KR20070083640A - Ｅ2―ｅｐｆ5, 신규한 치료학적 단백질 및 표적 - Google Patents

Ｅ2―ｅｐｆ5, 신규한 치료학적 단백질 및 표적 Download PDF

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죠나단 할
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크레이그 스테펜 믹카닌
피터 쉬미트
얀 바일러
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Abstract

본 발명은 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소 E2-EPF5의 신규한 용도에 관한 것이다. 특히, E2-EPF5 활성의 저해는 저산소증에 대한 반응에서 VEGF 뿐만 아니라, 전사 인자 HIF-1에 의해 조절되는 다른 단백질 생산을 저하시키는 것으로 나타났다. 상기 발견에 기초하여, 본 발명은 VEGF 유도 혈관화와 관련된 질환의 치료에 유용한 치료학적 방법 및 약제학적 조성물을 제공한다. 추가로, E2-EPF5는 치료제 개발을 위한 표적으로 제공된다. 따라서, 본 발명은 E2-EPF5 활성을 저해하고, 이로써, 종양 관련 혈관화와 같은 VEGF 유도 혈관화를 치료하기 위해 사용될 수 있는 후보 화합물을 동정하기 위한 선별 방법을 제공한다. 마지막으로, 본 발명은 또한 VEGF 및 다른 HIF-1에 의해 조절되는 단백질을 저해하는 방법을 제공한다.

Description

Ｅ2―ＥＰＦ5, 신규한 치료학적 단백질 및 표적{E2-EPF5, A NOVEL THERAPEUTIC PROTEIN AND TARGET}
선별 방법
본 발명은 VEGF-의존성 혈관화, 및 특히, 종양 관련 혈관화의 저해를 위한 치료 방법 및 약제학적 조성물에 관한 것이다.
혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 신생 혈관의 성장 자극 및 그의 투과를 포함하는, 인간의 종양에서 관찰되는 다수의 혈관 반응을 초래하는 단백질을 코딩한다. VEGF는 대부분의 고형 종양상의 혈관신생 확립에 필수적이고, VEGF 발현에 대한 구성상의 상향조절이 종양 혈관신생의 주요한 기여자로서 간주된다.
VEGF 및 수개의 다른 혈관신생 성장 인자의 발현은 전사 인자 HIF-1 (저산소증-유발 인자-1)에 의한 VEGF 유전자의 전사 유도를 포함하는 저산소증에 의해 중요하게 조절된다. 저산소증은 정상 수준의 조직 산소 분압 항상성의 저하이고, 급성 및 혈관 질환, 폐 질환 및 암을 앓고 있는 동안에 발생한다. 예를 들면, 종양 세포는 HIF-1을 유도함으로써 저산소증에 적응한다. HIF-1은 조직 산소화를 변화 시키는 적응 반응을 매개하고, 세포 증식, 세포 생존, 침윤 및 전이, 아포프토시스, 혈관신생, 글루코오스 및 철 대사를 포함하는 다중 과정에 관여하는 다양한 유전자의 전사를 활성화시킨다. Hif-1은 다수의 인간 암에서 과다발현되고 불명확한(poor) 예후 및 환자 사망률 증가와 관련된다. 최근 연구를 통해 HIF-1이 저산소증, 종양유전자 활성화 및 돌연변이화에 기인한 화학요법 및 방사선에 대한 내성을 매개한다고 제시되었다. 그러므로, HIF-1 활성의 저해가 항-혈관신생 요법의 중요한 구성 요소임을 나타낼 수 있다.
E2-EPF5는 유비퀴틴을 세포 단백질에 컨쥬게이션시키는 유비퀴틴-컨쥬게이션 효소 (E2) 계열의 일원이다. 유비퀴틴 및 유비퀴틴-양(like) 조절자는 유비퀴틴 활성화 효소 (E1), 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소 (E2 또는 UBCs) 및 유비퀴틴 리가아제 (E3)를 포함하는, 기계학적으로 보존되는 효소적 연쇄반응에 의해 처리되고(processed) 기질 단백질에 부착된다. 상기 조절은 상이한 작용을 갖고, 26S 프로테아좀 경로를 통한 유비퀴틴-의존성 단백질 분해를 그중의 가장 큰 특징으로 한다. E2 및 E3 둘 모두는 함께 작용하여 유비퀴틴을 표적 단백질로 전달시키기 때문에 이로써 기질 특이성을 측정하게 된다. 인간 게놈 서열의 유용성을 통해 E2, E3 및 탈유비퀴틴화 프로테아제를 포함하는 유비퀴틴 계열의 일원의 동정을 완성시킬 수 있는 가능성이 열렸지만, 단지 몇몇 기질의 유비퀴틴화만이 동정되었고 유비퀴틴 시스템 및 인간 질환에서의 그와의 관련성에 대한 이해는 여전히 초기 단계에 있다. 그러나, 유비퀴틴 및 유비퀴틴-양 분자에 의한 세포 단백질의 조절이 다중의 생물학적 과정, 특히, 세포 주기 진행, 세포 분화 및 DNA 수복에서 필수적인 조 절 기작이라는 주요 증거는 증가하고 있다.
이에, 본 발명은 저산소증에서, 및 특히, 저산소증에 대한 반응으로 전사 인자 HIF-1에 의해 조절되는 단백질의 증진에서 유비퀴틴-컨쥬게이션 효소 E2-EPF5에 대한 신규한 역할을 제공한다.
발명의 요약
제 1면으로, 본 발명은 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소 E2-EPF5를 코딩하는 유전자의 발현을 저해하거나 E2-EPF5 유전자 산물의 활성을 저해하는 제제를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 비정상적인 신생-혈관증식과 관련된 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 신생-혈관증식은 종양에서의 혈관신생, 류마티스 관절염에서의 윤활막 혈관신생, 당뇨 망막병증에서 관찰되는 바와 같은 눈 신생-혈관증식, 건선에서의 피부 혈관신생, 또는 간경화에서의 저산소증-유발 혈관신생이다. 특히 바람직한 실시태양에서, 신생-혈관증식은 VEGF-의존성 종양 혈관신생이다.
본 발명의 일면에서, 제제는 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소 E2-EPF5를 특이적으로 저해할 수 있는 저해성 핵산, 바람직하게, 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물, 더욱 바람직하게, siRNA 화합물이다. 본 발명의 또다른 일면에서, 제제는 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소 E2-EPF5에 특이적으로 결합하는 항체이다.
또다른 일면에서, 본 발명은 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소 E2-EPF5를 코딩하는 유전자의 발현을 저해하거나 E2-EPF5 유전자 산물의 활성을 저해하는 제제를 유효량으로 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 바람직하게, E2-EPF5 저해제는 E2-EPF5에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA 또는 항체이다.
추가의 일면에서, 본 발명은 (a) E2-EPF5 폴리펩티드를 시험 화합물과 접촉시키고 (b) E2-EPF5 생물학적 활성의 변화를 검출하는 것을 포함하는, VEGF-의존성 혈관화의 치료에 유용한 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, E2-EPF5 생물학적 활성은 저하된다.
또다른 일면에서, 본 발명은 유비퀴틴 컨쥬게이션 관련 효소 E2-EPF5의 발현을 저해하는 것을 포함하는, 저산소증에 대한 반응으로 HIF-1에 의해 조절되는 하나 이상의 폴리펩티드의 양을 저하시키거나 그의 활성을 저해시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, HIF-1에 의해 조절되는 유전자 또는 단백질은 GLUT-1, GLUT-3, HK2, EPO, NOS2, VEGF, TGF-알파, TGF-베타, VEGFR-2, C-Met, UPAR, CXCR4, 탄산 탈수효소 IX (CAIX)로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소 E2-EPF5를 저해하는 것이 저산소증에 대한 반응에서 HIF-1 의존성 단백질 발현에 간섭한다는 놀라운 발견에 기초한다. 특히, E2-EPF5를 저해하는 것이 저산소증에 대한 반응에서 VEGF의 증진에 간섭하는 것으로 밝혀졌다. 전혈관신생(proangiogenic) VEGF는 최초 혈관을 구성하는 내피 세포의 증식 및 유주에 필요하다. VEGF는 혈관신생 촉진외에도, 염증의 중대한 특징인 혈관 투과성의 증진을 포함하는 광범위한 활성을 갖는 34-45kDa의 당단백질이다. VEGF는 내피 세포를 위한 성장 인자로서 작용할 뿐만 아니라, HIV-관련 카포시 육종 세포 및 다른 종양 및 백혈병 세포를 포함하는 수개의 다른 세포상에서 작용한다. 종양 세포는 빈번하게 VEGF를 증진된 수준으로 발현시키는 바, 이는 혈관신생의 자극뿐만 아니라, 증식-자극성 자가 신호전달 경로의 활성화와 관련된 것으로 사료된다. 상기와는 대조적으로, VEGF 수용체에서 개시되는 신호 형질도입 경로를 통한 직접적인 효과외에도, VEGF는 또한 간접적인 효과도 유도한다는 것에 주시하는 것도 중요하다. 예를 들면, 수용체 Notch1은 상기 세포-표면 수용체의 리간드에 대한 반응의 증진을 허용하는 VEGF에 의해 상향조절된다. VEGF 발현은 수개의 병적 상태, 예로서, 종양 혈관신생, 저산소증-관련 혈관신생, 여러 형태의 실명 (예로서, 당뇨 망막병증, 증식성 당뇨 망막병증, 연령 관련 황반 변성), 류마티스 관절염, 건선 및 상처 치유 및 그외의 것들과 관련된다. 다수의 연구를 통해 수준이 증진된 VEGF 단독으로도 신생혈관증식을 유도하기에 충분하다는 것이 입증되었다. 예를 들면, 허혈의 래빗 모델에서 VEGF의 단일 주사가 곁맥관 발생을 증강시켰다고 입증되었다 [Takashita et al., 1995 J; Clin. Invest. 93, 662]. VEGF는 또한 각막으로 주사될 경우, 신생혈관증식도 유도할 수 있다.
이에, 본 발명은 저산소증에 대한 반응에서 증진되는, 하나 이상의 HIF-1에 의해 조절되는 폴리펩티드, 및 특히, VEGF의 양 또는 그의 활성을 저하시키는 방법을 제공한다. 저산소증하에서 HIF-1에 의해 조절되는, 다양한 작용을 갖는 단백질을 코딩하는 다수의 유전자는 공지되어 있고, 제한하는 것은 아니지만, 하기의 유전자: GLUT-1, GLUT-3, HK2, CAIX (예로서, 대사 적응에 관여); EPO, NOS2 (예로서, 아포프토시스 내성에 관여); VEGF, TGF-알파, TGF-베타, VEGFR-2 (예로서, 혈관신생에 관여), C-Met, UPAR, CXCR4 (예로서, 종양 침윤, 전이에 관여)를 포함한다. 본 발명과 관련하여 용어 "HIF-1에 의해 조절되는 폴리펩티드"는 그의 발현이 전사 인자 HIF-1에 의해, 예로서, 상기 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 전사 조절 요소와 HIF-1의 결합에 의해 조절되거나 영향을 받는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게, 단백질 발현은 HIF-1 전사 인자의 활성에 의해 활성화되고, 즉, 더많은 단백질이 HIF-1 활성화에 대한 반응으로 발현된다. HIF-1은 3개의 알파 서브유니트 (HIF-1α, HIF-2α 또는 HIF-3α)중 하나 및 베타 서브유니트 (HIF-1β, 아릴 하이드로카본 뉴클리어 트랜스로케이터(Aryl Hydrocarbon Nuclear Translocator), 또는 ARNT로도 공지되어 있음)로 구성된 이종이량체이다. HIF-1b는 구성상 발현되는 반면, 알파 서브유니트의 발현은 고도로 조절된다. 임의의 다른 단백질의 경우, 알파 서브유니트의 수준은 단백질 합성 속도 및 단백질 분해 속도에 의해 결정된다. HIF-1 알파 서브유니트의 합성은 산소-비의존적 기작에 의해 조절되는 반면, 분해는 주로 O2-의존적 기작에 의해 조절된다. 따라서, 알파 서브유니트에 대한 유전자가 대부분 계속적으로 전사되고 해독될지라도, 알파 서브유니트 단백질은 프로테아좀 분해를 통한 신속한 파괴에 기인하여 매우 낮은 수준으로 유지된다. 이러한 파괴는 저산소 조건하에서 저해되고 이는 HIF1a의 유도 및 상기 전사 인자에 의존적인 유전자의 주요 기작이 된다.
E2-EPF5는 서열 복잡성(sequence complexity)이 낮은 65aa-길이의 염기성 C-말단 신전(extension)을 갖는 25kDa의 클래스 II의 유비퀴틴-컨쥬게이션 효소를 코딩한다. E2-EPF5는 지방성낙엽상 천포창 (EPF)으로 명명되는 피부 질환을 앓는 환자에서 최초로 발견되었다 [Liu et al., 1992, JBC 267, 15829]. 이후, E2-EPF5는 단백질 분해 이벤트를 매개하는 것으로 간주되는 기작인 다중유비퀴틴 쇄 형성을 K48 잔기가 아닌 리신 잔기 K11을 통해 촉진시키기 때문에 다른 특징화된 E2 동종효소와 기능면에 있어서 상이한 것으로 간주되었다 [Bach and Ostendorff, Trends in Biochemical Sciences (2003), 28(4), 189-195]. E2-EPF5는 또한 E2-EPF5에 대하여 가능한 자가조절 모델을 제안하는 자가-유비퀴틴화를 지지하는 것으로 밝혀졌다. E2-EPF5에 대한 기질이 현재까지는 보고된 바 없지만, E2 계열의 일원내에서 유일한, 그의 고도로 염기성인 카복시-말단 신장 영역이 산성 단백질에 대한 특이성을 나타낼 수 있다 [Liu et al., J Biol Chem. 271 , 2817-2822]. 본 발명과 관련하여 용어 E2-EPF5의 (생물학적) 활성은 유비퀴틴과 관련된 그의 활성외에도, 저산소증-조절되는 유전자의 HIF-1 매개성 유도에 간섭하는 것을 포함한다.
