CN112138212A - 活性细胞外基质、含有活性细胞外基质的组合物、3d组织修复支架及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了活性细胞外基质、含有活性细胞外基质的组合物、3D组织修复支架及制备方法和应用，所述方法通过在细胞内预先导入表达活性因子的基因片段并进行体外细胞培养获得含有活性因子的细胞外基质，因而保证了细胞来源的可靠性，同时赋予细胞外基质产品质量的稳定性和可修饰性或可加工性。所述方法通过在3D打印的多孔支架上进行干细胞培养与定向分化，制备具有促进损伤修复的仿生支架，建立基于干细胞结合定向分化的材料设计原理及干细胞分化技术，开拓干细胞与材料结合在原位组织工程修复应用的新领域。本发明所述方法对仿生支架做进一步优化，实现植入后对细胞诱导吸附，生长与分化，实现组织(骨、软骨、皮肤、心肌和血管)再生。

Description

活性细胞外基质、含有活性细胞外基质的组合物、3D组织修复 支架及制备方法和应用

技术领域

本发明属于组织工程学技术领域，涉及一种体外细胞培养制备细胞外基质的方法，及以细胞外基质为核心组分制备获得相关植入物，具体为活性细胞外基质、含有活性细胞外基质的组合物、3D组织修复支架及制备方法和应用。

背景技术

器官/组织的损伤是医学中最难解决和代价最高的问题之一。由于疾病、创伤或先天性问题，对组织和器官的修复有大量和迫切的需求。每年有多达数千万患者因为创伤，退行性病变和烧伤等导致各种器官和组织相关疾病，包括皮肤、骨、软骨、神经、心脏和肾脏等损伤。每年需进行数百万次手术来治疗这些病患，治疗费用巨大，且呈继续增加的趋势。干细胞和组织工程的发展使得构建用于移植的功能组织和器官成为可能，已成为再生医学中最有希望的疗法之一。

采用人胚胎干细胞或成体干细胞用于组织和器官的修复已取得了许多重要进展。但这些干细胞的来源、伦理学问题以及其在宿主体内的归宿和致瘤性仍是有待解决的问题。

组织和器官的修复方法有两种。一种是将干细胞在体外培养分化成待修复或替代的组织或器官，然后移植到患者体内。这一方法对一些功能和结构相对简单和体积较小的病变组织有一定效果，例如皮肤，骨骼等。但是对体积较大、功能和结构复杂的组织和器官还有很大的难度。如体外培养大段骨，心脏，肝和肾等。

另一种方法是将干细胞注入到病变组织部位，使注入的干细胞或体内的干细胞归巢到病变部位进行组织修复。这一方法也取得了一定的进展，例如，利用干细胞注射治疗心衰、骨不连和眼睛黄斑变性等。采用自体干细胞注射尽管避免了免疫排斥问题，但会牵涉到干细胞的数量和来源问题。如果需要体外扩增，则会牵涉到干细胞的质量、扩增时间和治疗周期等问题。如采用异体干细胞，则会遇到免疫排斥以及其在宿主体内的归宿和致瘤性等问题。

采用生物因子来诱导体内干细胞归巢来进行组织修复则会遇到生物因子的种类、数量、剂量以及协同效应的问题。

许多在临床上已经成功应用的同种异体甚至是异种细胞外基质(ECM)在人体内都显示出具有招募宿主细胞并引导宿主细胞分化和修复受损组织的能力。这些ECM包括人羊膜，猪小肠粘膜下层(SIS)、脱细胞的人真皮

和猪膀胱ECM等。他们的优异生物活性来自其生化组成和天然微观结构。已知这些ECM在被加工和脱细胞后仍有许多细胞外基质组分(如胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白等)和许多其它活性因子，包括生长因子VEGF、bFGF、EGF、TGF-β、KGF、HGF和PDGF等。这些因子还有多种同种亚型，每种具有不同的特殊生物活性。因此，使用脱细胞ECM作为一种组织修复材料具有特别的优势，其含有的结构组分和生长因子(及生长因子抑制剂)都具有与体内相关的种类和数量比例，此外，ECM中融合各种成分的天然的三维结构也很可能起到了重要的作用。

然而，这些同种异体或异种组织ECM是从人尸体或动物组织/器官获取的。由于供体来源的质量变化难以控制，这类ECM存在质量变异性大的缺点和疾病传播的风险。此外，ECM的可加工性是一个严重的问题。组织来源的ECM缺乏加工能力，它们不能被加工成所需的形状、尺寸和孔隙率并不丧失其整体结构的完整性。

另外，尽管细胞外基质本身含有一些活性因子，但作为组织修复材料其含量还不够。因此，针对特定的组织修复，如骨修复，软骨修复等，还需要使得ECM中的相关活性因子如BMP或TGF-β的含量更高。因此，采用能够过表达某些活性因子的细胞来进行培养并产生富含这些活性因子的ECM很有必要。

发明内容

解决的技术问题：本发明解决的技术问题之一是提供一种细胞来源容易，在体外能够大量扩增，并通过基因工程改造和体外培养获得富含活性因子的细胞外基质，从而获得同种异体组织的细胞外基质以用于组织修复。

本发明解决的技术问题之二是提供一种体外多种细胞共培养的方式获得更为复杂的混合型细胞外基质，从而用于修复更为复杂的组织样结构。

本发明解决的技术问题之三是提供上述细胞外基质与治疗剂联合使用的组合物。

本发明解决的技术问题之四是提供一种含有上述细胞外基质的植入物，该植入物具有特定的形状和孔隙率，可以是3D打印出的多孔支架，经体外培养定向分化后获得带有活性细胞外基质涂层的3D组织修复构建。

本发明解决的技术问题之五是对上述含有细胞外基质的3D组织修复支架进行优化，包括对3D多孔支架表面进行预处理，以达到提高支架表面细胞粘附力、赋予支架多样化功能的目的。

本发明解决的技术问题之六是提供一种上述含有细胞外基质的3D组织修复支架与织物的联合使用方式。

本发明解决的技术问题之七是提供上述活性细胞外基质的3D组织修复支架在狭窄的血管区域中应用的方案。

技术方案：活性细胞外基质的制备方法，所述方法采用基因修饰的方法在细胞中引入表达活性因子的基因片段，通过体外培养的方式使其分泌细胞外基质和活性因子，然后脱除细胞得到富含活性因子的细胞外基质；其中，细胞为人源细胞或其他哺乳动物细胞中的至少一种。优选的，细胞为人间充质干细胞、人源iPS干细胞、其他哺乳动物的干细胞中的至少一种。采用Tet-on表达调控系统与CRISPR/Cas9系统联合应用的方法，在细胞培养过程中将活性因子的基因片段导入到干细胞，在体外进行干细胞扩增，而在干细胞定向分化阶段条件性过表达特定细胞生长因子，促进干细胞的定向分化和细胞因子的表达，从而获得具有高生物活性的组织修复ECM。

