KR101014351B1

KR101014351B1 - 세포외 신호조절 키나제의 활성을 저해하는트리아졸릴-벤즈아미드 유도체 또는 이의 약학적으로허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 또는 심혈관계질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101014351B1
Application number: KR1020080075997A
Authority: KR
Inventors: 류성언; 박황서; 반영재; 정대균
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2008-08-04
Filing date: 2008-08-04
Publication date: 2011-02-15
Also published as: KR20100015088A

Abstract

본 발명은 세포외 신호조절 키나제의 활성을 저해하는 트리아졸릴-벤즈아미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 또는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 트리아졸릴-벤즈아미드 유도체는 ERK2과 같은 세포외 신호조절 키나제의 활성을 효과적으로 저해하므로 이들의 활성에 의해 유발되는 유방암, 난소암, 자궁암, 전립선암, 고환암, 비뇨생식기암, 식도암, 후두암, 교모세포종, 신경모세포종, 위암, 피부암, 각질극세포종, 폐암 표피양암종, 대세포 암종, 소세포 암종, 폐 선암종, 골암, 결장암, 선종, 췌장암, 선암종, 갑상선암, 여포성 암종, 미분화 암종, 유두양 암종, 정상피종, 흑색종, 육종, 방광암종, 간 암종, 담즙성 계대접종, 신장 암종, 모발상 세포암, 인두암, 순암, 설암, 구강암, 소장암, 결장암, 대장암, 직장암, 뇌 및 중추신경계암 및 백혈병 등의 암 또는 허혈성 뇌졸중, 동맥경화, 뇌경색 등의 심혈관계 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

ERK2, 세포외 신호조절 키나제, 암, 허혈성 뇌졸중, 트리아졸릴-벤즈아미드 유도체

Description

세포외 신호조절 키나제의 활성을 저해하는 트리아졸릴-벤즈아미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 또는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for prevention or treatment of cancer or cardiovascular disease containing triazolyl-benzamide derivatives or pharmaceutically acceptable salts thereof inhibiting ERK2 as an active ingredient}

본 발명은 세포외 신호조절 키나제, 바람직하게는 세포외 신호조절 키나제 2의 활성을 저해하는 트리아졸릴-벤즈아미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 또는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

외부 자극에 의한 세포내 신호전달계에는 상호작용을 하는 많은 단백질들이 관여한다. 특히 성장 인자의 자극에 의한 신호전달계(signal transduction cascade)의 변화는 세포 변형(transformation)이나 세포 증식에 영향을 미치는 것 으로 알려져 있다. 성장 인자에 의한 자극은 세포막에 존재하는 수용체에 의하여 일련의 신호전달계를 거쳐 반응으로 나타난다. 이러한 신호전달계는 세포막에 존재하는 성장 인자 수용체와 세포질내 단백질 키나제의 두 단계로 크게 나눌 수 있다. 첫 단계는 세포막에서 성장인자 수용체와 연결 분자(GRB2), guanine nucleotide exchange factor(mSOS)를 통한 GTP 결합 단백질(Ras단백질)이 관여하며, 둘째 단계는 연속적인 세포질내 단백질 키나제의 활성이 일어나고 활성화된 단백질 키나제가 핵내로 이동하여 유전자 발현을 증가시킨다. 이러한 연속적인 세포질내 단백질 키나제를 분열제활성 단백질 키나제(mitogen-activated protein kinase: MAPK) 신호전달계라고 한다.

척추동물 세포에서는 세포외 신호조절 키나제(extracellular signal regulated kinase: ERK), JNK/SAPK, 그리고 p38의 독립적인 3가지 경로의 MAPK 신호전달계가 알려져 있다. ERK 경로는 주로 세포의 증식, 분화 및 생존 등의 반응을 촉발시키는 성장 인자에 의하여 활성화된다.