인간 E2-EPF5의 서열은 공개된 데이타베이스 (진뱅크 등록번호(GenBank Accession) M91670, GI:181915, 스위스프로트 엔트리(SwissProt entry) Q 16763)로부터 이용할 수 있다. cDNA 서열을 서열번호:1로 나타낸다. 아미노산 서열은 서열번호:2로 나타낸다. 그러나, 용어 E2-EPF5는 또한 본 원에 기술된 E2-EPF5의 생물학적 활성을 유지하는 한, 임의의 상동 또는 오솔로그(orthologous) 서열, 변이체 및 단편도 포함한다. 상동성 서열과 참조 서열 사이의 상동율(homology percent)은 바람직하게, 적어도 80%, 더욱 바람직하게, 적어도 85%, 바람직하게, 적어도 90%, 더욱 바람직하게, 적어도 95%, 더더욱 바람직하게, 적어도 99%이다. 서열 비교는 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 서열 정렬 알고리즘 (예로서, http://www- to.usc.edu/software/seqaln/index.html 참조)을 사용하여 수행한다. "단편"은 적어도 5개, 10개, 15개 또는 임의로 적어도 25개, 35개, 또는 45개의 E2-EPF5의 인접한 아미노산을 갖는 임의의 폴리펩티드 분자를 의미한다. 추가로 가능한 단편은 인지 부위, 유비퀴틴 결합 부위, 서브유니트 상호작용에 중요한 부위, 및 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소의 다른 작용을 수행하는데 중요한 부위를 포함하는 촉매 부위 또는 영역을 포함한다. 상기 영역 또는 모티프는 일반 전산화된 상동성 검색 방법에 의해 동정될 수 있다. 예를 들면, 단편은 5개, 10개, 15개, 20개, 30개, 40개, 50개, 또는 100개 이하의 아미노산을 포함하도록 작용 부위로부터 한 방향 또는 양쪽 방향으로 신장될 수 있다. 예를 들면, E2-EPF5 에피토프 또한 용어 단편에 포함된다. E2-EPF5 에피토프는 항체가 이에 대하여 생산될 수 있고 항체에 이에 결합하는 폴리펩티드상의 부위를 나타낸다. 그러므로, E2-EPF5 에피토프의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 E2-EPF5 폴리펩티드에 대한 항체를 제조하는데 유용하다. 바람직하게, 에피토프는 적어도 5개, 더욱 바람직하게, 적어도 10개, 15개, 20개, 25개, 또는 50개 길이의 아미노산 잔기의 서열을 포함한다.
일면에서 본 발명은 유비퀴틴 컨쥬게이션 관련 효소 E2-EPF5 활성을 저해하는 제제를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 비정상적인 신생-혈관증식을 치료하는 방법을 제공한다. 관련된 일면에서, 본 발명은 VEGF-의존성 혈관화, 특히, 종양 혈관신생과 관련된 병적 상태의 치료용 약제의 생산을 위한, E2-EPF5 활성을 저해하는 제제의 용도를 제공한다. 본 원에서 사용되는 바, 용어 "비정상적인 신생-혈관증식"은 정상적으로 건강한 유기체에서는 발생하지 않고 비정상적인 상태 또는 질환 상태와 관련되는 혈관화를 의미한다. 비정상적인 신생-혈관증식은 바람직하게 VEGF의 활성에 의해 조절되거나 영향을 받는, 즉, "VEGF-의존성 혈관화"이다. 특히 바람직한 실시태양에서, 비정상적인 신생-혈관증식은 VEGF-의존성 종양 혈관신생이다.
본 원에서 사용되는 바, 용어 "VEGF-의존성 혈관화"는 VEGF에 의한 자극시 임의의 신생 혈관 형성을 언급하고, 제한없이 종양에서의 혈관신생, 류마티스 관절염에서의 윤활막 혈관신생, 당뇨 망막병증 및 몇몇 다른 안과 질환에서 관찰되는 바와 같은 눈 신생-혈관증식, 건선에서의 피부 혈관신생, 또는 간경화에서의 저산소증-유발 혈관신생을 포함한다.
또다른 일면에서, 본 발명은 유비퀴틴 컨쥬게이션 관련 효소 E2-EPF5의 발현 또는 활성을 저해하는 것을 포함하는, 세포에서 HIF-1에 의해 조절되는 유전자를 저해하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 유비퀴틴 의존성 단백질 분해에 의해 HIF-1의 양을 저하시킴으로써, 예로서, HIF-1a 단백질의 합성 또는 안정화, 또는 HIF-1a 전사 활성화(transactivation)에 간섭함으로써 HIF-1에 의해 조절되는 유전자는 저해될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 유비퀴틴 컨쥬게이션 관련 효소 E2-EPF5의 발현 또는 활성을 저해하는 것을 포함하는, HIF-1에 의해 조절되는 폴리펩티드의 양을 저하시키는 방법을 제공한다. 특히 바람직한 실시태양에서, HIF-1에 의해 조절되는 유전자는 VEGF이다. 따라서, 본 발명은 추가로 항-혈관신생 방법을 제공한다. 따라서, 유비퀴틴 컨쥬게이션 관련 효소 E2-EPF5의 발현 또는 활성을 저해하는 것을 포함하는, 종양 혈관신생을 비롯한 혈관신생을 저해하는 방법을 제공한다.
유전자 발현 또는 단백질 활성과 관련하여, 용어 "저해"는 유전자 발현 또는 단백질 활성의 저하를 의미한다. 바람직하게, 상기와 같은 저하는 저해되지 않은 발현 또는 활성 수준과 비교하여 적어도 20%, 더욱 바람직하게, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%이다. 임의의 적절한 기술에 의해 유전자 또는 단백질이 저해될 수 있다. 당업자는 유전자 발현 또는 단백질 활성을 저해하는 다양한 방법 및 기술을 알고 있다. 예를 들면, E2-EPF5는 RNA 간섭 또는 안티센스 기술에 의해, 또는 E2-EPF5의 작용에 간섭하는 LMW 화합물을 사용하여, 또는 유비퀴틴 컨쥬게이션 관련 효소 E2-EPF5를 저하시키는 임의의 제제에 의해 저해될 수 있다.
유비퀴틴 컨쥬게이션 관련 효소 E2-EPF5 활성을 저해하는 제제는 E2-EPF5의 생물학적 활성을 저하시키는 임의의 물질일 수 있다. 상기 제제는 예를 들면 E2-EPF5 유전자의 발현 또는 E2-EPF5의 효소적 활성을 저해할 수 있거나, E2-EPF5 폴리펩티드의 분해를 유도할 수 있거나, 임의의 다른 방법으로 E2-EPF5의 생물학적 활성에 간섭할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 저해제는 저분자 화합물 또는 저해성 핵산 또는 항체이다.
본 원에서 주시되는 바, 용어 "저해성 핵산"은 유전자 발현의 유전자-특이성 저해를 초래할 수 있는 핵산 화합물을 언급한다. 전형적인 저해성 핵산은 제한하는 것은 아니지만, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 삼중 나선 DNA, RNA 압타머, 리보자임 및 siRNA를 포함한다. 예를 들면, 뉴클레오티드 서열에 대한 지식을 사용하여 유비퀴틴 컨쥬게이션 관련 효소 E2-EPF5의 발현을 강력하게 저해하는 siRNA 또는 안티센스 분자를 디자인할 수 있다. 유사하게, 리보자임을 합성하여 유전자의 특이적인 뉴클레오티드 서열을 인지하고 그를 절단할 수 있다. 표적화된 유전자 발현의 저해에 사용하기 위한 상기 분자의 디자인을 위한 기술은 본 분야의 당업자에게 잘 공지되어 있다.
본 발명의 저해성 핵산 화합물은 상업적으로 이용가능한 자동화 DNA 합성기, 예로서, 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystems) (캘리포니아주 포스터 시티 소재) 모델 380B, 392 또는 394 DNA/RNA 합성기 등의 기기상에서 통상의 수단에 의해 합성할 수 있다. 포스포라미다이트 화학 물질을 사용할 수 있다. 본 발명의 저해성 핵산 화합물은 또한 개질될 수 있고, 예를 들면, 다수의 참조 문헌에 기술되어 있는 뉴클레아제 내성 백본, 예로서, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포라미데이트 등을 사용할 수 있다. 저해성 핵산의 길이는 생물학적 활성이 저해되는 것을 보증하기에 충분하여야 한다. 따라서, 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 경우에는 특이적이 결합이 확실하게 다른 우연한 부위가 아닌, 바람직한 표적 폴리뉴클레오티드에서만 발생할 수 있도록 하는 것을 보증하기에 충분하도록 장쇄이어야 한다. 길이의 상위 범위는 길이가 약 30-40개 초과의 뉴클레오티드인 올리고머를 합성하고 정제하는 것에 대한 불편함 및 그의 비용, 불일치(mismatch)에 대하여 그보다 단쇄인 올리고뉴클레오티드보다 우수한 장쇄의 올리고뉴클레오티드의 허용(tolerance) 등을 포함하는 수개의 인자에 의해 결정된다. 바람직하게, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이 범위는 약 15개 내지 40개 뉴클레오티드이다. 더욱 바람직하게, 올리고뉴클레오티드의 길이 범위는 약 18개 내지 25개 뉴클레오티드이다. 더블-스트랜드 RNA, 즉, 작은 간섭(small interfering) RNA (siRNA) 분자로도 명명되는 센스-안티센스 RNA 또한 사용하여 E2-EPF5에 대한 핵산의 발현을 저해할 수 있다. RNA 간섭은 하나의 스트랜드가 표적 mRNA의 코딩 부위에 일치하는 외인성, 단쇄 RNA 이중 부위(duplex)를 투여하는 방법이다 [Elbashir et al., Nature 2001 , 411 : 494-498]. siRNA 분자는 세포내 유입시 외인성 RNA 이중 부위 뿐만 아니라, 내인성 메신저 RNA를 비롯한, 일치하는 서열을 갖는 싱글-스트랜드 RNA도 분해한다. 따라서, 본 기술은 촉매 기작을 통해 작용하는 것으로 사료되는 바, siRNA가 종래의 안티센스 RNA 방법론보다 더욱 효능이 있고 유효할 수 있다. 바람직한 siRNA 분자는 길이가 전형적으로 19개 내지 25개 뉴클레오티드, 바람직하게, 약 21개의 뉴클레오티드이고 E2-EPF5에 대한 핵산 서열을 포함한다. siRNA를 표적 세포로 전달하는 유효한 전략법은 예를 들면, 물리적 또는 화학적 형질감염을 사용하는 형질도입을 포함한다. 다르게는, siRNAs는 세포내에서 예로서, 기능적 siRNA 또는 그의 전구체의 전사를 허여하는 다양한 PolIII 프로모터 발현 카셋트를 사용하여 발현될 수 있다 (예를 들면, [Scherr et al., Curr. Med. Chem. 2003, 10(3):245-256]; [Turki et al., Hum. Gene Ther. 2002, 13(18):2197-2201]; [Cornell et al., Nat. Struct. Biol. 2003, 10(2):91-92] 참조). 본 발명은 또한 예를 들면, 마이크로-RNA (miRNA) 및 단쇄의 헤어핀 RNA (shRNA)와 같이 RNA 간섭 (RNAi)을 매개할 수 있는 다른 작은 RNA들을 포함한다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 유비퀴틴 컨쥬게이션 관련 효소 E2-EPF5 활성을 저해하는 제제는 항체이다. 상기 항체는 제한하는 것은 아니지만, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 (mAbs), 인간화된 항체 또는 키메라 항체, 단일 쇄 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 항-이디오타입 (항-Id) 항체, 및 상기 중 어느 것의 에피토프-결합 단편을 포함한다. 폴리클로날 항체의 생산을 위해 본 분야에 공지된 다양한 방법을 사용할 수 있다.
항체의 생산을 위해 본 분야에 공지된 다양한 방법을 사용할 수 있다. 폴리클로날 항체는 항원, 예를 들면, 표적 유전자 산물, 또는 그의 항원의 기능적 유도체로 면역화된 동물의 혈청으로부터 유래된 이질성의 항체 분자 군집이다. 폴리클로날 항체의 생산을 위해 적절한 애주번트로 보충된 E2-EPF5 폴리펩티드, 유도체 또는 단편을 주사하여 숙주 동물을 면역화시킬 수 있다. 특정 항원에 대한 항체의 동질성의 항체 군집인 모노클로날 항체는 배양액중 무한 증식성 세포주에 의한 항체 분자의 생산을 제공하는 임의의 기술에 의해 수득할 수 있다. 제한하는 것은 아니지만, 콜러(Kohler) 및 밀슈타인(Milstein)의 하이브리도마 기술 [1975, Nature 256:495-497] 인간 B-세포 하이브리도마 기술, 및 EBV-하이브리도마 기술을 포함한다. 상기 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD를 포함하는 임의의 면역글로불린 및 그의 임의의 하위부류일 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 생산 mAb를 시험관내 또는 생체내에서 배양할 수 있다. 생체내에서 고역가의 mAb를 생산하는 것이 곧 바람직한 생산 방법이다.
추가로, 적절한 생물학적 활성의 인간 항체 분자로부터 유래된 유전자와 함께 적절한 항원 특이성의 마우스 항체 분자로부터 유래된 유전자를 스플라이싱시켜 "키메라 항체" (즉, 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자, 예로서, 뮤린 mAb로부터 유래된 가변 또는 과가변 부위 및 인간 면역글로불린 불변 부위를 갖는 것)를 생산하기 위해 개발된 기술을 사용할 수 있다. 다르게는, 단일 쇄 항체의 생산을 위해 기술된 기술을 E2-EPF5 항체를 생산하기 위해 적합화시킬 수 있다. 아미노산 브릿지를 통해 Fv 부위의 중쇄 및 경쇄 단편을 연결시켜 단일 쇄 폴리펩티드를 수득함으로써 단일 쇄 항체를 형성한다. 상기 기술은 본 분야에 공지되어 있다.