进一步的，通过选取上述多种细胞共培养的方式生产更为复杂的组织样结构。

其中，在细胞内引入表达活性因子的基因片段的具体方法为：体外构建条件性过表达特定活性因子的基因载体，通过基因载体将目的基因序列导入细胞，进行细胞的体外大量扩增。在培养过程中需要进行细胞分化时或需要细胞开始分泌活性因子时，可以通过加入四环素(Tet)或阿霉素(Dox)，来诱导活性因子的过表达，使得细胞培养产生的ECM中富含这种活性因子，一方面可以促进细胞的选择性分化，另一方面可以使细胞培养分化产生的ECM中富含活性因子。

进一步的，所述基因载体为质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、非病毒载体或微环DNA载体。

进一步的，细胞体外培养的方法包括静态细胞培养和动态细胞培养方法。静态细胞培养器材包括细胞培养板，细胞培养瓶和细胞工厂。动态细胞培养设备包括生物反应器等能够使培养液流动的设备。也可以是上述培养方法的组合。

优选的，活性因子为骨形成蛋白(BMP)、转化生长因子β(TGF-β)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、神经营养因子(NT)，血小板衍生生长因子(PDGF)、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、氯化筒箭毒碱、生长分化因子9(GDF9)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF或FGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF-2)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)中的至少一种。

由以上方法制备获得的活性细胞外基质。

含有所述活性细胞外基质的组合物，所述组合物还包括治疗剂。采用赛默飞的细胞因子ELISA试剂盒检测活性外基质的组合物细胞因子的浓度范围在1pg/mL-2000μg/mL。

优选的，所述治疗剂包括如下，但不限于此：抗生素，激素类，生长因子，抗癌抗菌素，杀菌剂，抗病毒剂，疼痛药物，抗组织胺药，抗炎药，抗感染药，伤口愈合剂，抗增生药，伤口缝合药，细胞诱导剂，细胞活素类以及诸如此类。应用于治疗细胞，有利于人体健康的试剂都叫做治疗剂。

进一步的，与活性细胞外基质联合使用的有抗生素，抗生素是一种化学治疗性试剂，它能抑制或消除微生物生长，例如细菌，真菌或原生动物。常用抗生素有青霉素或链霉素；其他抗生素有氨基羟丁基卡那霉素A，妥布霉素，奈替米星，庆大霉素，卡那霉素，新霉素，巴龙霉素，格尔德霉素，除莠霉素，氯碳头孢，厄他培南，多尼培南，亚胺培南/西司他丁，美罗培南，头孢羟氨苄，头孢唑啉，头孢噻吩或头孢噻吩，头孢氨苄，头孢克洛，头孢孟多，头孢西丁，头孢丙烯，头孢呋辛，头孢克肟，头孢地尼，头孢妥仑，头孢哌酮，头孢噻肟，头孢泊肟，头孢他啶，头孢布烯，头孢唑肟，头孢曲松，头孢地尼，头孢吡肟，替考拉宁，万古霉素，阿奇霉素，克拉霉素，地红霉素，红霉素，罗红霉素，醋竹桃霉素，泰利霉素，大观霉素，氨曲南，阿莫西林，氨苄西林，阿洛西林，氟氯西林，羧苄青霉素，邻氯青霉素，双氯青霉素，美洛西林，萘夫西林，哌拉西林，替卡西林，杆菌肽，多粘菌素，多粘菌素B，环丙沙星，依诺沙星，加替沙星，左氧氟沙星，洛美沙星，莫西沙星，诺氟沙星，氧氟沙星，诺氟沙星，磺胺米隆，百浪多息，磺胺醋酰，磺胺甲二唑，磺胺，柳氮磺胺吡啶，磺胺异恶唑，甲氧苄啶，复方新诺明，地美环素，多西环素，米诺环素，土霉素，四环素，胂凡纳明，氯霉素，克林霉素，林可霉素，乙胺丁醇，磷霉素，夫西地酸，痢特灵，异烟肼，利奈唑，甲硝唑，莫匹罗星，呋喃妥因，平板霉素，吡嗪酰胺，奎奴普丁/达福普汀，利福平或利福霉素和替硝唑。

进一步的，与活性细胞外基质联合使用的有激素类药物，激素类是一种化学载体，它能通过血液从一个细胞(或一组群细胞)传递到另一个(或另一组群)。包括褪黑激素，5-羟色胺，甲状腺素，三碘甲腺原氨酸，肾上腺素，去甲肾上腺素，多巴胺，抗疟激素，脂联素，促肾上腺皮质激素，血管紧张素原和血管紧张素，抗利尿激素，心房利钠肽，降钙素，缩胆囊素，促肾上腺皮质激素释放激素，促红细胞生成素，卵泡刺激素，胃泌素，生长素释放肽，胰高血糖素，促性腺激素释放激素，生长激素释放激素，人绒毛膜促性腺激素，人胎盘催乳激素，生长激素，抑制素，胰岛素，胰岛素样生长因子，瘦素，促黄体生成激素，黑素细胞刺激素，催产素，甲状旁腺激素，催乳激素，胰泌素，促生长素抑制素，血小板生成素，促甲状腺激素，促甲状腺激素释放激素，皮质醇，醛固酮，睾丸酮，脱氢表雄酮，雄烯二酮，双氢睾酮，雌二醇，雌酮，雌三醇，孕酮，骨化三醇，骨化二醇，前列腺素，白三烯，前列腺素，血栓素，催乳素释放激素，促脂解素，脑钠肽，神经肽Y，组胺，内皮素，胰多肽，肾素和脑啡肽。

进一步的，与活性细胞外基质联合使用的有抗癌抗菌素，抗癌抗菌素或抗肿瘤药是一种能抑制或阻止肿瘤生长的药物。包括放线菌素(例如，放线菌素-D)，蒽环类抗生素(例如，阿霉素，柔红霉素，表柔比星)，博来霉素，普卡霉素，紫杉醇和丝裂霉素。

进一步的，与活性细胞外基质联合使用的有抗真菌剂，抗真菌剂是一种治疗真菌感染的药物。包括纳他霉素，龟裂杀菌素，菲律宾菌素，制霉菌素，两性霉素B，咪康唑，酮康唑，克霉唑，益康唑，联苯苄唑，布康唑，芬替康唑，异康唑，奥昔康唑，舍他康唑，硫康唑，噻康唑，氟康唑，伊曲康唑，艾沙康唑，雷夫康唑，泊沙康唑，伏立康唑，特康唑，特比萘芬，阿莫罗芬，萘替芬，布替萘芬，阿尼芬净，卡泊芬净，米卡芬净，苯甲酸，环吡酮，氟胞嘧啶，灰黄霉素，龙胆紫，卤普罗近，托萘酯，十一烯酸，茶树精油，香茅油，柠檬草，橙油，玫瑰油，广藿香，柠檬香桃木，楝树种子油，椰子油，锌和硒。