수용체 티로신 키나제(receptor tyrosine kinase: RTK)에 성장 인자가 결합하면 활성 Ras-GTP가 형성되고 이후 Raf, MEKK(MAPK kinase kinase), MEK(MAPK kinase), ERK(MAPK)이 차례로 활성화된다. 활성화된 ERK는 핵내로 이동하여 ternary complex factor(TCF) 또는 Elk를 인산화시키며, 인산화된 TCF/Elk은 serum-response factor(SRF)와 함께 c-fos gene의 조절부위인 serum-response element(SRE)에 결합하여 c-fos 전사를 활성화시킨다. 또한 ERK는 다른 단백질 키나제(예: p90rsk), 세포골격 단백질(예: microtubuleassociated proteins), 효소 (예: cytoplasmic phospholipase A2) 등의 기능을 조절하여 세포내 신호전달계에 핵심적인 역할을 하는 중간매개 산물로 생각되고 있다.

ERK에는 ERK-1(p44MAPK), ERK-2(p42MAPK)의 이성체와 이형 형태인 MAPK(p40MAPK)가 있다. ERK-1과 ERK-2는 기질의 특이성에 약간의 차이가 있을 뿐 기능적으로는 같다고 여겨진다.

성장 인자에 의한 ERK 경로의 활성은 일시적이어서 5분 내에 최대 수준에 도달하며, 30-60분내에 원래의 수준으로 회복된다. 그러므로 ERK의 지속적인 활성은 종양형성에 관련된 세포 내 신호전달계에서 중요한 역할을 담당할 것으로 예상된다. 그 이유는 첫째, 이 신호전달계를 활성화시키는 ras 유전자의 돌연변이와 그 활성기전이 많은 종류의 암종에서 밝혀졌기 때문이다. 둘째, ERK 경로에 속한 유전자 산물들은 유전자 조절물질이며, 이들 중에는 세포분열에 관여하는 유전자들도 존재한다는 사실에 근거하고 있다. 최근 연구에서 다양한 종류의 암종(유방암종, 신장암종 등)에서 ERK의 과발현이나 활성이 알려졌다.

단백질 활성화 효소(protein kinase; PK)의 일종인 세포외 신호조절 키나제 2(extracellular signaling-regulated kinase 2; 이하, ERK2)는 세포의 성장, 분화 및 사멸에 있어서 중요한 신호전달 매개체로 작용한다(Oncogene 26:3227-3239, 2007; Curr Opin Pharmacol 7:77-85, 2007). 상기 생물학적인 기전이 중요하게 작용하는 암, 뇌졸중 및 면역질환 등에서 ERK2의 활성은 질환의 발생 및 진전과 깊은 관계가 있다(Biochem Biophys Res Commun 336:357-363, 2005; Curr Med Chem 14:2214-2234, 2007). 따라서 ERK2 활성도를 효과적으로 저해하는 약물은 이들 질병의 치료제로서 사용될 가능성이 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 다양한 세포외 신호조절 키나제는 과잉 발현되거나 활성이 변경되는 경우에는 다양한 질병의 진행이 유발되는 것으로 알려져 있다. 특히, ERK2는 유방암, 난소암, 자궁암, 전립선암, 고환암, 비뇨생식기암, 식도암, 후두암, 교모세포종, 신경모세포종, 위암, 피부암, 각질극세포종, 폐암 표피양암종, 대세포 암종, 소세포 암종, 폐 선암종, 골암, 결장암, 선종, 췌장암, 선암종, 갑상선암, 여포성 암종, 미분화 암종, 유두양 암종, 정상피종, 흑색종, 육종, 방광암종, 간 암종, 담즙성 계대접종, 신장 암종, 모발상 세포암, 인두암, 순암, 설암, 구강암, 소장암, 결장암, 대장암, 직장암, 뇌 및 중추신경계암 및 백혈병 등의 암 또는 허혈성 심혈관계 질환의 발생 및 진전과 관련된다고 알려졌다. 따라서, 이들 세포외 신호조절 키나제를 억제하는 물질의 개발은 특정 유형의 질병, 예를 들면, 당뇨병, 자가면역 질병, 다양한 형태의 암 또는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 세포외 신호조절 키나제의 활성을 저해하는 화합물을 개발하기 위하여 예의 연구한 결과 도킹 시뮬레이션(docking simulation)을 이용한 구조 바탕 가상 탐색(structure-based virtual screening) 등을 포함하는 컴퓨터를 이용한 신약설계 프로토콜(Computer-aided drug design protocol)을 통하 여 세포외 신호조절 키나제를 저해할 수 있는 화합물을 찾아내고 생체외 효소 실험에 의해 세포외 신호조절 키나제의 저해활성을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 세포외 신호조절 키나제의 활성을 저해하는 트리아졸릴-벤즈아미드 유도체 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 암 또는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포외 신호조절 키나제, 바람직하게는 세포외 신호조절 키나제 2의 활성을 저해하는 트리아졸릴-벤즈아미드 유도체 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 암 또는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 트리아졸릴-벤즈아미드 유도체는 ERK2과 같은 세포외 신호조절 키나제의 활성을 효과적으로 저해하므로 이들의 활성에 의해 유발되는 유방암, 난소암, 자궁암, 전립선암, 고환암, 비뇨생식기암, 식도암, 후두암, 교모세포종, 신경모세포종, 위암, 피부암, 각질극세포종, 폐암 표피양암종, 대세포 암종, 소세포 암종, 폐 선암종, 골암, 결장암, 선종, 췌장암, 선암종, 갑상선암, 여포성 암종, 미분화 암종, 유두양 암종, 정상피종, 흑색종, 육종, 방광암종, 간 암종, 담즙성 계대접종, 신장 암종, 모발상 세포암, 인두암, 순암, 설암, 구강암, 소장암, 결 장암, 대장암, 직장암, 뇌 및 중추신경계암, 백혈병 등의 암; 또는 허혈성 뇌졸중, 동맥경화, 뇌경색 등의 심혈관계 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 세포외 신호조절 키나제 활성을 억제하는 하기 화학식 1의 유도체를 유효성분으로 하는 암 또는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 식에서,