바람직한 실시태양에서, E2-EPF5 항체는 "인간화된 항체"이다. E2-EPF5 폴리펩티드, 단편, 유도체, 및 본 원에 기술된 기능적 동등물에 대한 항체를 생산하기 위해 "인간화된 항체"의 생산에 유용한 기술을 적합화시킬 수 있다. 상기 기술은 미국 특허번호 제 5,932,448호; 제 5,693,762호; 제 5,693,761호; 제 5,585,089호; 제 5,530,101호; 제 5,910,771호; 제 5,569,825호; 제 5,625,126호; 제 5,633,425호; 제 5,789,650호; 제 5,545,580호; 제 5,661,016호; 및 제 5,770,429호 (상기의 모든 문헌 전체의 내용은 본 원에서 참고문헌으로서 인용된다)에 기술되어 있다.
특이적 E2-EPF5 에피토프를 인지하는 항체 단편은 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, 상기 단편은 제한하는 것은 아니지만, 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생산될 수 있는 F(ab')2 단편 및 F(ab')2의 디설파이드 브릿지를 환원시켜 생산할 수 있는 Fab 단편을 포함한다. 다르게는, Fab 발현 라이브러리를 작제하여 바람직한 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편을 신속하고 용이하게 동정할 수 있다.
E2-EPF5 단백질에 대한 적절한 항체는 상업적 출처로부터 수득할 수 있거나 통상의 방법에 따라 생산할 수 있다. 상기 항체는 제한하는 것은 아니지만, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 (mAbs), 인간화된 항체 또는 키메라 항체, 단일 쇄 항체, 단일 영역 항체, Fv 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 항-이디오타입 (항-Id) 항체, 및 상기중 임의의 것의 에피토프-결합 단편을 포함할 수 있다.
생성된 폴리펩티드가 E2-EPF5 단백질에 대하여 특이적인 하나 이상의 결합 부위를 포함하는 한, 광범위하게 다양한 항체/면역글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드를 사용할 수 있다. 상기 프레임워크 또는 스캐폴드는 5개의 주요 이디오타입의 인간 면역글로불린, 또는 그의 단편 (예로서, 본 원의 다른 부분에서도 기술된 것)을 포함하고, 바람직하게 인간화된 양상을 갖는 다른 동물 종의 면역글로불린을 포함한다. 카멜리드(camelid)로부터 동정된 것과 같은 단일 중쇄 항체가 이와 관련하여 특히 관심의 대상이 되고 있다. 본 분야의 당업자에 의해 계속적으로 신규한 프레임워크, 스캐폴드 및 단편이 발견되고 있고 개발되고 있다.
다르게는, 비면역글로불린 프레임워크 및 스캐폴드가 E2-EPF5 단백질에 대하여 특이적인 결합 부위를 포함하는 한, 사용될 수 있다. 공지된 비면역글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드는 아드넥틴(Adnectins) (섬유결합소) (매사추세츠주 월샘에 소재하는 컴파운드 테라퓨틱스 인코포레이티드(Compound Therapeutics, Inc.)), 앙키린 (스위스 취리히에 소재하는 몰레큘라 파트너스 아게(Molecular Partners AG)), 영역 항체 (매사추세츠주 케임브리지에 소재하는 도만티스 리미티드(Domantis, Ltd) 및 벨기에 취나르드에 소재하는 애블링크스 엔브이(Ablynx nv)), 리포칼린 (안티칼린) (독일 프라이징에 소재하는 피에리스 프로테오랩 아게(Pieris Proteolab AG)), 작은 모듈 면역-약물 (워싱턴주 시애틀에 소재하는 트루비온 파마슈티칼스, 인코포레이티드(Trubion Pharmaceuticals Inc.)), 맥시바디 (캘리포니아주 마운틴뷰에 소재하는 아비디아 인코포레이티드(Avidia, Inc.)), 단백질 A (스웨덴에 소재하는 어피바디 아게(Affibody AG)) 및 아필린 (감마-결정질 또는 유비퀴틴) (독일 할레에 소재하는 쉴 프로테인즈 게엠베하(Scil Proteins GmbH))를 포함한다.
본 발명에 따라, 사용되는 프레임워크 또는 스캐폴드와 상관없이 항-E2-EPF5 항체 또는 그의 단편, 또는 E2-EPF5-특이적인 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드는 추가의 부위에 공유 또는 비공유 결합할 수 있다. 추가의 부위는 폴리펩티드, 불활성 중합체, 예로서, PEG, 소분자, 방사성 동위 원소, 금속, 이온, 핵산 또는 다른 타입의 생물학적으로 관련된 분자일 수 있다. 면역컨쥬게이트, 면역독소 등으로 공지될 수 있는 상기의 작제물 또한 본 원에서 사용되는 바와 같은 E2-EPF5-특이적 결합 부위를 포함하는 항체, 항체 단편 또는 폴리펩티의 의미내 포함된다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 저해제는 E2-EPF5 발현 또는 E2-EPF5 폴리펩티드의 활성에 영향을 주는 소분자 (예로서, 분자량이 약 2kDa 미만, 더욱 바람직하게, 분자량이 약 1kDa 미만이고/거나 혈뇌장벽을 가로지르거나 적절한 세포내로의 유입을 달성할 수 있는 유기 또는 무기 분자)이다. 상기 소분자 화합물은 하기 기술하는 바와 같은 선별 방법에 의해 동정될 수 있다.
본 발명의 일면은 상기 기술된 바와 같은 질환을 앓는 개체의 치료에 사용하기 위한 치료제 개발을 위한 약물 표적으로서 E2-EPF5 유전자 및 유전자 산물을 제공한다. 따라서, 본 원에 기술된 바와 같은 질환을 치료하기 위하여 사용할 수 있는 화합물을 동정하기 위한 선별 방법을 본 발명의 일부분으로서 본 원에서 제공한다. 바람직한 실시태양에서 상기 방법은 E2-EPF5 폴리펩티드을 함유하는 반응 혼합물에 시험 화합물을 접촉시키는 것을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, E2-EPF5는 스위스프로트 엔트리 Q16763로 나타낸 서열을 포함할 수 있는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 그러나, 상기 폴리펩티드의 융합 작제물 (예를 들면, 하기의 실시예에 기술하는 바와 같은 융합 작제물)일 수 있는 바, 임의의 E2-EPF5 상동체, 오솔로그, 변이체 등을 본 발명에서 사용할 수 있다. 예를 들면, E2-EPF5 폴리펩티드는 스위스프로트 엔트리 Q16763와 실질적으로 상동성인 (예로서, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 일치) 아미노산 서열을 가질 수 있다.
특히 바람직한 실시태양에서, E2-EPF5는 VEGF-의존성 혈관신생이 중요한 역할을 하는 질환, 및 특히, 종양 혈관신생 또는 눈 혈관화 또는 저산소증-유발 혈관신생의 치료에서 유용한 치료제를 선별하기 위한 신규한 표적으로서 제공된다. 본 발명은 (a) E2-EPF5 폴리펩티드를 시험 화합물과 접촉시키고 (b) E2-EPF5 생물학적 활성의 변화를 검출하는 것을 포함하는, VEGF-의존성 혈관화의 저해에 유용한 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 변화는 일반적으로 시험 화합물이 결여되어 있는 대조군 반응과 관련하여 검출한다. 본 원에서 사용되는 바, 변화는 생물학적 활성이 바람직하게 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 50% 또는 적어도 100%까지 증가하거나 감소하는 것을 언급한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은
i) E2-EPF5 생물학적 활성에 대하여 허용되는 시료의 조건하에서 시험 화합물을 E2-EPF5 폴리펩티드와 접촉시키고;
ii) 적어도 하나의 E2-EPF5 생물학적 활성의 수준을 측정하고;
iii) 상기 수준을 상기 시험 화합물이 결여되어 있는 대조군 시료의 것과 비교하고;
임의로 iv) VEGF-의존성 혈관화와 관련된 질환의 예방학적 및/또는 치료학적 요법을 위한 화합물로서 추가의 시험에 대하여 상기 수준을 변화시키는 시험 화합물을 선택하는 것을 포함하는, VEGF-의존성 혈관화와 관련된 질환, 예로서, 종양 혈관화의 치료에 유용한 화합물을 동정하는 방법을 제공한다.
화합물 선별 분석법은 세포-기초 또는 무세포 시스템을 포함할 수 있다. 세포-기초 시스템은 천연(native), 즉, 정상적으로 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소 E2-EPF5를 발현시키는 세포, 예로서 생검일 수 있거나 세포 배양액에서 확장될 수 있다. 그러나, 하나의 실시태양에서, 세포-기초 분석법은 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소를 발현시키는 재조합 숙주 세포를 포함한다. 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소 E2-EPF5와 상호작용하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것은 또한 폴리펩티드에 결합하는 공지된 결합 분자 (예로서, 유비퀴틴)의 능력과 비교하여 폴리펩티드에 우선적으로 결합하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 폴리펩티드를 사용하여 유비퀴틴 컨쥬게이션 활성을 조절하는 화합물을 동정할 수 있다. 상기 화합물들은 예를 들면, 유비퀴틴화된 단백질 기질, 또는 유비퀴틴화된 단백질 기질 잔여물에 대한 친화도를 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 상기 화합물들은 또한 예를 들면, 이들 성분들에 대한 결합 속도를 증가시키거나 감속시킬 수 있다. 상기 화합물들은 또한 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소에 결합하기 위하여 이들 성분들과 경쟁할 수 있거나 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소에 결합한 이들 성분들을 대체할 수 있다. 상기 화합물들은 또한 다른 성분들, 예로서, ATP, 다른 서브유니트, 예로서, E1 활성화 효소 또는 E3 리가아제와의 상호작용에 영향을 줄 수 있다.
빠른 선별 방법, 예로서, 자동화된 고속 스크린(automated high-throughput screens) (HTS)에서 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소 E2-EPF5, 유도체 및 단편을 사용함으로써 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소에 결합할 수 있는 능력에 대하여 후보 화합물을 분석할 수 있다. 다수의 적절한 빠른 선별 분석법이 당업자에게 공지되어 있다.
기능성 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소 E2-EPF5에 대하여 이들 화합물을 추가로 선별하여 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소 E2-EPF5에 대한 화합물의 효능을 측정할 수 있다. 원하는 정도로 E2-EPF5를 활성화시키거나 (작용제) 불활성화시키는 (길항제) 화합물을 동정할 수 있다. 조절 방법은 시험관내에서 (예로서, 세포를 제제와 함께 배양함으로써), 또는 다르게는 생체내에서 (예로서, 제제를 대상자에게 투여함으로써) 실시될 수 있다. 본 발명의 E2-EPF5 폴리펩티드를 사용하여 E2-EPF5 단백질과 정상적으로 상호작용하는 표적 분자와 E2-EPF5 단백질 사이의 상호작용을 자극하거나 저해하는 능력에 대하여 화합물을 선별할 수 있다. 표적은 유비퀴틴, 유비퀴틴화된 기질, 또는 폴리유비퀴틴, 또는 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소 단백질과 정상적으로 상호작용하는 상기 경로의 또다른 성분 (예를 들면, E1 또는 E3 단백질)일 수 있다. 분석법은 E2-EPF5 단백질 또는 단편이 표적 분자와 상호작용할 수 있도록 하는 조건하에서 E2-EPF5 단백질을 후보 화합물과 배합하고, E2-EPF5 단백질과 표적 사이의 복합체 형성을 검출하거나 E2-EPF5와 표적 사이의 상호작용의 생화학적 결과를 검출하는 단계를 포함한다. 임의의 관련된 유비퀴틴 컨쥬게이션 작용 효과를 분석할 수 있다. 유비퀴틴화된 기질의 생산, 단백질 분해, 유리 폴리유비퀴틴의 감소, 기질 안정성을 포함한다.
표적 분자에 결합할 수 있는 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소의 능력을 측정하는 것은 또한 실시간 바이몰레큘라 인터렉션 애널리시스(Bimolecular Interaction Analysis) (BIA)와 같은 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 본 원에서 사용되는 바, "BIA"는 임의의 반응물(interactant) (예로서, 비아코어(BIAcore)®)을 표지하지 않고 실시간으로 생체특이적인 상호작용을 연구하기 위한 기술이다. 광학 현상 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에서의 변화를 생물학적 분자 사이의 실시간 반응에 대한 표시로서 사용할 수 있다. 생물학적 라이브러리; 공간적으로 어드레서블한(addressable) 평행의 고체상 또는 액상의 라이브러리; 디컨볼루션(deconvolution)을 필요로 하는 합성 라이브러리; '원-비드 원-컴파운드(one-bead one-compound)' 라이브러리 방법; 및 친화성 크로마토그래피 선택을 사용하는 합성 라이브러리 방법을 포함하는, 본 분야에 공지된 조합 라이브러리 방법으로 다수의 접근법중 임의의 것을 사용하여 본 발명의 시험 화합물을 수득할 수 있다. 생물학적 라이브러리 접근법은 폴리펩티드 라이브러리로 제한되는 반면, 다른 4개의 접근법은 화합물의 폴리펩티드, 비펩티드성 올리고머 또는 소분자 라이브러리로 적용될 수 있다 [Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145]. 분자 라이브러리의 합성 방법의 예는 본 분야, 예를 들면, ([DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909]; [Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422]; [Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678]; [Cho et al. (1993) Science 261:1303]; [Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059]; [Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061]; 및 [Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233])에서 찾아볼 수 있다. 화합물의 라이브러리는 용액중 (예로서, Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421]), 또는 비드 [Lam (1991) Nature 354:82-84], 칩 [Fodor (1993) Nature 364:555-556], 세균 [Ladner U.S. Pat. No. 5,223,409], 포자 [Ladner U.S. Pat. No. '409], 플라스미드 [Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869]상 또는 파지상 ([Scott and Smith (1990) Science 249:386-390]; [Devlin (1990) Science 249:404-406]; [Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6378-6382]; [Felici (1991) J. MoI. Biol. 222:301-310]; [Ladner, 상기 동일])에 제시될 수 있다. 후보 화합물은, 예를 들면, 1) 펩티드, 예로서, Ig-테일드 융합 펩티드 및 무작위 펩티드 라이브러리 (예로서, [Lam et al. (1991) Nature 354:82-84]; [Houghten et al. (1991) Nature 354:84-86] 참조) 및 D- 및/또는 L-배위 아미노산으로 제조된 조합형 화학-유도 분자 라이브러리의 일원들을 비롯한 가용성 펩티드; 2) 포스포펩티드 (예로서, 무작위 및 부분적으로의 축퇴성, 유도 포스포펩티드 라이브러리의 일원들 (예로서, [Songyang et al. (1993) Cell 72:767-778] 참조); 3) 항체 (예로서, 폴리클로날, 모노클로날, 인간화된, 항-이디오타입, 키메라, 및 단일 쇄 항체 뿐만 아니라 Fab, F(ab')2 , Fab 발현 라이브러리 단편, 및 항체의 에피토프-결합 단편); 및 4) 유기 및 무기 소분자 (예로서, 조합 및 천연 산물 라이브러리로부터 수득된 분자)를 포함한다.
