JP2008516953A - Ｅ２−ｅｐｆ５、新規治療用タンパク質および標的 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ユビキチン結合酵素Ｅ２−ＥＰＦ５の新規使用に関する。特に、Ｅ２−ＥＰＦ５活性の阻害は、ＶＥＧＦ、ならびに低酸素に応答して転写因子ＨＩＦ−１が調節する他のタンパク質の産生の減少を示す。これらの発見に基づいて、本発明は、ＶＥＧＦ誘発血管形成に関連する疾患の治療法およびそのための医薬組成物を提供する。加えて、Ｅ２−ＥＰＦ５は、治療薬の開発のための標的として提供される。従って、本発明は、Ｅ２−ＥＰＦ５活性を阻害し、故に腫瘍関連血管形成のようなＶＥＧＦ誘発血管形成の処置に使用できる、候補化合物の同定のためのスクリーニング法を提供する。最後に、本発明はまたＶＥＧＦおよび他のＨＩＦ−１調節タンパク質の阻害法も提供する。

Description

本発明は、ＶＥＧＦ依存性血管形成、および特に腫瘍関連血管形成の阻害のための、治療法および医薬組成物に関する。
血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)は、新血管の伸長およびその浸透処理の促進を含む、ヒト腫瘍において観察される多くの血管応答を担う、タンパク質をコードする。ＶＥＧＦは、ほとんどの固形腫瘍上の血管形成の確立に必須であり、ＶＥＧＦの恒常的上方制御は、腫瘍血管形成の主要な一因であると見なされる。
ＶＥＧＦおよび数種の他の血管形成増殖因子の発現は低酸素により厳密に調節され、転写因子ＨＩＦ−１(低酸素誘導性因子−１)によるＶＥＧＦ遺伝子の転写誘導が関与する。低酸素は組織酸素圧ホメオスタシスの正常レベルの減少であり、急性および血管疾患、肺疾患および癌の間に起こる。例えば、腫瘍細胞はＨＩＦ−１の誘発により低酸素に適応する。ＨＩＦ−１は、組織酸素化の変化に対する適応応答を介在し、細胞増殖、細胞生存、浸潤および転移、アポトーシス、血管形成、グルコースおよび鉄代謝を含む種々の遺伝子の転写を活性化させる。Ｈｉｆ−１は非常に多くのヒト癌で過剰発現され、悪い予後および増加した患者死亡数と関連する。最近の試験は、ＨＩＦ−１が低酸素、癌遺伝子活性化および変異により、化学療法および放射線に対する耐性を介在することを示している。ＨＩＦ−１活性の阻害は故に抗血管形成治療の重要な要素を代表し得る。
Ｅ２−ＥＰＦ５は、ユビキチンを細胞タンパク質に結合させるユビキチン結合酵素(Ｅ２)ファミリーのメンバーである。ユビキチンおよびユビキチン様修飾因子は、ユビキチン活性化酵素(Ｅ１)、ユビキチン結合酵素(Ｅ２またはＵＢＣ)およびユビキチンリガーゼ(Ｅ３)を含む機構的に保存された酵素カスケードにより加工され、基質タンパク質に結合する。このような修飾は異なる機能を有し、それらの中で最も特徴付けられているのは２６Ｓプロテアソーム経路を介するユビキチン依存性タンパク質分解である。Ｅ２およびＥ３の両方とも、ユビキチンを、基質特異性を決定している標的タンパク質に移動させるために協力する。ヒトゲノム配列はＥ２、Ｅ３および脱ユビキチン化プロテアーゼを含むユビキチンファミリーメンバーの同定を完了する可能性を開いているが、ユビキチン化の基質はほとんど同定されておらず、ユビキチンシステムおよびヒト疾患におけるその関与の理解はまだその初期段階である。しかしながら、ユビキチンおよびユビキチン様分子による細胞タンパク質の修飾が、複数の生物学的過程、とりわけ細胞サイクル進行、細胞分化およびＤＮＡ修復における必須の調節機構であるとの証拠が増え続けている。
本発明は、ここで、低酸素における、および、特に、低酸素に応答して転写因子ＨＩＦ−１により制御されるタンパク質の構築におけるユビキチン結合酵素Ｅ２−ＥＰＦ５の新規役割を提供する。
発明の要約
第一の局面において、本発明は、ユビキチン結合酵素をコードする遺伝子Ｅ２−ＥＰＦ５の発現を阻害するまたはＥ２−ＥＰＦ５遺伝子産物の活性を阻害する有効量の薬剤を投与することを含む、異常な新血管形成に関連する疾患の処置法を提供する。好ましい態様において、新血管形成は、腫瘍における血管形成、リウマチ性関節炎における滑膜血管形成、糖尿病性網膜症で観察される眼新血管形成、乾癬における皮膚血管形成、または肝硬変における低酸素誘発血管形成である。特に好ましい態様において、新血管形成はＶＥＧＦ依存性腫瘍血管形成である。
本発明の一つの局面において、薬剤はユビキチン結合酵素Ｅ２−ＥＰＦ５を特異的に阻害できる阻害性核酸、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物、より好ましくはｓｉＲＮＡ化合物である。本発明の他の局面において、薬剤はユビキチン結合酵素Ｅ２−ＥＰＦ５に特異的に結合する抗体である。
他の局面において、本発明は、ユビキチン結合酵素をコードする遺伝子Ｅ２−ＥＰＦ５の発現を阻害するまたはＥ２−ＥＰＦ５遺伝子産物の活性を阻害する有効量の薬剤を含む、医薬組成物に関する。好ましくは、Ｅ２−ＥＰＦ５阻害剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡまたはＥ２−ＥＰＦ５に特異的に結合する抗体である。
さらなる局面において、本発明は、(ａ)Ｅ２−ＥＰＦ５ポリペプチドと試験化合物を接触させ、(ｂ)Ｅ２−ＥＰＦ５生物活性の調節を測定する工程を含む、ＶＥＧＦ依存性血管形成の処置に有用な化合物の同定法に関する。好ましくは、Ｅ２−ＥＰＦ５生物活性が減少する。
さらに他の局面において、本発明は、ユビキチン結合関連酵素(ubiquitin conjugating relating enzyme)Ｅ２−ＥＰＦ５の発現阻害を含む、低酸素に応答してＨＩＦ−１により調節される１種以上のポリペプチドの量を減少させるまたは活性を阻害する方法に関する。好ましくは、ＨＩＦ−１調節遺伝子またはタンパク質は、ＧＬＵＴ−１、ＧＬＵＴ−３、ＨＫ２、ＥＰＯ、ＮＯＳ２、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、ＶＥＧＦＲ−２、Ｃ−Ｍｅｔ、ＵＰＡＲ、ＣＸＣＲ４、炭酸脱水酵素IX(ＣＡＩＸ)から成る群から選択される。
発明の詳細な記載
本発明は、ユビキチン結合酵素Ｅ２−ＥＰＦ５の阻害が、低酸素に応答したＨＩＦ−１依存性タンパク質発現を妨害するという驚くべき発見に基づく。特に、Ｅ２−ＥＰＦ５の阻害は、低酸素に応答したＶＥＧＦの構築を妨害することが判明した。血管形成促進性ＶＥＧＦは、最初の血管を構成する内皮細胞の増殖および移動のために必要である。ＶＥＧＦは、血管形成の促進の他に、炎症の重大な特性である血管透過性の増大も含む広範囲の活性を有する３４−４５kDa 糖タンパク質である。ＶＥＧＦは増殖因子として内皮細胞に対してだけでなく、ＨＩＶ関連カポジ肉腫細胞ならびに他の腫瘍および白血病細胞を含む数種の他の細胞に対しても作用する。新生物細胞はしばしば上昇したレベルのＶＥＧＦを発現し、それは血管形成の刺激だけでなく、増殖刺激オートクリンシグナル伝達経路の活性化にも関連すると考えられる。これとは対照的に、ＶＥＧＦ受容体で開始されるシグナル伝達経路を介する直接作用の他に、ＶＥＧＦはまた間接的作用も誘発することを考慮することは重要である。例えば、受容体Ｎｏｔｃｈ１はＶＥＧＦにより上方制御され、この細胞表面受容体へのリガンドの増強された応答もまた可能にする。ＶＥＧＦ発現は腫瘍血管形成、低酸素関連血管形成、盲目の数形態(例えば糖尿病性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症)、リウマチ性関節炎、乾癬および創傷治癒およびその他のようないくつかの病的状態と関連している。多くの試験は、上昇したレベルのＶＥＧＦだけで新血管形成の誘発に十分であることを証明している。例えば、ＶＥＧＦの１回の注射が、虚血のウサギモデルにおける側副血管発達を増加させることが証明されている(Takashita et al., 1995 J; Clin. Invest. 93, 662)。ＶＥＧＦはまた、角膜に注射したとき、新血管形成を誘発できる。
