CN109097363A - 一种可有效抑制骨肉瘤生长的生物重组型miR34a-5p - Google Patents

一种可有效抑制骨肉瘤生长的生物重组型miR34a-5p Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可有效抑制骨肉瘤生长的生物重组型miR34a‑5p，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明将人类来源的tRNA作为运载骨架，从其碱基序列中的反密码子处，通过插入可表达成熟miR34a‑5p的碱基序列，再通过质粒将该合成结构转运到普通的E.coli体内，经过12h左右的孵育，对目的miRNA进行分离、纯化和脱盐处理，便可获得能直接使用的重组型miRNA。在保证高产率、高纯度的前提下，由于其从始至终的制备过程均是以自然界生物体为媒介，极高保真度的还原了天然miR34a‑5p在细胞内原本的生物学特性，使其相对于人工化学合成的miRNA类似物而言，更加安全、稳定和天然。

Description

一种可有效抑制骨肉瘤生长的生物重组型miR34a-5p
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种新型的可通过生物工程方法构建、规模化生产重组型的miR34a-5p，即htRNALeu/miR34a-5p。
背景技术
骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是儿童和青少年中最常见的原发性肉瘤，男性发病率高于女性，比例约为2:1左右。从解剖学角度来讲，骨肉瘤最常见的发病部位常位于股骨远端、胫骨和肱骨的近端，且在所有患者中大约有50％至70％左右发生在膝关节周围。目前在临床上，对骨肉瘤主要的治疗手段为新辅助化疗---手术局部肿瘤组织切除---化疗药物维持的治疗方式，此治疗方案给临床患者的预后带来了巨大的改变，极大的降低了患者患肢的截肢比例，且明显的将患者五年生存率从之前的20％至30％左右提升至如今的70％以上。但是，这种治疗方式中通常所使用的化疗药物如甲氨蝶呤、阿霉素和顺铂(或异环磷酰胺)剂量均相对较高，对人体的毒副作用极大，且随着治疗的不断推进，极易降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，甚至可直接对化疗药物产生耐药。因此，对于骨肉瘤患者及科研工作者而言，尽早研发出新型的骨肉瘤治疗药物和治疗方案就显得十分急迫。
miR34a-5p是研究最为广泛和深入的非编码RNA之一，其在众多癌症如骨肉瘤、肺癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌、直肠癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、皮肤癌、食管癌、子宫癌、卵巢癌、尿道癌以及淋巴系统肿瘤中的表达均低于正常水平。正常生理调节情况下，miR34a-5p在转录水平直接受到抑癌蛋白p53的调控，是目前公认的抑癌miRNA，之前已有大量的文献报道指出，miR34a-5p可直接通过调控其下游靶基因如Bcl-2、SIRT1、C-MET、CDK6、CD44以及PDGFRA等而分别调控如增殖、凋亡、周期以及炎症等相应的细胞信号通路，进而发挥出明显的抑制肿瘤作用。Tian Y及其团队通过在人骨肉瘤MG63的研究中发现，在转染miR34a-5p类似物于细胞中后，细胞内凋亡及p53相关的细胞信号通路均发生了明显的改变，并对MG63细胞的生长产生了显著的抑制效果；Wu X等人的研究表明，在人骨肉瘤MG63和Saos-2细胞之中，miR34a-5p可以将细胞增殖相关蛋白Eag1明显抑制而控制肿瘤细胞的生长；Gang L于最近的一篇报道中指出，抑制miR34a-5p在人骨肉瘤U2OS的含量，可以通过减轻细胞凋亡水平和促进细胞黏附作用而提高细胞的增殖水平，相反，当把miR34a-5p转染至U2OS细胞中后，其可通过抑制miR34a-5p的靶标基因DUSP1而将细胞停滞于G0/G1期、增加细胞内细胞凋亡水平并抑制细胞的黏附作用，最终抑制细胞的增殖和生长；Chen X及其团队的研究证实，miR34a-5p可通过抑制生存蛋白(survivin)的表达而调控人骨肉瘤U2OS和Saos-2细胞的增殖作用、细胞周期、细胞凋亡以及细胞对化疗药物的敏感性进而达到对其生长的抑制效果。