유비퀴틴 컨쥬게이션 관련 효소 활성의 활성을 측정하는 적절한 분석법은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 이들 분석법은 제한하는 것은 아니지만, 폴리유비퀴틴 또는 유비퀴틴화된 기질 단백질 또는 단백질 잔여물 양의 증가를 비롯한 기질의 출현, 중간체 및 최종 산물의 출현, 예로서, 유리 유비퀴틴 단량체의 소실, 일반적인 단백질 전환, 특이적 단백질 전환, 유비퀴틴 결합, 유비퀴틴화된 기질 단백질과의 결합, 서브유니트 상호작용, ATP와의 상호작용, 상호작용 조절 인자와 같은 세포 성분과의 상호작용, 특이 단백질의 안정화 등을 포함한다.
일면에서, 본 발명에 따른 선별 방법에 의해 동정된 화합물을 제공한다. 상기 화합물은 바람직하게, 저분자 화합물 또는 항체, 특히, 모노클로날 항체, 또는 저해성 핵산이다. 화합물은 바람직하게, 항-혈관신생 활성을 갖고, 즉, 일반적으로 혈관 성장, 특히, 비정상적인 신생-혈관증식을 저해한다. 상기의 항-혈관신생 활성은 본 분야에 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 상기 방법으로서 예를 들면, 종양에서 혈관신생의 현미경 평가, 생체내 마트리겔(matrigel) 이동 및 혈관신생 분석법, 혈관신생의 알기네이트 마이크로비드 유리(release) 분석법, 디스크 혈관신생 분석법, 혈관신생의 스폰지 임플란트 모델, 종양 혈관신생에 대한 중공 섬유 분석법 또는 혈관신생에 대한 각막 분석법을 포함한다. 상기 분석법은 예를 들면, ["Angiogenesis Protocols", March 2001 , ISBN: 0-89603-698-7, Series: Methods in Molecular Medicine, Volume #: 46]에 기술되어 있다.
혈관신생 및 항혈관신생 전략법을 개발하기 위하여, 생체내 혈관신생에서 더욱 다량의 분석을 위해 동물 모델을 제공하고자 하는 협의된 노력이 기울어졌다. 생체내 기술은 눈에서 각막 주머니 및 홍채 임플란트, 래빗 귀 챔버, 등쪽 피지후계(skinfold) 챔버, 두개 창(cranial window), 햄스터 협낭 창, 스폰지 임플란트 분석법, 섬유소 응괴, 알긴산나트륨 비드 및 마트리겔 플러그, 래트 장간막 창, 닭 배아 융모막요막 및 마우스 및 래트에서 폐포로 구성된다 (1). 본 챕터에서 본 발명자는 무혈관 각막 분석법, 및 상이한 종에서 상기 분석법을 사용하는 것에 대한 장점 및 단점을 논의할 것이다. 각막 분석법은 주변에 위치하는 윤부 맥관구조로부터의 혈관 생성을 일으키기 위하여 각막 주머니내로 혈관신생 유도자 (종양 조직, 세포 현탁액, 성장 인자)를 배치하는 것에 기초한다. 다른 생체내 분석법과 비교할 때, 상기 분석법에서는 각막이 처음에 무혈관이기 때문에 오직 신생 혈관만을 측정한다는 장점을 갖는다.
본 발명의 추가의 일면은 상기 논의된 임의의 치료학적 효능을 위해 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 약제학적 조성물을 투여하는 것에 관한 것이다. 상기 약제학적 조성물은 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소 E2-EPF5를 코딩하는 유전자의 발현을 저해하는 제제 또는 E2-EPF5 유전자 산물의 활성을 저해하는 제제를 유효량으로 포함한다. 예를 들면, 본 발명에 따른 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소 E2-EPF5의 항체, 모사체, 작용제, 길항제, 또는 저해성 핵산을 포함할 수 있다. 조성물은 단독으로 투여될 수 있거나, 제한하는 것은 아니지만, 염수, 완충처리된 염수, 덱스트로스, 및 물을 포함하는 임의의 멸균의 생체적합성 약제학적 담체중에서 투여될 수 있는 안정화 화합물과 같은 적어도 하나의 다른 제제와 함께 배합되어 투여될 수 있다. 조성물은 환자에게 단독으로 투여될 수 있거나, 다른 제제, 약물 또는 호르몬과 함께 배합되어 투여될 수 있다.
본 발명에 포함된 약제학적 조성물은 제한하는 것은 아니지만, 경구, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 골수내, 수막강내, 뇌실내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하, 또는 직장 수단을 포함하는 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다. 활성 성분외에도, 약제학적 조성물은 활성 화합물이 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로 처리되는 것을 촉진시키는 부형제 및 보조제를 포함하는, 적절한 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있다. 제형화 및 투여에 관한 기술에 대한 추가의 상세한 설명은 레밍톤 파마슈티컬 사이언시스(Remington's Pharmaceutical Sciences) (펜실베이니아주 이스턴에 소재하는 마아크 퍼블리싱 코포레이션) 최신판에서 찾아볼 수 있다. 경구 투여용 약제학적 조성물은 본 분야에 잘 공지되어 있는 약제학적으로 허용가능한 담체를 사용하여 경구 투여에 적절한 제형으로 제형화될 수 있다. 상기 담체는 환자에 의한 섭취용으로 약제학적 조성물을 정제, 환제, 당의정, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리, 현택제 등으로서 제형화할 수 있다.
약제학적 조성물은 염으로서 제공될 수 있고, 제한하는 것은 아니지만, 인산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 포함하는, 다수의 산으로 형성될 수 있다. 염은 수용성 또는 다른 양성자성 용매중에서 상응하는 유리 염기 형태보다 더욱 가용성인 경향이 있다. 다른 경우에 바람직한 제제는 pH 4.5 내지 5.5의 범위로, 사용 전 완충액과 배합되는, 1-50mM 히스티딘, 0.1%-2% 수크로스, 및 2-7% 만닛톨중 어느 것 또는 모두를 함유할 수 있는 동결건조된 분제일 수 있다.
약제학적 조성물을 제조한 후, 적절한 용기에 놓을 수 있고 명시된 용태에 대하여 표지화될 수 있다. 투여를 위한 표지화는 투여량, 투여 빈도 및 투여 방법을 포함할 것이다.
본 발명에서 사용하기에 적절한 약제학적 조성물은 활성 성분을 의도하는 목적을 달성하기 위한 양으로 함유하는 조성물을 포함한다. 유효량의 결정은 충분하게 본 분야의 당업자의 능력내에 있다. 임의의 화합물의 경우, 치료학적 유효량은 초기에 예로서, 종양 세포의 세포 배양 분석법에서, 또는 동물 모델, 일반적으로, 마우스, 래빗, 개, 또는 돼지에서 추정될 수 있다. 또한, 동물 모델을 사용하여 적절한 투여 농도 범위 및 경로를 결정할 수 있다. 이후, 상기 정보를 사용하여 인간에서의 투여를 위한 유용한 용량 및 경로를 결정할 수 있다.
치료학적 유효량은 증상 또는 용태를 호전시키는, 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소 E2-EPF5의 활성 성분, 그의 단편, 항체, 작용제, 길항제 또는 저해제의 양을 언급한다. 치료학적 효능 및 독성, 예로서, ED50 (50%의 군집에서 치료학적으로 유효한 용량) 및 LD50 (50%의 군집에게 치명적인 용량)은 세포 배양액 또는 실험용 동물에서 표준 약제학적 방법에 의해 측정될 수 있다. 독성 효능 및 치료학적 효능 사이의 용량비가 치료학적 지수이고, 이는 비, LD50/ED50로 표시될 수 있다. 치료학적 지수가 높은 약제학적 조성물이 바람직하다. 세포 배양액 분석법 및 동물 연구로부터 수득한 데이타를 인간용의 다수의 제형으로 제형화하는데 사용한다. 상기 조성물중 함유된 용량은 바람직하게, 독성이 거의 없거나 전혀없이 ED50를 포함하는 혈중 농도 범위내 존재한다. 용량은 사용하는 제형, 환자의 민감성 및 투여 경로에 따라 상기 범위내에서 달라진다.
정확한 용량은 치료를 요하는 대상자와 관련된 인자에 비추어 당업자에 의해 결정될 것이다. 충분한 수준의 활성 부위를 제공하고 바람직한 효능을 유지하기 위하여 용량 및 투여는 조절된다. 고려될 수 있는 인자는 질환 상태의 중증도, 대상자의 일반적인 건강 상태, 대상자의 연령, 체중 및 성별, 섭식, 투여 시간 및 빈도, 약물 배합물(들), 반응 민감성, 및 요법에 대한 내성/반응을 포함한다. 장기간 작용하는 약제학적 조성물은 특정 제제의 반감기 및 제거율에 따라 매 3일 내지 4일마다, 매주, 또는 매 2주마다 한번씩 투여될 수 있다. 일반 투여량은 투여 경로에 따라 0.1 내지 100,000 마이크로그램부터 총 1g의 용량으로 다양할 수 있다. 특정 투여량 및 투여 방법에 대한 가이던스는 문헌에서 제공되고 일반적으로 본 분야의 당업자에 이용가능하다. 본 분야의 당업자는 단백질 또는 그의 저해제보다는 뉴클레오티드에 대한 상이한 제제를 사용할 것이다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 투여는 특정 세포, 용태, 위치 등에 대하여 특이적일 것이다. 단백질의 경구 투여에 적절한 약제학적 제형은 예로서, 미국 특허 제 5,008,114호; 제 5,505,962호; 제 5,641,515호; 제 5,681,811호; 제 5,700,486호; 제 5,766,633호; 제 5,792,451호; 제 5,853,748호; 제 5,972,387호; 제 5,976,569호; 및 제 6,051,561호에 기술되어 있다.
본 발명을 일반적으로 기술하면서, 본 원에서 일례의 목적으로서만 제공되고, 달리 언급하지 않는 한, 그로써 제한하고자 하는 것이 아닌 특정의 구체적인 일례에 대한 언급을 통해 추가로 이해될 수 있다.
1. 안티센스 ( ASO ) 및 siRNA 올리고뉴클레오티드
siRNA는 다수의 상업적 공급원, 예로서, 퀴아젠(Qiagen), 다마콘(Dharmacon), 프로리고(Proligo)로부터 이용가능하다.
올리고리보뉴클레오티드는 제조사 (제라곤(Xeragon))에 의해 기술된 바와 같 이 TOM-포스포라미다이트 화학 물질을 사용하여 합성할 수 있고 RP-HPLC에 의해 정제할 수 있었다. 순도는 모세관 겔 전기영동법에 의해 평가하였다. 260nM에서 흡광계수에 따라 UV에 의해 측량을 수행하였다. 다른 경우 [Elbashir et al., 2001]에서와 같이 더블-스트랜드 RNA (dsRNA)의 어닐링을 실시하였다.
개질된 안티센스 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 HPLC에 의해 정제된 포스포라미다이트 화학 물질을 사용하여 합성하고, 분석하고, 전자분무 질량 분광법 및 모세관 겔 전기영동법에 의해 특징화하였다. 260nM에서 흡광계수에 따라 UV에 의해 측량을 수행하였다.
모든 올리고뉴클레오티드는 인간 E2-EPF5 서열 (진뱅크 등록번호 M91670, GI 번호, GI: 181915, 스위스프로트 엔트리 Q16763)에 대하여 디자인하고 Refseq 및 유니진(UNIGENE) 데이타베이스에 대하여 블라스트(BLAST)에 의해 체크함으로써 특이성 수준을 최대화시켰다. 가장 효능이 있는 올리고뉴클레오티드를 동정하기 위하여 E2-EPF5을 표적하는 일련의 ASOs 및 siRNAs를 앞서 기술된 바와 같이 [Husken, D. et al, 2003], 이중-색 리포터 분석법에서 선별하였다. E2-EPF5의 코딩 서열을 포함하는 벡터를 CFP- 및 YFP 리포터 서열을 포함하는 목적지 벡터(destination vector)와 함께 재조합하였다. 생성된 이중 리포터 플라스미드 pNAS-X는 E2-EPF5 표적 서열이 발현된 YFP-리포터 유전자의 3'-UTR 부위로 삽입되어져 있는 융합 mRNA을 생성하였다. E2-EPF5 ASO 및 siRNA 활성은 YFP 리포터 단백질의 저해도에 의해 측정하였다. eCFP 단백질의 발현은 플라스미드 형질감염율(transfection efficiency)을 표준화하기 위한 수단으로서 작용하였다. 선별된 E2-EPF5 올리고뉴클레오티드의 목록은 각각 표 1 (E2-EPF5를 표적하는 ASOs; N = DNA , n = 2'-O- 메톡시에틸을 갖는 DNA , s = 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연결( internucleotidic linkage ), c = 2'-메 톡시에 틸 5- 메틸 시티딘) 및 표 2 (E2-EPF5를 표적하는 siRNAs)에 나타낸다 (안티센스 서열만을 나타낸다. N (G, C, A, U) = 리보뉴클레오시드, n(g, a, t) = 데옥시리보뉴클레오시드). 가장 활성인 올리고뉴클레오티드 (8162, 17828, 11723) 및 상응하는 대조군을 후속 연구에서 사용하였다.