进一步的，与活性细胞外基质联合使用的有抗病毒剂，抗病毒剂是一系列用于治疗病毒感染的药物。包括阿巴卡韦，无环鸟苷，无环鸟苷，阿德福韦酯，金刚烷胺，安普那韦，阿比朵尔，阿扎那韦，阿托伐他汀钙，溴夫定，西多福韦，双汰芝，瑞拉韦，地拉韦定，去羟肌苷，二十二烷醇，依度尿苷，依非韦伦，恩曲他滨，恩夫韦肽，恩替卡韦，进入抑制剂(融合抑制剂)，泛昔洛韦，福米韦生，福沙那韦，茚地那韦，膦甲酸，膦乙醇钠，更昔洛韦，加德西(宫颈癌疫苗)，伊巴他滨，异丙酯肌苷片，碘苷，咪喹莫特，茚地那韦，肌苷，整合酶抑制剂，干扰素III型干扰素II型，I型干扰素，拉米夫定，洛匹那韦，洛韦胺，MK-0518(雷特格韦)，马拉维若，吗啉胍，奈非那韦，奈韦拉平，多吉美，核苷类似物，奥司他韦，喷昔洛韦，帕拉米韦，普来可那立，鬼臼毒素，蛋白酶抑制剂(药理学)，逆转录酶抑制剂，利巴韦林，金刚乙胺，利托那韦，沙奎那韦，司他夫定，协同增强(ART)，替诺福韦，替诺福韦，替拉那韦，氟尿苷，三协维，醋胺金刚烷，替诺福韦，伐昔洛韦，缬更昔洛韦，Vicriviroc(抗艾滋病药)，阿糖腺苷，Viramidine(慢性丙肝治疗新药)，扎西他滨，扎那米韦，和齐多夫定。

进一步的，与活性细胞外基质联合使用的有疼痛药物或镇痛剂(俗称止痛药)，是用于缓解疼痛的多种不同种类药物。包括乙酰氨基酚/对乙酰氨基酚，非甾体类抗炎药(NSAIDs)，COX-2抑制剂(例如：罗非昔布和塞来昔布)，吗啡，可待因，羟考酮，氢可酮，二乙酰吗啡，杜冷丁，曲马多，丁丙诺啡，三环类抗抑郁药(例如：阿米替林)，卡马西平，加巴喷丁，和普瑞巴林。

进一步的，与活性细胞外基质联合使用的有抗组织胺药，抗组织胺药是组胺的对抗药，用于减少或消减组胺带来的影响。组胺是一种由过敏反应引发的内生的化学介质。包括H1抗组胺药，醋异丙嗪，阿利马嗪，阿司咪唑，阿扎他定，氮卓斯汀，苯海拉明，溴苯那敏，氯环嗪，氯代嘧胺，扑尔敏，苯丙醇胺，桂利嗪，氯马斯汀，苯甲，赛庚啶，右溴苯那敏，右氯苯那敏，苯海拉明，多西拉敏，依巴斯汀，依美斯汀，依匹斯汀，非索非那定，组胺拮抗剂(如西米替丁，雷尼替丁，法莫替丁；ABT-239，噻普酰胺，丙酸倍氯松，英普咪定，噻普酰胺，色甘酸钠，奈多罗米，羟嗪，甲哌噻庚酮，左卡巴斯汀，美海屈林，吡拉明，噻吡二胺，甲吡咯嗪，奥洛他定，苯吡胺，苯托沙敏，Resporal(抗癌药物)，阿伐斯汀和伪，盐酸苯海拉明片剂，他拉斯汀，特非那定和曲普利啶。

进一步的，与活性细胞外基质联合使用的有抗炎剂，抗炎剂是指减缓炎症的物质。包括糖皮质激素,布洛芬和萘普生,锦鸡菌素,双氯芬酸、水杨酸、辣椒素,ω-3脂肪酸。

进一步的，与活性细胞外基质联合使用的有抗感染剂，抗感染剂是一种能预防或阻抗感染的试剂。它可以分为几类：抗肠虫剂是抗感染剂的一种，其中包括阿苯达唑，甲苯咪唑，左旋咪唑，氯硝柳胺，吡喹酮，和噻嘧啶。另一种是抗丝虫剂，例如乙胺嗪，双氢除虫菌素，苏拉明钠，抗血吸虫和吸虫药物，羟胺硝喹，吡喹酮和三氯苯咪唑。还有一种是抗菌类，此种可以进一步分类。β-内酰胺药物有阿莫西林，氨苄青霉素，青霉素，苄星青霉素，头孢唑啉，头孢克肟，头孢他啶，头孢三嗪，氯唑西林，拉维酸，亚胺培南/西司他丁钠，青霉素V，和普鲁卡因青霉素。其他抗菌类药物有阿奇霉素，氯霉素，环丙沙星，克林霉素，复方新诺明，多西环素，红霉素，庆大霉素，甲硝哒唑，呋喃妥因，大观霉素，磺胺嘧啶，甲氧苄氨嘧啶，和万古霉素。抗麻风药的例子有氯法齐明，氨苯砜，利福平。抗结核药的例子有对-氨基水杨酸，丁胺卡那霉素，卷曲霉素，环丝氨酸，乙胺丁醇，乙硫异烟胺，异烟肼，卡那霉素，氧氟沙星，吡嗪酰胺，利福平，和链霉素。抗真菌的药物的例子有两性霉素B，克霉唑，氟康唑，氟胞嘧啶，灰黄霉素，制霉菌素，碘化钾。抗病毒试剂也是抗感染试剂。抗疱疹药物的例子有羟乙氧甲鸟嘌呤。抗逆转录病毒药物是核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂。其他的例子有阿巴卡韦，去羟肌苷，恩曲他滨，拉米夫定，司他夫定，替诺福韦，泰诺福韦，富马酸，齐多夫定，非核苷逆转录酶抑制剂，依法韦仑，奈韦拉平，蛋白酶抑制剂，茚地那韦，洛匹那韦+利托那韦，奈非那韦，利托那韦，沙奎那韦和利巴韦林。抗原虫药物也是抗变形虫和抗贾第鞭毛虫病的药物，如二氯尼特，甲硝唑，如两性霉素B，葡甲胺锑酸盐，喷他脒，阿莫地喹，蒿甲醚，蒿甲醚+本芴醇，青蒿琥酯，氯喹，强力霉素，甲氟喹，伯氨喹等抗疟药物，抗黑热病药，奎宁，磺胺多辛+乙胺嘧啶，氯喹，氯胍。抗肺部细胞摄入和抗弓形体的药物喷他脒，乙胺嘧啶，磺胺甲恶唑+甲氧苄啶。抗锥体虫的药物依氟鸟氨酸，硫胂密胺，喷他脒，苏拉明钠，苯并咪唑，硝呋莫司。抗偏头痛药，乙酰水杨酸，对乙酰氨基酚和普萘洛尔。