随着人们对非编码RNA研究的不断深入及认识的不断加深，miRNA分子在新型的癌症治疗方案中所起到的重要地位也是越来越明显，通过参阅大量文献我们能够清楚的发现，目前不论是在实验室研究阶段还是在临床实践过程中，科研人员所运用的绝大多数miRNA均是通过人工化学合成而来，而利用其它方式获取的miRNA试剂却微乎其微，十分局限。众所周知，通过人工化学方式而合成的miRNA要经过大量、特殊的人工基团修饰才能保证其结构和生物功能的稳定，但随着生产厂商将不同结构的人工化学基团添加至miRNA类似物之中后，这些人工基团本身所拥有的副作用也随之出现，且这些人工修饰基团具体能够对miRNA本身的生物学特性如miRNA的多维结构、理化性质、生物活性以及生物安全性等带来多大的影响和改变，目前也并没有合适的方法和有效的途径可以准确的检测和表述，因此，这些人工修饰的化学基团必定会在研究miRNA的过程中给科研工作者们带来不可忽视的影响。
发明内容
为了克服现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种新型的可通过生物工程方法构建、规模化生产的重组型的miR34a-5p，即htRNALeu/miR34a-5p。该重组型的miR34a-5p可高效表达出成熟的miR34a-5p分子，并显著抑制骨肉瘤细胞的增殖及生长，有效的抑制小鼠原位骨肉瘤的生长及肺转移发生率。
本发明另一目的，提供一种制备htRNALeu/miR34a-5p的方法，以人类来源的运载亮氨酸(Leu)的tRNA作为主要运载体，保留其本生的DHU环和TΨC环等特殊的重要二级结构，然后将tRNA的反密码子区域用pre-miR34a的碱基序列代替，构建出新型的可表达非编码RNA的结构表达平台，即htRNA/pre-miR34a，再把miR34a-5p的碱基序列嵌合在htRNA/pre-miR34a之中，将其结合至表达质粒里，接着再将该表达质粒转染到普通的E.coli体内进行孵育，利用苯酚法收集E.coli体内的总RNA，之后将所收集到的总RNA用快速蛋白液相色谱(FPLC)系统以负离子交换的形式把htRNALeu/miR34a-5p分离、纯化(纯度大于99％)，最后经过脱盐处理，遂可将其直接用于各类实验研究之中。该方法适用于大规模制备重组型miR34a-5p，快速、廉价、高效、安全，具有良好的开发和应用前景。
为实现上述目的本发明采用如下技术方案：
第一方面，提供一种含有人类来源的运载亮氨酸(Leu)的tRNA的重组型的miR34a-5p，即htRNALeu/miR34a-5p，其核苷酸序列如下所示：
ACCAGGAUGGCCGAGUGGUUAAGGCGUUGGACUGGCCAGCUGUGAGUGUUUCUUUGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUGUGAGCAAUAGUAAGGAAGCAAUCAGCAAGUAUACUGCCCUAGAAGUGCUGCACGUUGUUGGCCCGAUCCAAUGGACAUAUGUCCGCGUGGGUUCGAACCCCACUCCUGGUACCA(SEQ ID NO:1)。
第二方面，提供上述htRNALeu/miR34a-5p的制备方法，依次包括如下步骤：
1)重组型htRNALeu/miR34a-5p的设计及该基因PCR的扩增；
2)可表达htRNALeu/miR34a-5p的重组质粒pBSMrnaSeph的构建和提取；
3)将表达htRNALeu/miR34a-5p的重组质粒pBSMrnaSeph转染至E.coli HST08体内；
4)将步骤3)转染了质粒的E.coli HST08在培养基中大量增殖；
5)对E.coli HST08总RNA进行提取，并将htRNALeu/miR34a-5p最终纯化。
优选地，步骤1)中所述的htRNALeu/miR34a-5p的构建是通过RNA二级结构设计网站：http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi设计，tRNA为人类来源的运载亮氨酸(Leu)的tRNA，htRNALeu/miR34a-5p的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。为表达上述重组RNA，首先设计专属性PCR引物以扩增其对应的DNA序列，上游引物序列为：5'-TTGTAACGCTGAATTCACCAGGATGGCCGAGTGGTTAAGGCGTTGGACTGGCCAGCTGTGAGTG-3'(SEQ ID NO:2)，下游引物序列为：5'-CTTTCGCTAAGGATCTGCAGTGGTACCAGGAGTGGGGTTCGAACCCACGCGGACATATGTCCATTGGATCGGGCCAACAACGTGC-3'(SEQ ID NO:3)。