本発明は、ここで、１種以上のＨＩＦ−１調節ポリペプチド、および特に低酸素に応答して構築されるＶＥＧＦの量または活性を減少させる方法を、提供する。低酸素下に、ＨＩＦ−１により調節される種々の機能を有するタンパク質をコードする多数の遺伝子が既知であり、下記遺伝子を含むが、これらに限定されない：ＧＬＵＴ−１、ＧＬＵＴ−３、ＨＫ２、ＣＡＩＸ(例えば代謝適応に関連する)；ＥＰＯ、ＮＯＳ２(例えばアポトーシス抵抗性に関与する)；ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、ＶＥＧＦＲ−２(例えば血管形成に関与する)、Ｃ−Ｍｅｔ、ＵＰＡＲ、ＣＸＣＲ４(例えば腫瘍浸潤、転移に関与する)。本発明の状況において用語“ＨＩＦ−１調節ポリペプチド”は、例えば、タンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子の転写調節エレメントへのＨＩＦ−１の結合により、その発現が転写因子ＨＩＦ−１により調節されているまたはその影響を受ける全てのタンパク質またはポリペプチドを含む。好ましくは、タンパク質発現はＨＩＦ−１転写因子の活性により活性化され、すなわちより多くのタンパク質がＨＩＦ−１活性化に応答して発現される。ＨＩＦ−１は３種のアルファサブユニット(ＨＩＦ−１α、ＨＩＦ−２αまたはＨＩＦ−３α)の１個およびベータサブユニット(ＨＩＦ−１β、別名アリール炭化水素核運搬タンパク質、またはＡＲＮＴ)から成るヘテロ二量体である。ＨＩＦ−１ｂは恒常的に発現され、一方アルファサブユニットの発現は非常に制御されている。何らかの他のタンパク質について、アルファサブユニットのレベルは、タンパク質合成およびタンパク質分解の速度により決定される。ＨＩＦ−１アルファサブユニットの合成は、酸素非依存的機構を介して調節されているが、一方分解は主にＯ２依存的機構を介して調節されている。故に、アルファサブユニットの遺伝子は、主として連続的に転写および翻訳されるが、アルファサブユニットタンパク質は、プロテアソーム分解を介して急速に破壊されるため、非常に低いレベルを維持する。この破壊は、低酸素状態下で阻害され、これがＨＩＦ−１ａおよびこの転写因子に依存する遺伝子の誘導の主要な機構である。
Ｅ２−ＥＰＦ５は、配列がさほど複雑ではない６５ａａ長塩基性Ｃ末端伸張を有する２５kDaクラスIIユビキチン結合酵素をコードする。Ｅ２−ＥＰＦ５は、最初に地方病性落葉状天疱瘡(ＥＰＦ)と呼ばれる皮膚疾患に罹った患者から単離された(Liu et al., 1992, JBC 267, 15829)。その後、Ｅ２−ＥＰＦ５は、それが、タンパク分解事象を介在すると考えられている機構であるＫ４８残基を介してではなく、リシン残基Ｋ１１を介した多ユビキチン鎖形成を触媒するため、他の特徴付けされたＥ２イソ酵素と機能的に異なると仮定された(Bach and Ostendorff, Trends in Biochemical Sciences(2003), 28(4), 189-195)。Ｅ２−ＥＰＦ５はまた自己ユビキチン化を指示することも判明し、Ｅ２−ＥＰＦ５のための自己調節モデルの可能性が示唆された。Ｅ２−ＥＰＦ５のための基質は現在まで報告されていないが、Ｅ２ファミリーメンバーで独特なその非常に塩基性のカルボキシ末端伸張ドメインは、酸性タンパク質に対する特異性を示し得る(Liu et al., J Biol Chem. 271, 2817-2822)。Ｅ２−ＥＰＦ５終末(生物学的)活性は、本発明の情況内で、そのユビキチン関連活性以外にまた低酸素調節遺伝子のＨＩＦ−１介在誘導も妨害する。
ヒトＥ２−ＥＰＦ５の配列は公開データベース(GenBank Accession M91670, GI: 181915, SwissProt entry Q16763)から入手可能である。ｃＤＮＡ配列は配列番号１に示す通りである。アミノ酸配列は配列番号２に示す通りである。しかしながら、用語Ｅ２−ＥＰＦ５はまた、ここに記載のＥ２−ＥＰＦ５の生物活性を保持する限り、全ての相同配列もしくはオルソロガス配列、変異体およびフラグメントも含む。相同配列と参照配列の間の相同性％は、望ましくは少なくとも８０％、より望ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％である。配列比較は、Smith-Waterman配列アラインメント・アルゴリズムを使用して行う(例えばhttp://www-to.usc.edu/software/seqaln/index.html参照)。“フラグメント”は、Ｅ２−ＥＰＦ５の少なくとも５、１０、１５連続または所望により少なくとも２５、３５、または４５連続アミノ酸を有する、全てのポリペプチド分子を意味する。さらに可能なフラグメントは、触媒部位、または認識部位、ユビキチン結合部位、サブユニット相互作用のために重要な部位、およびユビキチン結合酵素の他の機能を行うために重要な部位を含むドメインを含む。このようなドメインまたはモチーフは、通常のコンピュータを利用した相同性検索法の手段により同定できる。フラグメントは、例えば、機能部位から、一方または両方に伸長し、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、または１００個までのアミノ酸を含み得る。用語フラグメントに包含されるのは、また例えばＥ２−ＥＰＦ５エピトープである。Ｅ２−ＥＰＦ５エピトープはポリペプチド上の部位を示し、それに対して抗体が産生され得、それに抗体が結合する。従って、Ｅ２−ＥＰＦ５エピトープのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、Ｅ２−ＥＰＦ５ポリペプチドに対する抗体の作製に有用である。好ましくは、エピトープは、少なくとも５個、より好ましくは少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、または５０個のアミノ酸残基の長さの配列を含む。
一つの局面において、本発明は、ユビキチン結合関連酵素Ｅ２−ＥＰＦ５活性を阻害する有効量の薬剤を投与することを含む、異常な新血管形成の処置法を提供する。関連局面において、本発明は、ＶＥＧＦ依存性血管形成、特に腫瘍血管形成に関連する病状の処置用薬剤の製造のための、Ｅ２−ＥＰＦ５活性を阻害する薬剤の使用を提供する。ここで使用する用語“異常な新血管形成”は、健康な生物では通常起こらず、異常または疾患状態と関連する血管形成を意味する。異常な新血管形成は、好ましくはＶＥＧＦの活性により調節されるかまたはその影響を受け、すなわち“ＶＥＧＦ依存性血管形成”である。特定の好ましい態様において、異常な新血管形成はＶＥＧＦ依存性腫瘍血管形成である。
ここで使用する用語“ＶＥＧＦ依存性血管形成”は、ＶＥＧＦによる刺激による新血管の何らかの産生に関し、腫瘍における血管形成、リウマチ性関節炎における滑膜血管形成、糖尿病性網膜症およびある他の眼疾患で観察される眼新血管形成、乾癬における皮膚血管形成、または肝硬変における低酸素誘発血管形成を含むが、これらに限定されない。
他の局面において、本発明は、ユビキチン結合関連酵素Ｅ２−ＥＰＦ５の発現または活性の阻害を含む、細胞におけるＨＩＦ−１調節遺伝子の阻害法を提供する。ＨＩＦ−１調節遺伝子の阻害は、例えばＨＩＦ−１ａタンパク質の合成もしくは安定化またはＨＩＦ−１ａトランス活性化の妨害によるユビキチン依存性タンパク質分解によるＨＩＦ−１の量の低下により、例えば達成できる。一つの態様において、本発明は、ユビキチン結合関連酵素Ｅ２−ＥＰＦ５の発現または活性の阻害を含む、ＨＩＦ−１調節ポリペプチドを減少させる方法を提供する。特定の好ましい態様において、ＨＩＦ−１調節遺伝子はＶＥＧＦである。従って、本発明は、さらに抗血管形成法を提供する。故に、ユビキチン結合関連酵素Ｅ２−ＥＰＦ５の発現または活性の阻害を含む、腫瘍血管形成を含む血管形成の阻害のための方法が提供される。
遺伝子発現またはタンパク質活性の文脈において、用語“阻害”は遺伝子発現またはタンパク質活性の減少を意味する。好ましくは、このような減少は、阻害無しの発現または活性のレベルと比較して、少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％である。遺伝子またはタンパク質阻害は、任意の適当な技術で達成できる。当業者はどのようにして遺伝子発現またはタンパク質活性を阻害するかの種々の方法および技術を知っている。例えば、Ｅ２−ＥＰＦ５は、ＲＮＡ干渉またはアンチセンス技術により、またはＥ２−ＥＰＦ５の機能を妨害するＬＭＷ化合物の使用により、またはユビキチン結合関連酵素Ｅ２−ＥＰＦ５を低下させる任意の薬剤により、阻害できる。
ユビキチン結合関連酵素Ｅ２−ＥＰＦ５活性を阻害する薬剤は、Ｅ２−ＥＰＦ５の生物活性を減少させる全ての物質であり得る。本薬剤は、例えば、Ｅ２−ＥＰＦ５遺伝子の発現またはＥ２−ＥＰＦ５の酵素活性を阻害してよく、Ｅ２−ＥＰＦ５ポリペプチドの分解を誘発してよく、または何らかの他の方法でＥ２−ＥＰＦ５の生物活性を妨害してよい。好ましい態様において、本阻害剤は低分子量化合物または阻害性核酸または抗体である。
ここで意図される用語“阻害性核酸”は、遺伝子発現の遺伝子特異的阻害を産生できる核酸化合物を意味する。典型的阻害性核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重螺旋ＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー、リボザイムおよびｓｉＲＮＡを含むが、これらに限定されない。例えば、ヌクレオチド配列の知識を使用して、ユビキチン結合関連酵素Ｅ２−ＥＰＦ５の発現を阻害する可能性のあるｓｉＲＮＡまたはアンチセンス分子を設計し得る。同様に、リボザイムを遺伝子の特異的ヌクレオチド配列を認識し、それを開裂するように合成できる。遺伝子発現の標的阻害に使用するためのこのような分子の設計の技術は、当業者に既知である。