R은 C₅~C₁₀의 아릴, 질소 및 산소 원자 중 1 이상을 포함하는 C₄~C₁₀ 헤테로아릴 또는 C₅~C₁₀ 아릴 C₂~C₄알케닐이다.

바람직하게는, 상기 R은 C₅~C₇의 아릴, 1 이상의 산소 원자를 포함하는 C₄~C₇ 헤테로아릴 또는 C₅~C₇ 아릴 C₂~C₄알케닐이다.

더욱 바람직하게는, 상기 R은 페닐, 퓨라닐 또는 페닐에테닐이다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 보다 구체적으로 예시하면 다음과 같다:

(1) N,N'-(1-페닐-1H-1,2,4-트리아졸-3,5-디일)디벤즈아미드;

(2) N-{1-페닐-3-[(페닐카보닐)아미노]-1H-1,2,4-트리아졸-5-일}퓨란-2-카복사미드; 및

(3) N-(1-페닐-5-{[(2E)-3-페닐프로프-2-에노일]아미노}-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)벤즈아미드.

상기 화합물들의 화학구조식을 표 1에 정리하였다.

화합물	화학구조식
1
2
3

본 발명에 따른 화학식 1의 유도체는 또한 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 제공될 수 있다. 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 히드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 히드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-히드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1의 유도체를 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다.

동량의 화학식 1의 유도체 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고, 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명의 화합물들은 또한 용매화물, 특히 수화물의 형태로 제공될 수도 있다. 수화는 상기 화합물을 분리하는 동안 일어나거나, 또는 화합물의 흡습성으로 인해 시간이 경과함에 따라 일어날 수 있다.

