclinando verticalmente a garrafa 5 vezes durante 10 segundos, e o líquido foi eliminado, sendo esta operação repetida pelo menos 3 vezes, até que a maior parte do sangue foi removido. Em seguida, os cordões umbilicais foram lavados com 500 ml de uma solução de lise dos eritrócitos a uma concentração de IX (para 1 litro de H20: 8,99 g de NH4C1, 1 g de KHCO3, 37 mg de EDTA, pH 7,3) até a remoção completa dos resíduos de sangue.

Assim que a superfície dos cordões umbilicais foi limpa de sangue, estes foram transferidos para uma placa de Petri de 10 cm e foram cortados com tesouras esterilizadas em fragmentos de 1-2 cm. Uma vez que o sangue retido nos vasos sanguíneos foi libertado durante o corte dos cordões umbilicais em fragmentos, foram adicionados 10 ml de PBS a IX contendo 1 ml de uma mistura de antibióticos (10,000 unidades), estreptomicina (10.000 pg) e anfotericina-B (25 pg) para limpar completamente os referidos fragmentos, e a superfície do fragmento foi pressionada contra a sua superfície de apoio, fazendo movimentos de deslocamento horizontal ao longo do fragmento com um bisturi estéril. Este processo foi repetido até que todos os resíduos de sangue foram retirados a partir do interior. Os fragmentos do cordão umbilical completamente limpos foram transferidos para um tubo estéril e foram processados imediatamente, embora, se necessário, estes podem ser criopreservados indefinidamente a -80 °C. A membrana que envolve os cordões umbilicais e os vasos sanguíneos localizados na mesma foram então removidos mecanicamente. Para fazer isso, os pedaços de cordão umbilical foram abertos longitudinalmente e com o auxílio de um bisturi e de pinças foram removidos cuidadosamente tanto a membrana do cordão umbilical como os vasos sanguíneos. A substância gelatinosa que foi obtida como uma consequência desta separação mecânica é a WJ. Foram obtidas 25 g de WJ.

Exemplo 2. Extração dos GAG a partir da gelatina de Wharton. O exemplo que se segue foi realizado com cordões umbilicais tanto de fonte humana como suína. Foi utilizado, com algumas modificações, um protocolo descrito para obter os GAG da cartilagem humana para se obter os GAG da WJ do cordão umbilical (Rogers et ai., 2006).

Ambas as WJ obtidas no exemplo 1 foram imersas em 20 ml da solução do tampão de extração (242 μΐ de 200 mM de L-cisteína, 1,42 ml de 704 mM de tampão de Na2HP04, 100 μΐ de 0,5 M de EDTA, 10 mg (14 U/mg) , pH 7,5), papaína (SIGMA, Ref: P4762) e foram mantidas a 60 °C durante 12 horas para digerir completamente a WJ, e uma vez que foram digeridas, as amostras foram centrifugadas a 1.500 g durante 5 minutos para remover o resíduo da digestão. Observou-se que os volumes da digestão foram aproximadamente 30 ml, aproximadamente 10 ml mais do que o volume de partida de 20 ml, devido à dissolução dos GAG presentes na WJ e, por conseguinte, devido à libertação da água que estes tinham acumulado.

Assim que as amostras foram centrifugadas, o sobrenadante foi transferido para outro tubo e os GAG presentes nas amostras foram em seguida precipitados.

Exemplo 3. Precipitação e isolamento dos GAG da WJ do cordão umbilical.

Os GAG da WJ presentes no sobrenadante do exemplo 2 foram precipitados com 5 volumes de etanol a 100 %. Por meio desta etapa, os GAG das amostras, assim como os sais presentes nos mesmos foram precipitados. Isto é devido ao facto de as moléculas de água presentes nas amostras interagirem com as moléculas de etanol, de tal modo gue as moléculas de água não podem interagir com os GAG das amostras. Os GAG foram deixados a precipitar durante 12 horas a -20 °C. Assim gue foram precipitados, foram centrifugados a 1.500 g durante 5 minutos, sendo assim removido todo o etanol a 100 %. O precipitado foi lavado com 5 volumes de etanol a 75 % para remover os sais residuais possíveis gue podem ter precipitado a partir da amostra. Em seguida, foi centrifugado durante cerca de 5 minutos a 1.500 g e o sobrenadante foi completamente removido.

Assim que as amostras foram precipitadas, o resíduo sólido foi deixado a secar durante cerca de 30 minutos à temperatura ambiente até todo o etanol se ter evaporado. A quantidade de GAG que precipita a partir de uma amostra de cerca de 25 g de WJ pode variar entre 50 e 300 mg, dependendo do material de partida. Nestes casos específicos, foram obtidas cerca de 250 mg de precipitados de GAG. Para obter o hidrogel da presente invenção, os precipitados de GAG foram ressuspendidos em 1 ml de H2O Milli-Q e foram armazenados a 4 °C.

Exemplo 4. Produção de um hidrogel injetável contendo os GAG da WJ do cordão umbilical. O conteúdo de água do hidrogel pode ser de 10 % até 100 vezes o seu próprio peso, dependendo da viscosidade desejada para a sua aplicação. O hidrogel obtido após a ressuspensão dos precipitados de GAG em 1 ml de H2O foi ressuspendido numa solução injetável de soro fisiológico, e foi deixado em agitação moderada num vortex até ter ocorrido a dissolução completa e homogeneização. Assim que o hidrogel foi dissolvido, foi armazenado a 4 °C.

Exemplo 5. Produção de um hidrogel reticulado contendo os GAG da WJ do cordão umbilical.

Para produzir um hidrogel mais consistente e estável, foi seguido o processo descrito na literatura (Cui et ai., 2006). Foi preparada uma solução aquosa a partir dos extratos de GAG obtidos a partir da WJ de acordo com o exemplo 3. Especificamente, foi preparada uma solução de GAG em H2O a 1 %. Para este fim, foram adicionados 10 ml de H2O a 200 mg dos GAG obtidos após a sua precipitação e isolamento (exemplo 3) . Foram adicionadas à solução 1,2 g de di-hidrazida adípica (ADH) e o pH da solução foi ajustado para pH = 3,5 com 0,1 N de HC1. Assim que este valor de pH foi ajustado, foram adicionadas à solução 0,6 g do fixador, EDC (l-etil-3-(3-dimetilaminopropil carbodiimida cloridrato) (SIGMA, Ref: E6383) . A mistura foi mantida entre 30 minutos a 1 hora sob agitação constante à temperatura ambiente até que foi obtido o hidrogel estável.

Assim que o hidrogel estável foi formado, foi lavado 3 vezes com IX de PBS (para 1 litro de H20: 8 g de NaCl, 0,2 g de KC1, 1,44 g de Na2HP04, 0,24 g de KH2P04, pH = 7,4 em 1 1 de H20) , 5 minutos de cada vez para remover o excesso de EDC. No que diz respeito à forma física do hidrogel, terá a forma do molde em que solidifica, de modo podem ser usadas placas de cultura convencionais de 96, 48, 24, 12 e 6 poços, placas de Petri, ou qualquer outro recipiente com a forma desejada.

