JP2011514148A - パーキンソン病の予防および処置用の候補化合物を同定するための熱変性スクリーニングアッセイ - Google Patents

Abstract

パーキンソン病の予防および処置のための候補化合物を同定するための熱変性スクリーニングアッセイ。本発明は、パーキンソン病の処置に有用な物質を同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイを提供する。一実施形態では、該アッセイは、それぞれが被検化合物およびパーキンタンパク質を含む複数の被験サンプルを熱不安定化条件に曝露すること、および被験サンプル中のパーキンリガーゼ活性を、被験物質を含まないコントロールサンプルと比較して決定することを含む。パーキンリガーゼ活性が該コントロールサンプルのリガーゼ活性を上回る被験サンプル中に含まれる被験物質は、パーキンソン病の処置のための候補化合物と同定される。

Description

関連出願の引用
本願は、２００８年１月３１日に出願したＵＳ ６１／０２５，２３１号の利益を主張する。ＵＳ ６１／０２５，２３１号の内容は、本明細書中に参考として援用される。

分野
パーキンソン病を処置するための物質を同定するスクリーニングアッセイを提供する。本発明は、医療および薬剤開発の分野に応用される。

背景
パーキンソン病（ＰＤ：Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）は、神経病理学的には黒質のドーパミンニューロンの脱落を特徴とする神経障害である。こうしたニューロンの脱落は臨床的には運動緩慢、固縮および／または振戦などの動作の変化として現れる（非特許文献１）。ヒト遺伝学的データからは、ＰＤの発症と関連している遺伝子が同定されている。そうした遺伝子の１つの位置が若年発症患者のコホートを用いて６番染色体に決定され、パーキンタンパク質と特定された（非特許文献２）。パーキンタンパク質はユビキチンプロテアソーム経路（ＵＰＳ：ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｐａｔｈｗａｙ）で機能するＥ３リガーゼタンパク質である（非特許文献３）。ＵＰＳは標的タンパク質の分解除去に関与する主要な細胞経路であり、Ｅ３リガーゼは基質を識別および標識して細胞内のプロテアソーム（非特許文献４）またはリソソーム（非特許文献５）による分解に導く働きをする。

ＰＤのもう１つの特徴はレビー小体と呼ばれる不溶性タンパク質の細胞封入体の存在である。レビー小体は多くのタンパク質からなるが、最も代表的なものはαシヌクレインタンパク質である（非特許文献６）。αシヌクレイン遺伝子に点突然変異または重複が生じると、ＰＤの原因となる（非特許文献７；非特許文献８）。

パーキンソン病を処置する新しい治療薬の一刻も早い開発が求められている。本発明は、新規な治療薬などパーキン活性を調節する物質を同定し確認するのに有用な新しい方法および材料を提供する。

Ｇｅｌｂ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５６：３３−３９，（１９９９） Ｋｉｔａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９２：６０５−６０８（１９９８） Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２５：３０２−３０５（２０００） Ｈｅｒｅｓｈｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：４２５−４７９（１９９８） Ｈｉｃｋｅ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：１０７−１１２（１９９９） Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８８：８３９−４０（１９９７） Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：２０４５−７（１９９７） Ｋｒｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１８：１０６−８（１９９８）

発明の簡単な説明
本発明は、パーキンソン病を予防および処置する候補化合物を同定するためのインビトロスクリーニングアッセイを提供する。パーキンタンパク質（「パーキン」）については、パーキンリガーゼ活性を低下させる条件（「熱不安定化条件」）に曝露する。熱不安定化条件への曝露は、被験物質の存在下または非存在下で行う。パーキンリガーゼ活性を維持する物質はパーキンソン病の処置の候補化合物となる。

一態様では、本発明は、ａ）それぞれがｉ）パーキンタンパク質およびｉｉ）複数の被験物質のうちの１種を含む複数の被験サンプルを熱不安定化条件に曝露するステップ；ｂ）前記被験サンプル中のパーキンリガーゼ活性を、被験物質の非存在下で熱不安定化条件に曝露したパーキンタンパク質を含むコントロールサンプルと比較して決定し、パーキンリガーゼ活性がコントロールサンプル中のリガーゼ活性を上回る被験サンプル中に含まれる被験物質を、パーキンソン病を処置する候補化合物と同定するステップなどを含むスクリーニングアッセイを提供する。一実施形態では、被験物質の非存在下で熱不安定化条件に曝露したパーキンは、その当初のＥ３リガーゼ活性の４０〜７０％を維持する。熱不安定化条件の例として、４５℃〜６０℃の温度で３０分〜１８０分間のインキュベーションが挙げられる。一例として、インキュベーションは約５７℃で約９０分間または約６０℃で約１５０分間であってもよい。

このアッセイでは、適切な緩衝液中でパーキンタンパク質、ユビキチン活性化酵素Ｅ１、ユビキチン結合酵素Ｅ２、ＡＴＰ、ユビキチンおよびパーキン基質を組み合わせて、組み合わせたものを２０〜３７℃でインキュベートし、パーキン基質のユビキチン化の速度または程度を測定することでパーキンリガーゼ活性を測定することができる。パーキン基質の例として、Ｓ５ａ（たとえば、ＧＳＴ−Ｓ５ａ）、セプチン４およびトロポニン１が挙げられる。

このアッセイでは、ドナー発色団がユビキチンに結合し、アクセプター発色団がパーキン基質に結合しているか、またはドナー発色団がパーキン基質に結合し、アクセプター発色団がユビキチンに結合している蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）アッセイによりパーキンリガーゼ活性を決定してもよい。実施形態の１つでは、ドナー発色団はユーロピウムクリプレート（ｅｕｒｏｐｉｕｍ ｃｒｙｐｌａｔｅ）であり、アクセプター発色団はアロフィコシアニンである。実施形態の１つでは、パーキン基質はＳ５ａである。ある形態のアッセイでは、対応する被験サンプルのパーキンリガーゼ活性に応じて候補化合物をランク付けする。

パーキン安定剤であるパーキン活性の正のモジュレーターは、前記化合物の存在下および非存在下で減弱していないパーキンタンパク質をインキュベートすることでパーキンアゴニストである候補化合物と識別することができ、パーキンリガーゼ活性を増大させる化合物をパーキンアゴニストと同定し、パーキンリガーゼ活性を増大させない化合物をパーキン安定剤と同定する。

一態様では、本発明は、（ａ）パーキンの正のモジュレーターを同定すること；（ｂ）パーキン以外のＥ３リガーゼタンパク質およびパーキン基質タンパク質を基質がユビキチン化される条件下で一緒にインキュベートすること；（ｃ）（ｂ）の条件下、Ｅ３リガーゼタンパク質およびパーキン基質タンパク質をパーキン活性の正のモジュレーターの存在下で一緒にインキュベートすること；（ｄ）正のモジュレーターの存在下と非存在下とでＥ３リガーゼのリガーゼ活性を比較することにより、正のモジュレーターが存在するときにＥ３リガーゼ活性が増大すると、正のモジュレーターがパーキンに完全には特異的でないことが示唆され、増大がないときは正のモジュレーターがパーキンに完全に特異的であることが示唆される、パーキン活性の正のモジュレーターの特異性を評価するインビトロ法を提供する。ある形態のアッセイでは、正のモジュレーターの存在下で基質のユビキチン化の増大は、正のモジュレーターがパーキンについては完全には特異的でないが正のモジュレーターが不完全に特異的であることを示し、ここで、不完全に特異性（ｐａｒｔｉａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）とは、非パーキンＥ３についてのＥＣ１０が１００マイクロモル以下であり、パーキンについてのＥＣ１０よりも少なくとも４倍大きいことと定義される。

アッセイに使用されるパーキン基質の例としては、Ｓ５ａおよびトロポニン１がある。アッセイのＥ３リガーゼタンパク質の例としては、ＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼ、Ｍｄｍ２、Ｎｅｄｄ４、Ｍｕｒｆ１およびＥ６ＡＰが挙げられる。

一態様では、本発明は、（ａ）パーキン活性の正のモジュレーターを同定する；（ｂ）（ａ）の正のモジュレーターをパーキン安定剤またはパーキンアゴニストと同定する；（ｃ）パーキン以外のＥ３リガーゼによるパーキン基質のユビキチン化に対するモジュレーターの作用に基づきパーキン特異的である正のモジュレーターを選択する（ｄ）パーキンによる複数のパーキン基質のユビキチン化を正に調節する能力に基づき基質特異的でない正のモジュレーターを選択することでパーキンソン病を処置する化合物を選択する方法を提供する。ある種の実施形態では、パーキン基質として、セプチン４、あるいはセプチン４およびＳ５ａまたはトロポニン１の一方または両方が挙げられる。

一態様では、本発明は、パーキンソン病を処置する方法であって、そうした処置を必要とする患者に、本発明の方法により同定された候補化合物を投与するか、またはそうした候補化合物の誘導体を投与することを含む方法を提供する。

図１は、パーキン安定剤およびアゴニストを対象としたＴＲ−ＦＲＥＴアッセイの説明図である。 図２は、パーキンの熱不安定化後のパーキンリガーゼアッセイの結果を示し、パーキン熱安定性の変化点が４２℃〜４７℃であることを示す。 図３は、熱変性アッセイの結果を示す。 図４は、Ｓ５ａを基質としたパーキンおよびｍｄｍ２ Ｅ３リガーゼ活性に対する化合物の作用を示すグラフを示す。この化合物はパーキン活性を増大させ、そのＥＣ５０は２．８ｕＭであったが、ｍｄｍ２のＥ３リガーゼ活性については増大させなかった。

詳細な説明
ヒトのパーキンタンパク質の活性が低下すると、黒質のドーパミン作動性ニューロンが徐々に脱落し、最終的にはパーキンソン病を発症することになる。パーキン活性の低下を回復させたり、抑制したり、または防止したりする物質はパーキンソン病を処置および予防する候補化合物であることが判明している。本発明は、そうした物質を同定するスクリーニングアッセイおよび他の方法を提供する。

パーキンタンパク質はＥ３（ユビキチン）リガーゼである。パーキンは、ユビキチン活性化酵素Ｅ１およびユビキチン結合酵素Ｅ２と共にタンパク質をユビキチン／プロテアソームタンパク質分解経路に誘導する働きをする。Ｅ１酵素はＡＴＰを使用してユビキチンを活性化してコンジュゲートし、ユビキチンをＥ２酵素に移す。パーキンはＥ２酵素と相互作用し、ユビキチンを標的タンパク質のリジンのε−アミノ基に移すことで、標的タンパク質をユビキチン化する。ユビキチン化された基質にユビキチン部分が連続的に付加されることでポリユビキチン鎖を形成することができる。パーキンリガーゼ活性については、ユビキチン化の速度または程度を測定することによりインビトロでのアッセイが可能である。

