KR20220069283A

KR20220069283A - 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR20220069283A
Application number: KR1020200156244A
Authority: KR
Inventors: 최병현; 김영직; 윤희웅
Original assignee: 에이템즈 주식회사
Priority date: 2020-11-20
Filing date: 2020-11-20
Publication date: 2022-05-27

Abstract

본 발명은 연골조직에서 유래된 세포외 기질을 유효성분으로 하는 안구질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명은 연골조직에서 유래된 세포외 기질(ECM)을 통해 천연 연골조직의 기능적 특성을 그대로 유지할 수 있는 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

Description

연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물{Phamaceutical composition for preventing or treating of ocular disease comprising extracellular matrix derived cartilage tissue}

본 발명은 연골조직에서 유래된 세포외 기질을 유효성분으로 하는 안구질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 대한 것이다.

안구질환은 젊은층부터 노년층까지 연령을 불문하고 발생할 뿐만 아니라 단순히 눈 충혈 질환부터 안구건조증 및 노년층에서 주로 발생하는 녹내장, 백내장까지 다양한 종류가 발생한다. 이중 녹내장, 백내장은 수정체에 이상이 발생하거나 시신경에 질환이 발생하는 경우로 외과적 시술이 필요하지만 안구건조증, 눈 충혈 등은 인공눈물, 점안제 등 약물로 치료가 가능한 질환이다.

안구는 각막, 수정체, 망막, 시신경 등 다양한 조직으로 이루어지는데 이 중 각막은 안구의 유일한 투명, 무혈관 조직이고, 각막의 가장 안쪽에 위치하는 각막 내피세포는 각막의 투명도를 유지해 시력을 보존하는 중요한 역할을 수행한다.

안구질환 중에는 염증에 기인하는 여러 가지 질환이 있는데 안구에 발생하는 염증성 질환의 경우 주로 자가인식 T세포와 이를 통한 B세포의 활성화를 통해 일어나는 면역반응 작용을 중점적으로 다루고 있지만 염증성 질환도 신생혈관 생성에 의해 유지 증가되는 것이 일반적이다.

염증성 안구질환은 안구 건조증, 결막염, 각막염 등 다양한 질환이 있지만 이러한 염증성 안구질환이 일어나면 염증의 생성, 확대에 신생혈관형성이 필수적으로 동반되고 혈관 형성 억제를 통해 염증성 안구질환의 치료 및 예방도 가능하다.

염증에 기인하지 않고 안구조직에 새로운 혈관이 생성되어 발생되는 익상편은 결막의 섬유조직이 눈동자로 번지는 질환으로 신생혈관 생성이 필수적으로 동반된다.

신생혈관생성(Angiogenesis 또는 Neovascularization)은 새로운 혈관이 형성되는 것을 의미하는데 발생과정이나 상처치료와 관련하여 정상적인 신생혈관의 생성은 유도되거나 자연스러운 과정이지만 조직의 퇴화를 유도하거나 염증의 전이과정에 기여하는 경우 신생혈관의 생성을 억제하는 것이 치료에 필요하다.

세포외 기질(Extracellular Matrix : ECM)은 특정 조직에서 세포를 제외한 나머지 성분을 말하는데 세포들이 분비한 다양한 구조적 기능적 분자들의 3차원적 조합으로 이루어져 있으며 조직의 물리적 성질을 결정하고 세포의 기능을 결정하는 역할을 수행함에 따라 생체소재로서 각광을 받고 있다.

특히 연골세포에서 유래한 ECM은 신생혈관의 생성을 억제하는 효과가 있는 것으로 알려져 있으나 연골조직에서 분리된 연골세포를 단층배양을 통해 기질막으로 형성한 후 이를 탈세포화하여 제작함에 따라 천연 연골조직(Native Cartilage Tissue)의 기능적 특징이 ECM에 남아 있지 않거나 외과적 시술을 통해서 기질막 형태의 ECM을 적용함에 따라 시술이 제한적이고, 부작용으로 인해 안구질환을 치료하는데 한계가 있어왔다.

한국공개특허 제10-2015-0067519호(2015년 6월 18일 공개)

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 연골조직에서 유래된 세포외 기질(ECM)을 통해 천연 연골조직의 기능적 특성을 그대로 유지할 수 있는 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공함에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 함유한다.