进一步的，与活性细胞外基质联合使用的有伤口愈合剂，伤口愈合剂能用于促进人体表皮或真皮组织再生长的自然过程。包括血纤维蛋白，纤连蛋白，胶原蛋白，5-羟色胺，缓激肽，前列腺素，前列环素，血栓素，组胺，神经肽，激肽，胶原酶，纤溶酶原激活物，锌离子依赖性金属蛋白酶，乳酸，葡萄糖胺聚糖，蛋白多糖，糖蛋白，糖胺聚糖(聚糖)，弹性蛋白，生长因子(PDGF，TGF-β)，一氧化氮，和基质金属蛋白酶，伤口密封剂的例子是：血纤维蛋白，血小板凝胶。

进一步的，与活性细胞外基质联合使用的有抗增生剂，抗增生剂用于阻止组织生长，例如预防冠脉血管术后再狭窄(复发性狭窄)，疤痕组织形成等。抗增生剂的一个例子是紫杉醇。将紫杉醇涂于冠脉支架磺酸钠该可以限制术后再狭窄或内膜(疤痕组织)生长。

进一步的，与活性细胞外基质联合使用的有细胞诱导剂，细胞诱导剂或趋化因子是被环境检测到的化学物质或分子通过身体细胞，细菌和其他单细胞或多细胞生物来影响它们的行动。包括甲酰基氨基酸的肽[氮-甲酸基甲二磺酰-亮氨酰-苯丙氨酸(参考文献中的fMLF或fMLP)，补体3a(C3a)和补体5a(C5a)，趋化因子(例如，IL-8)，白细胞三烯[例如，白细胞三烯B4(LTB4)]。

进一步的，与活性细胞外基质联合使用的有细胞活素类，细胞活素类是一组蛋白质或者肽，它们是由动物细胞合成的，能同其他细胞联系的信号化合物。细胞活素类被分为几科，四大科α-螺旋束中还可以再分为三亚科：白细胞介素-2亚科[促红细胞生成素(EPO)，血小板生成素(THPO)]；干扰素(IFN)亚科,白细胞介素-10亚科。其他例子有白细胞介素-1科(白细胞介素-1和白细胞介素18)，白细胞介素-17科，趋化因子，免疫白球素(Ig)总科，造血增长因子(1类)科，干扰素(2类)科，肿瘤坏死因子(TNF)(3类)科，七个恒跨膜螺旋科和转化生长因子β总科。

含有所述活性细胞外基质的3D组织修复支架，所述组织修复支架由以下方法制得：首先，将引入了表达活性因子基因片段的细胞在体外大量扩增，然后种植于3D多孔支架上进行培养分化，期间诱导活性因子的过表达、细胞外基质的分泌和细胞的分化；其次，对3D多孔支架进行脱除细胞处理；最后，将含有活性细胞外基质的3D组织修复支架干燥脱水、包装灭菌。

优选的，本发明中涉及的将培养好的细胞或在细胞/3D支架构件进行反复冻融，以脱去细胞。也可以采用表面活性剂洗脱的方法脱去活细胞。如果还需要去除ECM上残留的DNA和RNA，还可以顺序在含有DNA酶和RNA酶的溶液里浸泡清洗。

优选的，本发明中涉及的体外细胞培养获得ECM产品的方法还包括将脱细胞后的ECM进行干燥脱水的方法。包括采用冷冻干燥机，自然干燥。烘干以及采用脱水剂脱水的方法。

优选的，本发明中涉及的体外细胞培养获得的ECM产品或带ECM涂层的3D组织修复支架的灭菌方法包括环氧乙烷，电子束，伽玛射线，紫外线等灭菌方法。

优选的，支架材料为天然高分子材料、合成有机高分子材料、合成无机高分子材料、非金属陶瓷材料、金属及其氧化物材料中的至少一种；或支架材料为可降解材料、不可降解材料中的至少一种。

优选的，3D多孔支架的形状为长方体、立方体、管状、柱状、楔形、其他规则或不规则形状。

优选的，3D多孔支架表面采用生理生化方式、化学方式、涂层方式中的至少一种进行预处理。

进一步的，3D多孔支架表面采用生理生化方式中的表面改性技术来处理。这种工艺通过用等离子或辉光放电来提高混合型高分子支架的表面性能使其有更好的细胞黏附力。

进一步的，3D多孔支架表面采用化学方式来处理，尤其是酸或者碱。在某些特定实施例中，混合型高分子支架用浓硫酸，硝酸，盐酸，磷酸，铬酸，或它们的混合物来处理。在某些特定实施例中，混合型高分子支架用氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化钡，氢氧化铯，氢氧化锶，氢氧化钙，氢氧化锂，氢氧化铷或它们的混合物来处理。

进一步的，3D多孔支架表面采用涂层方式来处理。这种方法是将一种不同于支柱和/或纤维的物质涂于支架表面。这种物质对支柱和纤维有强共价键力或物理吸附性。另一种方式，涂层可以通过氢键，离子键，范德华力或它们的混合力同支架表面相结合。为了提高生物分子涂层的稳定性，涂层可以交联到支架表面。交联技术有化学交联，辐射，热处理，或上述方法混合使用。此外，交联在室温以上的高温真空条件下也会发生。用于交联的辐射可以是电子束辐射，伽马辐射，紫外线辐射或上述方法混合使用。

其中，涂层物质可以是高分子和治疗剂的混合物。

优选的，涂层物质是蛋白质，肽，甘油氨基聚糖，天然物质，无机物，治疗剂中的至少一种。

优选的，涂层物质是生物分子、天然混合物或高分子。高分子例子如下，但不仅限于此，胶原蛋白(I,II,III,IV,V,VI型等)、纤维连接蛋白，层粘连蛋白或其他细胞外基质分子。细胞外基质分子的例子有硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素，硫酸角质素，透明质酸，弹性蛋白，半纤维素，果胶，和伸展蛋白。生物分子可以共价键合或者物理吸附到管状支撑架表面。

优选的，涂层物质为合成高分子，包括聚乙烯醇缩醇，聚乙二醇，聚乙烯醇聚吡咯烷酮，聚(L-丙交酯)或聚赖氨酸。

优选的，涂层物质为有机材料，包括明胶，脱乙酰壳多糖，聚丙烯酸，聚乙二醇，聚乙烯醇缩醇，聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。

优选的，涂层物质为无机材料，包括磷酸钙，二氧化钛，氧化铝中的至少一种。

优选的，3D多孔支架表面会涂上由两种或两种以上有机材料组合成的复合材料，例如明胶和脱乙酰壳多糖，聚丙烯酸，聚乙二醇，聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮等。

优选的，3D多孔支架表面会涂上由无机材料和有机材料组合成的复合材料，例如磷酸钙/胶原蛋白，磷酸钙/明胶，磷酸钙/聚乙二醇等。

优选的，所述3D多孔支架的内表面和/或外表面粘附有织物。其中粘附的织物为纺织布、无纺布或二者的组合。织物可以是提前生产好的，或直接加工到支架的外表面。直接加工方法包含以下方式，但不仅限于此，例如：电纺织加工方法。这种方法中，混合型高分子支架的旋转杆还可用作纤维收集器。