一態様では、本発明のスクリーニングアッセイでは、それぞれがパーキンタンパク質および複数の被験物質のうちの１種を含む複数の被験サンプルを採取し、被験サンプルを熱不安定化条件（すなわち、未変性のパーキンタンパク質のリガーゼ活性を低下させるのに十分な高温）に曝露する必要がある。各被験サンプルのパーキンリガーゼ活性を決定して、被験物質の非存在下で熱不安定化条件に曝露したパーキンタンパク質を含むコントロールサンプルと比較してパーキン活性を維持または増大させる任意の被験物質（単数または複数）を同定する。パーキンリガーゼ活性がコントロールサンプル中のリガーゼ活性を上回る被験サンプル中に含まれる被験物質を、パーキンソン病を処置する候補化合物と同定する。本発明のこうした態様および他の態様については、以下に詳細に記載する。

被験サンプル
不安定化条件下でパーキン活性を維持する物質を同定するには、複数の被験サンプルを、被験物質を除いてパーキンリガーゼ活性を低下させる高温に曝露する。下記のように、各被験サンプルは、適切な媒体中にパーキンおよび被験物質を含む。特定のメカニズムに拘泥するものではないが、そうした物質の中には活性コンフォメーションでパーキンタンパク質を安定化し、および／または再生を触媒するもの（「安定剤」）もあれば、未変性のパーキンの活性を増大できるもの（「アゴニスト」）もあると考えられる。本発明のアッセイは安定剤およびアゴニストを相互に識別できると都合がよい。

ｉ）パーキン
アッセイに使用するパーキンタンパク質は、ほとんどの場合、ヒトパーキンとほぼ同じ配列を持つ。ヒトパーキンタンパク質の例示的な配列はＮＣＢＩ受託番号ＢＡＡ２５７５１で確認される（たとえば、配列番号１および配列番号２を参照されたい）。あるいは、非ヒト哺乳動物（たとえば、マウス）由来のパーキンタンパク質を用いてもよい。マウスパーキンタンパク質の例示的な配列はＮＣＢＩ受託番号ＡＡＩ１３２０５で確認される（たとえば、配列番号３および配列番号４を参照されたい）。パーキンタンパク質は通常、科学文献に広く記載されている方法を用いて組換え発現により得られる。パーキンは真核細胞培養で作製しても、大腸菌で作製しても（たとえば、米国特許出願公開第２００７／０２１２６７９号を参照されたい）、または当該技術分野において公知の他のタンパク質発現系で作製してもよい。

アッセイに使用するパーキンタンパク質は野生型配列を持っていてもよいし、あるいは対立遺伝子変異体もしくは他の自然発生変異体、または１つまたは複数の残基の置換、挿入、欠失を含む組換え変異体であってもよい。ただし、タンパク質は、少なくともある程度のリガーゼ活性を保持している。アッセイに使用する組換えパーキンはある程度まで修飾する場合が多い。たとえば、組換え発現タンパク質（たとえば、融合タンパク質）の場合、発現を促進するため１〜１０個の残基をわずかに変化させること（たとえば、Ｎ末端メチオニンの欠失）がよくある。パーキンについては、生成、検出または精製を促進するためにエピトープタグの付加により修飾してもよく、使用してもよい（ｍａｙ ｂｅ ｕｓｅｄ）。本発明に使用するタンパク質の標識によく用いられるエピトープタグとして、ＦＬＡＧ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ：ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ_６）（配列番号５）、Ｍｙｃ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ：ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）が挙げられる。

本アッセイに好適なパーキン形は一般に、同モル量の野生型ヒトパーキンのリガーゼ活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、多くの場合少なくとも８０％、非常に多くの場合少なくとも９０％を保持する。リガーゼ活性を保持するパーキンフラグメントを用いてもよい。通常そうしたフラグメントは、天然パーキン配列の少なくとも４００個の連続した残基を含み、多くの場合少なくとも５００個の連続した残基を含む。いくつかの実施形態では、本発明に使用するパーキン変異体（ｖａｒｉａｎｔ）は、天然形のパーキンとの配列同一性を少なくとも９０％、場合によって少なくとも９５％、多くの場合少なくとも９８％共有する。２つのタンパク質間の配列同一性は、２つのタンパク質配列を最適に整列させて決定すればよい。タンパク質は手作業で整列させても、またはデフォルトパラメーターを使用してＣｌｕｓｔａｌＷおよびＮＣＢＩアライメントプログラムなどのコンピューター実行アルゴリズムにより整列させてもよい。

また、パーキンソン病のリスクの増大に関連するパーキン変異体を用いてもよいが、少なくともある程度のリガーゼ活性を保持しているものとする。リスクの増大に関連する変異体の例として、１６７番目のセリンの代わりにアスパラギンを持つパーキン；２１２番目のシステインの代わりにチロシンを持つパーキン；２４０番目のトレオニンの代わりにメチオニンを持つパーキン；２７５番目のアルギニンの代わりにトリプトファンを持つパーキン；２８９番目のシステインの代わりにグリシンを持つパーキン；または４３７番目のプロリンの代わりにロイシンを持つパーキンがある。

ｉｉ）被験物質
パーキンを安定化および／または活性化する能力に関してスクリーニングが可能な物質の種類については特に限定されるものではない。たとえば、多くの化合物の天然および合成ライブラリーを用いてもよい。たとえば、ＮＣＩ Ｏｐｅｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｙ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ；Ｐｉｒｒｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｆ Ｆｕｎｇａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」 ＣｈｅｍＩｎｆｏｒｍ ３９：２；Ｓｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，「Ａｄｖａｎｃｉｎｇ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ−ｏｒｉｅｎｔｅｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ−ｌｉｋｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」 Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．９：２４８−５８；Ｗｅｂｂ ＴＲ，２００５， 「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」 Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ．８：３０３−８；Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７３；Ｍｅｄｙｎｓｋｉ，１９９４，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：７０９−７１０；Ｏｈｌｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０９２２−２６；Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２−２６；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１６１４−１８；ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：１１７０８−７１２）を参照されたい。被験物質は、分子量１０００未満、多くの場合５００未満の分子など小分子であってもよい。好ましくは、被験物質は血液脳関門を通過できるものであるか、または血液脳関門を通過できる誘導体に改変してもよい。

被験サンプル中の被験物質の濃度は物質の性質によって異なるが、１ｎＭ〜５μＭの範囲の濃度が一般的である。被験物質は、スクリーニングアッセイに使用する前に濃厚原液（たとえば、ＤＭＳＯまたは他の適切な緩衝液もしくは溶媒に溶かした５００μＭの原液）として調製してもよい。候補化合物のスクリーニングおよび確認の過程で、いくつかの種類の濃度の被験物質に対してパーキン活性の作用を測定することができる（たとえば、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、２０μＭおよび１００μＭ）。一実施形態では、スクリーニングアッセイで１０μＭおよび／または２０μＭの被験物質を使用する。被験物質の濃度とは、パーキンタンパク質を熱不安定化条件に曝露したときの状態をいう。以下の考察から、熱不安定化条件への曝露後に、パーキン活性を測定するための試薬を被験サンプルに加えて、容積を増加させ被験物質の濃度を低下させることが明らかになるであろう。

一般に、被験物質は熱不安定化条件への曝露のおりにパーキンとインキュベートする。さらに、被験物質は、数分から数時間（たとえば、１分〜５時間）にわたって非ストレス条件下（たとえば、４℃〜３７℃）でパーキンとプレインキュベートしてもよい。通常、試薬の移動手順（たとえば、ピペッティング）により、被験物質をパーキンと組み合わせてから熱不安定化条件に曝露するまでに少なくともある程度の時間のずれが生じることになった。一実施形態では、被験物質をある温度（たとえば、４℃）でパーキンタンパク質に加えてから、熱不安定化条件に曝露する前に被験サンプルを様々な温度（たとえば、３７℃）で一定期間インキュベートする。代替の実施形態では、被験物質を既に減弱したパーキンタンパク質に加える。なお別の代替の実施形態では、被験物質を既に減弱したパーキンタンパク質に加えてからさらに熱不安定化させる。

ほとんどの場合、各被験サンプルは、パーキンタンパク質および単一の被験物質を含む。しかしながら、１つの被験サンプルに被験物質の組み合わせを加えてもよい。組み合わせの検査は、たとえば、相加ないし相乗作用の確認に有用な場合がある。

熱不安定化条件
パーキンタンパク質および被験物質を含む被験サンプルについては、通常リガーゼ反応の開始前に熱不安定化条件に曝露する。熱不安定化条件は、被験物質の非存在下でパーキンタンパク質の熱不安定化（または「減弱」）が起こる温度およびインキュベーション時間を含む。熱不安定化はパーキンリガーゼ活性の低下として検出できる。アッセイに使用する典型的な熱不安定化条件では、パーキンリガーゼ活性が、熱不安定化させない（たとえば、アッセイの間４℃で維持される）パーキンタンパク質に比べて約１０％〜１００％低下する。多くの場合、高温に曝露されていないパーキンを含むコントロールの約４０〜８０％までパーキン活性を低下させる熱不安定化条件を選択する。好ましくは、コントロールの４０〜６０％などコントロールの約４０％〜７０％までパーキン活性を低下させる条件を選択する。熱不安定化条件に曝露したパーキンタンパク質は、「減弱したパーキン」と呼ぶことがある
パーキン減弱のための最適な時間および温度パラメーターは、使用するパーキンタンパク質の緩衝液、濃度、被験サンプル容積および形態によりやや異なる。熱不安定化およびリガーゼアッセイステップに共に好適な緩衝液の１つはアッセイ緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ８．８、１ｍＭのＤＴＴ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−１２７）である。もう１つの好ましい緩衝液は、アッセイ緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ８．８、１ｍＭのＤＴＴおよび０．００５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）である。パーキンは通常、０．１マイクログラム／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で熱不安定化条件に曝露するが、より高い濃度またはより低い濃度を用いてもよい。被験サンプルの容積は使用するフォーマットによって異なるが、多くの場合５０ナノリットル〜５０マイクロリットル、より頻繁には５００ナノリットル〜５マイクロリットルの範囲である。たとえば、一部のマイクロ流体フォーマットでは被験サンプル容積を小さくしてもよい。一実施形態では、５００ナノリットルの反応容量に対してアッセイ緩衝液Ａ中で０．１ｍｇ／ｍｌ溶解しているパーキンを用いて測定したときに、パーキン活性を約４０〜８０％低下させる熱不安定化条件を選択する。