또한, 상기 연골조직 유래 세포외 기질은 돼지 무릎관절에서 추출된 연골조직을 처리하여 얻은 세포외 기질인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 연골조직 유래 세포외 기질은 안구질환의 예방 또는 치료를 위해 각막에 신생혈관의 형성을 억제하는 기전을 이용하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 연골조직 유래 세포외 기질은 천연 연골 세포에 포함되는 신생혈관 형성을 억제하는 혈관형성 억제 인자를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 연골조직 유래 세포외 기질은 글리코사미노글리칸 (glycosaminoglycan), 엔도스태틴(endostatin), SPARC, chondromodulin-1 또는 Thrombospondin-1 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 연골조직 유래 세포외 기질은 연골조직에서 유래된 세포외 소포(Extracellular vesicle: EVs)를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 연골조직 유래 세포외 기질은 파우더의 형태로 제작되고, 상기 파우더에 포함되는 연골조직 사이즈의 평균이 10um 이하인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 연골조직 유래 세포외 기질은 수용액 또는 서스펜젼(suspension)의 형태로 제작되고, 상기 서스펜젼의 제타전위(zeta potential)는 ± 20~30 mV인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 연골조직 유래 세포외 기질은 연골조직을 분쇄한 후 효소를 이용하여 분쇄된 연골조직을 분해하고 분해된 연골조직을 수용액 또는 서스펜젼으로 제작한 것을 특징으로 한다.

이상과 같은 구성의 본 발명은 천연 연골조직에 포함된 신생혈관 형성을 억제하는 인자를 그대로 유지하여 신생혈관 억제기전을 이용하여 안구질환을 치료할 뿐만 아니라 예방할 수 있는 약학조성물을 제공한다.

또한, 천연 연골조직보다 고형화된 조성물의 사이즈가 작고 분산도 특성이 뛰어난 수용액 또는 서스펜젼의 형태로 제작하여 안구질환 치료에 효율적으로 적용이 가능한 약학조성물을 제공한다.

도 1은 본 발명의 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 약학조성물을 포함하는 파우더의 제조과정을 나타내는 도면이고,
도 2는 천연 연골조직과 본 발명의 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물의 물리적인 특성을 비교한 도면이고,
도 3은 천연 연골조직과 본 발명의 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물의 생화학적 특성을 비교한 도면이고,
도 4는 천연 연골조직과 본 발명의 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물의 신생혈관 억제인자를 정량화한 비교 도면이고,
도 5는 천연 연골조직과 본 발명의 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물 내 세포외소포체 (extracellular vesicles: EVs)을 물리/생화학적으로 규명하고 그 양을 정량화한 도면이고,
도 6은 HUVECs의 특성과 관련된 본 발명의 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물의 체외 효과를 나타내는 도면이고,
도 7은 HUVECs의 체외 혈관 형성 억제 특성과 관련된 본 발명의 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물의 효과를 나타내는 도면이고,
도 8은 토끼 각막 신생혈관 모델에서의 대조군, 콜라겐, 베바시주맙 및 본 발명의 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 7일간 투여한 후 체내 효과를 스코어링 한 실험 데이터이고,
도 9는 토끼 각막 신생혈관 모델에서의 대조군, 콜라겐, 베바시주맙 및 본 발명의 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 7일간 처치한 후 채취 된 각막 조직의 H&E 이미지이고,
도 10은 상기 토끼 각막조직의 혈관 생성 마커 (CD 31, VEGF) 에 대한 면역 조직 염색 이미지이다.

이하에서 도면을 참조하여 본 발명에 따른 에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 연골세포에서 유래한 세포외 기질(Extracellular matrix: ECM)이 체외 세포배양과정에 따라, 제조된 세포유래 ECM 마다 조성에 차이가 있거나, 실제 연골 조직 유래 세포외 기질의 생화학적 조성을 반영하지 못하거나, 제조비용과 수율이 제한적이며, 또한 세포유래 ECM이 기질막 형태 등으로만 제조됨에 따라 제조된 ECM이 외과적 시술을 필수적으로 하는 단점을 극복하기 위해 연골조직에서 유래된 ECM을 유효성분으로 하여 기질막의 형태가 아닌 수화 파우더의 형태로 제조하여 외과적 시술이 아닌 최소 침습적 시술 또는 적절한 용매를 추가하여 서스펜젼(suspension)의 형태로 제작하여 다양한 안구질환을 효율적으로 예방하거나 치료할 수 있는 약학조성물에 대한 것이다. 본 발명의 약학조성물은 연골조직의 생화학적 특징 및 분자를 그대로 유지함에 따라 안구질환의 치료에 탁월한 효과를 확인하였다.