표 1
Figure 112007027396648-PCT00001
표 2
Figure 112007027396648-PCT00002
2. 세포 배양
모든 세포 배양 시약은 기브코-BRL-인비트로겐 아게 (스위스 바젤에 소재)로부터 입수하였다. 사용하는 기초 배양 배지는 HeLa 세포용의 둘베코스 모디파이드 이글 배지 및 NCI-H1299 세포용의 RPMI1640이었다. 배지를 10% 우태아 혈청 (FBS) 및 1% L-글루타민과 임의로 50 마이크로그램/ml 겐타마이신 항생제로 보충하였다. 일반적인 유지를 위해 세포를 매주 2회에 걸쳐 1:4로 분리하였다. 형질감염시키기 전날, 세포를 트립신화하고, FBS를 함유하되 항생제는 함유하지 않는 배지에서 재현탁시키고, 웰당 0.5ml에 1.5-2 x 104 세포의 밀도로 24-웰 배양 플레이트 또는 웰 당 2ml에 5-1O x 104 세포의 밀도로 6-웰 배양 플레이트로 플레이팅하였다. 플레이트를 다습한 상태에서 5% CO2하에 37℃에서 24시간동안 인큐베이션시켰다.
3. siRNAs 의 형질감염 및 데스페리옥사민 ( DFO ) 및 염화코발트 처리
제조사 (인비트로겐)에 의해 제공받은 프로토콜에 따라 올리고펙트아민을 사용하여 siRNAs의 형질감염을 실시하였다. 간단하게, siRNAs를 옵티멤(Optimem)중 ㎕당 1.2μM siRNA으로 희석하였다. 개별적으로, 올리고펙트아민을 옵티멤 1㎕당 0.25㎕ 올리고펙트아민으로 희석하였다. 동량의 상기 siRNA 및 올리고펙트아민 용액을 혼합하고 실온에서 20-25분동안 인큐베이션시켜 복합체가 계속 형성되도록 하였다. 이어서, siRNA/올리고펙트아민 복합체를 10% FBS를 함유하되 항생제는 함유하지 않는 표준 배지중에서 바람직한 최종 농도, 전형적으로 20-80nM siRNA으로 희석하였다. 이후, 오래된 배지를 세포로부터 제거하고, 24-웰 플레이트의 경우 웰당 0.5ml, 및 6-웰 플레이트의 경우 웰당 2ml의 siRNA/올리고펙트아민 현탁액으로 대체하였다. 습윤화된 CO2 인큐베이터에서 48-72시간동안 인큐베이션시킨 후, 10% FBS를 함유하고 유도제를 함유하지 않거나 150μM 데페르리옥스아민 (약칭: DFO) 또는 CoCl2 (둘 모두 시그마(Sigma)로부터 입수; 새로 제조된 수성 원액으로부터)을 함유하는 새 배지를 사용하여 siRNAs를 함유하는 배지를 대체하였다. 37℃에서 6시간 후, 분비된 VEGF를 측정하기 위하여 세포 배지를 수거하고, 이에 반해, 웨스턴 블롯 또는 전체 RNA 분석을 위해 전체 세포 추출물의 세포 단층을 제조하였다.
4. ASOs 의 형질감염 및 DFO 및 염화코발트 처리:
ASOs를 TE (10mM 트리스 pH 8.0, 1mM EDTA)중 1mM의 농도로 저장하였다. 실험에 앞서, 10μM의 실험 용액을 옵티멤 (라이프 사이언시즈, 인코포레이티드(Life Sciences Inc.))중 제조하였다. ASOs를 옵티멤중 2 x 최종 농도로 희석하고 2 x 최종 농도로 희석된 리포펙틴 또는 에펙텐과 혼합하고 30분동안 실온에 방치하였다. 표준 배지를 30-50% 융합성 T24 세포 배양액으로부터 제거하고 세포 단층은 일단 무혈청 옵티멤1(OptiMEM1) (기브코 BRL)을 포함하였다. 이어서, ASO/리포펙틴 믹스를 세포 단층에 가한 후, CO2 인큐베이터에서 37℃하에 4시간동안 인큐베이션시킨 후, 배지를 제거하고, 10% FBS를 함유하는 표준 배지로 대체하였다. 습윤화된 CO2 인큐베이터에서 24-72시간동안 인큐베이션시킨 후, 배지를 10% FBS를 함유하되 유도제를 함유하지 않거나 150μM 데페르리옥스아민 (약칭: DFO) 또는 CoCl2 (둘 모두 시그마(Sigma)로부터 입수; 새로 제조된 수성 원액으로부터)을 함유하는 새 배지로 대체하였다. 37℃에서 6시간 후, 분비된 VEGF를 측정하기 위하여 세포 배지를 수거하고, 이에 반해, 웨스턴 블롯 분석을 위해 세포 단층 전체 RNA 또는 전체 세포 단백질 추출물을 제조하였다.
5. 실시간 역전사효소 PCR
제조사의 지시에 따라 RNeasy 96 키트 (퀴아젠 #74183)를 사용하여 전체 RNA를 제조하였다. 실시간 PCR용 프라이머쌍 및 FAM-표지된 TaqMan 프로브는 프라이머 익스프레스 v1.0 프로그램(Primer Express v1.0 program)(ABI PRISM, PE 바이오시스템스)을 사용하여 디자인하고 마이크로신쓰(Switzerland) (스위스), 퀴아젠 또 는 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) ("어세이-온-디맨드(assay-on-demand)")로부터 구입하였다. 하기 프라이머 서열을 사용하였다:
E2-EPF5 (등록번호 GI 181915):
역 프라이머: 5'-AAAGACCTTGATGCCATCGG-3' (서열번호: 27)
전향 프라이머: 5'-TCCGCCTGGTGTACAAGGA-3' (서열번호: 28)
TaqMan 프로브: 5'-FAM-TGACGACACTGACCGCAGACCCA-TAMRA-3' (서열번호: 29)
HIF-1a (등록번호): NM_8105
ABI 어세이-온-디맨드: HsOO153153_m1
VEGF (등록번호): NM_003376
역 프라이머: 5'-CACATTTGTTGTGCTGTAGGAAGC-3' (서열번호: 30)
전향 프라이머: 5'-TGAGATCGAGTACATCTTCAAGCC-3' (서열번호: 31)
TaqMan 프로브: 5'-FAM-CCATGCAGATTATGCGGATCAACCTCA-TAMRA-3' (서열번호: 32)
또는 ABI 어세이-온-디맨드: HsOO173626_m1
GLUT-1 (등록번호): NM_006516
ABI 어세이-온-디맨드: Hs00197884_m1
헥소키나제 2 (등록번호): NM_000189.
역 프라이머: 5'-TGTCTTGAGCCGCTCTGAGAT-3' (서열번호: 33)
전향 프라이머: 5'-TGTCCGTAACATTCTCATCGATTT-3' (서열번호: 34)
TaqMan 프로브: 5'-FAM-CCAAGCGTGGACTGCTCTTCCGAG-TAMRA-3' (서열번호: 35)
베타 액틴 (등록번호) : X00351
역 프라이머: 5'-TAATGTCACGCACGATTTCCC-3' (서열번호: 36)
전향 프라이머: 5'-TCACCGAGCGCGGCT-3' (서열번호: 37)
TaqMan 프로브: 5'-FAM-CAGCTTCACCACCACGGCCGA-TAMRA-3' (서열번호: 38)
BcI-XL (등록번호) : Z23115
역 프라이머: 5'-GGTCGCATTGTGGCCTTT-3' (서열번호: 39)
전향 프라이머: 5'-TCCTTGTCTACGCTTTCCACG-3' (서열번호: 40)
TaqMan 프로브: 5'-FAM-ACAGTGCCCCGCCGAAGGAGA-TAMRA-3' (서열번호: 41)
CYPA (사이클로필린-A, 등록번호) : NM_021130
역 프라이머: 5'-TCGAGTTGTCCACAGTCAGCA-3' (서열번호: 42)
전향 프라이머: 5'-GCGCTTTGGGTCCAGGA-3' (서열번호: 43)
TaqMan 프로브: 5'-FAM-TGGCAAGACCAGCAAGAAGATCACCA-TAMRA-3' (서열번호: 44)
실시간 PCR 반응을 위해, 6㎕ 물중 25ng의 전체 RNA를 제조사의 지시에 따라 총 용량 13㎕으로 0.33㎕의 5' 및 3' 프라이머 (각각 10μM), 0.33㎕의 TaqMan 프로브 (5μM), 6.33㎕의 RT PCR 마스터 믹스 키트(Master Mix Kit) (유로젠테크(Eurogentec), # RT-QRT-032X)와 함께 혼합하였다. 역전사 및 실시간 PCR을 ABI PRISM 서열 검출기 5700 또는 7700 (어플라이드 바이오시스템)에서 하기와 같이 실시하였다: 48℃에서 30분동안 역전사, 95℃에서 10분동안 변성, 이어서, 95℃에서 15초동안 변성 및 60℃에서 1분동안 어닐링 및 신장의 50회 싸이클. 유전자 발현 의 상대적인 측량은 ABI PRISM 5700 사용자 게시판 #2에 기술된 바와 같은 델타-Ct 방법을 사용하여 산출하였다.
6. 웨스턴 블롯팅
제조사 (일리노이주 록포드에 소재하는 피어스(Pierce))에 의해 제공된 프로토콜에 따라 M-PER 포유동물의 단백질 추출 시약에서 세포 용매물을 제조하였다. 10㎍의 전체 단백질 추출물을 8%의 프리메이드 아크릴아미드 겔 (캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 노백스(NOVEX))상에 로딩하고, 전기영동 분리 후, PVDF 막상으로 이동시켰다. TBST-5% 분유중 막을 포화시킨 후, TBST-5% 분유중 희석된 관련된 1차 항체로 단백질을 면역염색시켰다. 이어서, 막을 TBST로 3회에 걸쳐 세정하고, 또한 TBST-5% 분유중 용해된 적절한 2차 항체와 함께 30분동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 막을 TBST로 3회에 걸쳐 세정하고, ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시약 (아머샴 바이오사이언스(Amersham Biosciences))을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 면역염색화를 가시화하였다.
1차 항체에 사용한 희석도(dilution)는 마우스 항-HIF-1a (BD 바이오사이언스/파미겐 610958)(BD Biosciences/Pharmingen 610958))의 경우에는 1 : 250, 마우스 항-β-액틴 (시그마 A5441)의 경우에는 1 : 100,000, 래빗 항-ARNT (아릴 하이드로카본 뉴클리어 트랜스로케이터, 노부스(Novus) NB 730-H)의 경우에는 1 : 2000, 래빗 항-GLUT1 (글루코오스 수송체 ABCAM ab652)의 경우에는 1 : 500, 래빗 항-HIF2a-EPAS1 (노부스 ab199 카달로그 번호 730-H)의 경우에는 1 : 1,000이었다.
2차 항체로서 희석도 1 : 1 : 5,000-20,00O의 염소 항-마우스 IgG (Fab 특 이)-퍼옥시다제 항체 (시그마 A2304), 또는 희석도 1 : 20,O00의 래빗 IgG (HRP 컨쥬게이트된) 노부스 카달로그 번호 NB 730-H에 대한 염소 폴리클로날 항체를 사용하였다.
7. VEGF 분비의 측량
제조사의 지시에 따라 인간 VEGF (R& D 시스템)에 대한 효소면역측정법 (ELISA) 키트를 사용하여 분비된 VEGF를 측정하였다.
8. E2 - EPF5 siRNAs 의 특징화
E2-EPF5 특이적 유전자 저해제를 특징화하기 위하여 NCI-H1299 및 HeLa 세포를 E2-EPF5 siRNAs에 노출시키고 TaqMan RT-PCR에 의해 E2-EPF5 mRNA 저해를 연구하였다. 2개의 세포주 모두에서 각각 48시간, 72시간동안 siRNA을 인큐베이션시킨 후, E2-EPF5 mRNA는 70 내지 90%까지 감소하였다. 불일치 및 무관련 대조군 siRNAs는 E2-EPF5 유전자 발현에 영향을 주지 않았다. 동일한 방식으로 N-말단에 HIS-FLAG 에피토프로 표지된(tag) 재조합 E2-EPF5를 발현시키는 NCI-H1299 세포를 E2-EPF5 siRNAs 및 대조군에 노출시켰다. 가장 강력한 감소를 나타내는 17828과 대조군을 비교하였을 때, 일치하는 모든 siRNAs가 특이적으로 E2-EPF5 단백질 수준을 감소시켰다.