优选地，步骤2)所述的可表达htRNALeu/miR34a-5p的重组质粒pBSMrnaSeph的构建是，用上述PCR获得的重组型htRNALeu/miR34a-5p的相应DNA序列(目的片段)通过EcoRI和PstI两个酶切位点插入表达质粒pBSMrnaSeph中，形成可表达重组型htRNALeu/miR34a-5p的重组pBSMrnaSeph质粒，后将其转化入DH5α感受态细胞中扩增，并提取重组质粒。重组质粒经过测序确认构建成功后，便开始将其大量转化，即利用E.coli HST08大肠杆菌体系来大量表达重组型htRNALeu/miR34a-5p。
优选地，步骤3)所述的将重组质粒pBSMrnaSeph转染至E.coli HST08体内，转染浓度为100ng/10-50μL E.coli HST08。
优选地，步骤4)中转染了重组质粒的E.coli HST08的浓度为10-50μL/400mL培养液，重组质粒在E.coli HST08体内大量复制的孵育时间为12-15h。
优选地，步骤5)中所述的总RNA提取方法为苯酚提取法；对htRNALeu/miR34a-5p的纯化采用快速蛋白质液相色谱(FPLC)技术进行。
第三方面，提供上述htRNALeu/miR34a-5p在制备治疗骨肉瘤药物中的应用。
本发明的有益效果在于：
1、本发明将人类来源的运载亮氨酸(Leu)的tRNA作为主要运载体，保留其本生的DHU环和TΨC环等特殊的重要二级结构，使得其无法被体内的RNA酶识别而遭到降解，进而可高效的在细胞内集聚。
2、本发明从miRNA的生物稳定性、生物保真性以及今后miRNA在临床治疗方面的应用等角度考虑，发明并创造了以生物工程合成技术来生产miRNA的方法。简而言之，我们将人类来源的tRNA作为运载骨架，从其碱基序列中的反密码子处，通过特殊的方式插入各种需要表达的目的miRNA的碱基序列，再通过质粒将该合成结构转运到普通的E.coli体内，经过12h左右的孵育之后，对目的miRNA进行分离、纯化和脱盐处理，从而便可获得能直接使用的生物重组型miRNA，而这些重组miRNA均可通过普通的转染试剂，高效、瞬时转染至细胞或动物体内，以供给不同目的的实验研究使用。更为重要的是，通过本生物工程方法所获取的重组miRNA生物试剂，在保证高产率、高纯度的前提下，由于其从始至终的整个制备过程均是通过以自然界生物体为媒介，进而极高保真度的还原了天然miRNA在细胞内原本的生物学特性，充分的保证了其天然的生物属性，进而使其相对于人工化学合成的miRNA类似物而言，更加安全、稳定和天然。不仅如此，其生产周期短、成本低、产量大和安全性好等优势，使其可大规模应用于实验室细胞及动物实验的研究工作之中，具有良好的开发和应用前景。
附图说明
图1中A是阳性对照RNA，htRNALeu的二级结构示意图，B是htRNALeu/miR34a-5p的二级结构示意图。
图2是利用快速蛋白液相色谱法提纯的过程。A是htRNALeu的提纯过程，B是htRNALeu/miR34a-5p的提纯过程。
图3是利用高效液相色谱法进行纯度检测的过程，A是htRNALeu的纯度检测过程，B是htRNALeu/miR34a-5p的纯度检测过程。
图4是htRNALeu/miR34a-5p可高效表达出成熟的miR34a-5p分子。
图5是htRNALeu/miR34a-5p对骨肉瘤细胞增殖能力的抑制效果。
图6是htRNALeu/miR34a-5p所发挥出的特异性生物学效应。
图7是htRNALeu/miR34a-5p对骨肉瘤细胞凋亡水平的增强效果。
图8是htRNALeu/miR34a-5p对骨肉瘤细胞侵袭能力的抑制效果。
图9是htRNALeu/miR34a-5p对小鼠原位胫骨瘤及其自发性肺转移的抑制效果。A是肿瘤体重，B是肿瘤体积，C是小鼠体重。
具体实施方式
下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南等书中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。(由于阳性对照htRNALeu和htRNALeu/miR34a-5p的获取步骤相同，仅有各自的碱基序列和上下游引物不同，故以下步骤中如遇不同之处时则将详细区分，相同之处时则将只详细叙述htRNALeu/miR34-5p以代表。)
【实例1】可表达htRNALeu/miR34a-5p及其阳性对照htRNALeu重组质粒的构建和扩增
1.htRNALeu/miR34a-5p及其阳性对照htRNALeu二级结构的设计