본 발명은 연골조직에서 유래된 세포외 기질을 유효성분으로 하는 약학조성물을 제공하는데, 본 발명에서 “연골조직(Cartilaginous tissue)”은 연골세포(chondrocyte)와 그에 따라 생산된 연골기질(cartilage matrix)로 된 섬유성 결합조직의 일종으로 주로 척추동물에서 잘 발달한 조직을 의미한다.

이하에서 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 연골조직 유래 연골 무세포 기질(Cartilage acellular matrix) 파우더의 제조

도 1은 본 발명의 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 약학조성물을 포함하는 파우더의 제조과정을 나타내는 도면으로 연골조직을 탈세포화(decellularization)하여 연골 무세포 기질(Cartilage acellular matrix: CAM)을 제조한 후 효소처리(Enzymatic digestion)를 하여 본 발명의 약학조성물이 포함된 dg-CAM 파우더를 얻는다.

연골조직은 PBS(Phosphate-buffered saline)으로 세척한 후 동결건조기 Bondiro(Ilshinlab, Daejeon, Korea)를 이용하여 영하 80℃에서 72시간동안 동결건조 시킨다. 동결건조된 연골조직을 동결분쇄기(6870; SPEX, Metuchen, NJ, USA)를 이용하여 분쇄한다. 이처럼 본 발명의 약학조성물은 연골조직에서 유래하기 때문에 종래 연골세포 유래 ECM과 달리 세포 배양 단계를 거치지 않고 soluble한 약학조성물로 제조가 가능한 장점이 있다.

탈세포화를 위해서 분쇄된 연골조직 파우더를 저장성 버퍼(10 mM

Tris?HCl, pH 8.0)에서 4시간동안 배양하고 상온에서 0.1% 황산도데실나트륨(sodium dodecyl sulfate)이 함유된 TBS(Tris-buffered saline)로 2시간동안 교반시킨다. 교반 후 4℃에서 10분간 10,000g로 원심분리를 통해 연골조직 파우더를 추출한 후 초순수(deionized water)로 5번 세척하고 37℃에서 12시간 동안 100 U/ml DNase(Elpis Biotech, Daejeon, Korea)과 함께 배양한다. 2번 세척 후 탈세포화된 파우더는 불수용성 CAM 파우더를 얻기 위해 다시 동결, 분쇄한다. 효소 분해(Enzymatic digestion)는 10 mg/ml의 최종 농도에서 0.1%(w/v) 펩신을 함유하는 0.1 M HCl로 이루어진다. CAM 서스펜젼(suspension)은 pH 7.4의 1 M NaOH로 중화시킨 후 상온에서 48시간 동안 교반시킨다. 분해된 CAM을 이후 투석막(Spectra/por7, 2000 Da; Spectrum Laboratories, CA, USA)을 통해 12시간 동안 초순수로 투석시킨다. 최종 dg-CAM 파우더를 제조하기 위해 CAM 서스펜젼을 72시간 동안 동결 건조시킨다. dg-CAM 파우더는 산화에틸렌 가스(Deltamedical, Gyeonggi-do, Korea)로 최종 살균하고 영하 80℃에서 보관한다. dg-CAM 서스펜젼을 만들기 위해서 PBS, 세포배양배지(cell culture medium) 또는 식염수와 같은 생리적 용매 (Physiological solution)를 혼합하여 원하는 농도로 제조한다.

<실시예 2> dg-CAM 파우더의 물리적 특성

도 2는 천연 연골조직과 본 발명의 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물의 물리적인 특성을 비교한 도면이다.