パーキンの熱不安定化は通常、４５℃を超える温度に曝露することで達成される。実施例１に示すように、以下の、パーキンの熱安定性の変化点は４２〜４７℃の範囲である。１，５３６ウェルマイクロタイタープレートのウェルで変性が起こる実験では、これよりもやや高い温度が最適であった。一般に、熱変性条件は４５〜６０℃の範囲の温度を含み、インキュベーション時間は３０分〜３時間の範囲とする。例示的な熱不安定化条件としては、４５〜６０℃で３０〜１２０分間が挙げられる。たとえば、熱変性は５７℃で９０分間行ってもよい。他の例では、熱不安定化条件は６０℃で１５０分である。一実施形態では、アッセイ緩衝液Ａ中でパーキン（０．５ｍｇ／ｍｌ）および被験物質（１０μＭ）を５７℃で９０分間インキュベートする。

パーキンタンパク質および被験物質を含む被験サンプル中のパーキン活性の測定だけでなく、任意の被験物質の非存在下での減弱したパーキン、さらには熱不安定化条件に曝露されていないパーキンの測定も並行して行われる。これについては、以下の「対照サンプル」という表題のセクションで詳述する。

パーキンリガーゼ活性の決定：材料、フォーマットおよび方法
熱不安定化条件への曝露後、被験（および対照）サンプル中のパーキンリガーゼ活性を決定する。パーキンリガーゼ活性のアッセイは当該技術分野において公知であり、本発明のスクリーニング方法には様々なフォーマットおよび試薬の組み合わせを使用することができる。当然のことながら、本発明のスクリーニング方法はパーキン活性を決定する任意の特定の方法に限定されるものではない。

多くのパーキンリガーゼアッセイの基本的な成分はパーキンタンパク質、ユビキチン活性化酵素Ｅ１（たとえば、ＵＢＡ１、ＵＢＡ２）、ユビキチン結合酵素Ｅ２（たとえば、ＵｂｃＨ７、ＵｂｃＨ６、ＵｂｃＨ８、ＵｂｃＨ１３）、ＡＴＰ（たとえば、Ｍｇ−ＡＴＰ）、ユビキチン、基質（たとえば、標的タンパク質）および適切な緩衝液または反応媒体である。一実施形態では、Ｅ１、Ｅ２、ＡＴＰ、ユビキチン、パーキン基質を、減弱したパーキンを含む被験サンプルに一緒に加えてライゲーション反応を開始する。あるいは、アッセイ成分を別々に加えても、連続的に加えてもよい。たとえば、Ｅ１、Ｅ２、ユビキチンおよびパーキン基質を一緒に被験サンプルに加えてから、ＡＴＰを加えてライゲーション反応を開始してもよい。なお別の変更例では、一部のアッセイ成分（たとえば、ＡＴＰ）を、不安定化条件に曝露する前に加えても構わない。

アッセイ成分は市販されており（たとえば、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｉｎｃ．，８４０ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｄｒｉｖｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ ０２１３９）、および／またはどの成分も当該技術分野において公知の方法または下記の方法により取得することができる。たとえば、Ｗｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９：４８９−９８；ａｎｄ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９７：１３３５４−９を参照されたい。アッセイ成分は精製されており、および／または組換え体であってもよく、ヒト、哺乳動物、マウスまたは他の真核生物由来でもよい。いくつかのアッセイ形態では、その成分が同一種由来である（たとえば、パーキン、Ｓ５ａ、Ｅ１、Ｅ２およびユビキチンがすべてヒト由来、マウス由来など）。

例示的なユビキチン活性化酵素Ｅ１としてＵＢＡ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５５３８６）がある。好適なユビキチン結合酵素Ｅ２としては、ＵｂｃＨ７、ＵｂｃＨ５、ＵｂｃＨ１３およびＵｂｃＨ１３／Ｕｅｖｌが挙げられる。アッセイに使用することができるパーキン基質には、、αシヌクレイン、セプチン−４、２６ＳプロテアソームサブユニットＳ５ａ、トロポニン１、推定Ｇタンパク質共役受容体Ｐａｅｌ−Ｒ（Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｅｌｌ １０５：８９１−９０２）およびパーキンタンパク質自体（自己ユビキチン化）があるが、これに限定されるものではない。好ましい基質はＳ５ａ、トロポニン１およびセプチン−４である。

Ｓ５ａはパーキン基質である（参照によって本明細書に援用する同時係属の米国特許出願第６０／８９８，９４７号を参照されたい）。Ｓ５ａは、そのユビキチン相互作用モチーフを介してポリユビキチン鎖に結合するマルチユビキチン結合タンパク質である。Ｓ５ａについては、Ｆｅｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｃｈａｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ２６Ｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ」ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３８１（１−２），１４３−１４８；Ｃｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ２０Ｓ ａｎｄ ２６Ｓ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｓ」Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５，８０１−８４７（１９９６）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３４８（３）：７２７−３９；ｖａｎ Ｎｏｃｋｅｒ，１９９６，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６：６０２０−２８；Ｋａｔｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：８９３；ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：５４６１に記載されている。ヒトＳ５ａの配列は、ＮＣＩタンパク質データベースの受託番号ＮＰ＿００２８０１である（たとえば、配列番号６および配列番号７を参照されたい）。

Ｓ５ａ基質は、アッセイに使えるように修飾してもよい。たとえば、Ｓ５ａを融合タンパク質として発現させてもよく、たとえば、ＧＳＴまたはＨｉｓ_６などのエピトープタグを含ませもよい。ＧＳＴタグ付きＳ５ａはＢｉｏＭｏｌ，Ｉｎｃ．（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）から購入できる。Ｈｉｓ_６タグ付きＳ５ａは、Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：１７６７−７７に記載されているように調製できる。パーキンによりユビキチン化される能力を保持する切断型またはフラグメントを使用してもよく、通常天然Ｓ５ａ配列の少なくとも２００個の連続した残基、多くの場合少なくとも３００個の連続した残基、多くの場合少なくとも３５０個の連続した残基、場合によっては少なくとも３７０個の連続した残基を含む。いくつかの実施形態では、天然ヒトタンパク質との配列同一性が少なくとも９０％であるＳ５ａの変異体（ＮＰ＿００２８０１）を使用し、配列同一性は場合によっては少なくとも９５％、配列同一性は多くの場合少なくとも９８％である。２つのタンパク質間の配列同一性は、２つのタンパク質配列を最適に整列させて決定すればよい。タンパク質は手作業で整列させても、またはデフォルトパラメーターを使用してＣｌｕｓｔａｌＷおよびＮＣＢＩアライメントプログラムなどのコンピューター実行アルゴリズムにより整列させてもよい。

トロポニン１はトロポニンのサブユニットである（参照によって本明細書に援用する国際公開第２００８／０９５１２６号を参照されたい）。トロポニンは細い筋フィラメントにおいてアクチンに結合してトロポニン−トロポミオシン複合体を適当な位置に保持する。トロポニン１は融合タンパク質として発現させてもよく、たとえば、ＧＳＴまたはＨｉｓ_６などのエピトープタグを含ませもよい。トロポニン１は市販されているか、またはよく知られたプロトコルにより調製することもできる。パーキンによりユビキチン化される能力を保持するトロポニン１の切断型またはフラグメントを使用してもよく、通常天然トロポニン配列の少なくとも１５０個の連続した残基、多くの場合少なくとも１８０個の連続した残基、多くの場合少なくとも２００個の連続した残基、場合によっては少なくとも２０５個の連続した残基を含む。いくつかの実施形態では、天然ヒトタンパク質との配列同一性が少なくとも９０％であるトロポニン１の変異体（ＮＣＩタンパク質データベース受託番号ＮＰ＿０００３５４；たとえば、配列番号８を参照されたい）を使用し、配列同一性は場合によっては少なくとも９５％、配列同一性は多くの場合少なくとも９８％である。２つのタンパク質間の配列同一性は、２つのタンパク質配列を最適に整列させて決定すればよい。タンパク質は手作業で整列させても、またはデフォルトパラメーターを使用してＣｌｕｓｔａｌＷおよびＮＣＢＩアライメントプログラムなどのコンピューター実行アルゴリズムにより整列させてもよい。

セプチン４（「Ｓｅｐｔ４」）は、細胞分裂で役割を果たす保存されたタンパク質ファミリーのメンバーである。これまでにセプチン４には以下の３つのスプライスバリアント：Ｓｅｐｔ４ｖａｒ１（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００４５６５）、Ｓｅｐｔ４ｖａｒ２（「ＡＲＴＳ」とも呼ばれる）（ＮＰ＿５３６３４０）およびＳｅｐｔ４ｖａｒ３（ＮＰ＿５３６３４１）が同定されている。Ｓｅｐｔ４ｖａｒ１およびＳｅｐｔ４ｖａｒ３は、Ｓｅｐｔ４ｖａｒ１がＮ末端にさらに２１個のアミノ酸を含む以外は同一配列を持つ。Ｓｅｐｔ４ｖａｒ２（ＡＲＴＳ）は、残基１〜２４７については変異体１および３と配列同一性を共有し、アミノ酸２４７〜２７４については配列が異なる（参照によって本明細書に援用するＬａｒｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２：９１５−２０を参照されたい）。さらに、それぞれを参照によって本明細書に援用するＣｈａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，２００６，「Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｆｏｃａｌ，ｅｐｉｓｏｄｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｅｓ：ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ｗｉｔｈ ｌｉａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｐａｌｓｉｅｓ ａｎｄ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｎｅｕｒａｌｇｉｃ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｙ」Ｎｅｕｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄ．８（１−２）：１５９−７４；Ｓｐｉｌｉｏｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００６「Ｈｅｒｅ ｃｏｍｅ ｔｈｅ ｓｅｐｔｉｎｓ：ｎｏｖｅｌ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｔｈａｔ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ」 Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １１９（ｐｔ １）：４−１０；Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００４，「Ｔｈｅ ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｐｔｉｎ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ」Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０４（４）：４８９−５０５も参照されたい。Ｓｅｐｔ４ｖａｒ３はパーキン基質であることが示されている（データなし）。参照によって本明細書に援用する同時係属の米国特許出願第６０／９３９，３３５号を参照されたい。