以上含有所述活性细胞外基质的3D组织修复支架在制备血管支架，食管支架，肠道、胆道或尿路支架，或腹部动脉肿瘤治疗支架中的应用。当在染病和狭窄的血管区域中放置并撑开后，支架能保证血管壁内血流的通畅流动。当作为食管支架使用时，在狭窄的食道区域放置并撑开后能保证食物顺利流进胃部。这种应用对晚期食道癌患者会很有益处。

有益效果：(1)本发明所述方法通过在细胞内预先导入表达活性因子的基因片段并进行体外细胞培养获得含有活性因子的细胞外基质，因而保证了细胞来源的可靠性，同时赋予细胞外基质产品质量的稳定性和可修饰性或可加工性；(2)本发明所述方法通过在3D打印的多孔支架上进行干细胞培养与定向分化，制备具有促进损伤修复的仿生支架，建立基于干细胞结合定向分化的材料设计原理及干细胞分化技术，开拓干细胞与材料结合在原位组织工程修复应用的新领域；(3)本发明所述方法对仿生支架做进一步优化，实现植入后对细胞诱导吸附，生长与分化，实现组织(骨、软骨、皮肤、心肌和血管)再生。

附图说明

图1是实施例1中关于含BMP的ECM 3D支架处理兔子缺损软骨前后的结果图；

图2是实施例7中静电纺丝覆膜法制备带覆膜支架的设备原理图；

图3是采用电纺技术在PCL支架上覆膜PCL电纺丝膜；

图4是采用3D打印方法制备的用于血管修复再生的多孔管状聚合物支架。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

活性细胞外基质的制备方法，所述方法采用基因修饰的方法在细胞中引入表达活性因子的基因片段，通过体外培养的方式使其分泌细胞外基质和活性因子，然后脱除细胞得到富含活性因子的细胞外基质；其中，细胞为人源细胞或其他哺乳动物细胞中的至少一种。优选的，细胞为人间充质干细胞、人源iPS干细胞、其他哺乳动物的干细胞中的至少一种。采用Tet-on表达调控系统与CRISPR/Cas9系统联合应用的方法，在细胞培养过程中将活性因子的基因片段导入到干细胞，在体外进行干细胞扩增，而在干细胞定向分化阶段条件性过表达特定细胞生长因子，促使干细胞的定向分化和细胞因子的表达，从而获得具有高生物活性的组织修复ECM。

其中，在细胞内引入表达活性因子的基因片段的具体方法为：体外构建条件性过表达特定活性因子的基因载体，通过基因载体将目的基因序列导入细胞，进行细胞的体外大量扩增。在培养过程中需要进行细胞分化时或需要细胞开始分泌活性因子时，可以通过加入四环素(Tet)或阿霉素(Dox)，来诱导活性因子的过表达，使得细胞培养产生的ECM中富含这种活性因子，一方面可以促进细胞的选择性分化，另一方面可以使细胞培养分化产生的ECM中富含活性因子。

进一步的，所述基因载体为质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、非病毒载体或微环DNA载体。

进一步的，细胞体外培养的方法包括静态细胞培养和动态细胞培养方法。静态细胞培养器材包括细胞培养板，细胞培养瓶和细胞工厂。动态细胞培养设备包括生物反应器等能够使培养液流动的设备。也可以是上述培养方法的组合。

优选的，活性因子为骨形成蛋白(BMP)、转化生长因子β(TGF-β)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、神经营养因子(NT)，血小板衍生生长因子(PDGF)、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、氯化筒箭毒碱、生长分化因子9(GDF9)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF或FGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF-2)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)中的至少一种。

以含BMP的ECM 3D组织支架为例：通过制备适宜尺寸含有BMP的ECM 3D支架，在兔子的膝盖骨凹槽处制造直径为5mm、深度为3mm的软骨缺损。将该缺损处或者让其空置、或者只用普通支架或者用含BMP的ECM 3D支架填充(图1A)。在第1、3、6月处死兔子，对损伤部位进行组织学检查。采用O’Driscoll记录系统，由富有经验的病理学家对软骨修复进行分类比较。结构表面在所有时间点上，用含BMP的ECM 3D支架处理缺损较现有技术中的支架对软骨愈合有明显改善。如图1B所示，该图表明含BMP的ECM 3D支架对软骨缺损的愈合有效。

实施例2

体外构建骨形成蛋白BMP2/BMP4的慢病毒Tet-on载体，通过慢病毒等基因载体将目的基因序列导入细胞，进行细胞的大量扩增，再种植于3D多孔支架上进行培养扩增。在诱导软骨分化和骨分化阶段，通过加入四环素(Tet)或阿霉素(Dox)，诱导BMP2/BMP4的过表达，促进软骨形成和成骨分化。脱细胞的ECM中就会含有较高的BMP2/BMP4的含量，因此可用于临床上软骨修复和骨修复材料。采用Tet-on表达调控系统，可实现细胞扩增不受影响，而在细胞定向分化阶段条件性过表达特定细胞生长因子BMP2/BMP4。

同时，本实施例提供了活性ECM或带活性ECM的3D组织修复支架的脱细胞和干燥方法。经过脱细胞和冷冻干燥后的产品可以进行冷藏储存，因此产品运输容易，货架寿命长，产品可以即取即用。

实施例3

采用人成纤维细胞和脐静脉来源的内皮细胞(EC)进行共培养，可观察到长达400μm的具有EC细胞管腔3D管状网络结构的形成。这种共培养技术产生的组织样结构有可能促进带ECM涂层的3D构件在植入后的血管化。众所周知，用于组织修复的植入物的血管化是再生医学领域的主要挑战之一。在这种情况下，可以对人成纤维细胞采用Tet-on表达调控系统，在共培养时同过加入四环素(Tet)或阿霉素(Dox)，使得人成纤维细胞能够过表达内皮细胞生长因子(EGF)，使其进一步促进EC细胞形成血管腔组织。

这种活性ECM或带活性ECM的3D组织培养支架可以预先进行批量生产，然后采用冷冻干燥法进行干燥并进行冷藏储存，因此产品运输容易，货架寿命长，产品可以即取即用。

实施例4

含有所述活性细胞外基质的组合物，所述组合物还包括治疗剂。

所述治疗剂包括如下，但不限于此：抗生素，激素类，生长因子，抗癌抗菌素，杀菌剂，抗病毒剂，疼痛药物，抗组织胺药，抗炎药，抗感染药，伤口愈合剂，抗增生药，伤口缝合药，细胞诱导剂，细胞活素类以及诸如此类。应用于治疗细胞，有利于人体健康的试剂都叫做治疗剂。