我们利用人类来源的运载亮氨酸(Leu)的tRNA为htRNALeu/miR34a-5p的结构主体，其二级结构的设计预测(如图1B)通过专业的RNA二级结构设计网站：http:// rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi确定。htRNALeu/miR34a-5p的碱基序列：ACCAGGAUGGCCGAGUGGUUAAGGCG UUGGACUGGCCAGCUGUGAGUGUUUCUUUGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUGUGAGCAAUAGUAAGGAAGCAAUCAGCAAGUAUACUGCCCUAGAAGUGCUGCACGUUGUUGGCCCGAUCCAAUGGACAUAUGUCCGCGUGGGUUCGAACCCCACUCCUGGUACCA。阳性对照htRNALeu的二级结构以同样的方式进行设计(如图1A)，其碱基序列为：ACCAGGAUGGCCGAGUGGUUAAGGCGUUGGACUAGUAAUUUACGUCGACGGUGACGUCGAUGGUUGCGGGAUCCAAUGGACAUAUGUCCGCGUGGGUUCGAACCCCACUCCUGGUACCA。
2.可表达htRNALeu/miR34a-5p及其阳性对照htRNALeu重组质粒的构建
为表达重组型htRNALeu/miR34a-5p，首先设计专属性PCR引物以扩增其对应的DNA序列，上游引物序列为：5'-TTGTAACGCTGAATTCACCAGGATGGCCGAGTGGTTAAGGCGTTGGACTGGCCAGCTGTGAGTG-3'，下游引物序列为：5'-CTTTCGCTAAGGATCTGCAGTGGTACCAGGAGTGGGGTTCGAACCCACGCGGACATATGTCCATTGGATCGGGCCAACAACGTGC-3'。再用上述PCR获得的重组型htRNALeu/miR34a-5p的相应DNA序列(目的片段)通过EcoRI和PstI两个酶切位点插入表达质粒pBSMrnaSeph中，形成可表达重组型htRNALeu/miR34a-5p的重组pBSMrnaSeph质粒，后将其转化入DH5α感受态细胞中扩增，并提取重组质粒，重组质粒经过测序确认构建成功。其阳性对照htRNALeu上游引物序列为：5'-TTGTAACGCTGAATTCACCAGGATGGCCGAGTGGTTAAGGCGTTGGACTAGTAATTTACGTCGACGGTGACGTCGATGGTTGCG-3'，下游引物序列为：5'-CTTTCGCTAAGGATCTGCAGTACCAGGAGTGGGGTTCGAACCCACGCGGACATATGTCCATTGGATCCCGCAACCATCGACGTCAC-3'，其余步骤同重组型htRNALeu/miR34a-5p。
3.htRNALeu/miR34a-5p及其阳性对照htRNALeu的扩增
htRNALeu/miR34a-5p及其阳性对照htRNALeu于E.coli HST08大肠杆菌体系中扩增。
3.1培养基制备
1)以1L ddH2O加入31g 2XYT培养基的比例配置培养液；
2)将充分混匀的2XYT培养液高压灭菌，20mins。
3.2 htRNALeu/miR34a-5p及其阳性对照htRNALeu的扩增
3.2.1 RNA的转化
1)水浴锅42℃预热；
2)将20μl的HST08感受态细胞置于冰上解冻(HST08细胞与RNA质粒混合比例约为：20-50μl:100ng)；
3)待HST08感受态细胞充分解冻后，加入100ng含目的RNA质粒，用枪头小心轻柔的混匀充分；
4)将混匀的HST08-RNA质粒混悬液置于冰上30mins，充分反应；
5)转入42℃水浴锅中热击，45s；
6)快速放置冰上2mins；
7)加入1ml，37℃，无抗生素LB液体培养基，置于恒温振荡培养箱，37℃，225rpm,1h；
8)将充分震荡的1ml菌液加入400ml含氨苄西林(100μg/ml)的2XYT液体培养基中；
9)将2L锥形瓶置于恒温振荡培养箱震荡，37℃，225rpm，过夜(12～15h)。
3.2.2 总RNA抽提
1)将震荡过夜的2XYT液体培养基分装至250ml的塑料瓶中；
2)4℃，10000g，离心10mins；
3)弃上清；
4)每瓶加入5ml浓度为10nM的MgAc-TrisHcl缓冲液，涡旋，充分重悬菌团；
5)将重悬菌液转入50ml离心管中；
6)在通风安全柜中等体积加入苯酚；
7)置于摇床摇晃20～60mins；
8)4℃，10000g，离心10mins；
9)取上清，加入其10％体积浓度为5M的NaCl溶液；
10)4℃，10000g，离心10mins；
11)取上清，加入其2倍体积的无水乙醇，置于-80℃，至少1h，以充分沉淀RNA；
12)4℃，10000g，离心10mins；
13)根据总RNA团块大小，每管加入1～5ml的DEPC水将其溶解；
14)将充分溶解的总RNA悬液分装至1.5ml的EP管中，4℃，10000～15000g，离心15mins；