本発明のアッセイでは、Ｓｅｐｔ４タンパク質はＳｅｐｔ４ｖａｒ３としてもよい。あるいはＳｅｐｔ４タンパク質はＳｅｐｔ４ｖａｒ１であってもよい。あるいはＳｅｐｔ４タンパク質はＳｅｐｔ４ｖａｒ２であってもよい。アイソフォームの変異体、フラグメントおよび混合物を使用してもよい。Ｓｅｐｔ４のアイソフォーム１およびアイソフォーム３はアミノ末端の２１個のアミノ酸残基が異なるだけで、パーキンとの相互作用は同等と考えられる。Ｓｅｐｔ４ｖａｒ２（ＡＲＴＳ）はアミノ末端の１〜２４７残基が相同性を持つ。Ｓｅｐｔ４ｖａｒ２はユビキチン化され、神経細胞の免疫共沈降実験からＳｅｐｔ４ｖａｒ２およびパーキンが互いに相互作用することが明らかになった。

いくつかの実施形態では、本発明の方法と共にＳｅｐｔ４の切断型を使用してもよい。たとえば、以下の実験例で明らかなように、Ｓｅｐｔ４変異体は最大Ｎ末端の１１７個のアミノ酸を欠損してもパーキンによりユビキチン化される能力を保持しているため、本発明のアッセイに使用することができる。いくつかの実施形態では、たとえば、挿入、欠失または置換により異なるＳｅｐｔ４変異体などＳｅｐｔ４の他の変異体を用いて本発明の方法を実施してもよい。有用な変異体はパーキンユビキチン化基質であるという特性を保持しており、これについては当該技術分野において公知であり、本明細書に記載のアッセイにより検査できる。本発明に使用できるＳｅｐｔ４の他の変異体としては、Ｓｅｐｔ４タンパク質との配列同一性を９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％共有する変異体が挙げられる。当業者であれば、２つのタンパク質配列を最適に整列させて変異体が親タンパク質と共有する相同性を容易に決定できる。ＣｌｕｓｔａｌＷおよびＮＣＢＩアライメントプログラムなどのアライメントプログラムは、２つのタンパク質配列を最適に整列させるのに使用できる例示的なプログラムである。

Ｓｅｐｔ４タンパク質は融合タンパク質として発現させてもよく、たとえば、精製および／またはマイクロタイターウェルなどの基板に対する結合を促進するため、エピトープタグを含ませてもよい。たとえば、Ｉｈａｒａらはバキュロウイルス系を用いて、ヒトおよびマウスからクローニングされたヒスチジンタグ付きＳｅｐｔ４タンパク質を発現させている（Ｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｎｅｕｒｏｎ，５３：５１９−３３）。

アッセイの個々のフォーマットに応じて、アッセイ成分を標識または修飾してもよい。たとえば、ユビキチンおよび／または他の成分をビオチン化、タグ化、蛍光標識化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎａｔｅｄ）しても、または別の物質と複合体形成してもよい。たとえば、ビオチン化パーキン基質、およびユビキチンとユーロピウムクリプテートとの複合体を用いて以下に記載するホモジニアス時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ：Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を行う。

上述のように、パーキンリガーゼ反応は、アッセイ試薬を減弱したパーキンを含む調製物に加えることで開始することができる。好適な緩衝液またはキャリア（たとえば、アッセイ緩衝液Ａ）中でＥ１、Ｅ２、Ｍｇ−ＡＴＰ、ユビキチンおよび基質を含む「前混合物」を調製すると都合がよい。一実施形態では、パーキン減弱ステップおよびパーキンリガーゼアッセイを共に同じ媒体（たとえば、アッセイ緩衝液Ａ）で行う。ライゲーション反応は、２０〜３７℃の範囲の濃度（たとえば、室温、３０℃または３７℃）で、たとえば、３０分〜４時間進行させる。一実施形態では、ライゲーション反応を３０℃で１８０分間行う。

基質（たとえば、Ｓ５ａ）のユビキチン化の速度または程度は、様々なやり方で測定することができる。一方法では、ユビキチン化反応を行い、その反応混合物中のタンパク質を電気泳動により分離し、分離したタンパク質をウエスタンブロットし、このウエスタンブロットを抗基質（たとえば、抗Ｓ５ａ）または抗ユビキチン抗体でプローブし、基質に対するユビキチンの結合を反映する移動度の変化を検出する。図２を参照されたい。ただし、リガーゼ活性の測定には、免疫学に基づくアッセイ（ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、参照によって本明細書に援用するＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）、質量分光法、電磁スペクトル分光法、クロマトグラフ法、検出可能に標識したユビキチンを用いたアッセイおよび蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）型アッセイなどどのような方法を用いてもよい。好ましいアッセイの１つは蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ型）アッセイであり、その例を以下に記載する。一実施形態では、ドナー発色団がユビキチンに結合し、アクセプター発色団がパーキン基質に結合しているか、アクセプター発色団がユビキチンに結合し、ドナー発色団がパーキン基質に結合しているＦＲＥＴアッセイで、パーキンリガーゼ活性を決定する。

アッセイは、特定のエンドポイントにおける基質の単位質量当たりの全ユビキチン化、および／または基質分子のポリ−ユビキチン化の程度（すなわち、ユビキチン鎖の長さ）を測定するように設計してもよい。アッセイは、複数の時点でユビキチン化を測定して、単位時間当たりのユビキチン化レベル（ユビキチン化の「速度」）を決定するように設計しても、または様々な条件下で測定するように設計してもよい。

スクリーニングアッセイは、種々のフォーマットのうちどれを用いて行ってもよい。たとえば、パーキンをマイクロ遠心チューブ内で熱不安定化条件に曝露し、リガーゼ活性アッセイに供してもよい。しかしながら、好ましくはハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ：ｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）に好適なフォーマットでアッセイを行う。一アプローチでは、マルチウェルプレートを、好ましくは、試薬およびサンプルの自動（ロボット）ハンドリングと併用する。マルチウェルプレートマイクロタイタープレートは、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートおよび１，５３６ウェルプレートなど複数のフォーマットで入手可能である。別のアプローチでは、マイクロ流体アッセイ装置を用いる。

スクリーニングアッセイでは、複数の被験サンプルを同時にスクリーニングする。各アッセイでスクリーニングする被験物質の数は一般的に少なくとも２０、より一般的には少なくとも５０、好ましくは少なくとも１００、多くの場合少なくとも２００、３００または４００である。スクリーニングアッセイは多くの場合、同一の被験物質を含む複数の被験サンプル（複製および／または濃度の異なるもの）、および対照サンプル（以下に記載）を含む。当然のことながら、本発明のアッセイは、特に安定剤またはアゴニストと推定される被験物質の確認または特徴付けを行うため、単一の被験物質を含めより少ない数の被験物質を用いて行ってもよい。

対照サンプル
アッセイは一般に被験サンプルのほかに、対照または「コントロール」サンプルを含む。

対照サンプルの１つはパーキンを含むが、被験物質を含まず、被験サンプルと同じやり方で別途処理（減弱ステップなど）する。こうした対照のリガーゼ活性は、被験サンプル中のパーキンリガーゼ活性と比較するベースラインとなる。パーキンリガーゼ活性が対照サンプル中のリガーゼ活性を上回る被験サンプル中に含まれる被験物質を、パーキンソン病を処置する候補化合物と同定する。

第２のタイプの対照サンプルは、減弱していないパーキンおよび被験物質を含む。

第３のタイプの対照サンプルは減弱していないパーキンを含むが、被験物質を含まない。こうした対照のリガーゼ活性は、リガーゼアッセイの陽性コントロールとなる。

減弱したパーキンの安定剤である被験物質は、被験サンプルと対照サンプル（単数または複数）とのリガーゼ活性を比較することでパーキン活性のアゴニストと識別することができる。アゴニストであれば、減弱していないパーキン単独の場合と比較して、減弱していないパーキンおよび被験物質（アゴニスト）を含む対照サンプル中の活性を増大させる。このため、本発明はまた、前記化合物の存在下および非存在下で減弱していないパーキンタンパク質をインキュベートすることで、パーキン安定剤である候補化合物をパーキンアゴニストである候補化合物と識別する方法であって、パーキンリガーゼ活性を増大させる化合物をパーキンアゴニストと同定し、パーキンリガーゼ活性を増大させない化合物をパーキン安定剤と同定する方法も提供する。前述の決定は被験物質を減弱したパーキンとインキュベートして候補化合物を同定する一次スクリーンと同時に行ってもよく、および／または候補化合物（単数または複数）を同定してから別のステップとして行ってもよい。１つの被験物質がアゴニスト活性および安定剤としての活性を共に持つ場合があることを理解されよう。

蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）型アッセイ
一実施形態では、スクリーニングに、ホモジニアス時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）による基質−ユビキチン化アッセイを用いる。このアッセイを図１に図示する。図に示すように、パーキンタンパク質および被験物質を含む被験サンプルを、ビオチン化パーキン基質、Ｅ１、Ｅ２、ユビキチンユーロピウムクリプレート（Ｃｒｙｐｌａｔｅ）複合体［Ｕｂ−Ｅｕ（Ｋ）］をスパイクしたユビキチン、およびＭｇ−ＡＴＰを含む前混合物と組み合わせる。一実施形態では、基質はビオチン化Ｓ５ａ（Ｂｔ−Ｓ５ａ）である。Ｕｂ−Ｅｕ（Ｋ）は、ＡＴＰの存在下でＥ１によりＥ２に移され（Ｕｂ−Ｅｕ（Ｋ）−Ｅ２）、次いでＥ２はＵｂ−Ｅｕ（Ｋ）を基質に移れるように高エネルギーチオールエステル結合で保持する。Ｕｂ−Ｅｕ（Ｋ）はＥ２からビオチン化基質Ｓ５ａ（Ｂｔ−Ｓ５ａ）に移る。アロフィコシアニン標識ストレタビジン（ｓｔｒｅｔａｖｉｄｉｎ）（ＳＡ−ＡＰＣ）を加える。Ｕｂ−Ｅｕ（Ｋ）がＢｔ−Ｓ５Ａに移された場合、Ｅｕ^３＋およびＡＰＣは近接するため、この２つの蛍光標識間でエネルギーの移行が可能になる。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を測定するには、Ｅｕ^３＋を３２０ｎｍの波長で励起する。次いで時間分解蛍光発光が６８５ｎｍで検出される。ＦＲＥＴシグナルを補正するには、時間分解蛍光発光を６１５ｎｍ（その波長でのＵｂ−Ｅｕ（Ｋ）の発光）でも記録する。表示値は以下の通り計算される：比＝６６５ｎｍでの発光／６１５ｎｍでの発光×１０，０００。このアッセイでは、基質に移されたユビキチンのみが検出される。遊離Ｕｂ−Ｅｕ（Ｋ）またはＵｂ−Ｅｕ（Ｋ）−Ｅ２からはアッセイシグナルが得られない。好都合なことに、このアッセイでは減弱したパーキンの安定剤およびパーキンアゴニストを共にスクリーニングすることができる。さらに、この種のアッセイの利点として、パーキンの代わりに別のＥ３リガーゼを用いることで、ヒットと決定された任意の被検化合物の選択性の特徴付けを行えることが挙げられる。本発明のスクリーニング方法には、たとえば、様々なドナー−アクセプター対を使用する変更例（たとえば、Ｃｙ３／Ｃｙ５；さらに、Ｋａｉｎｍｕｌｌｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｎｗａｒｔｈ，２００６，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ８９：３０５６−７０を参照されたい）など種々のＦＲＥＴ型アッセイを使用できることが、本開示に基づく当業者であれば分かるであろう。