与活性细胞外基质联合使用的有抗生素，抗生素是一种化学治疗性试剂，它能抑制或消除微生物生长，例如细菌，真菌或原生动物。常用抗生素有青霉素或链霉素；其他抗生素有氨基羟丁基卡那霉素A，妥布霉素，奈替米星，庆大霉素，卡那霉素，新霉素，巴龙霉素，格尔德霉素，除莠霉素，氯碳头孢，厄他培南，多尼培南，亚胺培南/西司他丁，美罗培南，头孢羟氨苄，头孢唑啉，头孢噻吩或头孢噻吩，头孢氨苄，头孢克洛，头孢孟多，头孢西丁，头孢丙烯，头孢呋辛，头孢克肟，头孢地尼，头孢妥仑，头孢哌酮，头孢噻肟，头孢泊肟，头孢他啶，头孢布烯，头孢唑肟，头孢曲松，头孢地尼，头孢吡肟，替考拉宁，万古霉素，阿奇霉素，克拉霉素，地红霉素，红霉素，罗红霉素，醋竹桃霉素，泰利霉素，大观霉素，氨曲南，阿莫西林，氨苄西林，阿洛西林，氟氯西林，羧苄青霉素，邻氯青霉素，双氯青霉素，美洛西林，萘夫西林，哌拉西林，替卡西林，杆菌肽，多粘菌素，多粘菌素B，环丙沙星，依诺沙星，加替沙星，左氧氟沙星，洛美沙星，莫西沙星，诺氟沙星，氧氟沙星，诺氟沙星，磺胺米隆，百浪多息，磺胺醋酰，磺胺甲二唑，磺胺，柳氮磺胺吡啶，磺胺异恶唑，甲氧苄啶，复方新诺明，地美环素，多西环素，米诺环素，土霉素，四环素，胂凡纳明，氯霉素，克林霉素，林可霉素，乙胺丁醇，磷霉素，夫西地酸，痢特灵，异烟肼，利奈唑，甲硝唑，莫匹罗星，呋喃妥因，平板霉素，吡嗪酰胺，奎奴普丁/达福普汀，利福平或利福霉素和替硝唑。

与活性细胞外基质联合使用的有激素类药物，激素类是一种化学载体，它能通过血液从一个细胞(或一组群细胞)传递到另一个(或另一组群)。包括褪黑激素，5-羟色胺，甲状腺素，三碘甲腺原氨酸，肾上腺素，去甲肾上腺素，多巴胺，抗疟激素，脂联素，促肾上腺皮质激素，血管紧张素原和血管紧张素，抗利尿激素，心房利钠肽，降钙素，缩胆囊素，促肾上腺皮质激素释放激素，促红细胞生成素，卵泡刺激素，胃泌素，生长素释放肽，胰高血糖素，促性腺激素释放激素，生长激素释放激素，人绒毛膜促性腺激素，人胎盘催乳激素，生长激素，抑制素，胰岛素，胰岛素样生长因子，瘦素，促黄体生成激素，黑素细胞刺激素，催产素，甲状旁腺激素，催乳激素，胰泌素，促生长素抑制素，血小板生成素，促甲状腺激素，促甲状腺激素释放激素，皮质醇，醛固酮，睾丸酮，脱氢表雄酮，雄烯二酮，双氢睾酮，雌二醇，雌酮，雌三醇，孕酮，骨化三醇，骨化二醇，前列腺素，白三烯，前列腺素，血栓素，催乳素释放激素，促脂解素，脑钠肽，神经肽Y，组胺，内皮素，胰多肽，肾素和脑啡肽。

与活性细胞外基质联合使用的有抗癌抗菌素，抗癌抗菌素或抗肿瘤药是一种能抑制或阻止肿瘤生长的药物。包括放线菌素(例如，放线菌素-D)，蒽环类抗生素(例如，阿霉素，柔红霉素，表柔比星)，博来霉素，普卡霉素，紫杉醇和丝裂霉素。

与活性细胞外基质联合使用的有抗真菌剂，抗真菌剂是一种治疗真菌感染的药物。包括纳他霉素，龟裂杀菌素，菲律宾菌素，制霉菌素，两性霉素B，咪康唑，酮康唑，克霉唑，益康唑，联苯苄唑，布康唑，芬替康唑，异康唑，奥昔康唑，舍他康唑，硫康唑，噻康唑，氟康唑，伊曲康唑，艾沙康唑，雷夫康唑，泊沙康唑，伏立康唑，特康唑，特比萘芬，阿莫罗芬，萘替芬，布替萘芬，阿尼芬净，卡泊芬净，米卡芬净，苯甲酸，环吡酮，氟胞嘧啶，灰黄霉素，龙胆紫，卤普罗近，托萘酯，十一烯酸，茶树精油，香茅油，柠檬草，橙油，玫瑰油，广藿香，柠檬香桃木，楝树种子油，椰子油，锌和硒。

与活性细胞外基质联合使用的有抗病毒剂，抗病毒剂是一系列用于治疗病毒感染的药物。包括阿巴卡韦，无环鸟苷，无环鸟苷，阿德福韦酯，金刚烷胺，安普那韦，阿比朵尔，阿扎那韦，阿托伐他汀钙，溴夫定，西多福韦，双汰芝，瑞拉韦，地拉韦定，去羟肌苷，二十二烷醇，依度尿苷，依非韦伦，恩曲他滨，恩夫韦肽，恩替卡韦，进入抑制剂(融合抑制剂)，泛昔洛韦，福米韦生，福沙那韦，茚地那韦，膦甲酸，膦乙醇钠，更昔洛韦，加德西(宫颈癌疫苗)，伊巴他滨，异丙酯肌苷片，碘苷，咪喹莫特，茚地那韦，肌苷，整合酶抑制剂，干扰素III型干扰素II型，I型干扰素，拉米夫定，洛匹那韦，洛韦胺，MK-0518(雷特格韦)，马拉维若，吗啉胍，奈非那韦，奈韦拉平，多吉美，核苷类似物，奥司他韦，喷昔洛韦，帕拉米韦，普来可那立，鬼臼毒素，蛋白酶抑制剂(药理学)，逆转录酶抑制剂，利巴韦林，金刚乙胺，利托那韦，沙奎那韦，司他夫定，协同增强(ART)，替诺福韦，替诺福韦，替拉那韦，氟尿苷，三协维，醋胺金刚烷，替诺福韦，伐昔洛韦，缬更昔洛韦，Vicriviroc(抗艾滋病药)，阿糖腺苷，Viramidine(慢性丙肝治疗新药)，扎西他滨，扎那米韦，和齐多夫定。

与活性细胞外基质联合使用的有疼痛药物或镇痛剂(俗称止痛药)，是用于缓解疼痛的多种不同种类药物。包括乙酰氨基酚/对乙酰氨基酚，非甾体类抗炎药(NSAIDs)，COX-2抑制剂(例如：罗非昔布和塞来昔布)，吗啡，可待因，羟考酮，氢可酮，二乙酰吗啡，杜冷丁，曲马多，丁丙诺啡，三环类抗抑郁药(例如：阿米替林)，卡马西平，加巴喷丁，和普瑞巴林。