15)收集上清，并用针头过滤器进行过滤；
16)将收集的总RNA在变性凝胶Urea PAGE上电泳分离，确定总RNA中htRNALeu/miR34a-5p或其阳性对照htRNALeu比例，以确保足以纯化使用。
【实例2】htRNALeu/miR34a-5p及其阳性对照htRNALeu的纯化
将滤过的总RNA溶液使用NGC Quest 10 Plus快速蛋白质液相色谱(FPLC)系统纯化(阴离子交换柱型号及规格为：ENrichTM Q 10×100)，将htRNALeu/miR34a-5p或其阳性对照htRNALeu进行分离(如图2A-2B)，具体步骤如下：
1.平衡离子交换柱，用100％缓冲液A(10nM磷酸钠，pH＝7.0)以4.0ml/min流速平衡ENrichTM Q 10×100阴离子交换柱2个体积；
2.洗脱离子交换柱，用梯度浓度为0～55％的缓冲液B(10nM磷酸钠+1M氯化钠，pH＝7.0)以4.0ml/min流速洗脱30s,随之把缓冲液B的浓度保持在55％洗脱2mins，然后再用10mins将缓冲液B从55％提升至65％；
3.收集htRNALeu/miR34a-5p或其阳性对照htRNALeu，步骤2中随着缓冲液B浓度的不断提升，不同电荷大小的RNA会被依次洗脱，当UV/Vision检测器在260nm处显示的FPLC曲线出现明显的波峰时，所收集的RNA即为htRNALeu/miR34a-5p或其阳性对照htRNALeu；
4.将收集到的htRNALeu/miR34a-5p或其阳性对照htRNALeu在变性凝胶Urea PAGE上电泳分离，大致确定其纯度；
5.将不同批次收集的高纯度htRNALeu/miR34a-5p或其阳性对照htRNALeu溶液样品收集至50ml离心管中；
6.加入其2倍体积的无水乙醇，置于-80℃，至少1h，以充分沉淀RNA；
7.4℃，10000g，离心20mins；
8.小心弃上清，将50ml离心管倒置铺有吸水纸的桌面，10～30mins，风干RNA团块；
9.根据RNA团块大小，每管加入1～5ml的DEPC水将其溶解；
10.将溶解的RNA溶液加入“Centrifuge Filter Unites,30kDa”离心管中；
11. 4℃，7500g，离心10mins；
12.弃除收集管中的废液，并在离心管中加入1.6ml DEPC水，4℃，7500g，离心10mins，重复3次，以清除RNA中过量残存的盐渍；
13.将整个离心管倒置，4℃，1000g，离心2-5mins，收集RNA；
14.NanoDrop 2000测量RNA浓度，htRNALeu/miR34a-5p浓度为3.1×104ng/μl，故1L的培养液可制备重组型htRNALeu/miR34-5p约15.5mg；阳性对照htRNALeu浓度为3×104ng/μl，故1L的培养液可制备重组型htRNALeu约15mg；
15.将收集到的目的RNA在变性凝胶Urea PAGE上电泳分离，再次确定其大致纯度以及均一性。
【实例3】htRNALeu/miR34a-5p及其阳性对照htRNALeu纯度分析
htRNALeu/miR34a-5p及其阳性对照htRNALeu的纯度用Shimadzu LC-20AD高效液相色谱系统进行分析(如图3A-B)，色谱柱型号及规格为：XBridge OST C18,2.5μm,10×50m，缓冲液流速为0.2ml/min，柱温保持为60℃，缓冲液A为：8.6mM TEA和100mM六氟异丙醇水溶液(pH＝8.3)，缓冲液B为：8.6mM TEA和100mM六氟异丙醇甲醇溶液(pH＝8.3)。
1. 16％缓冲液B过柱1min；
2. 22％缓冲液B过柱1min；
3.光电二极管阵列探测器于260nm处检测htRNALeu/miR34a-5p或其阳性对照htRNALeu波形；
4.使用波峰面积计算法评估最终htRNALeu/miR34a-5p及其阳性对照htRNALeu纯度，纯度达到95％以上即为高纯度RNA。
【实例4】htRNALeu/miR34a-5p对骨肉瘤细胞及原位骨肉瘤抑制效果的检测
1.htRNALeu/miR34a-5p可成功表达成熟的miR34a-5p分子