リガーゼ特異性のスクリーン
上述の熱不安定化アッセイにより同定される正のモジュレーターは、パーキンに対する特異性を決定するため追加のスクリーニングステップによりさらに特徴付けが行われる。「特異性」とは、正のモジュレーターが検査対象の複数のＥ３リガーゼに対してアゴニストまたは安定剤ではないが、もっぱらパーキンのみ、または他のＥ３リガーゼよりパーキンをより効果的に調節することを意味する。

以下の実施例３に示すように、Ｓ５ａは複数のＥ３リガーゼに対する基質である。本発明は、パーキン以外のＥ３リガーゼを評価することでＳ５ａのライゲーションに対するパーキン活性の正のモジュレーターの特異性を決定するインビトロ法を提供する。一実施形態では、このアッセイでは、（１）パーキン以外のＥ３リガーゼタンパク質およびＳ５ａタンパク質を、Ｓ５ａタンパク質がユビキチン化される条件下で一緒にインキュベートする；（２）（１）の条件下、Ｅ３タンパク質およびＳ５ａタンパク質を、パーキンの正のモジュレーターの存在下で一緒にインキュベートする；（３）パーキンの正のモジュレーターの存在下でのＳ５ａのユビキチン化の速度または程度を、パーキンの正のモジュレーターの非存在下でのＳ５ａのユビキチン化の速度または程度と比較し、パーキン活性のモジュレーターの存在下でＳ５ａのユビキチン化が相対的に増加することから、パーキン活性モジュレーターが非パーキンＥ３リガーゼ活性の活性を正に調節する（たとえば、非パーキンＥ３リガーゼのアゴニストである）ことが明らかにされる。パーキンによるＳ５ａのユビキチン化は調節するが、非パーキンＥ３によるＳ５ａのユビキチン化を調節することが検出できないパーキン活性モジュレーターを、パーキン特異的な正の調節活性を持つものと同定する。以下の実施例４を参照されたい。また、このアッセイは、Ｅ１、Ｅ２および上記で論じた他の反応成分の存在下でユビキチン化され得るトロポニン１または他の任意のパーキン基質など異なるパーキン基質を用いて使用してもよい。

パーキンの正のモジュレーターであって、非パーキンのＥ３によるＳ５ａのユビキチン化も調節するが、パーキン活性を調節するよりも効果が小さいモジュレーターについては、パーキンについて不完全に特異的である、パーキンの正の調節活性を持つと同定する。この文脈において「効果が小さい」とは、パーキン活性を１０％増大させるのに必要な化合物の量（濃度）（「ＥＣ_１０」）がパーキンの場合よりも非パーキンについてのＥ３の場合の方が大きいことを意味する。このアッセイでは、化合物の非存在下での十分な活性の（すなわち、減弱したり、または変性したりしていない）Ｅ３リガーゼの総活性を１００％と定義する。非パーキンのＥ３についてのＥＣ_１０がパーキンについての場合の２倍を超えて大きくなると、不完全に特異的（ｐａｒｔｉａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）であることを示し、ただし、非パーキンのＥ３のＥＣ_１０は１００マイクロモル以下である。好ましくは、ＥＣ_１０は少なくとも５倍、１０倍、２０倍または１００倍大きい。このため、１マイクロモルの濃度でパーキン活性を１００％〜１１０％増大させ、２５マイクロモルの濃度で非パーキン活性を１００％〜１１０％増大させる化合物は、不完全特異性を示す。いくつかのアッセイ形態では、パーキンおよび非パーキンのＥ３が不完全に減弱されていて、十分な活性のリガーゼの活性が１００％未満であってもよい。こうした例では、１マイクロモルの濃度で減弱したパーキン活性を５０％〜６０％増大させ、２５マイクロモルの濃度で減弱した非パーキン活性を５５％〜６５％増大させる化合物は、不完全特異性を示す。当該技術分野において公知の方法により用量反応曲線を作成してもよい。通常は２倍または３倍段階希釈を使用する。通常、検査する濃度は１００マイクロモルから５０ピコモルの範囲である。非パーキンのＥ３リガーゼ（単数または複数）のＥＣ_１０が１００マイクロモルを超え、パーキンのＥＣ_１０よりも少なくとも４倍大きい場合、その化合物はパーキンに対して完全に特異的と見なされる。

非パーキンのＥ３リガーゼ活性のアッセイ条件は、結果の比較を行うパーキンアッセイで使用する条件と同じでもよいが、必ずしも同じとは限らない。たとえば、Ｅ３間の最適な反応条件または補助因子の違いを理由に、修正を行っても構わない。たとえば、Ｅ３がＭｄｍ２またはＭｕｒｆ１である場合、Ｅ２タンパク質はＵｂｃＨ５としてもよいが、対応するパーキンアッセイでは好ましいＥ２タンパク質はＵｂｃＨ７である場合がある。特異性については、アッセイ反応条件および／または検査対象の非パーキンのＥ３リガーゼ（単数または複数）を参照して報告すればよい。たとえば、実施例４に記載する実験から、検査対象の化合物はＭｄｍ２と比較してパーキンに特異的であることが明らかにされる。

熱不安定化アッセイを用いる場合、Ｅ３リガーゼは熱変性の条件、すなわち、Ｅ３活性を、高温に曝露していないコントロールの約３０〜８０％まで低下させる条件下でインキュベートする。Ｅ３活性をコントロールの４０〜６０％などコントロールの約４０％〜７０％まで低下させる条件を選択してもよい。熱不安定化条件に曝露されたＥ３タンパク質は、「減弱したＥ３」と呼ぶ場合がある。各Ｅ３リガーゼにより変性条件は異なるが、実施例に記載されているように決定すればよい。以下に示すように、Ｅ３であるＥ６ＡＰは４１℃で１時間のプレインキュベーション後、その活性が５０％低下すると考えられる。Ｅ３であるＭｕｒｆ１は６０℃で１時間のプレインキュベーション後、その活性が５０％低下すると考えられる。活性を４０〜７０％低下させる個々のＥ３リガーゼの熱変性条件を決定することは、本開示に基づく当業者の技術の範囲内である。

パーキン基質を用いた特異性アッセイには、その基質をユビキチン化できる、哺乳動物の任意のＥ３リガーゼを用いることができる。たとえば、実施例４に示すように、ＣＨＩＰ、Ｎｅｄｄ４、Ｍｕｒｆ１、Ｅ６ＡＰ、Ｍｄｍ２およびＳｉａｈ２はＳ５ａをユビキチン化することができる。ＣＨＩＰ（Ｈｓｐ７０相互作用タンパク質のカルボキシル末端）は、熱ショックタンパク質と相互作用し、シャペロン機能を負に制御するテトラトリコペプチド反復配列を含むタンパク質である（たとえば、Ｂａｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９：４５３５−４５；Ｃｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：９３−９６を参照されたい）。Ｎｅｄｄ４（神経前駆細胞の発生に伴い発現が抑制されるタンパク質４）はＥ３ユビキチンリガーゼファミリーに属する原型タンパク質で、Ｎ末端にＣ２ドメイン、タンパク質の中に２〜４個のＷＷドメイン、およびＣ末端の触媒部位にＨＥＣＴドメインを持つ（たとえば、Ｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３：１９７２−１９８４を参照されたい。Ｍｕｒｆ１（筋特異的リングフィンガータンパク質１）は、筋肉萎縮の発生の際に重要なタンパク質である（たとえば、Ａｔｔａｉｘ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｅｓｓａｙｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：１７３−１８６を参照されたい）。Ｍｄｍ２（ｐ５３結合タンパク質Ｍｄｍ２）は、腫瘍抑制因子ｐ５３のトランス活性化ドメインに結合するオンコプロテインである（Ｋｕｓｓｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９４８−９５３）。Ｅ６ＡＰ（ヒトパピローマウイルスＥ６結合タンパク質）は、ヒトパピローマウイルスＥ６オンコプロテインとｐ５３との相互作用に関与する（Ｈｕｉｂｒｅｇｔｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：７７５−７８４を参照されたい）。Ｓｉａｈ２（Ｓｅｖｅｎ ｉｎ ａｂｓｅｎｔｉａ ｈｏｍｏｌｏｇ ２）は、低酸素に対する細胞応答の制御に関係していると考えられている（たとえば、Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃｅｌｌ １１７：９４１−９５２を参照されたい）。当業者は医学文献を参照すれば他の哺乳動物のＥ３リガーゼも容易に同定できる。非限定的な例示して、Ｅ３ユビキチンリガーゼアトロフィン相互作用タンパク質４（ＡＩＰ（ａｔｒｏｐｈｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）４）；ＥＤＤ（またはＨＹＤ）；Ｓｍｕｒｆ２；アトロギン−１／ＭＡＦｂｘ；ＲＮＦ８；ｃ−ＩＡＰ１；ＳＣｆ−Ｃｄｃ４；Ｈｅｒｃ４；ｇｐ７８；ＲＩＮＣＫ；Ｐｉｒｈ２；Ｐｈｒ１；Ｔｒｉａｄ１；ＲＮＦ１２５／ＴＲＡＣ−１；Ｕｆｄ２ｐ；Ｌｉｇａｎｄ−ｏｆ−Ｎｕｍｂ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｘ１；Ｃｕｌｌｉｎ４Ｂ；ＨＲＤ−１；ＤＤＢ２；ＢＲＣＡ１ ＲＩＮＧ；ｃ−Ｃｂｌ；ＨＡＣＥ１；ＲＮＦ５；Ｓｋｐ２；ｍｉｎｄ ｂｏｍｂ １；およびＨｕｗｅ１が挙げられる。