与活性细胞外基质联合使用的有抗组织胺药，抗组织胺药是组胺的对抗药，用于减少或消减组胺带来的影响。组胺是一种由过敏反应引发的内生的化学介质。包括H1抗组胺药，醋异丙嗪，阿利马嗪，阿司咪唑，阿扎他定，氮卓斯汀，苯海拉明，溴苯那敏，氯环嗪，氯代嘧胺，扑尔敏，苯丙醇胺，桂利嗪，氯马斯汀，苯甲，赛庚啶，右溴苯那敏，右氯苯那敏，苯海拉明，多西拉敏，依巴斯汀，依美斯汀，依匹斯汀，非索非那定，组胺拮抗剂(如西米替丁，雷尼替丁，法莫替丁；ABT-239，噻普酰胺，丙酸倍氯松，英普咪定，噻普酰胺，色甘酸钠，奈多罗米，羟嗪，甲哌噻庚酮，左卡巴斯汀，美海屈林，吡拉明，噻吡二胺，甲吡咯嗪，奥洛他定，苯吡胺，苯托沙敏，Resporal(抗癌药物)，阿伐斯汀和伪，盐酸苯海拉明片剂，他拉斯汀，特非那定和曲普利啶。

与活性细胞外基质联合使用的有抗炎剂，抗炎剂是指减缓炎症的物质。包括糖皮质激素,布洛芬和萘普生,锦鸡菌素,双氯芬酸、水杨酸、辣椒素,ω-3脂肪酸。

与活性细胞外基质联合使用的有抗感染剂，抗感染剂是一种能预防或阻抗感染的试剂。它可以分为几类：抗肠虫剂是抗感染剂的一种，其中包括阿苯达唑，甲苯咪唑，左旋咪唑，氯硝柳胺，吡喹酮，和噻嘧啶。另一种是抗丝虫剂，例如乙胺嗪，双氢除虫菌素，苏拉明钠，抗血吸虫和吸虫药物，羟胺硝喹，吡喹酮和三氯苯咪唑。还有一种是抗菌类，此种可以进一步分类。β-内酰胺药物有阿莫西林，氨苄青霉素，青霉素，苄星青霉素，头孢唑啉，头孢克肟，头孢他啶，头孢三嗪，氯唑西林，拉维酸，亚胺培南/西司他丁钠，青霉素V，和普鲁卡因青霉素。其他抗菌类药物有阿奇霉素，氯霉素，环丙沙星，克林霉素，复方新诺明，多西环素，红霉素，庆大霉素，甲硝哒唑，呋喃妥因，大观霉素，磺胺嘧啶，甲氧苄氨嘧啶，和万古霉素。抗麻风药的例子有氯法齐明，氨苯砜，利福平。抗结核药的例子有对-氨基水杨酸，丁胺卡那霉素，卷曲霉素，环丝氨酸，乙胺丁醇，乙硫异烟胺，异烟肼，卡那霉素，氧氟沙星，吡嗪酰胺，利福平，和链霉素。抗真菌的药物的例子有两性霉素B，克霉唑，氟康唑，氟胞嘧啶，灰黄霉素，制霉菌素，碘化钾。抗病毒试剂也是抗感染试剂。抗疱疹药物的例子有羟乙氧甲鸟嘌呤。抗逆转录病毒药物是核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂。其他的例子有阿巴卡韦，去羟肌苷，恩曲他滨，拉米夫定，司他夫定，替诺福韦，泰诺福韦，富马酸，齐多夫定，非核苷逆转录酶抑制剂，依法韦仑，奈韦拉平，蛋白酶抑制剂，茚地那韦，洛匹那韦+利托那韦，奈非那韦，利托那韦，沙奎那韦和利巴韦林。抗原虫药物也是抗变形虫和抗贾第鞭毛虫病的药物，如二氯尼特，甲硝唑，如两性霉素B，葡甲胺锑酸盐，喷他脒，阿莫地喹，蒿甲醚，蒿甲醚+本芴醇，青蒿琥酯，氯喹，强力霉素，甲氟喹，伯氨喹等抗疟药物，抗黑热病药，奎宁，磺胺多辛+乙胺嘧啶，氯喹，氯胍。抗肺部细胞摄入和抗弓形体的药物喷他脒，乙胺嘧啶，磺胺甲恶唑+甲氧苄啶。抗锥体虫的药物依氟鸟氨酸，硫胂密胺，喷他脒，苏拉明钠，苯并咪唑，硝呋莫司。抗偏头痛药，乙酰水杨酸，对乙酰氨基酚和普萘洛尔。

与活性细胞外基质联合使用的有伤口愈合剂，伤口愈合剂能用于促进人体表皮或真皮组织再生长的自然过程。包括血纤维蛋白，纤连蛋白，胶原蛋白，5-羟色胺，缓激肽，前列腺素，前列环素，血栓素，组胺，神经肽，激肽，胶原酶，纤溶酶原激活物，锌离子依赖性金属蛋白酶，乳酸，葡萄糖胺聚糖，蛋白多糖，糖蛋白，糖胺聚糖(聚糖)，弹性蛋白，生长因子(PDGF，TGF-β)，一氧化氮，和基质金属蛋白酶，伤口密封剂的例子是：血纤维蛋白，血小板凝胶。

与活性细胞外基质联合使用的有抗增生剂，抗增生剂用于阻止组织生长，例如预防冠脉血管术后再狭窄(复发性狭窄)，疤痕组织形成等。抗增生剂的一个例子是紫杉醇。将紫杉醇涂于冠脉支架磺酸钠该可以限制术后再狭窄或内膜(疤痕组织)生长。

与活性细胞外基质联合使用的有细胞诱导剂，细胞诱导剂或趋化因子是被环境检测到的化学物质或分子通过身体细胞，细菌和其他单细胞或多细胞生物来影响它们的行动。包括甲酰基氨基酸的肽[氮-甲酸基甲二磺酰-亮氨酰-苯丙氨酸(参考文献中的fMLF或fMLP)，补体3a(C3a)和补体5a(C5a)，趋化因子(例如，IL-8)，白细胞三烯[例如，白细胞三烯B4(LTB4)]。

与活性细胞外基质联合使用的有细胞活素类，细胞活素类是一组蛋白质或者肽，它们是由动物细胞合成的，能同其他细胞联系的信号化合物。细胞活素类被分为几科，四大科α-螺旋束中还可以再分为三亚科：白细胞介素-2亚科[促红细胞生成素(EPO)，血小板生成素(THPO)]；干扰素(IFN)亚科,白细胞介素-10亚科。其他例子有白细胞介素-1科(白细胞介素-1和白细胞介素18)，白细胞介素-17科，趋化因子，免疫白球素(Ig)总科，造血增长因子(1类)科，干扰素(2类)科，肿瘤坏死因子(TNF)(3类)科，七个恒跨膜螺旋科和转化生长因子β总科。

实施例5

含有所述活性细胞外基质的3D组织修复支架，所述组织修复支架由以下方法制得：首先，将引入了表达活性因子基因片段的细胞在体外大量扩增，然后种植于3D多孔支架上进行培养分化，期间诱导活性因子的过表达、细胞外基质的分泌和细胞的分化；其次，对3D多孔支架进行脱除细胞处理；最后，将含有活性细胞外基质的3D组织修复支架干燥脱水、包装灭菌。