9. E2 - EPF5 의 저해가 저산소증에서 VEGF 발현을 억제시킨다
올리고뉴클레오티드의 형질감염에 적용가능(amenable)하다고 보고된 바 있는 NCI-H1299, HeLa 및 DU-145 세포주를 저산소증-자극 화합물: 데스페리옥사민 (DFO), 염화코발트 (CoCl2) 및 N-옥살릴글리신에 노출시켰다. 결과를 통해 6 및 24시간 자극 후, NCI-H1299 및 HeIa 세포에서는 DFO가 일관되게 VEGF mRNA를 4-7배 및 VEGF 단백질을 2-3배 유도한 것이 입증되었다. CoCl2에 의한 유도 범위는 유사하지만, 다소덜 일관되며, 장기간의 자극후에는 감소하였다. N-옥살릴글리신은 특히 6시간 후에는 VEGF 발현을 현저하게 유도하였다. VEGF mRNA 및 단백질 (100만개의 세포당 1시간에 2ng의 분비되는 VEGF 단백질)의 기본 발현 수준은 시험된 다른 2개의 세포주 (NCI-H1299: 318 ± 40pg VEGF/h, 106 세포; HeLa: 301 ± 60pg VEGF/h, 106 세포)에서보다 DU-145에서 약 10배 높은 것 (2160 ± 120pg VEGF/h, 106 세포)으로 밝혀졌다. RNA에서 2-3배 및 단백질 수준에서 1.3-1.5배의 현저한 VEGF 유도는 24시간 자극 후가 아닌, 단지 6시간의 자극 후에서만 모든 유도제를 사용하여 입증될 수 있었다. 특히, 적용된 조건하에서 E2-EPF5 mRNA는 조사된 세포주 어느 것에서도 현저히 조절된다고는 밝혀지지 않았다.
HRE-수용체 유전자 분석법 결과를 확인하기 위하여, 내인성 HRE-유도 표적 유전자, 특히, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 발현에 대한 E2-EPF5의 siRNA-매개성 저해 효과를 조사하였다. NCI-H1299 세포를 3일간 E2-EPF5 siRNAs에 노출시킨 후, 6시간동안 각각 DFO 및 CoCl2에 노출시켰다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 모든 E2-EPF5 siRNAs는 상응하는 불일치 및 무관련 대조군 올리고뉴클레오티드로 형질감염된 세포와 비교할 때, VEGF 분비의 현저한 감소를 유도하였다. E2-EPF5 siRNA의 억제에 대한 관찰된 활성과 함께 17828는 분비된 VEGF를 가장 현저하게 억제시켰다. 저산소증 유도제로서 DFO 대신 CoCl2를 사용할 경우에도 동일한 결과를 수득하였다.
60nM STDEV
11723 38 7
11769 50 10
17828 27 2
25296 97 2
17906 71 4
25297 112 2
8548 100 7
8548-DFO 없음 71 2
표 4: VEGF 분비에 대한 siRNA-매개성 E2-EPF5의 저해 효과. NCI-H1299 세포를 E2-EPF5, 상응하는 불일치 대조군 및 무관련 대조군 siRNA 8548에 대한 60nM siRNAs로 형질감염시켰다. 72시간 후, 처리하지 않은 8548 대조군과의 비교로 세포를 6시간동안 150μM DFO와 함께 인큐베이션시켰다. 적용용 배지(conditioned media)중 VEGF 단백질의 농도는 ELISA에 의해 측정하고 각 웰당 단백질 총량마다 pg/ml로서 표시하였다.
가장 효능이 있는 E2-EPF5 siRNA 17828를 사용하는 추가의 분석법을 통해 NCI-HI 299 및 HeLa 세포주 둘 모두에서 E2-EPF5의 저해가 VEGF mRNA의 저산소증-유발 발현 및 저산소증-유발 VEGF 단백질의 분비를 저하시키는 것으로 밝혀졌다. 전사 인자 HIF-1a를 표적하는 대조군 siRNA에 의한 경우에서와 같이 저산소 VEGF mRNA 및 단백질의 복귀(reversion)는 정상산소로 배양된 세포에서 관찰되는 수준에 대하여 거의 완벽에 가까웠다.
추가로, 표 5에 나타낸 바와 같이, E2-EPF5 하향조절은 또다른 내인성 Hif-1 표적 유전자, 다시말해, GLUT-1 (글루코오스 수송체 1)를 저해하는 반면, Hif-1 mRNA에는 현저한 변화는 없었다. 이는 E2-EPF5 억제가 Hif-1 그 자체의 전사에는 영향을 주지 않으면서 HRE-유도 유전자의 Hif-1 매개성 전사 활성을 저해한다는 것을 시사한다.
siRNA % GLUT-1 mRNA STDEV
17828 189 7.8
25296 560 2.0
25560 240 0.4
25584 486 7.2
8548 457 17.3
8548-DFO 100 5.1
표 5: E2-EPF5의 siRNA-매개성 저해는 HIF-1a를 표적하는 siRNA과 유사한 범위까지 GLUT-1 mRNA의 저산소증-유발 발현을 억제시켰다. HeLa 세포를 E2-EPF5 (17828), HIF-1a (25560), 상응하는 불일치 대조군 (E2-EPF5: 25296, Hif-1α: 25584) 및 무관련 대조군 siRNA 8548에 대한 40nM의 siRNAs로 형지감염시켰다. 72시간 후, 세포를 처리하지 않은 8548 대조군과의 비교로 150μM의 DFO와 함께 6시간동안 인큐베이션시켰다. GLUT-1 mRNA를 TaqMan RT-PCR에 의해 분석하였다.
10. E2 - EPF5 의 발현 및 세포 증식
E2-EPF5는 유비퀴틴-컨쥬게이션 효소 (E2)를 코딩한다. E2는 유비퀴틴을 세포 단백질에 부착시킴으로써 프로테아좀 분해에 대한 그를 표적하거나, 인산화와 유사하게 그들의 작용을 저해한다. 유비퀴틴은 풍부한 세포 주기 단백질을 조절함으로써 세포 성장 및 증식을 조절하는데 중요한 역할을 하고 [Bashier et al, 2003] 유비퀴틴화 기구의 다수의 요소는 다양한 암에서 잘못 조절되거나(disregulated), 돌연변이화되거나 증폭되고/거나 불명확한(poor) 예후와 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. E2-EPF5에 대하여 특이적인 프라이머를 사용하는 TaqMan 실시간 PCR에 의한 다양한 인간 조직에서의 E2-EPF5의 발현을 조사하였다. E2-EPF5는 흉선 및 고환에서 미세하게 상향조절되고, 이는 세포 증식과 E2-EPF5 발현 사이의 강력한 관계를 시사한다 (표 6).
조직 Arb. Units STDEVP
1 뇌 0.33 0.08
2 심장 0.38 0.35
3 신장 0.04 0.04
4 간 0.03 0.03
5 폐 0.10 0.01
6 기관 0.13 0.03
7 골수 0.94 0.20
8 결장 0.33 0.14
9 창자 0.33 0.12
10 지라 0.44 0.19
11 위 0.11 0.00
12 흉선 1.59 0.53
13 심장 0.71 0.03
14 유선 0.15 0.00
15 전립샘 0.84 0.47
16 골격근 0.03 0.01
17 고환 3.78 0.01
18 자궁 0.27 0.02
19 뇌 0.78 0.19
20 소뇌 0.92 0.12
21 태아 뇌 0.71 0.11
22 태아 간 0.87 0.24
23 척수 0.50 0.05
24 태반 0.17 0.06
25 부신 0.32 0.07
26 간 0.04 0.02
27 췌장 0.01 0.00
28 전립샘 0.39 0.01
29 침샘 0.03 0.01
30 갑상샘 0.03 0.02
표 6: 다양한 조직 (클론테크(Clontech))에서 E2-EPF5 mRNA의 발현. E2-EPF5에 대하여 특이적인 프라이머를 사용하는 TaqMan 실시간 PCR에 의해 조직 분포를 측정하였다.
11. 벡터 pDONR201 에서의 인간 E2 - EPF5 cDNA 의 클로닝
E2-EPF5 cDNA는 2개의 일련의 PCR 반응에 의해 클로닝한 후, 게이트웨이(gateway)™ 공여체 벡터에 삽입하였다. 열순환 반응기(thermocycler) 블록에서 50㎕ 광유로 오버레이시킨, 50㎕의 Ex faq™ 완충액중 10pmoles의 각각의 E2-EPF5-특이적 PCR 프라이머 (전향: ATC GAA GGT CGT ATG AAC TCC AAC GTG GAG AAC CTA CCC CCG (서열번호: 45), 역: TCA CTT GTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC CAG CCG CCG CAG CGC CCG CAG CGC CCG (서열번호: 46)), 10pmoles의 각각의 dNTPs, 2mM MgSO2, 5U의 TaKaRa Ex Taq™ DNA 폴리머라제를 사용하여 인간 태아 간 조직 (클론테크)으로부터의 1ng의 Quick-Clone™ cDNA의 존재하에서 1차 DNA 증폭을 실시하였다. PCR 싸이클링 조건은 하기와 같았다: 10분동안 94℃, [1분동안 94℃, 1분동안 62℃, 1분동안 72℃] 30회 싸이클, 10분동안 72℃, 이어서, 10℃에서 중단. PCR 산물을 PAGE에 의해 분석하였다. 진 클린 II 키트(Gene Clean II kit)에 의해 아가로스로부터 DNA를 용출시켰다. 동일한 프로토콜에 의해 약한 DNA 밴드를 다시 증폭시켰다. 증폭된 PCR 산물의 전형적인 수율은 50㎕ H2O중 약 8㎍ DNA이었다. PCR 산물은 5' -FXa 부위-특이성 E2 서열-FLAG 표지- 3'로 구성되었다. 열순환 반응기 블록에서 100㎕ 광유로 오버레이시킨, 100㎕ 완충액 (10mM Tris-HCl pH 8.8, 25mM KCl, 5mM (NH4)SO4)중 1차 PCR 반응으로부터의 100ng의 주형, 100pmoles의 각각의 PCR 프라이머 ATTB1FXA2 (GGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC TTA GCT GGT ATC GAA GGT CGT ATG (서열번호: 47)) 및 ATTB2FLAG (GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTA TCA CTT GTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC (서열번호: 48)), 20nmoles의 각각 의 dNTPs, 2mM MgSO4, 10% DMSO, 2.5U의 Pwo DNA 폴리머라제의 존재하에서 2차 DNA 증폭을 실시하였다. PCR 싸이클링 조건은 하기와 같았다: 2분동안 94℃, [1분동안 94℃, 1분동안 65℃, 1분동안 72℃] 2회 싸이클, [1분동안 94℃, 1분동안 60℃, 1분동안 72℃] 2회 싸이클, [1분동안 94℃, 1분동안 55℃, 1분동안 72℃] 30회 싸이클, 2분동안 72℃, 이어서, 10℃에서 중단. att-PCR 산물을 PAGE에 의해 분석하였다. PCR 정제 키트 (퀴아젠)으로 클로닝하여 DNA를 정제하였다. 전형적으로, 증폭된 att-PCR 산물의 수율은 50㎕ H2O중 7-8㎍ DNA이었다. att-PCR 산물은 5' -ATTB1-FXa 부위-특이성 E2 서열-FLAG 표지-ATTB2- 3'으로 구성되었다. att-PCR 산물을 게이트웨이™ 공여체 벡터 pDONR201에서 클로닝하였다. BP 클로나제(Clonase)™ 효소 믹스는 attB1/B2 (PCR 산물) 및 attP1/P2 (벡터) 부위를 통한 부위-특이성 및 배향-특이성의 시험관내 재조합 반응을 촉진시켰다. 반응 믹스 (20㎕)는 BP 완충액 (제공된 바와 같음), 200ng att-PCR DNA, 300ng pDONR201 벡터 및 4㎕ BP 클로나제™ 효소 믹스를 함유하였다. 25℃에서 1시간 후, 프로테이나제 K (2㎍/㎕)를 가하고 샘플을 37℃에서 10분동안 인큐베이션시켰다. 1㎕을 사용하여 적격한(competent) DH5a 이. 콜라이(E. coli) 세포를 형질전환시켰다. 카나마이신 (50mg/L)을 포함하는 LB 플레이스상에서 형질전환체를 선택하였다. 제한효소를 사용하고 DNA 서열화에 의해 클론을 특징화하였다. 적절한 클론을 pBM2537/NPL002981로 표시하였다.
12. 게이트웨이™ 발현 벡터 pDEST12 .2로의 E2 - EPF5 cDNA 클로닝
클로나제™ LR 효소 믹스는 attL1/L2 (pBM2537 유입 클론) 및 attR1/R2 (pDEST12.2 벡터) 부위를 통해 게이트웨이(GATEWAY) LR 재조합 반응을 매개하였다. 반응 믹스 (20㎕)는 LR 완충액 (제조사에 의해 제공된 바와 같음), 200ng 유입 클론 (pBM2537) DNA, 300ng 발현 벡터 (pDEST12.2, 기브코-BRL-인비트로겐 코포레이션) 및 4㎕ LR 클로나제™ 효소 믹스를 함유하였다. 25℃에서 1시간 후, 프로테이나제 K (2㎍/㎕)를 가하고 샘플을 37℃에서 10분동안 인큐베이션시켰다. 1㎕을 사용하여 적격한 DH5a 이. 콜라이 세포를 형질전환시켰다. 앰피실린 (50mg/L)을 포함하는 LB 플레이스상에서 형질전환체를 선택하였다. 제한효소를 사용하고 DNA 서열화에 의해 클론을 특징화하였다. 적절한 클론을 pDEST-EPF5/NPL006653으로 표시하였다.