いくつかの実施形態では、非パーキンのＥ３はＲＩＮＧファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、Ｅ３リガーゼはＭｄｍ２、Ｎｅｄｄ４、Ｍｕｒｆ１およびＥ６ＡＰから選択される。一実施形態では、Ｅ３リガーゼはＭｕｒｆ１またはＥ６ＡＰである。一実施形態では、Ｅ３リガーゼはＭｕｒｆ１である。いくつかの形態では、特異性アッセイは、たとえば、トロポニン１などＳ５ａ以外のパーキン基質を使用する。

創薬方法
一態様では、本発明は、パーキンソン病の治療および予防に使用される、パーキン活性の正のモジュレーターに関する方法であって、表１Ａまたは１Ｂに示すステップを含む方法を提供する。

ステップ１〜４はどのような順序で行ってもよいが、ただし、ステップ２〜４についてはステップ１と同時か、またはステップ１の後に行う。ステップ４は、セプチン４がパーキン基質ではあるが、他のＥ３リガーゼの基質でないことを発見したことによる。ステップ１は好ましくは本明細書に上述した熱変性アッセイを用いて行う。いくつかの実施形態では、ステップ２を省略する。いくつかの実施形態では、ステップ２および４を省略する。

候補化合物
パーキンリガーゼ活性が対照サンプル中のリガーゼ活性を上回る被験サンプル中に含まれる被験物質を、「ヒット」またはパーキンソン病を処置する候補化合物と同定する。好ましくは、候補化合物（たとえば、パーキン安定剤）は、熱不安定化（ｄｅｓｔａｂｉｚａｔｉｏｎ）により低下したリガーゼ活性の少なくとも１０％を保持する。たとえば、減弱していないパーキンを含む対照サンプルを１００％のリガーゼ活性を持つものと定義し、減弱したパーキンを含むが被験物質を含まない対照サンプルのリガーゼ活性が５０％である場合、熱不安定化（ｄｅｓｔａｂｉｚａｔｉｏｎ）により低下したリガーゼ活性の少なくとも１０％を保持するパーキン安定剤は、少なくとも５５％の活性を持つことになる。一層好ましくは、候補化合物は、熱不安定化（ｄｅｓｔａｂｉｚａｔｉｏｎ）により低下したリガーゼ活性の少なくとも２５％、リガーゼ活性の少なくとも３０％、リガーゼ活性の少なくとも５０％、またはリガーゼ活性の少なくとも７５％を保持する。

候補物質はパーキン活性を保持する能力に応じてランク付けしてもよい。その順位を記録してもよい（たとえば、印刷する、および／またはコンピューター読み取り可能な媒体に保存する）。

本明細書で使用する場合、「パーキンソン病の処置に有用な物質」または「パーキンソン病を処置する候補化合物」とは、パーキンソン病の患者に対して他の化合物よりも治療効果または予防効果を示す可能性が高いと見なされた化合物、すなわち、薬剤候補をいうことが理解されよう。創薬プロセスに精通した人であれば、薬剤候補については患者に投与する前にさらに試験（たとえば、動物を用いたインビボ試験）を行う場合があることが理解されよう。また、ヒトへの投与が認められた物質は薬剤候補の誘導体または化学修飾体であってもよいことは言うまでもない。

例として、リード化合物を修飾してプロドラッグ形態を製造してもよい。たとえば、リード化合物にエステル結合を加えて薬学的に許容されるエステル（たとえば、化合物またはその塩を製造するのに生理的に適切な条件下で加水分解するエステル）を製造しても、または化合物に保護基を加えてもよい。好適なエステル基の説明例として、ホルマート、アセタート、プロピオナート、ブチラート、スクシナートおよびコハク酸エチルがあるが、これに限定されるものではない。種々の保護基については、たとえば、Ｔ．Ｈ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）に開示されている。好適なプロドラッグ誘導体の選択および調製に関する従来の手順は当該技術分野において公知であり、たとえば、「Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，」Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５，ａｎｄ Ｂ．Ｔｅｓｔａ「Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ ａｎｄ Ｐｒｏｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２００３，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨに記載されている。

同様に、ポリケチド化合物の水溶性も、可溶化官能基を含む基を化合物に加えるか、または化合物から疎水基を除去して化合物の親油性を低下させることで向上させることができる。可溶化官能基を含む典型的な基として、２−（ジメチルアミノエチル）アミノ、ピペリジニル、Ｎ−アルキルピペリジニル、ヘキサヒドロピラニル、フルフリル、テトラヒドロフルフリル、ピロリジニル、Ｎ−アルキルピロリジニル、ピペラジニルアミノ、Ｎ−アルキルピペラジニル、モルホリニル、Ｎ−アルキルアジリジニルメチル、（１−アザビシクロ［１．３．０］ヘキス−１−イル）エチル、２−（Ｎ−メチルピロリジン−２−イル）エチル、２−（４−イミダゾリル）エチル、２−（１−メチル−４−イミダゾリル）エチル、２−（１−メチル−５−イミダゾリル）エチル、２−（４−ピリジル）エチルおよび３−（４−モルホリノ）−１−プロピルがあるが、これに限定されるものではない。

本発明により同定される化合物の修飾体は他にも多くあり、薬化学の技法により得られることが当業者には明らかであろう。

候補生成物（修飾の有無は関係ない）は、保存、安定性または投与の観点から使用前に製剤化してもよい。たとえば、生成物は、薬学的に許容される塩として製剤化してもよい。化合物の薬学的に許容される好適な塩として、たとえば、化合物の溶液を塩酸、臭化水素酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、安息香酸、酢酸、クエン酸、酒石酸、リン酸、炭酸または同種のものなど薬学的に許容される酸の溶液と混合して形成できる酸付加塩が挙げられる。化合物に１つまたは複数の酸性部分がある場合、薬学的に許容される塩は、化合物の溶液を水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化テトラアルキルアンモニウム、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、アンモニア、アルキルアミンまたは同種のものなど薬学的に許容される塩基の溶液と処理して形成することができる。

生成物は被検体への投与の前に、たとえば、薬学的に許容されるキャリアと組み合わせるなど当該技術分野において周知の方法により医薬組成物として製剤化してもよい。「薬学的に許容されるキャリア」という用語は、化合物の所望の剤形を調製するのに使用される媒体をいう。薬学的に許容されるキャリアは、１種または複数種の溶媒、希釈液もしくは他の液体ビヒクル；分散液もしくは懸濁助剤；界面活性剤；等張剤；増粘剤もしくは乳化剤；防腐剤；固体バインダー；潤滑剤；および同種のものを含んでもよい。Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｎａｒｏ，２００６ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ．２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ ｅｄ．（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．２０００）には、医薬組成物の製剤化に使用される様々なキャリアおよびそれを調製する周知の技法が開示されている。

組成物は、固形、半固形または液状など任意の好適な形態で投与すればよい。Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００５）．Ａｎｓｅｌ’ｓ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍｓ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎを参照されたい。例示であり限定ではないが、実施形態の１つでは、ポリケチドは外用、内用または非経口用に好適な有機または無機キャリアまたは賦形剤と混合して組み合わせる。活性成分は、たとえば、通常の無毒の薬学的に許容されるキャリアと配合して錠剤、ペレット、カプセル、坐剤、ペッサリー、溶液剤、エマルジョン、懸濁剤および使用に好適な他の任意の形態としてもよい。使用できるキャリアとしては、水、グルコース、ラクトース、ゴムアカシア、ゼラチン、マンニトール、デンプン糊、三ケイ酸マグネシウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイド状シリカ、ポテトスターチ、尿素、および固形、半固形または液状の調製物の製造に使用するのに好適な他のキャリアが挙げられる。さらに、補助安定化剤、増粘剤および着色剤および芳香剤を使用してもよい。

一態様では、本発明は、上記に開示した方法により同定されるパーキン活性の正のモジュレーターを提供する。この物質は、分子量１０００未満、多くの場合５００未満の分子など小分子であってもよい。一実施形態では、この物質は、パーキンを安定化したり（すなわち、過剰発現したときでもパーキンを活性コンフォメーションに維持する）、またはミスフォールドしたパーキン変異体を本来のフォールディングに導いたりすることができる「化学シャペロン」である。本発明はさらに、治療有効量の化合物を投与してパーキンソン病と診断された被検体を処置する方法も提供する。本発明はさらに、予防有効量の化合物を投与してパーキンソン病の発症リスクが平均より高いと決定された被検体を処置する方法も提供する。

（実施例１）
パーキンタンパク質の熱減弱のパラメーター
パーキンの減弱（熱不安定化）およびインビトロアッセイを５０ｕｌのエッペンドルフチューブアッセイフォーマットで行い、続いてＳ５ａに対する抗体のウエスタンブロッティングし、パーキンによるＳ５ａのユビキチン化の程度を評価した。

パーキンタンパク質を３７、４２、４７および５１℃で２時間プレインキュベートし、パーキンタンパク質を熱不安定化させた。２種類のパーキンタンパク質調製物を使用した。調製物１（「Ｈｉｓ−パーキン」）はヒスチジンタグ付きパーキンである（米国特許出願公開第２００７／０２１２６７９号に記載）。調製物２（「ＧＳＴ−パーキン」）はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグ付きパーキンである。熱不安定化後、パーキンを氷上で１０分間インキュベートし、次いでＥ１、Ｅ２（ＵｂｃＨ７）、Ｓ５ａ、Ｍｇ−ＡＴＰおよびユビキチンを含むリガーゼアッセイ反応混合物を加えた。

反応混合物を３７℃で９０分間インキュベートし、４×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液で止めてから、Ｓ５ａに対する抗体で免疫ブロットした。

結果を図２に示す。２種類の方法を用いて作製され、２つの異なるエピトープタグを持つパーキン調製物から同じ熱不安定化パラメーターが確認されたため、この実験によりパーキンが安定にフォールディングされない固有の温度が示唆される。パーキン熱安定性の変化点は４２℃〜４７℃である。

（実施例２）
ＦＲＥＴスクリーンの確認
図３は、上述のＦＲＥＴフォーマットを用いた熱変性アッセイの結果を示す。１，５３６ウェルアッセイプレートを使用した。この実験では、被検化合物を加えなかった。サンプルは表記したように、十分に活性なパーキンまたは減弱したパーキンを含むか、またはパーキンを含んでいなかった。アッセイの表示値から、サンプルが明確に分離されることが示される。