본 발명의 화학식 1의 유도체는 세포외 신호조절 키나제, 특히 ERK2의 활성을 억제하는 효능을 갖는다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 다양한 세포외 신호조절 키나제는 과잉 발현되거나 활성이 변경되는 경우에는 다양한 질병의 진행이 유발되는 것으로 알려져 있다. 특히, ERK2는 유방암, 난소암, 자궁암, 전립선암, 고환암, 비뇨생식기암, 식도암, 후두암, 교모세포종, 신경모세포종, 위암, 피부암, 각질극세포종, 폐암 표피양암종, 대세포 암종, 소세포 암종, 폐 선암종, 골암, 결장암, 선종, 췌장암, 선암종, 갑상선암, 여포성 암종, 미분화 암종, 유두양 암종, 정상피종, 흑색종, 육종, 방광암종, 간 암종, 담즙성 계대접종, 신장 암종, 모발상 세포암, 인두암, 순암, 설암, 구강암, 소장암, 결장암, 대장암, 직장암, 뇌 및 중추신경계암 및 백혈병 등의 암 또는 허혈성 뇌졸중의 발생 및 진전과 관련된다고 알려졌다. 따라서, 이들 세포외 신호조절 키나제를 억제하는 물질의 개발은 특정 유형의 질병, 예를 들면, 당뇨병, 자가면역 질병, 다양한 형태의 암 또는 허혈성 뇌졸중, 동맥경화, 뇌경색 등의 심혈관질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 화학식 1의 유도체를 재조합된 ERK2에 넣고 저해활성을 측정할 결과, ERK2에 대한 저해 활성이 8.3~21.1μM으로 나타남으로써 종래 ERK2 저해제(SB220025)의 저해 활성(19 μM)보다 동등하거나 약 2.5배 이상 더 높은 저해 활성을 나타냄을 알 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 화학식 1의 유도체는 세포외 신호조절 키나제에 대하여 효과적인 저해 활성을 나타내므로 ERK2에 의해 유발되는 암 또는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 암은 유방암, 난소암, 자궁암, 전립선암, 고환암, 비뇨생식기암, 식도암, 후두암, 교모세포종, 신경모세포종, 위암, 피부암, 각질극세포종, 폐암 표피양암종, 대세포 암종, 소세포 암종, 폐 선암종, 골암, 결장암, 선종, 췌장암, 선암종, 갑상선암, 여포성 암종, 미분화 암종, 유두양 암종, 정상피종, 흑색종, 육종, 방광암종, 간 암종, 담즙성 계대접종, 신장 암종, 모발상 세포암, 인두암, 순암, 설암, 구강암, 소장암, 결장암, 대장암, 직장암, 뇌 및 중추신경계암, 백혈병 등인 것이 바람직하다.

또한, 상기 심혈관계 질환은 허혈성 뇌졸중, 동맥경화, 뇌경색 등인 것이 바람직하다.

상기 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다. 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 캅셀제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상 적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다.

상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 목적하는 바에 따라 정맥내, 근육내 등의 경로를 통해 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 화학식 1의 유도체는 하루에 체중 1 ㎏당 0.01 내지 100 ㎎, 바람직하게는 0.1 내지 50 ㎎의 양을 1회 내지 수 회로 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법 및 배설 그리고 약제 혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 세포외 신호조절 키나제 ( ERK2 ) 억제 화합물의 선별

ERK2의 활성부위를 인식하는 화학구조를 도킹 시뮬레이션을 이용한 가상 스크리닝(virtual screening) 방법으로 선별하였다.

먼저, 문헌(Ohori, M at al., Biochem, Biophys. Res. comm. 2005, 336, 357)로부터 수용체 모델로서 ERK2와 이의 저해제 FR180204가 결합된 X선 결정구조의 3차원 구조(PBD code: 1TVO)를 선택하였다. 이후, 리간드(FR180204)와 용매 분자를 삭제하고 단백질 원자 각각에 수소 원자를 첨가하였다. 다음으로, 상기 ERK2의 X선 구조에서 이온화가능한 Asp, Glu, His 및 Lys 잔기가 양성자화 상태가 되도록 배열하였다. 일반적으로 수소결합이 존재하는 3.5 Å 이내 거리에서 수소결합을 수용할 수 있는 산소 원자 쪽으로 위치한 Asp 및 Glu 잔기의 측쇄(side chain)들은 중성이 되는 것으로 가정하였다.

구체적으로 약 8만5천여 개의 천연 화합물 및 합성 화합물 화학구조를 포함하는 인터바이오스크린 데이타베이스(http://www.ibscreen.com)에서 입수하여 AutoDock 프로그램을 통해 상기 ERK2의 ATP 결합 사이트의 3차원 구조에 도킹(docking)함으로써 상기 결합 사이트에서 아미노산과 화합물간의 결합에너지를 측정하여 결합친화성(binding affinity)을 스코어(score) 및 순위(rank)로 나타내었다. 이중 스코어가 높은 화합물로서 화학식 1의 유도체를 얻었으며, 구체적으로

(1) N,N'-(1-페닐-1H-1,2,4-트리아졸-3,5-디일)디벤즈아미드;

(3) N-(1-페닐-5-{[(2E)-3-페닐프로프-2-에노일]아미노}-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)벤즈아미드를 얻었다. 상기 화합물은 인터바이오스크린사로부터 입수할 수 있다.