以上涉及的将培养好的细胞或在细胞/3D支架构件进行反复冻融，以脱去细胞。也可以采用表面活性剂洗脱的方法脱去活细胞。如果还需要去除ECM上残留的DNA和RNA，还可以顺序在含有DNA酶和RNA酶的溶液里浸泡清洗。

以上涉及的体外细胞培养获得ECM产品的方法还包括将脱细胞后的ECM进行干燥脱水的方法。包括采用冷冻干燥机，自然干燥。烘干以及采用脱水剂脱水的方法。

以上涉及的体外细胞培养获得的ECM产品或带ECM涂层的3D组织修复支架的灭菌方法包括环氧乙烷，电子束，伽玛射线，紫外线等灭菌方法。

支架材料为天然高分子材料、合成有机高分子材料、合成无机高分子材料、非金属陶瓷材料、金属及其氧化物材料中的至少一种；或支架材料为可降解材料、不可降解材料中的至少一种。

3D多孔支架的形状为长方体、立方体、管状、柱状、楔形、其他规则或不规则形状。

实施例6

针对3D多孔支架进行预处理，3D多孔支架表面采用生理生化方式、化学方式、涂层方式中的至少一种进行预处理。

3D多孔支架表面采用生理生化方式中的表面改性技术来处理。这种工艺通过用等离子或辉光放电来提高混合型高分子支架的表面性能使其有更好的细胞黏附力。

3D多孔支架表面采用化学方式来处理，尤其是酸或者碱。在某些特定实施例中，混合型高分子支架用浓硫酸，硝酸，盐酸，磷酸，铬酸，或它们的混合物来处理。在某些特定实施例中，混合型高分子支架用氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化钡，氢氧化铯，氢氧化锶，氢氧化钙，氢氧化锂，氢氧化铷或它们的混合物来处理。

3D多孔支架表面采用涂层方式来处理。这种方法是将一种不同于支柱和/或纤维的物质涂于支架表面。这种物质对支柱和纤维有强共价键力或物理吸附性。另一种方式，涂层可以通过氢键，离子键，范德华力或它们的混合力同支架表面相结合。为了提高生物分子涂层的稳定性，涂层可以交联到支架表面。交联技术有化学交联，辐射，热处理，或上述方法混合使用。此外，交联在室温以上的高温真空条件下也会发生。用于交联的辐射可以是电子束辐射，伽马辐射，紫外线辐射或上述方法混合使用。

其中，涂层物质可以是高分子和治疗剂的混合物。

涂层物质是蛋白质，肽，甘油氨基聚糖，天然物质，无机物，治疗剂中的至少一种。

涂层物质是生物分子、天然混合物或高分子。高分子例子如下，但不仅限于此，胶原蛋白(I,II,III,IV,V,VI型等)、纤维连接蛋白，层粘连蛋白或其他细胞外基质分子。细胞外基质分子的例子有硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素，硫酸角质素，透明质酸，弹性蛋白，半纤维素，果胶，和伸展蛋白。生物分子可以共价键合或者物理吸附到管状支撑架表面。

涂层物质为合成高分子，包括聚乙烯醇缩醇，聚乙二醇，聚乙烯醇聚吡咯烷酮，聚(L-丙交酯)或聚赖氨酸。

涂层物质为有机材料，包括明胶，脱乙酰壳多糖，聚丙烯酸，聚乙二醇，聚乙烯醇缩醇，聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。

涂层物质为无机材料，包括磷酸钙，二氧化钛，氧化铝中的至少一种。

3D多孔支架表面会涂上由两种或两种以上有机材料组合成的复合材料，例如明胶和脱乙酰壳多糖，聚丙烯酸，聚乙二醇，聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮等。

3D多孔支架表面会涂上由无机材料和有机材料组合成的复合材料，例如磷酸钙/胶原蛋白，磷酸钙/明胶，磷酸钙/聚乙二醇等。

实施例7

所述3D多孔支架的内表面和/或外表面粘附有织物。其中粘附的织物为纺织布、无纺布或二者的组合。织物可以是提前生产好的，或直接加工到支架的外表面。直接加工方法包含以下方式，但不仅限于此，例如：电纺织加工方法。这种方法中，混合型高分子支架的旋转杆还可用作纤维收集器，原理图如2所示。其中，图3是在3D多孔支架的外表面覆上PCL电纺丝膜，其中PCL溶液的浓度可调。

Claims (10)

1.活性细胞外基质的制备方法，其特征在于，所述方法采用基因修饰的方法在细胞中引入表达活性因子的基因片段，通过体外培养的方式使其分泌细胞外基质和活性因子，然后脱除细胞得到富含活性因子的细胞外基质；其中，细胞为人源细胞或其他哺乳动物细胞中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的活性细胞外基质的制备方法，其特征在于，活性因子为骨形成蛋白、转化生长因子β、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、神经营养因子，血小板衍生生长因子、促红细胞生成素、血小板生成素、氯化筒箭毒碱、生长分化因子9、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、肝细胞生长因子中的至少一种。

3.由权利要求1或2所述方法制备获得的活性细胞外基质。

4.含有权利要求3所述活性细胞外基质的组合物，其特征在于，所述组合物还包括治疗剂。

5.含有权利要求3所述活性细胞外基质的3D组织修复支架，其特征在于，所述组织修复支架由以下方法制得：首先，将引入了表达活性因子基因片段的细胞在体外大量扩增，然后种植于3D多孔支架上进行培养分化，期间诱导活性因子的过表达、细胞外基质的分泌和细胞的分化；其次，对3D多孔支架进行脱除细胞处理；最后，将含有活性细胞外基质的3D组织修复支架干燥脱水、包装灭菌。

6.根据权利要求4所述的含有权利要求3所述活性细胞外基质的3D组织修复支架，其特征在于，支架材料为天然高分子材料、合成有机高分子材料、合成无机高分子材料、非金属陶瓷材料、金属及其氧化物材料中的至少一种；或支架材料为可降解材料、不可降解材料中的至少一种。

7.根据权利要求4所述的含有权利要求3所述活性细胞外基质的3D组织修复支架，其特征在于，3D多孔支架的形状为长方体、立方体、管状、柱状、楔形、其他规则或不规则形状。

8.根据权利要求4所述的含有权利要求3所述活性细胞外基质的3D组织修复支架，其特征在于，3D多孔支架表面采用生理生化方式、化学方式、涂层方式中的至少一种进行预处理。

9.根据权利要求4所述的含有权利要求3所述活性细胞外基质的3D组织修复支架，其特征在于，所述3D多孔支架的内表面和/或外表面粘附有织物。

10.权利要求5-9任一所述含有权利要求3所述活性细胞外基质的3D组织修复支架在制备血管支架，食管支架，肠道、胆道或尿路支架，或腹部动脉肿瘤治疗支架中的应用。

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