Para além disso, o hidrogel pode ser solidificado num recipiente grande, tal como um copo, e uma vez que é solidificado, o hidrogel pode ser cortado com a forma e a espessura caraterística. Especificamente, neste exemplo, o hidrogel solidificou em poços de placas de 24 poços e assim que solidificou foi lavado 3 vezes durante 5 minutos com 500 μΐ de IX de PBS.

Neste caso, o hidrogel reticulado em placas de 24 poços foi liofilizado de acordo com técnicas padrão.

Neste exemplo, a estrutura tridimensional do hidrogel foi analisada por meio de microscopia eletrónica de varrimento (SEM) . Assim que o hidrogel foi liofilizado foi realizado o seguinte: foi cortada uma secção do hidrogel liofilizado e esta secção foi seca ao ponto crítico com CO2 num secador AUTOSAMDRI-814 e foi metalizada com ouro num SPUTTER. As preparações foram observadas a uma voltagem de 20 KV no microscópio eletrónico de varrimento JEUL (JSM35). A análise de SEM (figura 3) do hidrogel desidratado indicou que tem uma estrutura porosa uniforme. A micrografia mostra a existência de uma estrutura tridimensional altamente porosa, com um diâmetro de poro que varia entre 0,5 e 500 pm. Esta gama de poros envolve a existência de micro e macroporosidade. Os macroporos (300 - 500 pm) são necessários para que seja levada a cabo a colonização celular apropriada, de modo a que um elevado número de células são concentradas e de modo a que coexistam diferentes tipos de células, favorecendo a formação de tecidos estruturados, por exemplo, de modo a que possa ser formada uma rede vascular. Os poros intermédios permitem a integração de células. Os microporos (0,5 - 50 pm) são necessários para a sobrevivência das células, uma vez que estes são responsáveis por levar a cabo a correta difusão de gases, nutrientes e a remoção dos produtos residuais resultantes do metabolismo celular. O tamanho dos poros é medido com base na escala métrica obtida por meio do microscópio eletrónico de varrimento.

Este biomaterial mostra uma sensibilidade estrutural mais elevada, sendo indicado para aplicações em que não só é procurada uma natureza bioativa e ação trófica, mas também uma estrutura que pode albergar temporariamente células até que é realizada a reparação de tecidos, tal como o tratamento de úlceras e de outras doenças dermo-epidérmicas, a reparação de cartilagem e os tratamentos oftalmológicos, entre outros. As células contidas no biomaterial podem ser as dos tecidos adjacentes ao local de implantação que conseguiram colonizá-lo, ou também células dispostas ex vivo no biomaterial antes da sua aplicação clínica, de tal modo que a sua ação regenerativa é reforçada.

Este biomaterial tem uma distribuição homogénea dos poros com um tamanho numa gama de 0,5 - 1000 micras, determinado por meio de técnicas de microscopia de eletrónica de varrimento. Este intervalo de porosidade é adequado tanto para a difusão de gases e nutrientes através de toda a sua estrutura, como para permitir que as células o colonizem.

Exemplo 6. Caraterização e quantificação dos GAG presentes no biomaterial da invenção

Os diferentes GAG presentes no biomaterial da invenção foram analisados e quantificados por meio da técnica de espectrometria de massa (ESI/MS). Dado que, por meio desta técnica apenas podem ser determinadas moléculas com um peso molecular de entre 200 e 2.000 Daltons e que as moléculas dos GAG ultrapassam estes limites, na maior parte, em primeiro lugar, a amostra foi enzimaticamente digerida, de modo a obter, assim, cadeias de GAG com um peso molecular entre 200 e 2.000 Da.

Como um padrão para a identificação e quantificação dos GAG, foram utilizados compostos comerciais padrão representando cada GAG com uma concentração conhecida. Especificamente, os padrões utilizados para realizar a quantificação dos GAG foram os seguintes: para o ácido hialurónico: sal de potássio de ácido hialurónico (SIGMA, Ref: 53750); para o sulfato de condroitina: sal de sódio de sulfato de condroitina (SIGMA, Ref: C4384); para o sulfato de dermatano: sal de sódio de sulfato de dermatano (SIGMA, Ref: C3788); para o sulfato de queratano: sulfato de queratano (CHEMOS, Ref: 7295); para a heparina: sal de sódio de heparina (SIGMA, Ref: H8537); e para o sulfato de heparano: sal de sódio de sulfato de heparano (SIGMA, Ref 51541) .

Os valores da quantificação dos GAG presentes na amostra foram obtidos com base nos resultados obtidos para cada GAG padrão utilizado. A fim de realizar a digestão enzimática dos GAG, foi seguido o processo descrito na literatura (Mahoney et al., 2001) . Para esse fim, foram utilizadas as enzimas especificas para a digestão de cada GAG.

Para o ácido hialurónico foi utilizada a hialuronidase (SIGMA, Ref: H3506); para o sulfato de condroitina foi utilizada a condroitinase (SIGMA, Ref: C2780); para o sulfato de dermatano foi utilizada a condroitinase B (SIGMA, Ref: C8058); para a heparina foi utilizada a heparinase I (SIGMA, Ref: H2519); para o sulfato de heparano foi utilizada a heparinase I (SIGMA, Ref: H2519); para o sulfato de queratano foi utilizada a queratanase (K2876) .

Estas enzimas foram preparadas por ressuspensão de 440 U da enzima correspondente em 10 ml do tampão que se seque: 2 ml de 100 mM de tampão de fosfato pH = 7,77, 770 μΐ de 1 M de NaCl, 1 mg de BSA e 7,2 3 ml de H20. O tampão de digestão enzimática com uma concentração de enzima de 160 U/ml foi preparado tal como se segue: foram adicionados 4,5 ml de enzima (2000 U) a 7,5 ml de tampão de digestão, 1,5 ml de 1 M de NaCl, 0,333 ml de 3 M de acetato de sódio pH = 5,2 e 5,67 ml de H20. As amostras e os padrões a ser submetidos a digestão enzimática foram preparados tal como se segue: foram adicionados 500 μΐ de tampão de digestão (80 U de enzima) a 500 μΐ de padrão para cada GAG a uma concentração de 2 mg/ml, de tal modo a que a última solução do padrão foi a uma concentração de 1 mg/ml. O mesmo foi feito com a amostra de GAG: foram adicionados 500 μΐ de tampão de digestão (80 U de enzima) a 500 μΐ da amostra de GAG.

As amostras foram digeridas a 37 °C durante 1 hora, após o que a enzima foi inativada por meio de desnaturação térmica a 60 °C durante 5 minutos.

Uma vez que foram realizadas as digestões, as amostras e os padrões foram analisados por meio de espectrometria de massa. A espectrometria de massa é uma metodologia experimental utilizada para determinar a razão de massa para carga de certos iões presentes na amostra a ser analisada. O espectrómetro de massa é composto por 3 componentes básicos: fonte de iões, analisador de massa e detetor. A amostra a ser analisada é ionizada por meio de fontes de iões, que são separados no analisador de massa e são detetados para produzir um espectro de massa, em que os valores de massa para carga são mostrados em comparação com a abundância relativa de uma espécie de ião especifico.