13. pDEST -형 발현 플라스미드를 사용한 NCI -H1299의 형질감염
배지, 우태아 혈청 (FCS), 베르센느(Versene), 리포펙틴, 게네티신을 라이프 사이언시즈, 인코포레이티드로부터 구입하였다. 사용된 세포 배양액 페트리 디쉬 (d = 8 cm)는 팔콘(Falcon) 타입 3003이고, 6-웰, 24-웰 및 96 웰 다중디쉬는 눈크(Nunc) (라이프 사이언시즈, 인코포레이티드)로부터 입수하였다. NCI-H1299 세포 (CRL-5803)를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(ATCC)으로부터 입수하였다. 37℃하에 5% CO2를 포함하는 습윤 대기중 10% FCS 및 60㎍/ml 겐타마이신을 포함하는 RPM11640에서 세포를 유지시켰다. 배양액을 증식시키기 위해, 매주 세포를 분리하고; 즉, 베르센느로 2회에 걸쳐 세정 하고 트립신-EDTA 용액으로 5분동안 처리하고, 15 x 원 배지 용량으로 희석하고 10ml/8cm 조직 배양 디쉬 또는 20ml/75㎠ T-플라스크에 재플레이팅시켰다. 3-4일 후, 0.5 용량의 배지를 가하여 영양분을 공급하였다. 리포펙트아민 플러스 시약(Lipofectamine Plus reagent) (라이프 사이언시즈-인비트로겐 코포레이션)을 사용하여 NCI-H1299 세포를 형지감염시켰다. 간단하게, 세포를 6-웰당 1x105으로 6-웰 다중디쉬에 시딩하고 1일동안 배양하였다. 96-웰 플레이트중 2개의 웰에서 2㎍의 플라스미드 DNA (pDEST-12.2 또는 pDEST-EPF5)를 100㎕의 옵티멤 및 15㎕의 플러스 시약과 혼합하고, 15분동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 동시에 10㎕의 리포펙트아민을 100㎕의 옵티멤 배지와 혼합하고 15분동안 실온에서 또 인큐베이션시켰다. 이어서, DNA 혼합물을 리포펙트아민 용액에 가하고, 잘 혼합하고, 다시 15분동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 그동안, FCS-함유 배지를 세포로부터 흡인시키고, 세포를 1ml/웰 옵티멤으로 세정한 후, 1ml의 옵티멤을 각 웰에 가하였다. 이어서, 100㎕의 플라스미드/플러스 시약/리포펙트아민 복합체를 배지에 가하고 세포 (현재 1150㎕의 배지중)를 습윤화된 인큐베이터중 5% CO2하에 4시간동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 이때, DNA-리포좀 믹스를 세포로부터 제거하고 2ml의 신선한 RPM11640 배지 (10% FCS 및 60㎍/ml 겐타마이신 포함)를 가하였다. 다음날, 세포를 상기 기술된 바와 같이 트립신화하고, FCS를 포함하는 3ml RPMI1640 배지에 재현탁시키고, 300, 150, 60 또는 30㎕의 세포 현탁액을 10% FCS 및 60㎍/ml 겐타마이신과 함께 10ml의 RPM11640을 포함하는 8-cm 페트리 디쉬에 플레이팅시켰다. 다 음날, 1.0mg/ml 게네티신을 가하였다. 매주 2회씩 선택 배지 (RPM11640 + 10% FCS + 1mg/ml 게네티신)를 신선한 배지로 교체하였다. 콜로니는 2-3주 후 나타났다. pDEST-EPF5에 의해 형질전환되어진 잘-분리된 성장 콜로니를 갖는 플레이트로부터 100㎕ 팁을 포함하는 피펫터를 사용하여 24개를 벗겨냄과 동시에, 벗겨낸 세포를 팁안으로 흡입시켰다. 이어서, 팁으로부터 세포를 24-웰 플레이트로 이동시키고 0.5ml 선택 배지를 가하였다. 5-10일 후, 클로닝된 세포는 융합 단층을 형성하였다. 융합 24-웰로부터의 세포를 트립신화하고, 2개의 24-웰 및 1개의 6-웰 "웰"로 분할하였다. 몇일 후, 전체 RNA를 24-웰의 각 클론중 1개로부터 분리하고 실시예 5에 기술된 바와 같은 RT-PCR에 의해 E2-EPF5 mRNA의 수준을 측정하였다. 상기 RT-PCR을 통해 pDEST-EPF5의 통합된 카피 (또는 카피들)로부터의 재조합 E2-EPF5 mRNA 및 천연 내인성 E2-EPF5 mRNA의 조합 수준을 측정하였다. pDEST-EPF5에 의해 성공적으로 형질전환된 NCI-H1299 세포에서 조합된 E2-EPF5 mRNA는 천연 H1299 세포 또는 pDEST12.2로 형질전환된 세포에서보다 2.5 x 이상으로 높았다. 3개의 독립적인 NCI-H1299/pDEST-EPF5 클론을 추가로 증폭시켰다 (nrs 1 , 5, 및 15). NCI-H1299/pDEST-EPF5 세포에 의한 재조합 E2-EPF5의 발현은 항-FLAG 에피토프 항체 (시그마)를 사용하여 실시예 6에 기술된 바와 같이 웨스턴 블롯상에서 확인하였다. 대조군으로서 pDEST12.2에 의해 형질전환된 NCI-H1299 세포의 약 200개의 콜로니를 포함하는 수개의 8cm 페트리디쉬를 트립신화하고 증폭시켜 NCI-HI 299/pDEST-EPF5 세포와의 실험에서 음성 대조군으로서 사용하였다.
13. PDEST - EPF5 NCI - H1299 세포주에서 증가된 VEGF 분비
실시예 12에 기술된 E2-EPF5-FLAG 세포주의 강제 과다발현에 대한 효과를 측정하기 위하여 웰당 20'000 세포로 24-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 20시간 후, 추가로 150μM DFO를 함유하는 RPMH 640 배지 + 10% FCS 또는 RPM11640 배지 + 10% FCS로 배지를 대체시켰다. 6시간 후, 분비된 VEGF 단백질 수준 측정을 위해 (실시예 7) 배지를 수거하고 냉동시키는 반면, 상기 세포로부터의 전체 RNA를 분리하고 한 세트의 mRNA 종의 수준은 RT-PCR에 의해 측정하였다 (실시예 5). E2-EPF5를 상승된 수준으로 발현시키는 pDEST-EPF5-형질전환된 NCI-H1299 세포에 의해 분비된 VEGF 단백질의 양은 E2-EPF5를 정상 수준으로 발현시키는 pDEST12.2-세포에 의해 분비된 양보다 현저히 높았다 (2 ± 0.3-배 이상) (표 7). 대조적으로, DFO에 의한 유도는 본질적으로 변함이 없었다 (표 7). 그러나, 기본 VEGF 수준의 상승과 함께 동등한 DFO-유도는 DFO-유도 후의 VEGF 절대 수준이 상승된 E2-EPF5를 발현시키지 않는 NCI-H1299 세포에서보다 2배 높다는 것을 암시한다.
Figure 112007027396648-PCT00003
표 7: 모(parental) NCI-H1299 세포에서의 수준과 비교되는 pDEST12.2 및 pDEST-EPF5-형질전환된 NCI-H1299 세포의 적용용 배지중 6시간 후의 VEGF 단백질 수준.
14. pDEST - EPF5 NCI -H1299 세포주에서의 메신저 RNA 수준
플라스미드-형질전환된 NCI-H1299 세포 (실시예 13)로부터 분리된 전체 RNA를 사용하여, 수개의 mRNAs 종 수준을 RT-PCR에 의해 측정하였다 (실시예 5). E2-EPF5 mRNA 수준 (재조합 + 천연 E2-EPF5 mRNA)은 모 NCI-H1299 세포에서보다 pDEST-EPF5로 형질전환된 세포에서 2.3-3배 높았다 (표 8). 이는 3개의 공지된 HIF-조절되는 유전자의 mRNA: VEGF mRNA (38 ± 10% 증가), 헥소키나제-2 mRNA (HK2, 4.9 ± 2.5-배 증가) 및 GLUT-1 mRNA (3.8 ± 0.2-배 증가)의 현저히 상승된 mRNA 수준을 수반하였다. 대조적으로, HIF에 의해 조절되지 않는 다수의 유전자의 mRNA의 기본 수준은 현저히 변하지는 않았다 (β-액틴, Bcl-xL, CYPA 및 HIFIa). DFO에 의한 HIF-조절되는 유전자의 유도 속도는 E2-EPF5 과다발현 세포에서 변함이 없지만, 그럼에도 불구하고, 더욱 높은 기본 mRNA 수준 및 정상적인 DFO-유도의 조합된 효과는 HIF-반응성 mRNA의 수준을 여분의 E2-EPF5를 발현시키지 않는 DFO-자극받은 NCI-H1299 세포에서 관찰되는 것보다 더 높게 상승시켰다.
Figure 112007027396648-PCT00004
표 8: pDEST12.2 및 pDEST-EPF5-형질전환된 NCI-H1299 세포주에서의 mRNA 발현 수준 (n. d. = 미측정)
15. 이. 콜라이에서 재조합 E2 - EPF5 - FLAG 단백질의 생산
게이트웨이™ 시스템 매뉴얼에 따라, 플라스미드 pBM2537/NPL002981 (실시예 11)로부터의 삽입체를 벡터 pDEST17 (인비트로겐 코포레이션)과 재조합하여 플라스미드 E2-12-flag-pDEST17/ NPL006782를 수득하였다. 재조합 E2-EPF5 단백질의 코딩되는 아미노산 서열은:
Figure 112007027396648-PCT00005
이다.
상기 플라스미드를 사용하여 이. 콜라이에서 재조합 E2-EPF5를 발현시켰다. N-말단 6-HIS 말단을 통해 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있고, 이로써 95% 이상의 순수한 표지된 E2-EPF5 시료를 수득하였다. 상기는 시험관내 자가유비퀴틴화 분석법에서 활성이고 C-말단 FLAG-표지 펩티드 서열 (DYKDDDDK)에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있었다.
16. 재조합 E2 - EPF5 - FLAG 단백질에 대한 래빗 항체의 생산
프로인트 완전 애주번트와 함께 0.2mg 이. 콜라이-유래의 재조합 E2-EPF5 (실시예 15)를 피하 주사한 후, 1주 간격으로 프로인트 불완전 애주번트와 함께 0.1mg 단백질로 추가접종하여 래빗을 면역화시켰다. 5, 6, 7, 8 및 9주 후에 20-30ml의 혈액을 수거한 후, 10주 후에 100-120ml의 혈액을 최종적으로 채혈하고, 그로부터 혈청을 제조하였다. 고정 재조합 E2-EPF5상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 최종의 채혈 혈청으로부터 폴리클로날 항-E2-EPF5 항체를 정제하였다. 간단하게, [Harlow, E. and Lane, D. Using Antibodies: A Laboratory Manual, (1999) Cold Spring Harbor NY Cold Spring Harbor Press, pp. 522-523]에 기술된 바와 같이 붕산염 완충액중 디메틸 피멜리미데이트를 사용하여 재조합 이. 콜라이-유래의 (FLAG-표지) E2EPF5 (실시예 15)를 항-FLAG 세파로스에 공유결합시켰다. E2-EPF5-특이적인 항체를 분리하기 위하여, 1.5ml의 조 래빗 항-E2-EPF5 혈청을 PBS로 평형화된 150 마이크로리터의 패킹된 비드에 적용시켰다. 비결합 항체를 과량의 PBS로 제거하였다. 항-E2-EPF5 항체는 글리신-HCl 0.2M (pH 2.5)를 사용하여 용출시킨 후, 즉시, 1/10 용량의 트리스-HCl 1M (pH 9)을 추가하여 중화시키고 4℃에 저장하 였다.
17. 마우스 종양 조직에서의 E2 - EPF5 검출
염색에 사용된 종양은 C57BL/6 마우스에서 배양된 B16BL6 흑색종으로부터 유래된 것이었다. 중량이 17 내지 20g인 흑색의 C57BL/6 암컷 마우스를 이파 크레도(Iffa Credo) (프랑스 라브레슬에 소재) 동물 사육 시설로부터 입수하였다. 꼬리 표지를 통해 식별하고 정상적인 조건하에서 군으로 사육하고 (우리당 6-7마리의 동물) 매일 관찰하였다. 처리군당 6마리의 마우스를 사용하였다. 멜라닌 생산 뮤린 흑색종 종양 세포주 B16/BL6은 C57BL/6 마우스의 자발성 종양으로부터 유래하고, 광범위하게 특징화되었고, 미국 휴스톤 텍사스 메디컬 센터의 이사야 제이. 피들러 박사(Isaiah J. Fidler)로부터 입수하였다. 모든 실험에 사용하는 배양된 종양 세포에는 미코플라스마가 없었다. 5% 우태아 혈청, 1% 피루브산나트륨, 1% 비필수 아미노산 및 2% 비타민으로 보충된, 안정한 글루타민을 포함하는 MEM (MEM EBS, AMIMED, 알시윌(Allschwil))중에서 37℃ 및 5% CO2하에 배양하고 융합시까지 배양시켰다. 이어서, 0.25% 트립신-0.02% EDTA (37℃에서 2분)로 박리시킨 후, 처리하였다. 트립판 블루 배제에 의해 생육성을 평가하고, >90% 생육성을 갖는 현탁액만을 사용하였다. 종양 세포를 행크 완충액에 재현탁시키고, 면역적격성의 합성 C57BL/6 암컷 마우스의 귀로의 진피내(i.d.) 주사를 위해 5 x 104 세포/㎕의 현탁액을 제조하였다. 종양 세포 주사를 위해, 3% 이소플루란 (스위스 참에 소재하는 포레너(Forene), 애보트 아게(Abbott AG)) 흡입에 의해 마취를 유도하였다. 39℃의 온도로 유지된 가온 수술장에 동물을 넣고, 그들의 귀를 서서히 양면 스티커가 장착된 스틸 콘(steel cone)으로 확장시켰다. 이어서, 현미경의 도움으로 3OG의 피하주사 바늘을 귀 주변부에 삽입하고 피하 평면(subcutaneous plane)에 4-5mm로 통로를 뚫어 바늘 유입점에 대한 원위부(site distal)로 종양 세포가 전달될 수 있도록 하였다. 주사 부위는 항상 제 1 및 제 2 신경혈관 다발사이의 귓등에 위치하였다. 마이크로리터 주사기 (250㎕, 스위스 보나두즈에 소재하는 해밀턴(Hamilton)를 사용하여, 1㎕의 종양 세포 현탁액 (5 x 104 세포)를 마우스 귀의 피하 평면내로 주사하여 2 x 2mm의 피하 물집을 형성시켰다. 1주 후, 원발성 종양이 발생하기 시작하였고, 귀 중앙에서 흑반 윤선(black dot)을 용이하게 관찰할 수 있었다. 원발성 종양 크기를 7일째, 14일째 및 21일째 모니터하였다. 3주 (21일째) 후, CO2 흡입에 의해 동물을 살해하고, 목 림프절의 중량을 측량하고, 4.2% 포름알데히드에서 고정시키고, 파라핀에 함몰시켰다.