为了验证htRNALeu/miR34a-5p能否在细胞中被成功转染并高效表达出成熟的miR34a-5p分子，我们以脂质体包裹的形式将其转染至人骨肉瘤143B及MG63细胞中，并通过实时定量PCR技术(miR34a-5p上游引物：5'-CGCGCTGGCAGTGTCTTAGCT-3'，下游引物：5'-GTGCAGGGTCGGAGG-3'，逆转录引物：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAACC-3'；内参U6上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；内参GAPDH上游引物：5'-ATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3'，下游引物5'-GCTTCACCACCTTCTTGATGT-3'。)对其进行客观的评价(如图4)。结果表明，htRNALeu/miR34a-5p在人骨肉瘤143B细胞中所表达出成熟的miR34a-5p分子明显增多，高出对照组(Vehicle)和htRNALeu组达600倍左右(P<0.001)；同样，在人骨肉瘤MG63细胞中所表达出成熟的miR34a-5p分子的增长水平与对照组(Vehicle)和htRNALeu组相比，也是达到了400倍左右(P<0.001)，通过以上数据可以明确表明，生物工程方法生产的htRNALeu/miR34a-5p可在人骨肉瘤143B和MG63细胞中成功转染并高效表达出成熟的miR34a-5p分子，发挥出了其有效的药理学作用。
2.htRNALeu/miR34a-5p对抑制骨肉瘤细胞有效性的评价
(1)htRNALeu/miR34a-5p有效抑制骨肉瘤细胞的增殖活性
运用MTT法对htRNALeu/miR34a-5p抑制细胞的增殖作用进行评价。如图5所示，将htRNALeu/miR34a-5p与人骨肉瘤143B和MG63细胞分别孵育0h、24h、48h和72h后，其对人骨肉瘤143B和MG63的抑制效果随着孵育时间的延长而加强(P<0.001)，呈现出明显的时间依赖性。
(2)htRNALeu/miR34a-5p有效抑制其下游靶标蛋白表达
为了进一步研究htRNALeu/miR34a-5p是否能够发挥其特有的生物学作用，我们分别针对为miR34a-5p选定了多个具有代表性的下游直接靶基因所翻译的蛋白进行验证。通过Western Blot技术检测相应的蛋白表达量可知，人骨肉瘤143B细胞及MG63细胞经过10nM的htRNALeu/miR34a-5p孵育48h后，miR34a-5p的下游直接靶基因Bcl-2、SIRT1和C-MET所翻译的蛋白，其表达量在143B和MG63细胞中均被明显的降低了50％～70％左右(图6,p<0.05)。进而清楚的证实，该htRNALeu/miR34a-5p具备且发挥了miR34a-5p分子本有的特异性生物学功能。
(3)htRNALeu/miR34a-5p有效促进骨肉瘤细胞的凋亡水平
我们将转染了10nM的htRNALeu/miR34a-5p人骨肉瘤143B细胞和MG63细胞孵育48h后，运用Annexin V-FITC染色法，通过流式细胞技术分析其对凋亡过程的影响。如图7所示，结果明显表明，经过htRNALeu/miR34a-5p处理后的人骨肉瘤143B和MG63细胞的细胞凋亡水平较htRNALeu组和对照组(Vehicle)均显著升高(P<0.05)，尤其是在晚期凋亡阶段所表现出的效果最为明显。因此我们可以推断，运用生物工程方法所生产的htRNALeu/miR34a-5p可通过诱导细胞凋亡过程，特别是细胞的晚期凋亡而发挥对人骨肉瘤143B和MG63细胞的生长抑制作用。
(4)htRNALeu/miR34a-5p有效抑制骨肉瘤细胞的侵袭能力
我们通过Transwell试剂盒验证htRNALeu/miR34a-5p对人骨肉瘤143B和MG63细胞侵袭能力的影响。结果表明(图8)，与htRNALeu组和对照组(Vehicle)相比，运用htRNALeu/miR34a-5p处理后的人骨肉瘤143B和MG63细胞的细胞侵袭能力显著降低(p<0.001)，故此结果充分表明，生物工程方法生产的人源性htRNALeu/miR34a-5p可以明显抑制人骨肉瘤143B和MG63细胞的侵袭能力。
3.htRNALeu/miR34a-5p对抑制原位骨肉瘤及自发性肺转移有效性的评价
我们利用SCID小鼠作为动物实验模型，研究htRNALeu/miR34a-5p对原位骨肉瘤及其自发性肺转移的抑制效果。小鼠每组各10只，共分为3组，分别为htRNALeu/miR34a-5p组，htRNALeu组和对照组(Vehicle)。小鼠骨肉瘤及自发性肺转移模型所选择的细胞系为具有易成瘤且高侵袭、高转移性的人骨肉瘤143B-luc-GFP细胞，将其原位注入SCID小鼠的胫骨骨髓腔中，以建立原位胫骨骨肉瘤兼自发性肺转移的动物模型，再通过尾静脉注射的方式，利用商业化生产的in vivo-jetPEI体内转染试剂，将htRNALeu/miR34a-5p递送至小鼠体内，从而验证其在动物体内对原位肿瘤生长及自发性肺转移的抑制效果。