Especificamente, neste exemplo, a injeção das amostras no espectrómetro de massa foi levada a cabo tal como se segue: foram injetados 20 μΐ das amostras a um caudal de 0,2 ml/minuto diretamente no detetor de massa / massa (modelo Thermo LCQ). Foi usado o método de ionização por electrospray negativo (ESI/MS) e o tempo do cromatograma foi fixado em 10 minutos. Foram selecionados os iões moleculares com uma gama de ± 6 Da, que corresponde, de acordo com a literatura (Mahoney et al. , 2001), ao peso molecular das cadeias reconhecidas para cada tipo de GAG. Os iões referidos permaneceram presentes tanto na amostra de GAG padrão como na amostra a ser analisada, de modo a que a presença de cada GAG na amostra foi assim demonstrada qualitativamente. Para assegurar a reprodutibilidade dos resultados, as amostras e os padrões foram injetados em duplicado.

Para a quantificação dos diferentes GAG, foi feita uma linha padrão para o padrão para cada GAG a 1 mg/ml. A linha padrão feita consistia das seguintes concentrações de cada um dos GAG padrão (ácido hialurónico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, heparina, sulfato de heparano e sulfato de queratano) usados para fazer as linhas padrão: 750 yg/ml, 500 pg/ml, 250 yg/ml, 100 pg/ml e 0 pg/ml. As diluições da linha padrão foram realizadas com H2O e foi usada uma mistura que contém proporções iguais de tampão de digestão enzimática e H2O como o branco da linha.

Os resultados da qualificação e as proporções de cada GAG no biomaterial da invenção são os seguintes, tendo em conta que a origem do biomaterial é natural, o que implica a existência de variações na sua composição (figura 1): 70 % de ácido hialurónico 10 % de sulfato de queratano 7 % de condroitina-6-sulfato 5 % de sulfato de heparano 4 % de condroitina-4-sulfato 3 % de sulfato de dermatano 1 % de heparina

Exemplo 7. Estudo histológico para a determinação da presença de restos celulares no biomaterial 0 biomaterial da invenção contém uma combinação de GAG de uma origem natural. Esta origem natural aumenta o seu efeito regenerativo e o seu efeito na atividade celular, uma vez gue as estruturas dos GAG e as interações entre estes é semelhante à forma como são encontrados na matriz extracelular em condições fisiológicas. 0 cordão umbilical é um tipo de tecido gue possui pouca ou nenhuma imunogenicidade, de facto, os usos heterólogos das células estaminais contidas na WJ são considerados para tratamentos num certo número de trabalhos. Existem também trabalhos em gue os sistemas de artéria ou veia são desenvolvidos a partir da vasculatura do cordão umbilical, também para uso heterólogo. No entanto, para assegurar gue o biomaterial da invenção é livre de células e de restos de células, gue podem causar reações inflamatórias ou reações de rejeição de implantes, foram efetuadas colorações histológicas com hematoxilina - eosina, alcian blue e metilo verde - pironina (figura 2) .

Hematoxilina - eosina: esta é a coloração histoquímica mais utilizada a nível histopatológico. Permite observar células e componentes de células. A hematoxilina apresenta afinidade para os componentes ácidos da célula, especialmente os ácidos nucleicos, e a eosina apresenta afinidade para as áreas básicas, permitindo uma boa observação do citoplasma da célula. As preparações da amostra de GAG (figura 2 B) foram coradas e foram utilizadas como controlo positivo extensões de células (figura 2 A) . 0 processo que foi levado a cabo para realizar a coloração com hematoxilina - eosina foi o que se segue: uma amostra de GAG foi estendida sobre uma lâmina com o auxílio de uma zaragatoa estéril, e a extensão foi deixada a secar pelo menos 24 horas. Assim que as lâminas foram secas, as extensões foram fixadas com 70 % de metanol durante 5 minutos. Após este tempo, o fixador foi removido por lavagem com H20. As lâminas foram coradas com hematoxilina durante 3 minutos (PANREAC, solução de hematoxilina de DC Harris). Após este tempo, o excesso de corante foi removido por lavagem com H2O. Todas as lâminas foram passadas através de H20 com 0,5 % de HC1 para eliminar as ligações não especificas do corante. As lâminas foram lavadas com H20. As lâminas foram coradas com eosina (0,5 % em H20) durante 30 segundos. As lâminas foram lavadas com H20 para remover o excesso de eosina. Foram adicionadas à preparação várias gotas de meio de montagem Fluoromount-G (SOUTHERN BIOTECH, Ref: 0100-01), estas foram cobertas com uma lamela e foram observadas sob um microscópio.

Os resultados da coloração com hematoxilina - eosina (figura 2, imagens A e B) indicam a ausência de células na amostra de GAG analisados.

Alcian blue: o alcian blue é um dos principais corantes catiónicos (contém cargas positivas na sua molécula), que se liga a locais com cargas negativas dos polissacáridos com radicais sulfato, fosfato ou carbonato que formam parte de proteoglicanos. Estas ligações eletrostáticas dependem do pH do meio; a um pH neutro o corante liga-se a proteoglicanos com radicais neutros; a um pH ácido liga-se a proteoglicanos sulfatados; e a um pH básico liga-se a proteoglicanos de fosfato. A pH = 1, o alcian blue liga-se a proteoglicanos fracos e fortemente sulfatados, que contêm sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, sulfato de heparano e sulfato de queratano formando parte dos GAG da gelatina de Wharton. As preparações da amostra de GAG (figura 2 F) foram coradas e foram utilizadas como controlo as extensões de células (figura 2 E). O processo que foi levado a cabo para realizar a coloração com alcian blue, neste exemplo em particular, foi o que se segue:

Uma amostra de GAG foi estendida numa lâmina com a ajuda de uma zaragatoa estéril, e a extensão foi deixada a secar pelo menos 24 horas. Assim que as lâminas foram secas, as extensões foram fixadas com 70 % de metanol durante 5 minutos. Após este tempo, o fixador foi removido por lavagem com IX de PBS. As lâminas foram imersas em 0,1 N de HC1 pH = 1 durante 5 minutos. Após este tempo foram coradas com 1 % de alcian blue em 0,1 N de HC1 pH = 1 durante 2 horas. As lâminas foram imersas em 0,1 N de HC1 durante 5 minutos e foram imediatamente lavadas com H20 para remover o excesso de corante. Foram adicionados às preparações várias gotas de meio de montagem Fluoromount-G (SOUTHERN BIOTECH, Ref: 0100-01), estas foram cobertas com uma lamela e foram observadas sob um microscópio. Os resultados da coloração com alcian azul (figura 2, imagens E e F) indicam a presença de GAG na amostra analisada do biomaterial.