（実施例３）
パーキン安定剤およびアゴニストの超ハイスループットスクリーン（ＵＨＴ（Ｕｌｔｒａ−Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）スクリーン）
本発明のＦＲＥＴ型アッセイを用いて２６０，６９１個の化合物をスクリーニングし、７８４個の化合物を、パーキンソン病を処置する候補化合物として確認した。パーキンは、被検化合物の存在下で５７℃にて９０分間曝露して熱減弱させた。減弱後、アッセイ試薬混合物（Ｅ１、Ｅ２、Ｅｕ−（Ｋ）−ユビキチン、Ｍｇ−ＡＴＰおよびビオチン化Ｓ５ａ）を加え、３０℃でインキュベートし、残存するパーキン活性を測定した。ビオチン化基質Ｂｔ−Ｓ５ａのユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ）を、アロフィコシアニンＡＰＣ（ＸＬ−６６５、Ｃｉｓｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ ０１７３０）を架橋したストレプトアビジン結合アクセプター試薬を加えて基質のＥｕ−（Ｋ）−ユビキチンとＡＰＣとの間のＦＲＥＴシグナルを測定することで決定した。このアッセイについては、以下の段落でより詳細に記載する。

熱不安定化：
ｉ）アッセイ緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ８．８、１ｍＭのＤＴＴ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−１２７）に溶かした０．０５ｍｇ／ｍｌのＧＳＴ−パーキン１ｕＬを１５３６ウェルプレートのウェルに加えた。
ｉｉ）被験サンプルのウェルに１０または２０ｎＬの被験物質（ＤＭＳＯに溶かした５００ｕＭの原液）を加え、対照サンプルのウェルに未希釈ＤＭＳＯを加えた。
ｉｉｉ）サンプルを５７℃で９０分間インキュベートした。

減弱していないパーキンの対照サンプル：
ｉ）アッセイ緩衝液Ａに溶かした０．０５ｍｇ／ｍｌのＧＳＴ−パーキン１ｕＬを１，５３６ウェルプレートのウェルに加えた（十分に活性なパーキンを含むウェル）。

ライゲーションアッセイおよび検出：
ｉ）アッセイ成分を含む５００ｎＬの前混合物を最終濃度：
１５ｎＭのＥ１
３００ｎＭのＥ２
１ｍＭのＭｇ−ＡＴＰ
４００ｎＭのＢｔ−Ｓ５ａ
２０ｎＭのＵｂ−Ｅｕ（Ｋ）
８００ｎＭのＵｂ
になるように各ウェルに加えた。
ｉｉ）ライゲーション（ユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ））反応を３０℃で１８０分を進行させた。
ｉｉｉ）３ｕＬの停止−検出混合液を、１００ｍＭのＮａＰｉ ｐＨ７．０、１００ｎＭのストレプトアビジン結合ＸＬ６６５（ＳＡ−ＸＬ６６５）、４００ｍＭのＫＦ、１６ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１％ＢＳＡを含む原液に最終濃度が７５ｎＭのＳＡ−ＸＬ６６５、３００ｍＭのＫＦ、１２ｍＭのＥＤＴＡになるように加えた。
ｉｖ）４ｕＬの反応混合物を室温で４５分インキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。
ｖ）以下のパラメーターを用いてＥｎＶｉｓｉｏｎ装置（ＰａｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でＨＴＲＦを読み取った：
ａ）励起３２０ｎｍ。
ｂ）測定した発光６６５ｎｍおよび６１５ｎｍ。
ｃ）ディレイタイム：７０μｓ。
ｄ）時間窓１００μｓ。
ｅ）照射間隔：２０００μｓ。

一次スクリーンの結果
ｉ）２６０，６９１個の化合物それぞれの反復試験片４〜５個を２０ｕＭでスクリーニングした。
ｉｉ）平均の減弱効率は６１％であった。
ｉｉｉ）ヒットの閾値は、全プレートの中央値３＊σ（すなわち、対照の閾値は１８．６２％活性化）または特定のプレートの個別の３＊σのいずれか大きい方とした。
ｉｖ）３２８８個の一次ヒット化合物が同定され、１．３％のヒット率を示した。

確認スクリーンの結果：
ｉ）３，２８８個の一次ヒット化合物それぞれの反復試験片４〜５個を試験した。
ｉｉ）平均の減弱効率は６７．４％であった。
ｉｉｉ）対照のヒットの閾値は１４．７２％であった。ヒットが「確認される」閾値を超える反復試験片は半数未満でなければならない。
ｉｖ）７８４個の化合物をヒットと確認し、確認率は２４％を示した。

（実施例４）
選択性スクリーニングの代替Ｅ３リガーゼ
この実施例では、本明細書に開示したスクリーニング方法を用いてパーキン活性の正のモジュレーターの特異性が確認できることを説明する。この方法では、パーキン活性の正のモジュレーターの特異性を、ａ）パーキン以外のＥ３リガーゼタンパク質およびパーキン基質タンパク質を基質がユビキチン化される条件下で一緒にインキュベートし；（ｂ）（ａ）の条件下、Ｅ３リガーゼタンパク質およびパーキン基質タンパク質をパーキン活性の正のモジュレーターの存在下でインキュベートし；（ｃ）正のモジュレーターの存在下および非存在下でのＥ３リガーゼのリガーゼ活性を比較し、正のモジュレーターが存在するときにＥ３リガーゼ活性が増大すると、正のモジュレーターがパーキンに完全には特異的でないことが示され、増大がないときは、正のモジュレーターがパーキンに完全に特異的であることが示されることにより決定する。

Ｅ３リガーゼはユビキチン化酵素の最大のファミリーであり、現在、数百の推定配列が同定されている。Ｅ３リガーゼには、以下の構造および作用機序に基づき分類された３つのファミリーがある：（１）Ｅ６ＡＰカルボキシ末端と相同性のあるもの（ＨＥＣＴ：Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ Ｅ６ＡＰ Ｃａｒｂｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎｕｓ）、（２）非常に興味深い新しい遺伝子（ＲＩＮＧ：Ｒｅａｌｌｙ Ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ Ｎｅｗ Ｇｅｎｅ）および（３）ＵＦＤ２ホモロジー（Ｕ−ｂｏｘ）。本発明のアッセイは、たとえば、ＲＩＮＧ Ｅ３でも、Ｕ−ｂｏｘ Ｅ３でも、またはＨＥＣＴ Ｅ３でもよい。パーキンはＲＩＮＧファミリーのメンバーであるため、化合物スクリーニングの代替リガーゼとしては別のＲＩＮＧファミリーのＥ３を用いるのが最も有用と考えられる。しかしながら、Ｅ３リガーゼはこれまでのところ発現させるのが難しい。したがって、我々は各ファミリーからＥ３リガーゼを選択してＳ５ａをユビキチン化する能力を検査した。二次スクリーンに使用する理想的なＥ３リガーゼは、十分に発現し、パーキン用のユビキチン化アッセイで使用する反応条件下で高活性を持ち、熱変性アッセイにおいてパーキンの破壊に使用するのと同様の条件下で熱変性できるものであろう。パーキンは変性温度が４５〜６０℃であることが判明している。特異性スクリーニングの理想的なＥ３リガーゼは、熱変性温度の範囲が、パーキンのスクリーニング用に開発された熱ストレスアッセイで使用する４５〜６０℃であろう。

我々は、下記（セクションＢ）のように６種のＥ３リガーゼ（ＣＨＩＰ、Ｎｅｄｄ４、Ｍｕｒｆ１、Ｍｄｍ２、Ｅ６ＡＰおよびＳｉａｈ２）を発現させ精製した。Ｓｉａｈ２を除いてどのＥ３リガーゼもＳ５ａを高活性でユビキチン化することができた。Ｓｉａｈ２はＳ５ａをユビキチン化したが、非常に低活性であった。以下のセクションＣを参照されたい。

次いで我々は、４℃〜６０℃の範囲の温度でのプレインキュベーション後、Ｅ３リガーゼがＳ５ａをユビキチン化する能力を試験した。ＣＨＩＰおよびＳｉａｈ２を除く全Ｅ３について熱変性温度を評価した。以下のセクションＣを参照されたい。試験対象のＥ３それぞれについて活性の約５０％が失われた温度を表２に示す。

我々は、この実験を踏まえてＮｅｄｄ４、Ｅ６ＡＰおよびＭｕｒｆ１がどれも優れた発現、精製およびＳ５ａに対する活性を示すと結論した。ＣＨＩＰはよく発現し、Ｓ５ａに対する活性も適切であったが、あまり純粋なサンプルではなかった。Ｓｉａｈ２はよく発現し、精製されたが、Ｓ５ａに対して非常に低い活性を示した。Ｎｅｄｄ４、Ｅ６ＡＰ、Ｍｕｒｆ１およびＭｄｍ２の熱変性の特性を評価した。Ｎｅｄｄ４は３７℃で６０分間のインキュベーション後に活性であったが、９０分後には活性が失われた。Ｍｄｍ２は６０℃でのプレインキュベーション後も十分な活性を持っていた。Ｅ６ＡＰは４１℃で熱変性を示し、Ｍｕｒｆ１は６０℃で熱変性を示した。

こうした結果をすべて考慮すると、Ｅ６ＡＰおよびＭｕｒｆ１の２種が、熱変性に基づく特異性スクリーニングに使用するのに最も有望なＥ３リガーゼであった。Ｍｕｒｆ１はパーキンと同様、ＲＩＮＧ Ｅ３であるため、リガーゼの二次スクリーンにはＭｕｒｆ１が特に好適である。

Ａ．Ｅ３リガーゼの発現および精製
Ｅ３リガーゼのＧＳＴ融合体をコードする発現プラスミドをＢＬ２１ ＤＥ３ ｐＬｙｓＳ細胞に形質転換し、アンピシリン耐性で選択した。細胞を選択培地で一晩増殖させ、翌朝１：１０倍に希釈した。細胞密度がＯＤ_６００で測定して対数増殖期に達したら、１ｍＭのＩＰＴＧで発現を誘導した。発現は温度および時間によって異なった。これを以下の表３に示す。さらに、Ｅ３タンパク質の精製に使用したアフィニティーカラムの種類およびタンパク質を透析した最終緩衝液も掲載する。