本発明の阻害性核酸化合物は、市販の自動ＤＮＡシンセサイザー、例えばApplied Biosystems(Foster City, CA)モデル３８０Ｂ、３９２または３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー、または類似の装置により慣用の手段で合成できる。ホスホラミダイト化学を用い得る。本発明の阻害性核酸化合物はまた、多くの文献に記載された、修飾された、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートなどのようなヌクレアーゼ抵抗性の基本構造であり得る。本阻害性核酸の長さは、生物活性の阻害を確実にするのに十分でなければならない。故に、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、特異的結合が所望の標的ポリヌクレオチドでしか起こらず、他の思いがけない部位では起こらないことを確実にするのに十分大きくなければならない。長さの上限は、約３０−４０ヌクレオチド長より大きいオリゴマーの合成および精製の不便さおよび費用、ミスマッチに対する短いオリゴヌクレオチドよりも長いオリゴヌクレオチドの大きな寛容性などを含む、数個の因子により決定される。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１５から４０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。より好ましくは、本オリゴヌクレオチド部分は、約１８から２５ヌクレオチドの範囲の長さを有する。
低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)分子とも呼ばれる二本鎖ＲＮＡ、すなわちセンス−アンチセンスＲＮＡも、Ｅ２−ＥＰＦ５の核酸の発現の阻害に使用できる。ＲＮＡ干渉は外因性、短ＲＮＡ二本鎖を、一本の鎖が標的ｍＲＮＡのコード領域に対応する場所に適用する、方法である(Elbashir et al., Nature 2001, 411: 494-498)。細胞に入ると、ｓｉＲＮＡ分子は外因性ＲＮＡ二本鎖だけでなく、同一配列を有する一本鎖ＲＮＡ(内因性メッセンジャーＲＮＡを含む)の分解を起こす。従って、ｓｉＲＮＡは、伝統的アンチセンスＲＮＡ法よりも、この方法が触媒機構を介した作用に頼っているため、より強力で有効であり得る。好ましいｓｉＲＮＡ分子は、典型的に１９から２５ヌクレオチド長、好ましくは約２１ヌクレオチド長であり、かつＥ２−ＥＰＦ５の核酸を含む。ｓｉＲＮＡの標的細胞への送達のための有効な戦略は、例えば、物理的または化学的トランスフェクションを使用した形質導入を含む。あるいは、ｓｉＲＮＡを、例えば、機能的ｓｉＲＮＡまたはその前駆体の種々の転写を可能にするＰｏｌIIIプロモーター発現カセットを使用して、細胞内で発現させ得る。例えば、Scherr et al., Curr. Med. Chem. 2003, 10(3): 245-256; Turki et al., Hum. Gene Ther. 2002, 13(18): 2197-2201; Cornell et al., Nat. Struct. Biol. 2003, 10(2): 91-92を参照のこと。本発明はまた例えばミクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)および短ヘアピン型ＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)のような、ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)を介在できる他の小ＲＮＡもカバーする。
他の好ましい態様において、ユビキチン結合関連酵素Ｅ２−ＥＰＦ５活性を阻害する薬剤は抗体である。このような抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(ｍＡｂｓ)、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ(ａｂ')２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されるフラグメント、抗イディオタイプ(抗Ｉｄ)抗体、および上記の何れかのエピトープ−結合フラグメントを含み得るが、これらに限定されない。当分野で既知の種々の方法をポリクローナル抗体の産生に使用できる。
当分野で既知の種々の方法を抗体の産生に使用できる。ポリクローナル抗体は、標的遺伝子産物、またはその抗原性機能的誘導体のような抗原で免疫化した動物の血清由来の抗体分子の異種集団である。ポリクローナル抗体の産生のために、宿主動物をアジュバントを補ったＥ２−ＥＰＦ５ポリペプチド、誘導体またはフラグメントの注射により免疫化し得る。特定の抗原に対する抗体の同種集団であるモノクローナル抗体は、培養で連続的細胞系により得られ得る抗体分子の産生のために提供される、何らかの技術により得られ得る。これらは、KohlerおよびMilstein(1975, Nature 256: 495-497)のハイブリドーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術を含むが、これらに限定されない。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびその全てのサブクラスを含む、任意の免疫グロブリンクラスにあり得る。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマはインビトロまたはインビボで培養できる。インビボでの高力化のｍＡｂの産生により、これは現在好ましい産生法である。
加えて、適当な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子と、適当な生物活性のヒト抗体分子由来の遺伝子の一緒のスプライシングによる、“キメラ抗体”(すなわち、マウスｍＡｂ由来の可変または超可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するもののような、異なる部分が異なる動物種由来である、分子)の産生のために開発された技術も使用できる。あるいは、一本鎖抗体の産生について記載された技術をＥ２−ＥＰＦ５抗体の産生に適用できる。一本鎖抗体を、Ｆｖ領域の重および軽鎖フラグメントをアミノ酸架橋を介して連結することにより形成し、一本鎖ポリペプチドをもたらす。このような技術は当分野で既知である。
好ましい態様において、Ｅ２−ＥＰＦ５抗体は“ヒト化抗体”である。“ヒト化抗体”産生に有用な技術は、ここに記載のＥ２−ＥＰＦ５ポリペプチド、フラグメント、誘導体、および機能的等価体に対する抗体の産生に適用できる。このような技術は米国特許５,９３２、４４８；５,６９３,７６２；５,６９３,７６１；５,５８５,０８９；５,５３０,１０１；５,９１０,７７１；５,５６９,８２５；５,６２５,１２６；５,６３３,４２５；５,７８９,６５０；５,５４５,５８０；５,６６１,０１６；および５,７７０,４２９に記載され、これら全ての開示を、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
特異的Ｅ２−ＥＰＦ５エピトープを認識する抗体フラグメントを、既知技術により産生できる。例えば、このようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化により産生できるＦ(ａｂ')２フラグメントおよびＦ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド架橋の還元により産生できるＦａｂフラグメントを含むがこれらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築し、所望の特異性のモノクローナルＦａｂフラグメントの速くて容易な同定を可能にし得る。
Ｅ２−ＥＰＦ５タンパク質に対する適当な抗体は、市販の供給源から得ることができ、または慣用法に従い、製造できる。このような抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(ｍＡｂｓ)、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、一ドメイン抗体、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ(ａｂ')２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されるフラグメント、抗イディオタイプ(抗Ｉｄ)抗体、および上記の何れかのエピトープ−結合フラグメントを含み得るが、これらに限定されない。