Metil verde - pironina: esta coloração é usada para a investigação histológica do ácido nucleico contido em tecidos, bem como para demonstrar a presença de células linfáticas e de células plasmáticas. É também útil para a identificação de células plasmáticas e ARN em secções de tecidos e preparações citológicas. A pironina cora de vermelho o citoplasma das células plasmáticas e a maior parte dos nucléolos. O metil verde cora o ADN de uma cor verde azulada (púrpura). As preparações da amostra de GAG foram coradas (figura 2 D) e foram utilizadas como controlo as extensões de células (figura 2 C). O processo que foi levado a cabo para realizar a coloração com metil verde - pironina neste exemplo em particular, foi o que se segue:

Uma amostra de cada GAG foi estendida numa lâmina com a ajuda de uma zaragatoa estéril, e a extensão foi deixada a secar pelo menos 24 horas. Assim que as lâminas foram secas, as extensões foram fixadas com 70 % de metanol durante 5 minutos. Após este tempo, o fixador foi removido por lavagem com H20. As lâminas foram imersas em 0,1 N de HC1 pH = 1 durante 5 minutos. Após este tempo foram coradas com metil verde - pironina durante 5 minutos (0,012 % de metil verde em H20, 0,01 % de pironina em H20 0,75 % de metanol) e foram imediatamente lavadas com H20 para remover o excesso de corante. Foram adicionados às preparações várias gotas de meio de montagem Fluoromount-G (SOUTHERN BIOTECH, Ref: 0100-01), estas foram cobertas com uma lamela e foram observadas sob um microscópio. Os resultados da coloração com metil verde - pironina (figura 2, imagens C e D) sugerem a ausência de ácidos nucleicos na amostra analisada de GAG.

Exemplo 8. Testes de citotoxicidade com vários tipos de células no biomaterial da invenção. 0 requisito principal para um biomaterial ser capaz de ser usado para a implantação ou como uma matriz para a engenharia de tecidos é a ausência de citotoxicidade. A fim de verificar que o biomaterial da invenção não causa efeitos tóxicos, foi determinada a citotoxicidade por meio do

método de MTT (Roche Diagnostics, EUA), validado pelo ECVAM (Centro Europeu para a Validação de Métodos Alternativos) nas células dispostas sobre o biomaterial da invenção. Os tipos de células utilizados são associados com as patologias em que o biomaterial é alvo, tais como, os queratinócitos da pele e os fibroblastos, os osteoblastos do osso, os condrócitos da cartilagem e as células estaminais mesenquimais derivadas de tecido adiposo, bem como a linha de células indicadas na norma ISO 10993 para ensaios de toxicidade L929. O ensaio MTT é baseado na capacidade das enzimas mitocondriais das células vivas para transformar certos substratos em outros metabolitos secundários. A quantidade de composto formado depende da atividade da desidrogenase mitocondrial, o que é um indicador claro do número de células viáveis existentes na cultura.

Especificamente, este teste mitocondrial, kit de proliferação celular I (MTT), n.° de catálogo 1 465 007 Roche, determina a transformação realizada pelos succinatos da desidrogenase mitocondrial da célula de sal de tetrazólio (amarelo) em cristais de formazano insolúveis (azul). As células foram subsequentemente permeabilizadas e os cristais formados são solubilizados, conduzindo a uma solução de cor que pode ser quantificada através da medição da sua absorvância num leitor de microplacas de ELISA a um comprimento de onda de 550 nm. Os resultados obtidos são apresentados na figura 4. 0 processo a ser seguido é o seguinte: 1. As células foram semeadas em placas de 96 poços com 50 μΐ de biomaterial em cada poço a uma densidade de 2.000 - 5.000 células / poço dependendo do tipo de célula. Foi previamente determinada a concentração celular adequada para cada tipo de célula. Os fibroblastos, os osteoblastos, os condrócitos e as células estaminais mesenquimais derivadas de tecido adiposo, todas a partir de uma cultura primária de origem humana, foram semeadas a uma concentração de 4.000 células por poço, a linha de fibroblastos de ratinho L929 foi semeada a uma concentração de 200 células por poço e os queratinócitos obtidos a partir da pele humana em cultura primária foram semeados a uma concentração de 5.000 células por poço. 2. A cultura foi deixada a estabilizar a 37 °C e 5 % de CO2 durante 24 horas antes de se iniciar os ensaios de citotoxicidade. Este ensaio incluiu controlos positivos (células + meio + material conhecido que induz citotoxicidade, neste caso foi usado o policloreto de polivinilo ou PVC) , controlo (células + meio de cultura normal), e células em contato com o biomaterial da invenção. 3. As células foram deixadas a incubar a 37 °C no incubador durante o período de tempo indicado no protocolo até a realização das determinações, o que, neste caso, foram às 24, 48 e 72 horas de contato. 4. Após o período de incubação terminar, foram adicionados à cultura 10 μΐ da solução de MTT (0,5 mg/ml) em cada poço, para cada 100 μΐ de meio, e incubou-se durante 4 horas a 37 °C no incubador. 5. Após a incubação terminar, puderam ser observados os cristais de formazano no interior das células. São adicionados a cada cultura ou poço 100 μΐ de solução de solubilização e é incubada a 37 °C no incubador durante a noite. As células foram então permeabilizadas e os cristais assim solubilizados com os 100 μΐ de solubilizante, tal como indicado, conduzindo a uma solução de cor prontamente quantificável. 6. Assim que os cristais foram dissolvidos, a placa de cultura é lida diretamente com um leitor de ELISA a 550 nm. Antes da leitura, é aconselhável limpar a superfície inferior da placa com etanol. Tal como pode ser observado na figura 4, o biomaterial da invenção não causou efeitos tóxicos em qualquer das linhas de células testadas, não havendo nenhuma diferença significativa no que diz respeito ao controlo.

Exemplo 9. Utilização do biomaterial da invenção na sua forma injetável para o tratamento da osteoartrite

Para a avaliação in vivo do efeito terapêutico do biomaterial da invenção na osteoartrite (OA), foi utilizado o hidrogel obtido no exemplo 3 e foi ressuspendido numa solução de soro fisiológico injetável contendo condrócitos derivados de cartilagem, alogénicos. Foram utilizados como um modelo experimental coelhos que foram submetidos a ressecção do ligamento cruzado anterior em um dos seus joelhos. Esta ressecção do ligamento foi realizada por meio de artrotomia lateral. Em seguida, com o objetivo de desestabilizar o joelho, foi esperado um período que varia de meses a semanas, sendo que durante este tempo ocorreram erosões na cartilagem semelhante à osteoartrite. Para além disso, os animais sem artrotomia no joelho foram utilizados como um grupo de controlo. A superfície articular ferida foi preparada por meio de lavagem e desbridamento por cirurgia artroscópica e os ferimentos foram cobertos com a mistura de célula / biomaterial injetável da invenção. Quatro semanas depois de depositar o biomaterial, os animais foram sacrificados e a cartilagem foi extraída. A cartilagem obtida foi fixada em 4 % de paraformaldeído para o seu processamento histológico posterior. Para obter as secções histológicas, a amostra foi incluída em parafina, para o que foi mantida durante 5 minutos em álcoois a 50, 70, 90 e 100 %. As amostras foram colocadas subsequentemente em citrosol durante 5 minutos e foram incluídas em parafina, até a obtenção de um bloco sólido. Foram obtidas secções histológicas de 5 pm utilizando um micrótomo e a coloração histológica e a imunomarcação foram realizadas utilizando estas seções .

Foram analisados diferentes marcadores da matriz extracelular da cartilagem nas secções histológicas por meio de técnicas de imunohistoquímica. As moléculas específicas da matriz extracelular da cartilagem e os marcadores moleculares estudados eram colagénio do tipo I e do tipo II, agrecano e versicano. A imunomarcação foi realizada utilizando anticorpos monoclonais. A técnica utilizada para marcar a secção de tecido foi imunomarcação direta, utilizando anticorpos monoclonais marcados com um fluorocromo. A marcação foi observada usando microscopia confocal.