dg-CAM 파우더의 물리적 특성은 천연 연골조직(Native cartilage tissue: NCT)과 비교하였다. 각 ECM 파우더의 모폴로지(morphology)는 SEM(JSM-6700F; JEOL, Tokyo, Japan)으로 분석하였고, PBS 내의 ECM 파우더는 광학현미경(E600; Nikon, Tokyo, Japan)으로 얻었다. dg-CAM 파우더의 입자 크기 및 제타 전위는 1 mg/ml의 농도로 PBS에 분산시킨 후 ELSZ-2000(Otsuka Electronics, Osaka, Japan)를 이용하여 측정하였다. dg-CAM 파우더의 습윤성은 광학 접촉각 측정기(Phoenix 150; Surface Electro Optics, Suwon, Korea)를 이용하여 상온에서 sessile drop 방법을 통해 측정하였다. dg-CAM 파우더 내의 용해성 단백질(soluble proteins)의 양은 상온에서 100 ml PBS와 dg-CAM 파우더를 0.1% (w/v)로 혼합한 후 500 rpm으로 1시간동안 교반한 서스펜젼을 10,000 rcf에서 원심분리한 후 상층액의 단백질 농도를 Bradford 분석법을 통해 측정하였다. dg-CAM 서스펜젼의 분산 안정성(dispersion stability) 시간에 따른 서스펜젼의 혼탁도로 측정하였다. dg-CAM 서스펜젼의 복소점도(Complex viscosity)는 PBS로 5, 10, 20 and 40 mg/ml를 점도계(DV-III, Brookfield, MA, USA)를 이용하여 측정하였다.

dg-CAM 파우더와 NCT는 도 2A에 도시된 것과 같이 다양한 크기와 불규칙한 형상을 나타내지만 dg-CAM 파우더는 사이즈가 좀 더 작고 덩어리진 형상을 나타낸다. 또한, 도 2A 하단에 도시된 것과 같이 PBS에 혼합된 서스펜젼도 유사하게 NCT는 비교적 비균질하고 큰 섬유 파편의 형상을 나타내는 반면 dg-CAM 서스펜젼은 균질한 입자 사이즈를 보이며 주로 바늘 모양의 파티클로 형성된다.

도 2B에 도시된 것과 같이 NCT의 입자크기는 30~100 um에 분포하는 반면 dg-CAM 파우더는 5~50 um에 분포하여 NCT에 비해 입자크기가 작다는 것을 알 수 있다. 표면전위(Surface charge)는 콜로이드 입자의 친수성과 분산 안정성을 판단하는데 중요한 파라미터인데 도 2C에 도시된 것과 같이 dg-CAM 파우더가 NCT에 비해 훨씬 낮은 제타전위를 나타낸다. 도 2D는 친수성을 평가하기 위한 접촉각을 나타내는 그래프인데 dg-CAM 파우더가 NCT에 비해 훨씬 낮은 접촉각으로 친수성이 훨씬 우수하다는 것을 알 수 있다. 또한, 도 2E에 도시된 것과 같이 dg-CAM 파우더에 수용성 단백질이 NCT에 비해 많이 함유되어 있음을 알 수 있다. 따라서 도 2F에 도시된 것과 같이 이 NCT 서스펜젼이 dg-CAM 서스펜젼에 비해 시간의 경과에 따라 많이 침전됨을 알 수 있다. 도 2G에 도시된 것과 같이 분산안정성이 NCT에 비해 dg-CAM 파우더가 훨씬 우수하다는 것을 알 수 있다. 복소점도는 수용성 분자의 액체역학작용(hydrodynamic action)에 영향을 미치는데 도 2H에 도시된 것과 같이 농도가 증가할수록 dg-CAM 내 수용성 단백질의 용출로 인하여 복소점도가 증가하지만 NCT의 복소점도는 유의적인 차이를 보이지 않았다.

<실시예 3> dg-CAM 파우더의 생화학적 특성

도 3, 4, 5는 dg-CAM 파우더의 생화학적 특성을 나타내기 위한 그래프이다.

NCT와 dg-CAM 파우더에 함유된 단백질을 비교하기 위해 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기영동법(Sodium dodecyl sulfate?polyacrylamide gel electrophoresis: SDS-PAGE)을 이용하여 밴드패턴을 비교하였다.

NCT와 dg-CAM 파우더의 유기분자 조성을 평가하기 위해 FTIR(Nicolet iS50; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 이용하여 평가하였다.

탈세포화를 평가하기 위해 Quant-iT PicoGreen assay kit(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)과 microplate reader(Tecan)를 이용하였다. sGAG 함유량은 Blyscan sulfated glycosaminoglycan assay kit (B1000, Biocolor, Carrickfergus, UK)로, 콜라겐의 함유량은 Sircol soluble collagen assay kit (S1000, Biocolor)로 측정하였다.