発現および精製はＰＡＧＥによりクマシー染色を用いてモニターし、目的のタンパク質を含む溶出画分を同定した。

Ｂ．基質としてのＳ５ａの使用能力
各Ｅ３リガーゼについて、Ｓ５ａを基質として用いたユビキチン化アッセイを行った。簡単に説明すると、ユビキチン化反応物は、５０ｎＭのＥ１、１ｍＭのＭｇＡＴＰ、５μＭのＵｂｃＨ７、０．２ｍｇ／ｍＬのＥ３、２００ｎＭのユビキチンおよび２００ｎＭのＳ５ａを含んでいた。ユビキチン化反応物を３７℃で１時間インキュベートし、サンプルを０、３０’および６０’時に採取した。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、イモビロンにトランスファーし、Ｓ５ａに対するモノクローナル抗体（ＢｉｏＭｏｌ）を用いてウエスタンブロットした。

Ｃ．Ｅ３リガーゼの熱変性
熱変性特性Ｅ３リガーゼの特徴付けを行うため、Ｅ３を４℃〜６０℃の範囲の温度（Ｍｄｍ２およびＮｅｄｄ４は４、３７、４５、５０および６０℃；Ｍｕｒｆ１は４、３７、５０、６０、７０および８０℃；Ｅ６ＡＰは３７、３９、４１、４３および４５℃で９０分間プレインキュベートした。９０分時に、５０ｎＭのＥ１、１ｍＭのＭｇ−ＡＴＰ、５μＭのＵｂｃＨ７（Ｍｄｍ２およびＭｕｒｆ１ではＵｂｃＨ５）、２００ｎＭのユビキチンおよび２００ｎＭのＳ５ａを含む前混合物を作製した。この前混合物を０．２ｍｇ／ｍＬのＥ３リガーゼに加え、３７℃で６０分間インキュベートした。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、Ｓ５ａに対するモノクローナル抗体（ＢｉｏＭｏｌ）を用いてウエスタンブロッティングにより評価した。

パーキンは４５℃〜５０℃でその活性の約５０％を失ったが、これは先の実験と整合している。Ｍｄｍ２は６０℃でのプレインキュベーション後も活性を保持するようだ。Ｎｅｄｄ４は、試験した条件下、４℃を除くどの温度でもプレインキュベーション後に活性を失うようであった。Ｅ６ＡＰは、４１℃でのプレインキュベーション後にその活性の５０％を失うと見られたため、我々は３７℃〜４５℃の温度範囲でこの実験を繰り返し、Ｅ６ＡＰが熱変性を受けるより具体的な温度を決定した。Ｍｕｒｆ１は、６０℃でその活性の５０％を失うようであった。

（実施例５）
リガーゼ選択性のスクリーニング
パーキンのＥ３リガーゼ活性を阻害または増強する物質（以下「正のモジュレーター」という場合がある）は、Ｓ５ａをパーキン基質としたアッセイを用いて同定することができる。本明細書に開示した新たなスクリーニング方法を用いれば、パーキン−Ｓ５ａ相互作用に対する正のモジュレーターの特異性を確認することができる。パーキンによるＳ５ａのユビキチン化は調節するが、別のＥ３リガーゼによるＳ５ａのユビキチン化は調節しない物質は、パーキンに特異的な正の調節活性を持つ物質と同定される。

図４は、パーキン活性の正のモジュレーター（ＧＳＴ−パーキンＰＳ／ＵｂｃＨ７を用いたＥＣ_５０＝２．８ｕＭ）についてＥ３リガーゼＭｄｍ２に対する作用を試験した実験を示す。ＧＳＴ−Ｍｄｍ２は、１５３６ウェルフォーマットに１００ｎＭのＵｂｃＨ５ａと一緒に０．００５ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。図に示すように、パーキン活性の正のモジュレーターはＭｄｍ２の活性を増大させなかったことから、この正のモジュレーターがパーキンに対して特異性を持つことが明らかになった。この実験では熱変性ステップを用いなかった。

本明細書に引用する刊行物および特許文書（特許、公開された特許出願および未公開の特許出願）はすべて、参照によって本明細書に援用するために、そうした各刊行物および文書を具体的に個々に示しているかのように参照によって本明細書に援用する。刊行物および特許文書の引用は、そうした文書のいずれかが適当な従来技術であることを認めることを意図するものではなく、そうした文書の内容または日付を承認することにもならない。本発明について書面による説明および実施例によって記載してきたが、当業者であれば、本発明が種々の実施形態により実施することができ、かつ前述の説明および実施例は説明のためのものであり、以下の特許請求の範囲を限定するものでないことを理解するであろう。

Claims (25)

1. ａ）それぞれが
   ｉ）パーキンタンパク質および
   ｉｉ）複数の被験物質のうちの１種
   を含む複数の被験サンプルを熱不安定化条件に曝露すること；
   ｂ）該被験サンプル中のパーキンリガーゼ活性を、被験物質の非存在下で熱不安定化条件に曝露したパーキンタンパク質を含むコントロールサンプルと比較して決定すること
   を含むスクリーニングアッセイであって、
   パーキンリガーゼ活性が該コントロールサンプル中の該リガーゼ活性を上回る被験サンプル中に含まれる被験物質は、パーキンソン病の処置のための候補化合物と同定される
   アッセイ。
2. 被験物質の非存在下で前記熱不安定化条件に曝露したパーキンはその当初のＥ３リガーゼ活性の４０〜７０％を保持する、請求項１に記載のアッセイ。
3. 前記熱不安定化条件は４５〜６０℃の温度での３０〜１８０分間のインキュベーションを含む、請求項２に記載のアッセイ。
4. 前記熱不安定化条件は約５７℃の温度での約９０分間のインキュベーションを含む、請求項２に記載のアッセイ。
5. 前記熱不安定化条件は約６０℃の温度での約１５０分間のインキュベーションを含む、請求項２に記載のアッセイ。
6. パーキンリガーゼ活性はパーキンタンパク質、ユビキチン活性化酵素Ｅ１、ユビキチン結合酵素Ｅ２、ＡＴＰ、ユビキチンおよびパーキン基質を適切な緩衝液中で組み合わせ、その組み合わせたものを２０〜３７℃でインキュベートし、該パーキン基質のユビキチン化の速度または程度を測定することで決定される、請求項１に記載のアッセイ。
7. 前記パーキン基質はＳ５ａ、セプチン４またはトロポニン１である、請求項６に記載のアッセイ。
8. 前記パーキン基質はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として発現されるＳ５ａである、請求項７に記載のアッセイ。
9. パーキンリガーゼ活性はドナー発色団がユビキチンに結合し、アクセプター発色団がパーキン基質に結合しているか、またはドナー発色団がパーキン基質に結合し、アクセプター発色団がユビキチンに結合している蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイを用いて決定される、請求項１に記載のアッセイ。
10. 前記ドナー発色団はユーロピウムクリプレート（ｃｒｙｐｌａｔｅ）であり、前記アクセプター発色団はアロフィコシアニンである、請求項９に記載のアッセイ。
11. 前記パーキン基質はＳ５ａである、請求項９に記載のアッセイ。
12. １５３６ウェルプレートで行われる、請求項９に記載のアッセイ。
13. パーキン安定剤であるパーキン活性の正のモジュレーターをパーキンアゴニストである候補化合物と識別することをさらに含む請求項１に記載のアッセイであって、
    該化合物の存在下および非存在下で、減弱していないパーキンタンパク質をインキュベートし、パーキンリガーゼ活性を増大させる化合物はパーキンアゴニストと同定され、パーキンリガーゼ活性を増大させない化合物はパーキン安定剤と同定されること
    を含む、アッセイ。
14. 前記候補化合物をそれに対応する被験サンプルの前記パーキンリガーゼ活性に応じてランク付けすることをさらに含む、請求項１に記載のアッセイ。
15. パーキン活性の正のモジュレーターの特異性を評価するインビトロ法であって、該インビトロ法は、
    （ａ）請求項１に記載の方法を用いてパーキンの正のモジュレーターを同定すること
    （ｂ）パーキン以外のＥ３リガーゼタンパク質およびパーキン基質タンパク質を該基質がユビキチン化される条件下で一緒にインキュベートすること；
    （ｃ）（ｂ）の条件下、該Ｅ３リガーゼタンパク質および該パーキン基質タンパク質をパーキン活性の正のモジュレーターの存在下で一緒にインキュベートすること；
    （ｄ）該正のモジュレーターの存在下および非存在下で該Ｅ３リガーゼのリガーゼ活性を比較することを含み、該正のモジュレーターが存在する場合、Ｅ３リガーゼ活性における増大は、該正のモジュレーターがパーキンに完全には特異的でないことを示し、増大がないことは、正のモジュレーターがパーキンに完全に特異的であることを示す、
    インビトロ法。
16. 前記正のモジュレーターの存在下での基質のユビキチン化の増大は、該正のモジュレーターがパーキンに完全には特異的でないが、正のモジュレーターは不完全に特異的であることを示し、ここで、不完全に特異的とは、前記非パーキンのＥ３についてのＥＣ_１０が１００マイクロモル以下であり、パーキンについてのＥＣ_１０よりも少なくとも４倍大きいことと定義される、請求項１５に記載のインビトロアッセイ。
17. 前記パーキン基質はＳ５ａである、請求項１５に記載の方法。
18. 前記パーキン基質はトロポニン１である、請求項１５に記載の方法。
19. 前記Ｅ３リガーゼタンパク質はＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼである、請求項１５に記載の方法。
20. 前記Ｅ３リガーゼタンパク質はＭｄｍ２、Ｎｅｄｄ４、Ｍｕｒｆ１およびＥ６ＡＰからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
21. 前記Ｅ３リガーゼタンパク質はＭｕｒｆ１である、請求項２０に記載の方法。
22. パーキンソン病の処置のための化合物を選択する方法であって：（ａ）パーキン活性の正のモジュレーターを同定すること；（ｂ）（ａ）の正のモジュレーターをパーキン安定剤またはパーキンアゴニストと同定すること；（ｃ）パーキン以外のＥ３リガーゼによるパーキン基質のユビキチン化に対する該モジュレーターの作用に基づき、パーキン特異的である正のモジュレーターを選択すること（ｄ）パーキンによる複数のパーキン基質のユビキチン化を正に調節する能力に基づき、基質特異的でない正のモジュレーターを選択することを含む、方法。
23. 前記複数のパーキン基質はセプチン４を含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記複数のパーキン基質はセプチン４と、Ｓ５ａまたはトロポニン１の一方または両方とを含む、請求項２２に記載の方法。
25. パーキンソン病を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に請求項１に記載の方法により同定された候補化合物を投与すること、またはそのような候補化合物の誘導体を投与することを含む、方法。