Os resultados obtidos demonstraram que a combinação do biomaterial / célula induziu a regeneração da cartilagem ferida uma vez que: - 0 biomaterial injetável e o seu componente celular não causaram toxicidade uma vez implantados, ou seja, não foram observados fenómenos de inflamação ao nível macroscópico ou microscópico nas secções histológicas. - 0 biomaterial encaixava na geometria e tamanho da ferida a ser reparada e permaneceu na área do implante. - Não foram observadas alterações no fenótipo das células do tecido saudável ao lado da área do implante. - A presença de moléculas da matriz extracelular específicas para a cartilagem, tais como o colagénio do tipo II, na área do implante indicaram o início do processo regenerativo com a formação de nova matriz extracelular da mesma qualidade do tecido nativo.

Estes dados demonstram que o biomaterial da invenção, combinado com uma terapia celular, promove a regeneração do defeito condral, ao contrário dos animais de controlo que não apresentaram qualquer sinal de reparação da cartilagem.

Exemplo 10. Utilização do biomaterial tridimensional O biomaterial sólido da invenção obtido no exemplo 5 tem a maioria das caraterísticas necessárias para um penso ser eficaz na cura de uma úlcera crónica. Neste sentido, com a finalidade de avaliar o efeito terapêutico em úlceras crónicas, o estudo experimental in vivo foi realizado utilizando ratinhos albinos Swiss que foram submetidos a um desgaste térmico de cerca de 3 cm2 na região dorsal. O grupo de controlo foi composto por animais submetidos a este mesmo tipo de ferida, mas tratados com um gel comercial de ácido hialurónico.

Para a aplicação do biomaterial da invenção, a superfície da ferida induzida foi preparada por meio de lavagem, desinfeção e desbridamento cirúrgico. O biomaterial foi então aplicado à ferida por meio de injeção, onde cobriu e preencheu tanto em profundidade como superficialmente a área afetada. 15 dias após a colocação do biomaterial os animais foram sacrificados e a área da ferida foi extirpada e fixada em paraformaldeído a 4 % para o seu exame histológico posterior. Para o processamento, a amostra foi incluída em parafina, para o que foi mantida durante 5 minutos em álcoois a 50, 70, 90 e 100 %. As amostras foram subsequentemente colocadas em citrosol durante 5 minutos e foram incluídas em parafina, até a obtenção de um bloco sólido. Foram obtidas secções histológicas de 5 pm utilizando um micrótomo e a coloração histológica e a imunomarcação foram realizadas utilizando estas secções.

Foram analisados em secções histológicas por meio de técnicas de imunohistoquímica diferentes marcadores fenotípicos epidérmicos, tais como a queratina 5 e 10, marcadores de diferenciação, tais como a involucrina e a loricrina, o marcador dérmico vimentina, e componentes da matriz, tais como a laminina. A técnica utilizada para marcar a secção de tecido foi a imunomarcação direta, utilizando anticorpos monoclonais marcados com um fluorocromo. A marcação foi observada usando microscopia confocal.

Os resultados obtidos demonstraram que o biomaterial foi eficaz na regeneração da úlcera uma vez que: - 0 biomaterial aplicado na ferida foi imunologicamente inerte e não foram apresentados sinais de toxicidade. - 0 biomaterial encaixou na geometria e tamanho da ferida a ser reparada, cobrindo completamente a área afetada tanto em profundidade como superficialmente. - À medida que o processo de cura avança, o biomaterial degradou-se e foi substituído com componentes dermo-epiteliais. - As secções histológicas mostraram que o biomaterial induziu a migração e proliferação de fibroblastos e de queratinócitos, que permaneceram viáveis no seu interior. - 0 biomaterial da invenção induziu a cura da ferida, que foi duas vezes mais eficaz no que diz respeito aos animais de controlo, e, para além disso, a qualidade do novo tecido de cicatriz foi significativamente maior do que nos animais sem a aplicação do biomaterial da invenção.

Exemplo 11: Viabilidade e atividade metabólica das células de cartilagem articular e de células estaminais mesenguimais (MSC) em co-cultura na forma injetável do biomaterial da presente invenção.

Para determinar a viabilidade e a atividade metabólica foram cultivadas 2 x 10 6 células em 800 μΐ de 10 mg/ml do biomaterial da presente invenção em placas de 24 poços. Os condrócitos e as MSC foram mantidas em cultura durante 7 dias. Nos dias 3 e 7, foi realizada a coloração com corante vital de MTT, que cora as células que são metabolicamente ativas, sendo assim obtida uma medida da viabilidade celular.

Figura 6. Imagem de microscopia de luz invertida que mostra a viabilidade de células de cartilagem articular (condrócitos) e MSC coradas com MTT, em co-cultura no biomaterial da presente invenção. A coloração é tanto no dia 3 como 7. As células marcadas a preto são viáveis e metabolicamente ativas. Em resumo, com base nos resultados apresentados na figura 6, o biomaterial da presente invenção mantém a viabilidade das células em relação ao controlo na aglutinação de células testadas.

Exemplo 12: Capacidade proliferativa das células cultivadas na presente invenção em comparação com o ácido hialurónico (HA). A capacidade proliferativa das células no biomaterial da presente invenção e em HA foi realizada utilizando MTT, de acordo com a técnica descrita no exemplo 8. As células testadas incluíram: condrócitos humanos, fibroblastos L-929, fibroblastos humanos, e células estaminais mesenquimais de tecido adiposo humano (AMSC). A proliferação foi observada às 24, 48 e 72 horas de cultura. As figuras 7 e 8 ilustram ambas que a proliferação e a sobrevivência das células em cultura é significativamente mais elevada no biomaterial da presente invenção quando comparadas com o HA em concentrações semelhantes.

Exemplo 13: Afinidade e capacidade de crescimento tridimensional de células no biomaterial da presente invenção em comparação com o ácido hialurónico (HA).

Um objetivo na utilização do biomaterial da presente invenção é o de melhorar o recrutamento celular para a área da lesão a partir do tecido circundante, bem como atuar como um veículo para a aplicação de populações de células terapêuticas a uma lesão. Assim, é aparente a importância do biomaterial da presente invenção na manutenção da homeostase celular.

Para determinar a capacidade dos condrócitos para formar agregados dentro do biomaterial da presente invenção, nós cultivámos 750 k de condrócitos por poço em placas de 6 poços com 1,0 ou 2,0 mg/ml do biomaterial da presente invenção. 72 horas após o início da cultura, os condrócitos foram observados a formar aglomerados no hidrogel a 2,0 mg/ml de concentração, enquanto que não ocorreram agregações no hidrogel a 1,0 mg/ml. 96 horas após o início da cultura, os condrócitos em 2,0 mg/ml do biomaterial da presente invenção foram completamente agregados em aglomerados enquanto que os em 1,0 mg/ml do hidrogel começaram a formar aglomerados. Por outras palavras, a agregação e formação de aglomerados ocorre rapidamente na maior concentração do material da presente invenção, quando comparado com o controlo.