広範囲の抗体／免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドを、得られるポリペプチドが、Ｅ２−ＥＰＦ５タンパク質に特異的な１種以上の結合領域を有する限り、用いることができる。このようなフレームワークまたはスキャフォールドは、ヒト免疫グロブリンの５個の主イディオタイプ、またはそれらのフラグメント(例えば、本明細書の他の場所に記載のもの)を含み、好ましくはヒト化局面を有する、他の動物種の免疫グロブリンを含む。ラクダ科の動物から同定されたような１個の重鎖抗体は、この点で特に興味深い。新規フレームワーク、スキャフォールドおよびフラグメントは、当業者により発見され、開発され続けている。
あるいは、非免疫グロブリンフレームワークおよびスキャフォールドを、それらがＥ２−ＥＰＦ５タンパク質に特異的な結合領域を含む限り、使用し得る。既知の非免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドは、Adnectins(フィブロネクチン)(Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA)、アンキリン(Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland)、ドメイン抗体(Domantis, Ltd(Cambridge, MA)およびAblynx nv(Zwijnaarde, Belgium))、リポカリン(Anticalin)(Pieris Proteolab AG, Freising, Germany)、小モジュラー免疫薬剤(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA)、マキシボディ(Avidia, Inc. (Mountain View, CA))、タンパク質Ａ(Affibody AG, Sweden)およびaffilin(ガンマ−クリスタリンまたはユビキチン)(Scil Proteins GmbH, Halle, Germany)を含む。
本発明によって、抗Ｅ２−ＥＰＦ５抗体もしくはそのフラグメント、またはＥ２−ＥＰＦ５特異的結合領域を含むポリペプチドは、用いるフレームワークまたはスキャフォールドに関係なく、付加的部分に共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる。本付加的部分はポリペプチド、ＰＥＧのような不活性ポリマー、小分子、放射性同位体、金属、イオン、核酸または他のタイプの生物学的に関連する分子であり得る。免疫複合体、免疫毒素などとして既知であり得るこのような構築物もまた、ここで使用する抗体、抗体フラグメントまたはＥ２−ＥＰＦ５特異的結合領域を含むポリペプチドの意味に含まれる。
本発明の他の態様において、Ｅ２−ＥＰＦ５発現またはＥ２−ＥＰＦ５ポリペプチドの活性に影響する、阻害剤は小分子(例えば、分子量約２kDa未満、より好ましくは分子量約１kDa未満であり、および／または血液−脳関門を通過でき、または適当な細胞に入り込むことができる有機または無機分子)である。このような小分子化合物は、下記のスクリーニング法により同定できる。
本発明の一つの局面は、上記の疾患を有する個体の処置において使用するための治療剤の開発のための薬物標的としてのＥ２−ＥＰＦ５遺伝子および遺伝子産物を提供する。本発明の一部としてここで提供されるのは、従って、ここに記載の疾患の処置に使用し得る化合物のスクリーニング法である。これらの方法は、好ましい態様において、試験化合物を、Ｅ２−ＥＰＦ５ポリペプチドを含む反応混合物に接触させることを含む。好ましい態様において、Ｅ２−ＥＰＦ５は、SwissProt entry Q16763に明示の配列を含み得る、アミノ酸配列を有するポリペプチドである。しかしながら、全てのＥ２−ＥＰＦ５相同体、オルソログ、変異体などをこれらの方法で使用でき、同様にこれらのポリペプチドの融合構築物も使用できる(例えば下記実施例に記載の融合構築物)。例えば、Ｅ２−ＥＰＦ５ポリペプチドは、SwissProt entry Q16763と実質的に相同性(例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一)のアミノ酸配列を有し得る。
特に好ましい態様において、ＶＥＧＦ依存性血管形成、特に、腫瘍血管形成または眼血管形成または低酸素誘発血管形成が役割を有する疾患の処置に有用な治療剤のスクリーニングの新規標的として、Ｅ２−ＥＰＦ５が提供される。本発明は、(ａ)Ｅ２−ＥＰＦ５ポリペプチドと試験化合物を接触させ、(ｂ)Ｅ２−ＥＰＦ５生物活性の調節を測定する、工程を含む、ＶＥＧＦ依存性血管形成の阻害に有用な化合物の同定法を提供する。本調節は、通常試験化合物が存在しないコントロール反応に対して検出する。ここで使用する調節は生物活性の、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％または少なくとも１００％までの増加または減少を意味する。
他の態様において、本発明は、
ｉ)試験化合物をとＥ２−ＥＰＦ５ポリペプチドを、Ｅ２−ＥＰＦ５生物活性に許容的なサンプル条件で接触させ；
ii)該少なくとも１種のＥ２−ＥＰＦ５生物活性を測定し；
iii)該レベルを、該試験化合物を核コントロールサンプルと比較し；そして、所望により、
iv)ＶＥＧＦ依存性血管形成関連する疾患の予防的および／または治療的処置のための化合物としてさらに試験するために、該レベルの変化をもたらす試験化合物を選択する
工程を含む、ＶＥＧＦ依存性血管形成が関連する疾患、例えば腫瘍血管形成の処置に有用な化合物の同定法を提供する。
化合物スクリーニングアッセイは、細胞を利用したまたは無細胞システムを含み得る。細胞を利用したシステムは、生検サンプルとしてまたは細胞培養で増殖させた、未処置の、すなわち、通常ユビキチン結合酵素Ｅ２−ＥＰＦ５を発現する細胞であり得る。一つの態様において、しかしながら、細胞を利用したアッセイは、ユビキチン結合酵素を発現する組み換え宿主細胞を含む。試験化合物がユビキチン結合酵素Ｅ２−ＥＰＦ５と相互作用する能力の測定は、また既知結合分子(例えば、ユビキチン)がポリペプチドに結合する能力と比較して、試験化合物が優勢にポリペプチドと結合する能力の測定も含み得る。本ポリペプチドは、ユビキチン結合活性を調節する化合物の同定に使用できる。このような化合物は、例えば、ユビキチン化タンパク質基質、またはユビキチン化タンパク質基質レムナントに対する親和性を増加または減少できる。このような化合物はまた、例えば、これらの成分への結合の割合を増加または減少できる。このような化合物はまた、ユビキチン結合酵素へのこれらの成分の結合と競合でき、または、ユビキチン結合酵素に結合したこれらの成分を置き換え得る。このような化合物はまたＡＴＰのような他の成分、Ｅ１活性化酵素またはＥ３リガーゼのような他のサブユニットとの相互作用にも影響し得る。
ユビキチン結合酵素Ｅ２−ＥＰＦ５、誘導体およびフラグメントは、ユビキチン結合酵素と結合する能力について候補化合物をアッセイするための、高速スクリーニング法、例えば自動ハイスループットスクリーニング(ＨＴＳ)において使用できる。多くの適当な高速スクリーニングアッセイは、当業者に既知である。
これらの化合物は、ユビキチン結合酵素Ｅ２−ＥＰＦ５に対する化合物の効果を測定するために機能的ユビキチン結合酵素Ｅ２−ＥＰＦ５に対してさらにスクリーニングできる。Ｅ２−ＥＰＦ５を望む程度まで活性化(アゴニスト)または不活性化(アンタゴニスト)する化合物を同定できる。調節的な方法を、インビトロで(例えば、細胞を薬剤と一緒に培養することにより)、または別法として、インビボで(例えば、薬剤を対象に投与することにより)行うことができる。本発明のＥ２−ＥＰＦ５ポリペプチドは、Ｅ２−ＥＰＦ５タンパク質と、通常Ｅ２−ＥＰＦ５タンパク質と相互作用する標的分子の相互作用を刺激または阻害する能力について化合物をスクリーニングするのに使用できる。本標的はユビキチン、ユビキチン化基質、またはポリユビキチンまたは。ユビキチン結合酵素タンパク質が通常相互作用する経路の他の成分(例えばＥ１またはＥ３タンパク質)であり得る。本アッセイは、Ｅ２−ＥＰＦ５タンパク質と候補化合物を、Ｅ２−ＥＰＦ５タンパク質またはフラグメントが標的分子と相互作用できる条件下で合わせ、そしてＥ２−ＥＰＦ５タンパク質と標的の間の複合体の形成を検出するか、またはＥ２−ＥＰＦ５と標的の相互作用の生化学的結果を検出する工程を含む。ユビキチン結合機能の何らかの関連効果をアッセイできる。これは、ユビキチン化基質の産生、タンパク質分解、遊離ポリユビキチンの減少、基質の安定化を含む。