5μM의 파라핀 박편 (박절기 (마이크롬(MICROM))로 제조)을 수퍼프로스트+(SuperFrost+) (멘젤(Menzel)) 유리 슬라이드에 놓고, 37℃에서 밤새도록 건조시키고, 전열기상의 59℃에서 5분동안 가열하였다. 박편을 크실렌중에서 2회에 걸쳐 탈랍시키고, 에탄올 용액을 감소시키면서 (100%, 95%, 90%, 70%) 다시 수화시키고, dd 수에서 세정한 후, 고온의 항원 언마스킹(unmasking) 기술에 사용하였다. 박편을 0.1m의 Na-시트레이트 (pH 6.0)중에서 전자 레인지로 가열하였다 (98℃까지 14분간 가열, 98℃로 10분간 유지; 마일스톤(Milestone) #T/TMEGA). 박편을 실온까 지 냉각시키고, 이중 증류수 (ddH20)중에서 세정하고, PBS에 침지시켰다. 내인성 과산화효소의 활성을 차단하기 위하여 박편을 PBS중의 0.3% H2O2중에서 30분동안 인큐베이션시키고 PBS중에서 세정하였다. 비특이적 항체 결합을 차단하기 위하여, 습윤실에서 박편을 실온에서 20분동안 1.5% 염소 혈청 (벡터 라보레토리즈(Vector Laboratories))를 함유하는 PBS와 함께 인큐베이션시켰다. 차단 혈청을 블롯팅하고, 0.1% 트윈-20을 함유하는 PBS로 희석된 1차 항체 (0.5 - 1.0㎍/ml 폴리클로날 래빗 항-EPF5)와 함께 박편을 1시간동안 인큐베이션시켰다. 박편을 PBS중에서 2분간 3회에 걸쳐 세정한 후, 1.5% 차단 혈청을 함유하는 PBS로 희석된 2차 결합 항체 (비오티닐화된 염소 항-래빗 IgG, 벡터 라보레토리즈)와 함께 인큐베이션시켰다. 박편을 PBS중에서 2분간 3회에 걸쳐 세정하고, 실온에서 30분동안 아비딘 홍당무 H 복합체 (벡타스테인 엘리트 ABC 키트 PK-6101(VECTASTAIN Elite ABC kit PK-6101))와 함께 인큐베이션시켰다. 박편을 PBS중에서 2분간 3회에 걸쳐 세척하고, 5 내지 10분동안 벡터 노바레드(Vector NovaRed) (과산화효소에 대한 기질 키트, 벡터 라보레토리즈 #SK-480)로 염색하고 ddH2O중에서 2분간 3회에 걸쳐 세정하였다. 이어서, 박편을 메이어 헤마톡실린(Mayer's Hematoxylin)(플루카(Fluka) #51275)에서 30초동안 대조염색시키고, 흐르는 수돗물에서 5분동안 세정하고, ddH2O중에서 세정하고, 대기건조시켰다. 박편을 유키트(Eukitt) (플루카 #03989)에 탑재하고 명시야 현미경에 의해 분석하였다.
B16BL6 림프절 전이 검사를 통해 현저히 짙게 염색된, 종양의 괴사 중심에 바로 인접하고 있는 종양 세포가 나타났다. 공급 혈관으로부터 가장 먼곳에 살아있는 종양 세포가 존재하고, 이는 가정컨대 저산소 부위이다. 따라서, 상기 부위에서의 E2-EPF5 단백질 수준 증가는 종양 세포의 저산소증 반응에서 E2-EPF5의 역할과 일치하다. 저산소증 반응은 종양 세포의 생존에 매우 중요한 바, E2-EPF5를 저해하는 것이 종양 성장을 간섭하는 것으로서, 이는 치료학적으로 이용될 수 있는 효과라고 기대되고 있다.
18. 마우스 안과 질환 모델에서 신생혈관증식 부위에서의 E2 - EPF5 의 검출
허혈성 망막병증을 C57/BL6J 마우스에서 유발시켰다 [Smith et al.1994, Oxygen-induced retinopathy in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci 35:101-111.]. 간단하게, 7일된 마우스 및 그의 모(mother)를 밀폐된 인큐베이터에 넣고 5일동안 75 + 3% 산소 대기하에 노출시켰다 (산소과잉). 인큐베이터 온도는 23 ± 2℃로 유지시키고, 산소는 매 8시간마다 산소 분석기를 사용하여 측정하였다. 5일 후, 마우스를 인큐베이터로부터 제거하고, 실내 대기에 놓고, 5일 후 P17에서, 마우스를 희생시키고, 신속하게 눈을 제거하고 화합물을 함몰시키는 최적의 절단 온도 (OCT; 인디애나주 엘크하트에 소재하는 마일 다이아그노스틱스(Miles Diagnostics))에서 냉동시키거나, 4% 인산-완충처리된 포름알데히드에 고정시키고 파라핀에 함몰시켰다. 산소과잉에 노출되지 않았던 성별 및 연령이 동일한 C67BL6J 마우스를 대조군으로서 사용하였다. 운반체를 사용하는 섭식에 의해 처리하고, 5일 후, 희생시키고, 냉동 또는 파라핀 박편을 위해 그의 눈을 처리하였다. 5μM의 냉동 박편을 대기 건조시키고, 무수 아세톤(dry acetone)중 4℃에서 10분동 안 고정시키고 PBS중에서 세정하였다. 박편을 PBS중의 0.3% H2O2중에서 30분동안 인큐베이션시켜 내인성 조직 과산화효소의 활성을 차단하였다. 박편을 세정하고 1.5% 염소 혈청을 함유하는 PBS와 함께 인큐베이션시켰다. 이후의 모든 면역염색 단계는 17에 기술된 바와 같이 실시하였다. 파라핀 박편중 EPF5의 면역염색은 17에 기술된 바와 같이 실시하였다. 조직 슬라이드 검사를 통해 대조군 눈의 상응하는 부위가 아닌, 혈관 세포 그 자체를 비롯한 ROP 눈중 병적 신생혈관증식의 부위에서는 현저하게 더욱 높은 수준의 E2-EPF5 염색이 나타났다. 저산소증에 대하여 반응하는 조직내 E2-EPF5 단백질 수준 증진에 대한 관찰 결과는 세포 저산소증 반응에서 E2-EPF5의 작용상의 역할과 일치하였다. 반대로, 마우스를 고도한 산소 수준으로부터 정상의 산소 수준으로 이동시켰을 때 경험하게 되는 상대적 저산소증에 기인하여 망막의 비정상적인 혈관화가 발생하였다. 미숙아 망막병증 모델이 망막 혈관신생 모델로서 광범위하게 사용된다. E2-EPF5를 저해하는 것이 저산소증 반응에 간섭하고, 이는 수개의 질환 상태에서 이로운 것으로 사료되는 효과일 수 있다.
Figure 112007027396648-PCT00006
Figure 112007027396648-PCT00007
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG <120> screening methods <130> DC/4-33973A <160> 49 <170> patentIn version 3.3 <210> 1 <211> 890 <212> DNA <213> Human <400> 1 ggcggaccga agaacgcagg aagggggccg gggggacccg cccccggccg gccgcagcca 60 tgaactccaa cgtggagaac ctacccccgc acatcatccg cctggtgtac aaggaggtga 120 cgacactgac cgcagaccca cccgatggca tcaaggtctt tcccaacgag gaggacctca 180 ccgacctcca ggtcaccatc gagggccctg aggggacccc atatgctgga ggtctgttcc 240 gcatgaaact cctgctgggg aaggacttcc ctgcctcccc acccaagggc tacttcctga 300 ccaagatctt ccacccgaac gtgggcgcca atggcgagat ctgcgtcaac gtgctcaaga 360 gggactggac ggctgagctg ggcatccgac acgtactgct gaccatcaag tgcctgctga 420 tccaccctaa ccccgagtct gcactcaacg aggaggcggg ccgcctgctc ttggagaact 480 acgaggagta tgcggctcgg gcccgtctgc tcacagagat ccacgggggc gccggcgggc 540 ccagcggcag ggccgaagcc ggtcgggccc tggccagtgg cactgaagct tcctccaccg 600 accctggggc cccagggggc ccgggagggg ctgagggtcc catggccaag aagcatgctg 660 gcgagcgcga taagaagctg gcggccaaga aaaagacgga caagaagcgg gcgctgcggg 720 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Ser Gly Arg Ala Glu Ala Gly Arg Ala Leu Ala Ser Gly Thr Glu 165 170 175 Ala Ser Ser Thr Asp Pro Gly Ala Pro Gly Gly Pro Gly Gly Ala Glu 180 185 190 Gly Pro Met Ala Lys Lys His Ala Gly Glu Arg Asp Lys Lys Leu Ala 195 200 205 Ala Lys Lys Lys Thr Asp Lys Lys Arg Ala Leu Arg Ala Leu Arg Arg 210 215 220 Leu 225 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> #8162 Match <400> 3 tgtcgtscsa scscstscsc sttgta 26 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> #9679 <400> 4 cggscscscs astscscstt tta 23 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 5 ccattgsgsc sgscscscsa scgttc 26 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligo <400> 6 ccagttsgsc stscscscsa scggtc 26 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 7 tcgcgcstsc sgscscsasg scatgc 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 8 tctctcsgsc sgscscsasg scaggc 26 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 9 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Gly Ala Gly Gly Pro Ser Gly Arg Ala Glu 180 185 190 Ala Gly Arg Ala Leu Ala Ser Gly Thr Glu Ala Ser Ser Thr Asp Pro 195 200 205 Gly Ala Pro Gly Gly Pro Gly Gly Ala Glu Gly Pro Met Ala Lys Lys 210 215 220 His Ala Gly Glu Arg Asp Lys Lys Leu Ala Ala Lys Lys Lys Thr Asp 225 230 235 240 Lys Lys Arg Ala Leu Arg Ala Leu Arg Arg Leu Asp Tyr Lys Asp Asp 245 250 255 Asp Asp Lys

Claims (19)

  1. 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소 E2-EPF5를 코딩하는 유전자의 발현을 저해하거나, E2-EPF5 유전자 산물의 활성을 저해하는 제제를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 비정상적인 신생-혈관증식과 관련된 질환을 치료하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 비정상적인 신생-혈관증식이 VEGF-의존성 혈관화인 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, VEGF-의존성 혈관화가 종양에서의 혈관신생, 류마티스 관절염에서의 윤활막 혈관신생, 당뇨 망막병증에서 관찰되는 바와 같은 눈 신생-혈관증식, 건선에서의 피부 혈관신생, 또는 간경화에서의 저산소증-유발 혈관신생인 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소 E2-EPF5를 특이적으로 저해할 수 있는 저해성 핵산인 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 저해성 핵산이 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA인 방법.
  6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 유비퀴틴 컨쥬게 이션 효소 E2-EPF5에 특이적으로 결합하는 항체인 방법.
  7. 약제학적으로 허용가능한 담체, 및 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소 E2-EPF5를 코딩하는 유전자의 발현을 저해하거나 E2-EPF5 유전자 산물의 활성을 저해하는 제제를 유효량으로 포함하는 약제학적 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, E2-EPF5 저해제가 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA인 약제학적 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, E2-EPF5 저해제가 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소 E2-EPF5에 특이적으로 결합하는 항체인 약제학적 조성물.
  10. (a) 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소 E2-EPF5를 시험 화합물과 접촉시키고
    (b) 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소 E2-EPF5 생물학적 활성의 변화를 검출하는 것을 포함하는, 비정상적인 신생-혈관증식의 저해에 유용한 화합물을 동정하는 방법.
  11. i) E2-EPF5 생물학적 활성에 대하여 허용되는 시료의 조건하에서 시험 화합물을 유비퀴틴 컨쥬게이션 효소 E2-EPF5와 접촉시키고;
    ii) 적어도 하나의 E2-EPF5 생물학적 활성의 수준을 측정하고;
    iii) 상기 수준을 상기 시험 화합물이 결여되어 있는 대조군 시료의 것과 비 교하고;
    임의로 iv) 혈청 글루코오스를 잘못 조절하는(disregulate) 질환 또는 대사성 질병의 예방학적 및/또는 치료학적 요법을 위한 잠재적 치료제로서 추가의 시험에 대하여 상기 수준을 변화시키는 시험 화합물을 선택하는 것을 포함하는, 비정상적인 신생-혈관증식과 관련된 질환의 치료에 유용한 화합물을 동정하는 방법.
  12. 제 10항 또는 제 11항에 있어서, E2-EPF5 생물학적 활성이 저하되는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 비정상적인 혈관화가 종양에서의 혈관신생, 류마티스 관절염에서의 윤활막 혈관신생, 당뇨 망막병증에서 관찰되는 바와 같은 눈 신생-혈관증식, 건선에서의 피부 혈관신생, 또는 간경화에서의 저산소증-유발 혈관신생인 방법.
  14. 제 10항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 동정되는 화합물.
  15. 유비퀴틴 컨쥬게이션 관련 효소 E2-EPF5의 발현을 저해하는 것을 포함하는, HIF-1에 의해 조절되는 발현을 저해하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, HIF-1에 의해 조절되는 유전자가 GLUT-1, GLUT-3, HK2, EPO, NOS2, VEGF, TGF-알파, TGF-베타, VEGFR-2, C-Met, UPAR, CXCR4, 탄산 탈수효 소 IX (CAIX)로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  17. 제 15항에 있어서, HIF-1에 의해 조절되는 유전자가 VEGF인 방법.
  18. 유비퀴틴 컨쥬게이션 관련 효소 E2-EPF5의 발현을 저해하는 것을 포함하는, 종양 혈관신생을 저해하는 방법.
  19. 제 15항에 있어서, 상기 저해가 저해성 핵산 또는 항체를 통해 달성되는 방법.
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