As células dispostas em contato com o biomaterial da presente invenção demonstram uma maior afinidade para o biomaterial da presente invenção em relação às superficies de plástico de cultura de células padrão. Elas separam-se da placa de cultura de células e migram para o biomaterial da presente invenção onde formam aglomerados viáveis. No entanto, quando se utiliza a mesma concentração de HA, como um controlo, as células demonstram uma maior afinidade para o plástico de cultura de células. Nas mesmas concentrações existem diferenças substanciais na coerência entre o biomaterial da presente invenção e o HA. O HA é menos viscoso do que o biomaterial da presente invenção. A figura 9 ilustra o efeito migratório observado no biomaterial da presente invenção quando comparado com o HA. O ensaio de vivo / morto foi utilizado para delinear células viáveis (verde) de células não viáveis (vermelho). Em conclusão, as células utilizadas nesta experiência têm uma maior afinidade para o biomaterial da presente invenção do que para o plástico de cultura de células, uma descoberta que não é repetida para o HA e o plástico.

Exemplo 14: Uma observação da funcionalidade das células cultivadas na presente invenção em relação às células cultivadas em HA.

Neste exemplo, foi determinada a expressão dos marcadores associados com a regeneração do tecido.

Para determinar a expressão de diferentes marcadores de cartilagem em MSC no biomaterial da presente invenção e controlar o HA, as células foram cultivadas em frascos T75 com 7,5 x 105 células por frasco em duas concentrações diferentes do hidrogel (0,1 e 0,5 mg/ml) e HA. Depois de quatro dias, o ARN foi extraído a partir das amostras por centrifugação das células e subsequente purificação do ARN com o mini kit de isolamento de ARN total da Agilent (Agilent technologies, EUA). Após a extração de ARN, foi sintetizado o ADNc e foi realizada a RT-PCR de acordo com protocolos padrão para a expressão do colagénio do Tipo II e do versicano. A figura 10 ilustra os resultados das análises da expressão de genes dos fatores de cartilagem colagénio II e versicano de MSC cultivadas no biomaterial da presente invenção versus um controlo de HA. O colagénio do tipo II constitui a maioria da matriz de cartilagem articular (90 %) e é um marcador da diferenciação celular no sentido do fenótipo de condrócitos. As MSC cultivadas no biomaterial da presente invenção iniciam a expressão do colagénio do tipo II após 4 dias de cultura, um fenómeno que não se observa quando são cultivadas em HA. O versicano é um componente menor na matriz extracelular da cartilagem. É considerado um marcador de desdiferenciação ou perda do fenótipo de condrócitos em células previamente semelhantes a condrócitos. À medida que as células dirigidas a condrócitos amadurecem, expressam menos versicano e, concomitantemente, aumentam a sua expressão de agrecano, sulfato de condroitina e colagénio II. As MSC no biomaterial da presente invenção em comparação com a população controlo de células em HA de concentração correspondente demonstram uma redução na expressão do gene do versicano com um aumento da expressão de colagénio II. Por conseguinte, o biomaterial da presente invenção indica uma indução da diferenciação do fenótipo de condrócitos ou a capacidade para a síntese de moléculas relacionadas com a regeneração da cartilagem articular.

Exemplo 15: Caraterização reométrica do biomaterial da presente invenção derivado de fontes humanas e de suíno.

As caraterizações mecânicas dos biomateriais são realizadas de forma rotineira a fim de fornecer informação tanto relevante como comparativa sobre estruturas de engenharia de tecidos. Com os hidrogéis, os estudos mecânicos podem fornecer informações importantes sobre a adequação de um hidrogel para injeção utilizando várias técnicas, ou o grau de conclusão de um processo químico, tais como a reticulação.

Neste exemplo, estruturas de GAG isoladas a partir da WJ tal como descrito anteriormente, foram divididas em alíquotas em três soluções (1 %, 5 %, 10 %) em 2 ml de volume respetivos, a fim de avaliar o efeito da concentração sobre os parâmetros reológicos. Foi empregue na experiência um reómetro da TA Instruments, modelo AR2000ex. Em primeiro lugar, para cada amostra, foi realizado um varrimento de estirpe a fim de confirmar que cada amostra foi testada dentro da sua gama viscoelástica linear (dados não mostrados) em estudos posteriores envolvendo o módulo de armazenamento e de perda, assim como a viscosidade.

Após a determinação da gama viscoelástica linear, foram determinados o módulo de perda, o módulo de armazenamento, e a viscosidade para cada amostra com uma frequência constante ao longo de um varrimento de temperatura fisiologicamente relevante variando de 20 °C a 50 °C. Os dados foram representados num gráfico e são apresentados nas figuras 11 - 13.

Na figura 11, os valores de humano da concentração de 10 % foram maiores do que os valores de suíno na concentração de 10 %. Os valores de humanos a 5 % excederam os de suíno a 5 %. Os resultados para as concentrações mais baixas (1 % para ambos, e 5 % para suíno) tinham uma razão mais baixa de sinal para ruído devido a qualidades internas do cone do viscosímetro. Quantitativa e qualitativamente, as amostras humanas comparadas numa base de gramas com amostras suínas apresentaram módulos maiores. Para além disso, é observada uma ligeira diminuição em módulos ao longo da mudança de temperatura testada - uma descoberta consistente com os efeitos de temperatura viscoelásticos na mudança de temperatura sob frequência de oscilação constante. Na figura 12, os resultados para os valores de humano excederam os das amostras de suíno ao longo de concentrações respetivas. Os resultados para as concentrações mais baixas (1 % para ambos, e 5 % para suíno) apresentaram uma baixa razão de sinal para ruído devido a qualidades internas do cone do viscosímetro. Tal como nos resultados do módulo de armazenamento, é observada uma ligeira diminuição esperada em módulos com a temperatura. Os valores de módulo de perda são mais elevados do que os valores do módulo de armazenamento em todos os casos respetivos, indicando assim o domínio dos efeitos viscosos sobre os efeitos elásticos. Esta é uma descoberta esperada, dado que os GAG isolados são um hidroqel não reticulado com comportamento de fluxo inerente. Os resultados do módulo de perda para três concentrações diferentes do biomaterial da presente invenção derivaram de fontes suínas e humanas. Na fiqura 13, os resultados para os valores de humanos excederam os das amostras de suíno ao lonqo de concentrações respetivas. Os resultados para as concentrações mais baixas (1 % para ambos, e 5 % para suíno) apresentaram uma baixa razão de sinal para ruído devido a qualidades internas do cone do viscosímetro. É possível uma ampla gama de viscosidades por meio da variação da concentração das amostras, embora numa base por grama, o hidrogel humano é consistentemente mais viscoso. Uma solução a 10 % do biomaterial humano da presente invenção, neste exemplo, possui uma viscosidade média semelhante à do óleo de rícino.

Em conclusão, estão disponíveis uma ampla variedade de viscosidades e módulos por simples ajustamento da concentração dos GAG extraídos.

Exemplo 16: Recrutamento celular dos tecidos circundantes (quimiotaxia). O objetivo deste ensaio foi determinar a capacidade quimiotática do biomaterial da presente invenção para as células de um tecido. Para isso, foram utilizadas amostras de cartilagem humana de dois pacientes humanos diferentes. Uma vez que a concentração de 2 mg/ml revelou-se adequada em ensaios de viabilidade e de proliferação para as MSC e os condrócitos, foi utilizada esta concentração no exemplo atual. Foram utilizadas placas não aderentes para evitar a presença de um substrato pró-fixação. O desenho experimental foi tal como se segue:

• Controlo negativo: fragmento em DMEM • Ácido hialurónico: fragmento em HA a 2 mg/ml • Material de interesse: fragmento no biomaterial da presente invenção a 2 mg/ml.