標的分子にユビキチン結合酵素が結合する能力の測定はまた、実時間生体分子相互作用分析(ＢＩＡ)のような技術を使用して達成できる。ここで使用する“ＢＩＡ”は、反応体(例えば、BIAcore(登録商標))の何れも標識無しで、実時間で生体分子特異的相互作用を試験する技術である。光学現象表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)の変化を、生物学的分子間の実時間反応の指標として使用できる。本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー；空間的に接近可能な平行固相または液相ライブラリー；逆重畳積分を必要とする合成ライブラリー法；‘１ビーズ１化合物'ライブラリー法；および親和性クロマトグラフィー選択を使用した合成ライブラリー法を含む、当分野で既知のコンビナトリアル・ライブラリー法における多数のアプローチの何れかを使用して得ることができる。生物学的ライブラリーアプローチはポリペプチドライブラリーに限定されているが、他の４つのライブラリーはポリペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用できる(Lam, K. S. (1997)Anticancer Drug Des. 12: 145)。分子ライブラリーの合成法の例は文献に、例えばDeWitt et al. (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909; Erb et al. (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37: 2678; Cho et al. (1993)Science 261: 1303; Carell et al. (1994)Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994)Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; およびin Gallop et al. (1994)J. Med. Chem. 37: 1233に見ることができる。化合物のライブラリーは溶液中(例えば、Houghten(1992)Biotechniques 13: 412-421)、またはビーズ上(Lam(1991)Nature 354: 82-84), chips(Fodor(1993)Nature 364: 555-556)、細菌(Ladner 米国特許５,２２３,４０９)、胞子(Ladner 米国特許'４０９)、プラスミド(Cull et al. (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869)またはファージ上(Scott and Smith(1990)Science 249: 386-390); (Devlin(1990)Science 249: 404-406); (Cwirla et al. (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 6378-6382); (Felici(1991)J. Mol. Biol. 222: 301-310); (Ladner supra)に提示できる。候補化合物は、例えば、１)Ｉｇで終わる融合ペプチドならびにランダムペプチドライブラリー(例えば、Lam et al. (1991)Nature 354: 82-84; Houghten et al. (1991)Nature 354: 84-86)およびＤ−および／またはＬ−配置アミノ酸から成るコンビナトリアル・ケミストリー由来分子ライブラリーのメンバーを含む可溶性ペプチドのようなペプチド；２)ホスホペプチド(例えば、無作為におよび部分的に変性し、方向付けしたホスホペプチドライブラリーのメンバー、例えば、Songyang et al. (1993) Cell 72: 767-778を参照)；３)抗体(例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ、および一本鎖抗体ならびに抗体のＦａｂ、Ｆ(ａｂ')２、Ｆａｂ発現ライブラリーフラグメント、およびエピトープ−結合フラグメント)；および４)小有機および無機分子(例えば、コンビナトリアルおよび天然産物ライブラリーから得られた分子)を含む。
ユビキチン結合関連酵素活性の活性を測定するための適当なアッセイは、当分野で既知である。これらのアッセイは、ポリユビキチンまたはユビキチン化基質タンパク質またはタンパク質レムナントの量の増加を含む基質の様子、遊離ユビキチンモノマーの消失のような中間および最終産物の様子、全体的タンパク質ターンオーバー、特異的タンパク質ターンオーバー、ユビキチン結合、ユビキチン化基質タンパク質への結合、サブユニット相互作用、ＡＴＰとの相互作用、トランス作動性調節因子のような細胞成分との相互作用、特異的タンパク質の安定化などを含むが、これらに限定されない。
一つの局面において、本発明のスクリーニング法で同定された化合物が提供される。このような化合物は、好ましくは低分子量化合物または抗体、特にモノクローナル抗体、または阻害性核酸である。本化合物は、好ましくは抗血管形成活性を有し、すなわちそれらは、一般に血管の増殖をおよび特に異常な新血管形成を阻害する。このような抗血管形成活性は、当分野で既知の方法により決定できる。このような方法は、例えば腫瘍における血管形成の微視的評価、インビボマトリゲル移動および血管形成アッセイ、血管形成のアルギン酸マイクロビーズ放出アッセイ、ディスク血管形成アッセイ、血管形成のためのスポンジ移植モデル、腫瘍血管形成のための中空繊維アッセイまたは血管形成のための角膜アッセイを含む。このようなアッセイは、例えば“Angiogenesis Protocols”, March 2001, ISBN: 0-89603-698-7, Series: Methods in Molecular Medicine, Volume #: 46に記載されている。
血管形成および抗血管形成戦略を開発するために、インビボ血管形成のより定量的な分析のための動物モデルを提供するために多大な努力がなされている。インビボ技術は、眼における角膜ポケットおよび虹彩移植、ウサギ耳チャンバー、背面皮下脂肪チャンバー、頭蓋窓、ハムスター頬袋窓、スポンジ移植アッセイ、フィブリン凝固、アルギン酸ナトリウムビーズおよびマトリゲルプラグ、ラット腸間膜窓、ニワトリ胚絨毛尿膜ならびにマウスおよびラットにおける気嚢から成る(１)。この章で、我々は、無血管角膜アッセイ、ならびに異なる種でこのアッセイを使用した利点および欠点を記載する。角膜アッセイは、末梢に位置した角膜縁脈管構造から血管伸長を発生させるための、血管形成インデューサー(腫瘍組織、細胞懸濁液、増殖因子)の角膜ポケットへの配置に基づく。他のインビボアッセイと比較して、このアッセイは、角膜が最初は無血管性であるため、新血管のみ測定する利点を有する。
本発明のさらなる局面は、上記の何れかの治療的効果のための、薬学的に許容される担体と組み合わさった医薬組成物の投与に関連する。このような医薬組成物は、ユビキチン結合酵素をコードする遺伝子Ｅ２−ＥＰＦ５の発現を阻害するまたはＥ２−ＥＰＦ５遺伝子産物の活性を阻害する有効量の薬剤を含む。それらは例えば本発明に従うユビキチン結合酵素Ｅ２−ＥＰＦ５の抗体、摸倣物、アゴニスト、アンタゴニスト、または阻害性核酸を含み得る。本組成物は、単独でまたは、安定化化合物のような少なくとも１種の他の薬剤と組み合わせて投与でき、それは、塩水、緩衝化塩水、デキストロース、および水を含むが、これらに限定されない任意の滅菌、生体適合性担体中に投与し得る。本組成物は、患者に、単独で、または他の薬剤、薬物またはホルモンと組み合わせて投与し得る。
本発明により包含される医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、または直腸手段を含むが、これらに限定されない多くの経路の何れかにより投与できる。
活性成分に加えて、これらの医薬組成物は、活性化合物を製剤する工程を容易にし、薬学的に使用できる賦形剤および助剤を含む、適当な薬学的に許容される担体を含み得る。製剤および投与のさらに詳細な技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co., Easton, Pa.)の最新版に見ることができる。