도 3A는 각 파우더에 포함된 단백질을 대비하기 위한 그래프로 NCT와 dg-CAM 파우더는 거의 동일한 패턴을 나타내고 있어 NCT의 단백질이 dg-CAM 파우더에서도 그대로 유지됨을 알 수 있다. 또한, 도 3B의 FTIR 스팩트럼도 NCT와 dg-CAM 파우더의 유기분자가 유사함을 알 수 있다. 즉, 도 3A, 3B를 통해 분쇄, 탈세포화, 효소분해를 통해 제조된 dg-CAM 파우더는 NCT와 거의 동일한 생화학적 특성을 유지하고 있음을 알 수 있다. 도 3C를 통해 dg-CAM 파우더의 탈세포화가 잘 이루어졌음을 알 수 있고, 도 3D, 3E를 통해 dg-CAM 파우더에 콜라겐과 sGAG가 NCT와 거의 동일하게 함유되어 있음을 알 수 있다.

연골조직 ECM에는 항신생혈관생성 인자인 엔도스타틴, SPARC 및 TSP-1이 포함되어 있다고 알려져 있다. 도 4A에는 dg-CAM 파우더에 포함된 항신생혈관생성 인자가 NCT 파우더의 그것과 거의 유사하다는 것을 나타내고 있고, 도 4B, 4C, 4D는 dg-CAM 파우더에 포함된 항신생혈관생성 인자의 양이 NCT 파우더와 별 차이가 없음을 나타내고 있다.

도 5에는 NCT의 세포외 소포(EVs)가 dg-CAM 파우더에 거의 동일한 수준으로 함유되어 있음을 나타내는 도면으로 도 5A와 5B를 통해 dg-CAM 파우더에 포함된 EVs가 전형적인 EVs의 물리적 특성인 원형의 형태와 200~800nm의 크기 범위인 것을 알 수 있고, 도 5C는 dg-CAM 파우더에 포함된 EVs의 생물학적 특성을 확인하기 위하여 엑소좀 표면 마커로 알려져 있는 CD81, CD63, CD9를 포함하는 테트라스폰딘(tetraspondin) 계열 표면 단백질 마커를 웨스턴 블롯을 통하여 확인하였을 때 MSCs-EVs와 dg-CAM 파우더의 EVs가 동일한 표면 단백질 마커를 가지고 있다는 것을 나타낸 것이고, 도 5D는 dg-CAM으로부터 유래된 EVs의 세포 내재화 특성을 확인하기 위해 Calcein AM으로 루미날 라벨링한 후 EVs가 세포의 핵 주변으로 내재화되었음을 확인 하였고, 도 5E를 통해 dg-CAM 파우더와 NCT 파우더 사이의 EVs의 함유량에 별 차이가 없음을 알 수 있다. 종합적으로, dg-CAM 유래 EVs는 형태, 크기, 생물학적 표면 단백질 마커, 세포 내재화 등의 분석에서 전형적인 세포유래 EVs의 물리/화학/생물학적 특성을 나타내었고, 탈세포 및 효소처리 공정과정이후에도 dg-CAM 내에 잘 유지되어 있음을 확인하였다.

<실시예 4> 세포 생존율, 증식률, 부착능 및 이동성 분석

도 6은 혈관내피세포 (HUVECs)에서 세포의 생존율, 증식률, 부착능 및 이동성을 분석한 그래프로 혈관내피세포에 대한 dg-CAM 서스펜젼의 세포활성 억제효과를 나타내는 도면이다.

도 6을 참조하면 HUVECs에 다양한 농도의 dg-CAM 서스펜젼을 24시간 처리하여 WST assay를 통해 세포생존율을 확인한 결과 도 6A에서와 같이 0.3 에서 10 mg/ml 농도의 dg-CAM은 HUVECs 및 연골세포(chondrocytes) 모두에서 70% 이상의 세포생존율을 보임으로서 세포독성이 없는 것을 알 수 있다. 도 6B는 HUVECs 및 연골세포의 각각 DAY 1, 4, 7의 WST 측정결과로 대조군은 HUVECs 및 연골세포 모두에서 세포 증식이 시간에 따라 증가하였고, 콜라겐 처리 대조군도 마찬가지였으나 dg-CAM 파우더는 HUVECs 특이적으로 세포 증식이 억제되었음을 확인할 수 있었고 연골세포에서는 대조군과 차이가 없었다. 도 6C는 세포의 이동효과를 확인하기 위한 보이든 챔버 분석의 결과인데 dg-CAM 파우더는 화학 유인 물질로 작용하는 FBS가 포함된 배지에도 불구하고 대조군 배지에 비해 약 10% HUVECs의 이동을 저하시켰음을 확인할 수 있었다. 도 6D는 세포 부착효과를 분석한 그래프로 dg-CAM과 콜라겐 서스펜젼의 부착효과를 확인하기 위해 세포 시딩(seeding) 4시간 후 Calcein AM으로 염색 후 측정한 결과 HUVECs에서는 유의미하게 부착도가 감소한 반면 연골세포에서의 부착도는 향상된 것을 알 수 있다.