Para além disso, foi utilizada como um controlo positivo, uma placa pegajosa. 0 tecido foi cultivado em DMEM suplementado com 10 % de soro fetal bovino. As imagens foram recolhidas diariamente e são apresentadas na figura 14. Os resultados não mostram células em qualquer dos controlos ou no fragmento exposto ao HA. No entanto, no fragmento que esteve no biomaterial da presente invenção, observou-se que um grande número de células tinha migrado para a superfície exterior da cartilagem desde o ponto de tempo mais cedo. O ensaio de vivo / morto foi utilizado para determinar se as células que migram para a superfície dos fragmentos de cartilagem são ou não viáveis. Os resultados são apresentados na figura 15 e indicam que a grande maioria das células emergentes a partir dos fragmentos de cartilagem são viáveis. No entanto, não foram observadas células a migrar a partir da superfície dos fragmentos de cartilagem para o biomaterial circundante da presente invenção.

Com base neste conjunto de resultados, podemos concluir que: 1. O biomaterial da presente invenção possui a capacidade para recrutar células de cartilagem a partir do tecido nativo. 2. As células de cartilagem que são recrutadas pelo biomaterial da presente invenção são viáveis.

Uma vez que podem ser feitas várias formas de realização da invenção acima, e como podem ser feitas várias alterações nas formas de realização apresentadas anteriormente, é para ser entendido que todas as matérias aqui descritas devem ser interpretadas como ilustrativas e não num sentido limitado.

Lisboa, 28 de Outubro de 2015.

REFERÊNCIAS

Collins Μ. Ν, Birkinshaw C. 2008. "Physical properties of crosslinked hyaluronic acid hydrogels". Journal of Material Science. Materials in Medicine, 19: 3335-3343. - Coburn J. A, Pandit A. 2007. "Development of naturally-derived biomaterials and optimization of their biomechanical properties". Topics in Tissue Engineering, 3: 1-14. - Cui F. Z, Tian W. M, Hou S. P, Xu Q. Y, Lee I. S. 2006. "Hyaluronic acid hydrogel immobilized with RGD peptides for brain tissue engineering". Journal of Material Science. Materials in Medicine, 17: 1393-1401.

Danishefsky I, Bella Jr. A. 1996. "The sulfated mucopolysaccharides from human umbilical cord", J. of

Biological Chemistry, 241: 143-146. - Dawson J. I, Oreffo R. 2008. "Bringing the regeneration gap: stem cells, biomaterials, and clinical translation in bone tissue engineering". Archives of Biochemistry and Biophysics, 473: 124-131. - Elisseeff J, Ruffner M, Kim T. G, Williams C. 2005. "Cellular photoencapsulation in hydrogels". Culture of Cells for Tissue Engineering, Capitulo 9. - Goa K. L, Benfield P. 1994. "Hyaluronic acid. A review of its pharmacology and use as a surgical aid in ophthalmology, and its therapeutic potential in joint disease and wound healing." Drugs, 47: 536-566.

Gogiel T, Galewska Z, Jaworski S. 2005. "Pre-eclampsia-associated alterations in Wharton's jelly proteoglycans". Acta Biochim Pol, 52: 501-507.

Hadidian Z, Pirie N. W. 1948. "The preparation and some properties of hyaluronic acid from human umbilical cord". The Biochemical Journal, 42: 260-265.

Hiles M, Hodde J. 2006. "Tissue engineering a clinically useful extracellular matrix biomaterial". Int Urogynecol

Journal, 17: 39-43. - Ishihara M, Obara K, Ishizuka T, Fujita M, Sato M, Masuoka K,

Saito Y, Yura H, Matsui T, Hattori H, Kikuchi M, Kurita A. 2002. "Controlled release of fibroblasts growth factors and heparin from photocrosslinked chitosan hydrogels and subsequent effect on in vivo vascularization". Journal of

Biomedical Materials Research, 78: 364-371. - Jeanloz R. W, Forchielli E. 1950. "Studies on hyaluronic acid and related substances I. Preparation of hyaluronic acid and derivatives from human umbilical cord". Journal of Biological Chemistry, 186: 495-511. - Kanematsu A, Yamamoto S, Ozeki M, Noguchi T, Kanatani I, Ogawa 0, Tabata Y. 2003. "Collagenous matrices as release carriers of exogenous growth factors". Biomaterials, 25: 4513- 4520. - Laurent T. C, Fraser J. R. E. 1992. "Hyaluronan" . The FASEB Journal, 6: 2397-2404. - Longaker M, Chiu E. S, Harrison M. R, Crombleholme, Langer J. C, Duncan B. W, Adzick N. S, Verrier E. D, Stern R. 1989. "Studies in fetal wound healing" Annals of Surgery, 210: 667- 672 . - Mahoney D. J, Aplin R. T, Calabro A, Hascall V. C, Day A. J. 2001. "Novel methods for the preparation and characterization of hyaluronan oligosaccharides of defined length". Glycobiology, 11: 1025-1033. - Malkowski A, Sobolewski K, Jaworski S, Bankowski E. 2007. "FGF binding by extracellular matrix components of Wharton's jelly". Acta Biochim Pol, 54: 357-363. - Moore R. D, Schoenberg M. D. 1957. "Studies on connective tissue. I. The polysaccharides of the human umbilical cord". A. M. A. Archives of pathology, 64: 39-45. - Pieper J. S, Oosterhof A, Dijkstra P. J, Veerkamp J. H, van

Kuppeveit T. H. 1999. "Preparation and characterization of porous crosslinked collagenous matrices containing bioavailable chondroitin sulphate", Biomaterials, 20: 847-858. - Rabenstein D. L. 2002. "Heparin and heparin sulfate: structure and function". Natural products reports, 19: 312-331. - Rogers B. A, Murphy C. L, Cannon S. R, Briggs T. W. R. 2006. "Topographical variation in glycosaminoglycan content in human articular cartilage". The Journal of Bone and Joint Surgery, 88: 1670-1674.

Sobolewski K, Malkowski A, Bankowski E, Jaworski S. 2005. "Wharton's jelly as a reservoir of peptide growth factors." Placenta, 26, 747-752.

Toole B. P. 2004. "Hyaluronan: from extracellular glue to pericellular cue". Nature Cancer Reviews, 4, 528-539. - Torres D. S, Freyman T. M, Yannas I. V, Spector M. 2000. "Tendon cell contraction of collagen-GAG matrices in vitro: effect of cross-linking. Biomaterials, 21, 607-619.

Trowbridge J. M, Gallo R. 2002. "Dermatan sulfate: new functions from an old glycosaminoglycan". Glycobiology, 12: 117-125. - Ueno N, Chakrabarti B, Garg H. G. Hyaluronic acid of human skin and post-burn scar: heterogeneity in primary structure and molecular weight". 1992. Biochem Int, 26: 787-796. - Wissink M. J. B, Beernink R, Pieper J. S, Poot A. A, Engbers G. Η. M, Beugeling T, van Aken W. G, Feijen J. 2001. "Binding and release of basic fibroblast growth factor from heparinized collagen matrices", Biomaterials, 22: 2291-2299.