経口投与用医薬組成物は、当分野で既知の薬学的に許容される担体を使用して、経口投与に適当な剤形に製剤できる。このような担体は、医薬組成物の患者が摂取するための錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などへの製剤を可能にする。
本医薬組成物は塩として提供でき、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含むが、これらに限定されない多くの酸と形成できる。塩は、対応する遊離塩基形態と比較して、水性または他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向にある。他の場合において、好ましい製剤は、下記：ｐＨ範囲４.５から５.５の１−５０mM ヒスチジン、０.１％−２％スクロース、および２−７％マンニトールの何れかまたは全てを含み得る凍結乾燥粉末であり得、それは使用前に緩衝液と組み合わせる。
医薬組成物製造後、それらを適当な容器に入れ、適応症の処置のための表示をし得る。投与のために、表示は投与の量、頻度、および方法を含む。
本発明での使用に適当な医薬組成物は、活性成分が、意図する目的を達成するための十分量で含まれる、組成物を含む。有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。任意の化合物について、治療的有効量は、最初に、例えば、新生物細胞の細胞培養アッセイで、または動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌ、またはブタにおいて概算できる。動物モデルはまた、適当な濃度範囲および投与経路の決定にも使用できる。このような情報を、次いで、ヒトでの投与のための有用な用量および経路の決定に使用できる。
治療的有効量は、症状または状態を軽減する活性成分、そのフラグメント、ユビキチン結合酵素Ｅ２−ＥＰＦ５の抗体、アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の量を意味する。治療的有効量および毒性、例えば、ＥＤ５０(集団の５０％に有効な量)およびＬＤ５０(集団の５０％に致死的な量)は、細胞培養または実験動物における標準の薬学的方法により決定できる。毒性と治療効果の用量比が治療指数であり、それは比率、ＬＤ５０／ＥＤ５０として示し得る。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータを、ヒト使用のための用量範囲の計算に使用する。このような組成物中に含まれる用量範囲は、好ましくはほとんどまたは全く毒性がなくＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は用いる投与形態、患者の感受性、および投与経路に依存して、この範囲内で変化する。
正確な投与量は、処置を必要とする対象に関連する因子に照らして、実施者が決定する。投与量および投与は、活性部分の十分なレベルを提供するため、または所望の効果を維持するために調節する。考慮すべき因子は疾患状態の重症度、対象の全体的健康、対象の年齢、体重、および性別、食事、投与時間および頻度、薬物組合せ(複数もある)、反応感受性、および治療に対する寛容性／応答を含む。長時間作用型医薬組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランスに依存して、３〜４日毎、毎週、または２週間に１回投与し得る。通常の投与量は、投与経路に依存して、０.１〜１００,０００マイクログラムから、約１ｇまでの総量で変化し得る。特定の投与量および送達法についてのガイダンスは、文献に提供され、一般に当分野の実施者に利用可能である。当業者は、ヌクレオチドについて、タンパク質またはそれらの阻害剤と異なる製剤を用いる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置などに特異的である。タンパク質の経口投与に適当な医薬製剤は、例えば、米国特許５,００８,１１４；５,５０５,９６２；５,６４１,５１５；５,６８１,８１１；５,７００,４８６；５,７６６,６３３；５,７９２,４５１；５,８５３,７４８；５,９７２,３８７；５,９７６,５６９；および６,０５１,５６１に記載されている。
本発明を一般的に記載してきたが、説明だけの目的で個々に提供し、特記されない限り限定する意図はない、いくつかの具体的実施例を参照して、さらなる理解を得ることができる。
１. アンチセンス(ＡＳＯ)およびｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド
ｓｉＲＮＡは、例えばQiagen、Dharmacon、Proligoのような多くの商業的供給者から入手可能である。
オリゴリボヌクレオチドは、製造業者(Xeragon)が記載の通りＴＯＭ−ホスホラミダイト化学を使用して合成でき、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製できる。純度は、キャピラリー・ゲル電気泳動により評価する。定量は、２６０nMでの吸光率に従ったＵＶにより行う。二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)のアニーリングは、いろんな所に記載の通り行う(Elbashir et al., 2001)。
修飾アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドは、ホスホラミダイト化学を使用して合成し、ＨＰＬＣで精製し、エレクトロスプレー質量分析およびキャピラリー・ゲル電気泳動により分析および特徴付けする。定量は、２６０nMでの吸光率に従ったＵＶにより行う。
全オリゴヌクレオチドを、ヒトＥ２−ＥＰＦ５配列(GenBank Accession M91670, GI number, GI: 181915, SwissProt entry Q16763)に対して設計し、特異性のレベルを最大にするために、RefseqおよびUNIGENEデータベースに対して、BLASTで確認する。最も強力なオリゴヌクレオチドを同定するために、Ｅ２−ＥＰＦ５を標的とする一連のＡＳＯおよびｓｉＲＮＡを、先に記載の通り(Huesken, D. et al, 2003)二色レポーターアッセイにおいてスクリーニングする。Ｅ２−ＥＰＦ５のコード配列を含むベクターを、ＣＦＰ−およびＹＦＰレポーター配列を含む目的地ベクターで組み換える。得られるデュアルレポータープラスミドｐＮＡＳ−Ｘは融合ｍＲＮＡを産生し、そこでＥ２−ＥＰＦ５標的配列が発現されたＹＦＰ−レポーター遺伝子の３'−ＵＴＲ領域に挿入されている。Ｅ２−ＥＰＦ５ ＡＳＯおよびｓｉＲＮＡ活性を、ＹＦＰレポータータンパク質の阻害の程度により測定する。ｅＣＦＰタンパク質の発現は、プラスミドトランスフェクション効率を標準化する手段として働く。スクリーニングしたＥ２−ＥＰＦ５オリゴヌクレオチドのリストを表１(Ｅ２−ＥＰＦ５をターゲティングするＡＳＯ；Ｎ＝ＤＮＡ、ｎ＝２'−Ｏ−メトキシエチルを有するＤＮＡ、ｓ＝ホスホロチオエート・インターヌクレオチド・架橋、ｃ＝２'−メトキシエチル５−メチルシチジン)および表２(Ｅ２−ＥＰＦ５をターゲティングするｓｉＲＮＡ)に各々示す(アンチセンス配列のみ示す。Ｎ(Ｇ,Ｃ,Ａ,Ｕ)＝リボヌクレオシド、ｎ(ｇ,ａ,ｔ)＝デオキシリボヌクレオシド)。最も活性なオリゴヌクレオチド(８１６２、１７８２８、１１７２３)および対応するコントロールをフォローアップ試験に使用する。
Figure 2008516953
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２. 細胞培養
全ての細胞培養試薬はGibco-BRL-Invitrogen AG(Basel. Switzerland)からである。使用した基底培養培地は、ＨｅＬａ細胞についてダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)およびＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞についてＲＰＭＩ１６４０である。培地に１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)および１％Ｌ−グルタミンと、所望により５０マイクログラム／ml ゲンタマイシン抗生物質を補った。通常の維持のために、細胞を１：４に週に２回分ける。トランスフェクションの前日、細胞をトリプシン処理し、ＦＢＳを含むが抗生物質を含まない培地に再懸濁し、２４ウェル培養プレートにウェル当たり０.５ml当たり１.５−２×１０４細胞の密度で、または６ウェルプレートにウェル当たり２ml当たり５−１０×１０４細胞の密度の何れかで播種する。プレートを、２４時間、３７℃で５％ＣＯ２中、高湿度でインキュベートする。