首先于实验的第0天将人骨肉瘤143B-luc-GFP细胞接种至SCID小鼠的胫骨骨髓腔内，待第10天通过影像学方法明确原位骨肉瘤已经成功建立后，便开始通过尾静脉给药的方式对其进行htRNALeu/miR34a-5p的注射，用药量按照1.5μg/g体重计算，注射频率和次数分别为2天一次，共9次(当肿瘤体积或直径达到最大伦理范围上限时结束注射)。在最后一次注射后的第2天，将小鼠以颈椎脱臼法行安乐死，仔细沿肿瘤边缘将小鼠的原位骨肉瘤剥离称重及测量体积，结果显示，htRNALeu/miR34a-5p组中原位胫骨骨肉瘤的重量明显低于htRNALeu组和对照组(图9A)，htRNALeu/miR34a-5p组中小鼠原位骨肉瘤的体积明显小于htRNALeu组和对照组(图9B)。进一步通过统计分析可知，从注射的第24天开始各组小鼠间肿瘤体积大小的差异便具有显著的统计学意义，并且一直维持至最后一天(第28天)。在htRNALeu/miR34a-5p的整个静脉注射治疗过程中，小鼠的体重均保持正常，且与对照组相比，差异无统计学意义(图9C)，进而有力的表明了htRNALeu/miR34a-5p具有良好的安全性。
与此同时，我们将小鼠的肺组织仔细摘除并行H&E病理染色切片，以最终确定各组小鼠发生原位骨肉瘤自发性肺转移的数量，通过logistic回归法分析得知(表1)，以对照组中小鼠的自发性肺转移率为参照，与htRNALeu组之间无统计学差异，而与htRNALeu/miR34a-5p组相比，其自发性肺转移率则分别被明显降低(P<0.01)。综合以上动物实验结果可明确证实，htRNALeu/miR34a-5p能有效的抑制小鼠原位胫骨骨肉瘤细胞的生长及其自发性肺转移。
表1.对照组、htRNALeu组和htRNALeu/miR34a-5p组小鼠发生原位胫骨骨肉瘤及其自发性肺转移的比较
。
序列表
<110> 武汉大学中南医院
<120> 一种可有效抑制骨肉瘤生长的生物重组型miR34a-5p
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 192
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
accaggaugg ccgagugguu aaggcguugg acuggccagc ugugaguguu ucuuuggcag 60
ugucuuagcu gguuguugug agcaauagua aggaagcaau cagcaaguau acugcccuag 120
aagugcugca cguuguuggc ccgauccaau ggacauaugu ccgcgugggu ucgaacccca 180
cuccugguac ca 192
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaacgcgaac accaggaggc cgagggaagg cgggacggcc agcggagg 48
<210> 3
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctttcgctaa ggatctgcag tggtaccagg agtggggttc gaacccacgc ggacatatgt 60
ccattggatc gggccaacaa cgtgc 85
<210> 4
<211> 119
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
accaggaugg ccgagugguu aaggcguugg acuaguaauu uacgucgacg gugacgucga 60
ugguugcggg auccaaugga cauauguccg cguggguucg aaccccacuc cugguacca 119
<210> 5
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttgtaacgct gaattcacca ggatggccga gtggttaagg cgttggacta gtaatttacg 60
tcgacggtga cgtcgatggt tgcg 84
<210> 6
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctttcgctaa ggatctgcag taccaggagt ggggttcgaa cccacgcgga catatgtcca 60
ttggatcccg caaccatcga cgtcac 86
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgcgctggca gtgtcttagc t 21