< 실시예 2> 세포외 신호조절 키나제 저해 활성 측정

ERK 저해 활성 측정 실험은 문헌(Ohori, M at al., Biochem, Biophys. Res. comm. 2005, 336, 357)에 제안된 방법으로 수행하였다.

먼저, 소의 마이엘린염기성단백질(myelin basic protein, MBP) 용액을 인산염생리식염완충액(phospate-buffered saline; PBS)에 희석시킨 후, Nunc-Immuno 96 마이크로웰 플레이트(MaxiSorpTM)의 각 웰(1 ㎍/well)에 코팅하였다. 상기 플레이트들을 300 ㎕의 PBST(0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS)로 세척한 후 각 웰에 100 ㎕의 블로킹 완충액(3% 소 혈청 알부민을 함유하는 PBST)을 첨가하였다. 이후, 이 플레이트들을 상온에서 1시간 동안 배양시켰다.

실험군 화합물은 가상 스크리닝을 통하여 선택(화합물 1~3)하였으며, 마그네슘/ATP cocktail 기질과 재조합된 ERK2를 7.2 pH를 갖는 실험용 희석 완충액(20 mM 4-모폴린프로판설폰산(MOPS), 25 mM β-글리세롤 포스페이트, 5 mM 에틸렌글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), 1 mM Na3VO4, 1 mN 이티오트레이톨(DTT) 및 0.005% 소 혈청 알부민 포함)으로 희석시켰다. 이러한 희석된 혼합물을 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 판경계 대조군(inter-plate control) 및 바탕 등급 결정을 위해 키나제 끄는 기(kinase-withdrawal group), 운반기 및 양성 대조군 SB220055가 사용되었다.

상온에서 1시간 배양시킨 후, 1차 항포스포-MBP 항체를 적절한 농도의 블로킹 완충액(1:20,000 v/v)으로 희석시켰다. 다음으로 희석한 항체를 플레이트의 각 웰에 옮긴 다음 블로킹 완충액(1:5,000 v/v)으로 희석시킨 2차 항마우스 HRP 결합된 다중클론 항체를 첨가하였다. 이후 각 웰에 o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드(OPD) 기질 혼합 용액을 첨가하고 플레이트들을 10분 동안 배양시켰다. 효소반응을 2.5 M 황산으로 종결지시고, 490 nm에서 HRP 활성을 측정하였다.

측정 결과를 표 2에 나타내었다.

구분	IC₅₀ (μM)
양성대조군(SB220025)	19.0
화합물 1	8.3
화합물 2	18.3
화합물 3	21.1

표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 1의 유도체는 ERK2에 대한 저해 활성이 8.3~21.1μM으로 나타남으로써 종래 ERK2 저해제(SB220025)의 저해 활성(19 μM)보다 동등하거나 약 2.5배 이상 더 높은 저해 활성을 나타냄을 알 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 화학식 1의 유도체는 세포외 신호조절 키나제에 대하여 효과적인 저해 활성을 나타내므로 ERK2에 의해 유발되는 암 또는 심혈관계 질환등의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

< 제제예 1> 정제(직접 가압)

화학식 1의 유도체 5.0 ㎎을 체로 친 후, 락토스 14.1 ㎎, 크로스포비돈 USNF 0.8 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 0.1 ㎎을 혼합하고 가압하여 정제로 제조하였다.

< 제제예 2> 정제(습식 조립)

화학식 1의 유도체 5.0 ㎎을 체로 친 후, 락토스 16.0 ㎎과 녹말 4.0 ㎎을 섞었다. 폴리솔베이트 80 0.3 ㎎을 순수한 물에 녹인 후 이 용액의 적당량을 첨가한 다음, 미립화하였다. 건조 후에 미립을 체질한 후 콜로이달 실리콘 디옥사이드 2.7 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 2.0 ㎎과 섞었다. 미립을 가압하여 정제로 제조하였다.