３. ｓｉＲＮＡのトランスフェクションならびにデスフェリオキサミン(ＤＦＯ)および塩化コバルト処置
ｓｉＲＮＡのトランスフェクションを、製造業者(Invitrogen)により提供されたプロトコールに従い、オリゴフェクタミンを使用して行う。簡単に言うと、ｓｉＲＮＡをオプティメムで１.２μM ｓｉＲＮＡ／μlに希釈する。別に、オリゴフェクタミンを０.２５μl オリゴフェクタミン／μl オプティメムに希釈する。これらのｓｉＲＮＡおよびオリゴフェクタミン溶液の等量を合わせ、２０−２５分、室温でインキュベートし、複合体の形成を進行させる。次に、ｓｉＲＮＡ／オリゴフェクタミン複合体を、１０％ＦＢＳを含むが、抗生物質を含まない培地中に、所望の最終濃度まで、典型的に２０−８０nM ｓｉＲＮＡまで希釈する。その後、古い培地を細胞から除き、ｓｉＲＮＡ／オリゴフェクタミン懸濁液に変える：２４ウェルプレートについては、０.５ml／ウェルおよび６ウェルプレートについては２ml／ウェル。４８−７２時間、加湿ＣＯ２インキュベーターでインキュベーション後、ｓｉＲＮＡ含有培地を、インデューサーを含まないか、または１５０μM デスフェリオキサミン(deferrioxamine)(略語：ＤＦＯ)もしくはＣｏＣｌ２(両方ともSigmaから；新たに調製した水性貯蔵溶液から)を含む、１０％ＦＢＳ含有標準培地で置き換える。６時間、３７℃の後、細胞の培地を、分泌ＶＥＧＦの決定のために回収し、一方細胞単層から、全細胞抽出物を、ウェスタン・ブロットまたは全ＲＮＡ分析のために調製する。
４. ＡＳＯのトランスフェクションならびにＤＦＯおよび塩化コバルト処置：
ＡＳＯを１mM濃度でＴＥ(１０mM Ｔｒｉｓ ｐＨ ８.０、１mM ＥＤＴＡ)内に貯蔵する。実験前に、１０μM作業溶液をオプティメム(Life Sciences Inc.)内に製造する。ＡＳＯを、オプティメム中で最終濃度の２倍にに希釈し、リポフェクチンまたはEffecteneをまた最終濃度の２倍に希釈し、室温で３０分放置する。標準培地を３０−５０％コンフルエントＴ２４細胞培養から除去し、細胞単層を一度無血清オプティメム１(Gibco BRL)で行う。ＡＳＯ／リポフェクチン混合物を、次いで細胞単層に添加し、その後４時間、３７℃でＣＯ２インキュベーター中インキュベートし、その後培地を除去し、１０％ＦＢＳ添加新鮮培地で置き換える。加湿ＣＯ２インキュベーター中で２４−７２時間インキュベーション後、培地をインデューサーを含まないか、または１５０μM デスフェリオキサミン(deferrioxamine)(略語：ＤＦＯ)もしくはＣｏＣｌ２(両方ともSigmaから；新たに調製した水性貯蔵溶液から)を含む、１０％ＦＢＳ含有新鮮培地で置き換える。６時間、３７℃の後、細胞の培地を、分泌ＶＥＧＦの決定のために回収し、一方細胞単層から、全細胞抽出物を、ウェスタン・ブロットまたは全ＲＮＡ分析のために調製する。
５. 実時間逆転写酵素ＰＣＲ
全ＲＮＡを、RNeasy 96 kit(Qiagen #74183)を使用して、製造業者の指示に従い調製する。実時間ＰＣＲのためのプライマー対およびＦＡＭ標識TaqManプローブを、Primer Express v1.0 program(ABI PRISM, PE Biosystems)を使用して設計し、Microsynth(Switzerland)、QiagenまたはApplied Biosystemsから購入する(“アッセイ−オン−デマンド”)。下記プライマー配列を使用する：
Ｅ２−ＥＰＦ５(Acc. Nr GI 181915)：
リバースプライマー：5'-AAAGACCTTGATGCCATCGG-3'(配列番号２７)
フォワードプライマー：5'-TCCGCCTGGTGTACAAGGA-3'(配列番号２８)
TaqManプローブ：5'-FAM-TGACGACACTGACCGCAGACCCA-TAMRA-3'(配列番号２９)

ＨＩＦ−１ａ(Acc. Nr)：NM_18105
ＡＢＩアッセイ−オン−デマンド：Hs00153153_m1

ＶＥＧＦ(Acc. Nr)：NM_003376
リバースプライマー：5'-CACATTTGTTGTGCTGTAGGAAGC-3'(配列番号３０)
フォワードプライマー：5'-TGAGATCGAGTACATCTTCAAGCC-3'(配列番号３１)
TaqManプローブ：5'-FAM-CCATGCAGATTATGCGGATCAACCTCA-TAMRA-3'(配列番号３２)
またはＡＢＩアッセイ−オン−デマンド：Hs00173626_m1
ＧＬＵＴ−１(Acc. Nr)：NM_006516
ＡＢＩアッセイ−オン−デマンド：Hs00197884_m1

ヘキソキナーゼ２(Acc. Nr)：NM_000189
リバースプライマー：5'-TGTCTTGAGCCGCTCTGAGAT-3'(配列番号３３)
フォワードプライマー：5'-TGTCCGTAACATTCTCATCGATTT-3'(配列番号３４)
TaqManプローブ：5'-FAM-CCAAGCGTGGACTGCTCTTCCGAG-TAMRA-3'(配列番号３５)

ベータアクチン(Acc. Nr)：X00351
リバースプライマー：5'-TAATGTCACGCACGATTTCCC-3'(配列番号３６)
フォワードプライマー：5'-TCACCGAGCGCGGCT-3'(配列番号３７)
TaqManプローブ：5'-FAM-CAGCTTCACCACCACGGCCGA-TAMRA-3'(配列番号３８)

Ｂｃｌ−ＸＬ(Acc. Nr)：Z23115
リバースプライマー：5'-GGTCGCATTGTGGCCTTT-3'(配列番号３９)
フォワードプライマー：5'-TCCTTGTCTACGCTTTCCACG-3'(配列番号４０)
TaqManプローブ：5'-FAM-ACAGTGCCCCGCCGAAGGAGA-TAMRA-3'(配列番号４１)

ＣＹＰＡ(シクロフィリン−Ａ、Acc. Nr)：NM_021130
リバースプライマー：5'-TCGAGTTGTCCACAGTCAGCA-3'(配列番号４２)
フォワードプライマー：5'-GCGCTTTGGGTCCAGGA-3'(配列番号４３)
TaqManプローブ：5'-FAM-TGGCAAGACCAGCAAGAAGATCACCA-TAMRA-3'(配列番号４４)
実時間ＰＣＲ反応のために、２５ng 全ＲＮＡの６μl 水溶液を０.３３μl ５'および３'プライマー(各１０μM)、０.３３μl TaqManプローブ(５μM)、６.３３μl RT PCR Master Mix Kit(Eurogentec, # RT-QRT-032X)と、総量１３μlで製造業者の指示に従い混合する。逆転写および実時間ＰＣＲを、ABI PRISM配列ディデクター５７００または７７００(Applied Biosystems)で、下記の通り行う：３０分、４８℃で逆転写、１０分、９５℃で変性、続いて５０サイクルの１５秒、９５℃の変性ならびに１分、６０℃でのアニーリングおよび伸長。遺伝子発現の相対的用量を、ABI PRISM 5700 user bulletin #2に記載の通り、delta-Ct法で計算する。
６. ウェスタン・ブロット法
細胞溶解物を、製造業者(Pierce, Rockford, IL)により提供されたプロトコールに従い、Ｍ−ＰＥＲ哺乳動物タンパク質抽出試薬中に調製する。１０μg 全タンパク質抽出物を８％の予め作製されたアクリルアミドゲル(NOVEX, San Diego, CA)に載せ、電気泳動分離後、ＰＶＤＦ膜に移す。ＴＢＳＴ−５％粉乳中に膜を飽和させた後、タンパク質をＴＢＳＴ−５％粉乳で希釈した関連する一次抗体で免疫染色する。次に、本膜を３回ＴＢＳＴで濯ぎ、適当な二次抗体との３０分のインキュベートのために、またＴＢＳＴ−５％粉乳に溶解する。次に、本膜を３回ＴＢＳＴで洗浄し、ＥＣＬウェスタン・ブロット検出試薬(Amersham Biosciences)を、製造業者のプロトコールに従い使用して免疫染色を可視化する。
一次抗体に使用する希釈はマウス抗ＨＩＦ−１ａ(BD Biosciences/Pharmingen 610958)について１：２５０、マウス抗β−アクチン(Sigma A5441)について１：１００.０００、ウサギ抗ＡＲＮＴ(アリール炭化水素受容体核運搬体、Novus NB 730-H)について１：２０００、ウサギ抗ＧＬＵＴ１(グルコース輸送体ABCAM ab652)について１：５００、ウサギ抗ＨＩＦ２ａ−ＥＰＡＳ１(Novus ab199 Cat. No. 730-H)について１：１'０００である。
二次抗体について、ヤギ抗マウスＩｇＧ(Ｆａｂ特異的)−ペルオキシダーゼ抗体(Sigma A2304)を１：１：５'０００−２０'０００の希釈で、またはウサギＩｇＧ(ＨＲＰ結合)Novus Catalog Number NB 730-Hに対するヤギポリクローナル抗体を１：２０'０００の希釈で使用する。