Claims (22)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um biomaterial sob a forma de um hidrogel injetável, que compreende um extrato de gelatina de Wharton do cordão umbilical de animal (não humano), caraterizado pelo facto de que: o referido extrato é constituído por uma mistura de glicosaminoglicanos (GAG) presente no cordão umbilical, que consiste em ácido hialurónico, sulfato de queratano, condroitina-6-sulfato, sulfato de heparano, condroitina-4-sulfato, sulfato de dermatano e heparina, e - o referido extrato é livre de membrana do cordão umbilical, vasos sanguíneos e células ou restos celulares como presentes originalmente na gelatina de Wharton.
2. 2. 0 biomaterial de acordo com a reivindicação 1, caraterizado pelo facto de compreender ácido hialurónico em 4 0 - 8 0 % da mistura total de GAG.
3. 3. O biomaterial de acordo com a reivindicação 1, caraterizado pelo facto de compreender sulfato de queratano em 2 - 25 % da mistura total de GAG.
4. 4. O biomaterial de acordo com a reivindicação 1, caraterizado pelo facto de compreender condroitina-6-sulfato em 3 - 10 % da mistura total de GAG.
5. 5. O biomaterial de acordo com a reivindicação 1, caraterizado pelo facto de compreender sulfato de heparano em 1 - 9 % da mistura total de GAG.
6. 6. O biomaterial de acordo com a reivindicação 1, caraterizado pelo facto de compreender condroitina-4-sulfato em 0,5 - 7 % da mistura total de GAG.
7. 7. O biomaterial de acordo com a reivindicação 1, caraterizado pelo facto de compreender sulfato de dermatano em 0,1 - 7 % da mistura total de GAG.
8. 8. 0 biomaterial de acordo com a reivindicação 1, caraterizado pelo facto de compreender heparina em 0,05 - 3 % da mistura total de GAG.
9. 9. Um biomaterial de acordo com a reivindicação 1, caraterizado pelo facto de conter: ácido hialurónico (70 %) , sulfato de queratano (10 %) , condroitina-6-sulfato (7 %) , sulfato de heparano (5 %) , condroitina-4-sulfato (4 %) , sulfato de dermatano (3 %) e heparina (1 %).
10. 10. O biomaterial de acordo com as reivindicações de 1 - 9, caraterizado pelo facto do hidrogel injetável ter uma viscosidade de 10 cS - 150.000 cS.
11. 11. O biomaterial de acordo com a reivindicação 10, caraterizado pelo facto de que tem uma viscosidade entre 10 e 15.000 cS.
12. 12. O biomaterial de acordo com a reivindicação 11, caraterizado pelo facto de que tem uma viscosidade entre 10 e 2.000 cS.
13. 13. O biomaterial de acordo com as reivindicações de 1 - 10, caraterizado pelo facto de que possui uma estrutura tridimensional.
14. 14. O biomaterial de acordo com a reivindicação 13, caraterizado pelo facto de que tem uma estrutura substancialmente porosa com um diâmetro de poro de 0,5 - 1000 pm.
15. 15. O biomaterial de acordo com a reivindicação 14, caraterizado pelo facto de que o diâmetro de poro é de 0,5 - 500 pm.
16. 16. O biomaterial de acordo com as reivindicações de 1 - 15, caraterizado pelo facto de compreender adicionalmente células, para além daquelas originalmente presentes na gelatina de Wharton.
17. 17. 0 biomaterial de acordo com a reivindicação 16, caraterizado pelo facto de que as referidas células são selecionadas a partir do grupo que consiste de células estaminais mesenquimais indiferenciadas ou células estaminais mesenquimais diferenciadas em outra estirpe de células e/ou células estaminais hematopoiéticas indiferenciadas ou células estaminais hematopoiéticas diferenciadas em outra estirpe de células e/ou condrócitos e/ou condroblastos e/ou osteoblastos e/ou osteócitos e/ou queratinócitos e/ou fibroblastos e/ou os miócitos e/ou adipócitos e/ou neurónios e/ou outras células do sistema nervoso e/ou células do sistema de células brancas do sangue e/ou células da córnea e/ou células endoteliais e/ou células epiteliais.
18. 18. Um biomaterial de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o biomaterial é combinado com um material de reforço para formar um compósito.
19. 19. Um processo para a obtenção do biomaterial de acordo com as reivindicações de 1 - 18, caraterizado pelo facto de compreender as etapas que se seguem: a) Obtenção de um cordão umbilical de origem animal (não humano); b) Tratamento do cordão umbilical com uma solução salina e antibióticos; c) Eliminação de todo o sangue da superfície do cordão; d) Fragmentação do cordão em secções de 1 - 2 cm; e) Limpeza de todo o sangue retido no interior; f) Eliminação das membranas e dos vasos sanguíneos do cordão umbilical; g) Separação da substância gelatinosa que compreende a gelatina de Wharton; h) Digestão enzimática da substância gelatinosa obtida; i) Precipitação e isolamento dos GAG; e ressuspensão do precipitado sólido em H20 Milli-Q para se obter um extrato aquoso constituído por uma mistura de GAG que consiste em ácido hialurónico, sulfato de queratina, condroitina-6-sulfato, sulfato de heparina, condroitina-4-sulfato e heparina, e sendo dito extrato isento da membrana do cordão umbilical, vasos sanguíneos e células ou restos celulares como presentes originalmente na gelatina de Wharton; j) Opcionalmente, reticulação dos GAG obtidos na etapa i).
20. 20. O processo para a obtenção do biomaterial obtido de acordo com a reivindicação 19, caraterizado pelo facto de que a reticulação é reticulação covalente e é levada a cabo por alterações na temperatura, reações quimicas ou fotopolimerização.
21. 21. O processo para a obtenção do biomaterial obtido de acordo com a reivindicação 20, caraterizado pelo facto de que a reticulação é iónica e é levada a cabo por modificações do grupo lateral de componentes dos GAG individuais da gelatina de Wharton.
22. 22. Biomaterial de acordo com as reivindicações de 1 a 18 para uso em remodelação, preenchimento ou reconstrução de tecidos moles, tratamento de rugas, vincos e cicatrizes, queimaduras, úlceras, aumento de tecido mole, lipoatrofia facial, doenças do disco intervertebral, reparação de cartilagem, lesões músculo-esqueléticas, osteoartrite e periartrite, tratamento de tumores, doenças vaginais, lesões cerebrais, reparação da medula, doenças neurodegenerativas, doenças cardiovasculares e processos lubrificantes, como um analgésico e anti-inflamatório; tratamento de queimaduras, úlceras e defeitos dermo-epidérmicos, tratamento de doenças oftalmológicas, tais como lesões da córnea, lesões da retina ou cataratas; reparação de cartilagem, tratamento do sistema osteoarticular, tal como no caso de defeitos osteocondrais, osteoartrite ou defeitos ósseos, e um adjuvante na resolução de doenças vaginais, tratamento de gengivite e periodontite; e utilização no desenvolvimento de sistemas de cultura de células. Lisboa, 28 de Outubro de 2015.