< 제제예 3> 분말과 캡슐제

화학식 1의 유도체 5.0 ㎎을 체로 친 후에, 락토스 14.8 ㎎, 폴리비닐 피롤리돈 10.0 ㎎, 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎와 함께 혼합하였다. 상기 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 단단한 No. 5 젤라틴 캡슐에 채웠다.

< 제제예 4> 주사제

화학식 1의 유도체 100 mg을 함유시키고, 그 밖에도 만니톨 180 mg, Na₂HPO₄·12H₂O 26 mg 및 증류수 2974 mg를 함유시켜 주사제를 제조하였다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 트리아졸릴-벤즈아미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물:

[화학식 1]

.

(상기 식에서,

R은 C₅~C₁₀의 아릴, 질소 및 산소 원자 중 1 이상을 포함하는 C₄~C₁₀ 헤테로아릴 또는 C₅~C₁₀아릴 C₂~C₄알케닐이다)
제1항에 있어서, 상기 R은 C₅~C₇의 아릴, 1 이상의 산소 원자를 포함하는 C₄~C₇ 헤테로아릴 또는 C₅~C₇아릴 C₂~C₄알케닐인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 R은 페닐, 퓨라닐 또는 페닐에테닐인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유도체는

(1) N,N'-(1-페닐-1H-1,2,4-트리아졸-3,5-디일)디벤즈아미드;

(2) N-{1-페닐-3-[(페닐카보닐)아미노]-1H-1,2,4-트리아졸-5-일}퓨란-2-카복사미드; 및

(3) N-(1-페닐-5-{[(2E)-3-페닐프로프-2-에노일]아미노}-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)벤즈아미드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 암은 유방암, 난소암, 자궁암, 전립선암, 고환암, 비뇨생식기암, 식도암, 후두암, 교모세포종, 신경모세포종, 위암, 피부암, 각질극세포종, 폐암 표피양암종, 대세포 암종, 소세포 암종, 폐 선암종, 골암, 결장암, 선종, 췌장암, 선암종, 갑상선암, 여포성 암종, 미분화 암종, 유두양 암종, 정상피종, 흑색종, 육종, 방광암종, 간 암종, 담즙성 계대접종, 신장 암종, 모발상 세포암, 인두암, 순암, 설암, 구강암, 소장암, 결장암, 대장암, 직장암, 뇌 및 중추신경계암 및 백혈병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 유도체는 세포외 신경조절 키나제(ERK2)의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 트리아졸릴-벤즈아미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 허혈성 뇌졸중, 동맥경화 및 뇌경색으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:

[화학식 1]

.

(상기 식에서,

R은 C₅~C₁₀의 아릴, 질소 및 산소 원자 중 1 이상을 포함하는 C₄~C₁₀ 헤테로아릴 또는 C₅~C₁₀아릴 C₂~C₄알케닐이다)
제8항에 있어서, 상기 R은 C₅~C₇의 아릴, 1 이상의 산소 원자를 포함하는 C₄~C₇ 헤테로아릴 또는 C₅~C₇아릴 C₂~C₄알케닐인 것을 특징으로 하는 허혈성 뇌졸중, 동맥경화 및 뇌경색으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 R은 페닐, 퓨라닐 또는 페닐에테닐인 것을 특징으로 하는 허혈성 뇌졸중, 동맥경화 및 뇌경색으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 유도체는

(1) N,N'-(1-페닐-1H-1,2,4-트리아졸-3,5-디일)디벤즈아미드;

(2) N-{1-페닐-3-[(페닐카보닐)아미노]-1H-1,2,4-트리아졸-5-일}퓨란-2-카복사미드; 및

(3) N-(1-페닐-5-{[(2E)-3-페닐프로프-2-에노일]아미노}-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)벤즈아미드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 허혈성 뇌졸중, 동맥경화 및 뇌경색으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 화학식 1의 유도체는 세포외 신경조절 키나제(ERK2)의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 허혈성 뇌졸중, 동맥경화 및 뇌경색으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.