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtgcagggtc ggagg 15
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacacaacc 50
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aacgcttcac gaatttgcgt 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atcaccatct tccaggagcg a 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcttcaccac cttcttgatg t 21

Claims (8)

1.一种含有人类来源的以运载亮氨酸(Leu)的tRNA为运载骨架的重组型miR34a-5p，即htRNALeu/miR34a-5p，其特征在于，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种如权利要求1所述的重组型的miR34a-5p的制备方法，其特征在于，依次包括如下步骤：
1)重组型htRNALeu/miR34a-5p的设计及该基因PCR的扩增；
2)可表达htRNALeu/miR34a-5p的重组质粒pBSMrnaSeph的构建和提取；
3)将表达htRNALeu/miR34a-5p的重组质粒pBSMrnaSeph转染至E.coli HST08体内；
4)将转染了质粒的E.coli HST08在培养基中大量增殖；
5)对E.coli HST08总RNA进行提取，并将htRNALeu/miR34a-5p最终纯化。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述的htRNALeu/miR34a-5p的构建是通过RNA二级结构设计网站：http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/ RNAWebSuite/RNAfold.cgi设计，tRNA为人类来源的运载亮氨酸(Leu)的tRNA，htRNALeu/miR34a-5p的碱基序列如SEQ ID NO:1所示；为表达上述重组RNA，首先设计PCR引物以扩增其对应的DNA序列，上游引物序列为：5'-TTGTAACGCTGAATTCACCAGGATGGCCGAGTGGTTAAGGCGTTGGACTGGCCAGCTGTGAGTG-3'(SEQ ID NO:2)，下游引物序列为：5'-CTTTCGCTAAGGATCTGCAGTGGTACCAGGAGTGGGGTTCGAACCCACGCGGACATATGTCCATTGGATCGGGCCAACAACGTGC-3'(SEQ IDNO:3)。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的可表达htRNALeu/miR34a-5p的重组质粒pBSMrnaSeph的构建是，用上述PCR获得的重组型htRNALeu/miR34a-5p的相应DNA序列通过EcoRI和PstI两个酶切位点插入表达质粒pBSMrnaSeph中，形成可表达重组型htRNALeu/miR34a-5p的重组pBSMrnaSeph质粒，后将其转化入DH5α感受态细胞中扩增，并提取重组质粒；重组质粒经过测序确认构建成功后，便开始将其大量转化，即利用E.coli HST08大肠杆菌体系来大量表达重组型htRNALeu/miR34a-5p。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述的将重组质粒pBSMrnaSeph转染至E.coli HST08体内，转染浓度为100ng/10-50μL E.coli HST08。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中转染了重组质粒的E.coliHST08的浓度为10-50μL/400mL培养液，重组质粒在E.coli HST08体内大量复制的孵育时间为12-15h。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤5)中所述的总RNA提取方法为苯酚提取法；对htRNALeu/miR34a-5p的纯化采用快速蛋白质液相色谱技术进行。
8.权利要求1所述的重组型的miR34a-5p在制备治疗骨肉瘤药物中的应用。
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