<실시예 5> HUVECs에서 dg-CAM 파우더의 체외 혈관 생성 억제효과 분석

도 7은 HUVECs에서 dg-CAM 파우더의 혈관 생성 억제효과를 나타내기 위한 그래프로 dg-CAM 파우더는 베바시주맙(bevacizumab)과 유사한 정도의 혈관 생성 억제효과를 보였고, 대조군과 콜라겐 파우더 대비 유의미한 혈관 생성 억제효과를 나타내었다.

<실시예 6> dg-CAM 파우더의 토끼 각막 신생혈관 모델에서 인비보(in vivo) 혈관 침투 억제 효과 분석

도 8, 9, 10은 dg-CAM 파우더의 혈관 생성 억제효과를 나타내기 위한 이미지와 그래프이다.

도 8A는 봉합상처(suture injury) 부위에서 대조군 (식염수) 및 콜라겐 서스펜젼으로 처치된 그룹에 비해 dg-CAM 서스펜젼과 베바시주맙으로 처치된 그룹에서 혈관 생성이 유의미하게 억제된 것을 나타내는 이미지이고, 도 8B는 혈관의 길이, 영역, 개수의 정량분석결과에서 dg-CAM 서스펜젼과 베바시주맙이 처치된 그룹이 대조군 및 콜라겐이 처치된 그룹에 비해 현저히 감소된 것을 확인할 수 있다.

도 9는 각막 손상 부위로의 혈관 침투의 정도를 H&E 염색을 통해 나타낸 이미지와 그래프로 각막 상피에 대조군 및 콜라겐 서스펜젼 처치 그룹에 비해 dg-CAM 서스펜젼과 베바시주맙으로 처치된 그룹이 신생 혈관 생성이 현저하게 억제됨을 확인할 수 있다.

도 10은 각 그룹의 국소 처리 후 각막조직에서 대표적인 혈관신생 마커인 CD31과 VEGF의 발현을 면역 염색을 통하여 분석한 결과 두 개의 혈관 신생 마커는 대조군 및 콜라겐 처치그룹에 비해 dg-CAM 서스펜젼과 베바시주맙 처리된 그룹에서 현저하게 감소된 발현신호를 보이는 것을 확인할 수 있다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims

연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 함유하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에서,
상기 연골조직 유래 세포외 기질은 돼지 무릎관절에서 추출된 연골조직을 처리하여 얻은 세포외 기질인 것을 특징으로 하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에서,
상기 연골조직 유래 세포외 기질은 안구질환의 예방 또는 치료를 위해 각막에 신생혈관의 형성을 억제하는 기전을 이용하는 것을 특징으로 하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에서,
상기 연골조직 유래 세포외 기질은 천연 연골 조직 세포외 기질에 포함되는 신생혈관 형성을 억제하는 혈관형성 억제 인자를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 4에서,
상기 연골조직 유래 세포외 기질은 GAG, 엔도스태틴(endostatin), SPARC, chondromodulin-1 또는 TSP-1 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 4에서,
상기 연골조직 유래 세포외 기질은 연골조직에서 유래된 세포외 소포(Extracellular vesicle: EVs)를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에서,
상기 연골조직 유래 세포외 기질은 파우더의 형태로 제작되고,
상기 파우더에 포함되는 연골조직 사이즈의 평균이 10um 이하인 것을 특징으로 하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에서,
상기 연골조직 유래 세포외 기질은 수용액 또는 서스펜젼(suspension)의 형태로 제작되고,
상기 서스펜젼의 제타전위(zeta potential)는 ± 20~30 mV인 것을 특징으로 하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에서,
상기 연골조직 유래 세포외 기질은 연골조직을 분쇄한 후 효소를 이용하여 분쇄된 연골조직을 분해하고 분해된 연골조직을 수용액 또는 서스펜젼으로 제작한 것을 특징으로 하는 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물.