７. ＶＥＧＦ分泌の定量
分泌されたＶＥＧＦを、ヒトＶＥＧＦ用の酵素吸着免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)キット(R&D Systems)を製造業者の指示に従って使用して、決定する。
８. Ｅ２−ＥＰＦ５ ｓｉＲＮＡの特徴付け
Ｅ２−ＥＰＦ５特異的遺伝子阻害剤の特徴付けのために、ＮＣＩ−Ｈ１２９９およびＨｅＬａ細胞をＥ２−ＥＰＦ５ ｓｉＲＮＡに暴露し、Ｅ２−ＥＰＦ５ ｍＲＮＡの阻害を、TaqMan RT-PCRにより試験する。Ｅ２−ＥＰＦ５ ｍＲＮＡは、両方の細胞系において、各々７２時間および４８時間ｓｉＲＮＡ インキュベーション後に、７０から９０％減少する。ミスマッチおよび無関係コントロールｉＲＮＡはＥ２−ＥＰＦ５遺伝子発現に影響しない。同じ方法で、Ｎ−末端をＨＩＳ−ＦＬＡＧエピトープで標識した組み換えＥ２−ＥＰＦ５を発現するＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞をＥ２−ＥＰＦ５ ｓｉＲＮＡおよびコントロールに暴露する。全てのマッチｓｉＲＮＡは、Ｅ２−ＥＰＦ５タンパク質レベルを、コントロールと比較して特異的に低下させ、１７８２８が強い減少を示す。
９. Ｅ２−ＥＰＦ５は低酸素中のＶＥＧＦ発現を抑制する
オリゴヌクレオチドのトランスフェクションに感受性であることが報告されているＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＨｅＬａおよびＤＵ−１４５細胞系を低酸素刺激化合物：デスフェリオキサミン(ＤＦＯ)、塩化コバルト(ＣｏＣｌ２)およびＮ−オキサリルグリシンに暴露する。結果は、ＮＣＩ−Ｈ１２９９およびＨｅｌａ細胞において、ＤＦＯが、６時間および２４時間後、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡを４−７倍およびＶＥＧＦタンパク質を２−３倍一貫して誘発することを証明する。ＣｏＣｌ２による誘発の程度は、一貫性は低いが、同程度であり、長時間刺激後、減少する。Ｎ−オキサリルグリシンは、ＶＥＧＦ発現を、とりわけ６時間後に著しく誘発する。ＶＥＧＦ ｍＲＮＡおよびタンパク質(２ng 分泌ＶＥＧＦタンパク質／時間／１００万細胞)の発現の規定レベルは、試験した他の２種の細胞系(ＮＣＩ−Ｈ１２９９：３１８±４０pg ＶＥＧＦ／時間、１０６細胞；ＨｅＬａ：３０１±６０pg ＶＥＧＦ／時間、１０６細胞)よりも、ＤＵ−１４５において約１０倍高い(２１６０±１２０pg ＶＥＧＦ／時間、１０６細胞)ことが判明した。ＲＮＡで２−３倍およびタンパク質レベルで１.３−１.５倍の著しいＶＥＧＦ誘導が全インデューサーで、２４時間刺激後でなく、６時間刺激後にのみ証明できる。顕著なことに、適用した条件下で、Ｅ２−ＥＰＦ５ ｍＲＮＡは、試験した細胞系の何れでも著しい調節はされないことが判明した。
ＨＲＥレポーター遺伝子アッセイの結果を確認するために、内因性ＨＲＥ駆動型標的遺伝子、とりわけ血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)の発現に対するＥ２−ＥＰＦ５のｓｉＲＮＡ介在阻害を試験する。ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞を３日間Ｅ２−ＥＰＦ５ ｓｉＲＮＡに暴露し、その後６時間ＤＦＯおよびＣｏＣｌ２各々に暴露する。表４に示す通り、全Ｅ２−ＥＰＦ５ ｓｉＲＮＡは、対応するミスマッチおよび無関係コントロールオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした細胞と比較して、ＶＥＧＦ分泌の著しい減少を誘発する。Ｅ２−ＥＰＦ５ ｓｉＲＮＡの抑制に対する観察された活性と一直線になって、１７８２８が分泌ＶＥＧＦの最も著しい抑制をもたらす。低酸素誘発剤としてＤＦＯの代わりにＣｏＣｌ２を使用して、同じ結果が得れる。
Figure 2008516953
 表４：ＶＥＧＦの分泌に対するｓｉＲＮＡ−介在Ｅ２−ＥＰＦ５阻害の影響。ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞を６０nMのＥ２−ＥＰＦ５に対するｓｉＲＮＡ、対応するミスマッチコントロールおよび無関係コントロールｓｉＲＮＡ ８５４８でトランスフェクトする。７２時間後、細胞を、非処置８５４８コントロールと比較しながら、１５０μM ＤＦＯと６時間インキュベートする。馴化培地中のＶＥＧＦタンパク質濃度をＥＬＩＳＡにより測定し、核ウェルにおける総タンパク質量あたり、pg／mlで表す。
最も強力なＥ２−ＥＰＦ５ ｓｉＲＮＡ １７８２８を適用したさらなる分析は、ＮＣＩ−Ｈ１２９９およびＨｅＬａ細胞系の両方において、Ｅ２−ＥＰＦ５の阻害が、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの低酸素誘発発現および低酸素誘発ＶＥＧＦタンパク質の分泌を減少させることを確認する。低酸素ＶＥＧＦ ｍＲＮＡおよびタンパク質の逆戻りは、正常酸素培養細胞で観察されるレベルまでほぼ完全であり、転写因子ＨＩＦ−１ａを標的とするコントロールｓｉＲＮＡの場合もそうである。
加えて、表５に示す通り、Ｅ２−ＥＰＦ５下方制御は、他の内因性Ｈｉｆ−１標的遺伝子、すなわちＧＬＵＴ−１(グルコース輸送体１)を阻害するが、一方Ｈｉｆ−１ ｍＲＮＡは明白には変化しない。これは、Ｅ２−ＥＰＦ５抑制が、Ｈｉｆ−１自体の転写に影響することなく、ＨＲＥ駆動型遺伝子のＨｉｆ−１介在転写活性化を阻害することを示唆する。
Figure 2008516953
 表５：Ｅ２−ＥＰＦ５のｓｉＲＮＡ介在阻害は、ＨＩＦ−１ａを標的とするｓｉＲＮＡと同程度までＧＬＵＴ−１ ｍＲＮＡの低酸素誘発発現を抑制する。ＨｅＬａ細胞を４０nMのＥ２−ＥＰＦ５(１７８２８)、ＨＩＦ−１ａ(２５５６０)に対するｓｉＲＮＡ、対応するミスマッチコントロール(Ｅ２−ＥＰＦ５：２５２９６、Ｈｉｆ−１α：２５５８４)および無関係コントロールｓｉＲＮＡ ８５４８でトランスフェクトする。７２時間後、細胞を、非処置８５４８コントロールと比較しながら、１５０μM ＤＦＯと６時間インキュベートする。ＧＬＵＴ−１ ｍＲＮＡをTaqMan ＲＴ−ＰＣＲでアッセイする。
１０. Ｅ２−ＥＰＦ５および細胞増殖の発現
Ｅ２−ＥＰＦ５はユビキチン結合酵素(Ｅ２)をコードする。Ｅ２は、リン酸化と同様、ユビキチンを細胞タンパク質に結合させ、それによりそれをプロテアソーム分解の標的にするか、それらの機能を調節する。ユビキチン経路は、多数の細胞サイクルタンパク質の調節により細胞生育および増殖の制御に重要な役割を有し(Bashier et al, 2003)、ユビキチン化の多くの成分は、種々の癌において機構的に調節解除され、変異し、もしくは増幅しおよび／または悪い予後と相関することが判明している。種々のヒト組織におけるＥ２−ＥＰＦ５の発現を、Ｅ２−ＥＰＦ５特異的プライマーを使用したTaqMan実時間ＰＣＲにより、試験する。Ｅ２−ＥＰＦ５は、胸腺および精巣でわずかに上方制御され、細胞増殖とＥ２−ＥＰＦ５の発現の間の関係の可能性を示唆する(表６)。
Figure 2008516953
 表６：種々の組織におけるＥ２−ＥＰＦ５ ｍＲＮＡ発現(Clontech)。組織分布を、Ｅ２−ＥＰＦ５に特異的なプライマーを使用したTaqMan実時間ＰＣＲでアッセイする。
１１. ベクターｐＤＯＮＲ２０１へのヒトＥ２−ＥＰＦ５ ｃＤＮＡのクローニング
Ｅ２−ＥＰＦ５ ｃＤＮＡを、２連続的ＰＣＲ反応により、その後GatewayＴＭドナーベクターに挿入することによりクローン化する。最初のＤＮＡ増幅をヒト胎児肝臓組織(Clontech)からの１ngのQuick-CloneＴＭ ｃＤＮＡの存在下、各１０pmoleのＥ２−ＥＰＦ５特異的ＰＣＲ プライマー(フォワード：ATC GAA GGT CGT ATG AAC TCC AAC GTG GAG AAC CTA CCC CCG(配列番号４５)、リバース：TCA CTT GTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC CAG CCG CCG CAG CGC CCG CAG CGC CCG(配列番号４６))、各１０nmoleのｄＮＴＰ、２mM ＭｇＳＯ２、５０μlのＥｘ ＴａｑＴＭ緩衝液中の５ＵのＴａＫａＲａ Ｅｘ ＴａｑＴＭ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、サーモサイクラー・ブロック中、５０μl鉱油と重層して行う。ＰＣＲサイクリング条件は下記の通りである：９４℃で１０分、［９４℃で１分、６２℃で１分、７２℃で１分］３０サイクル、７２℃で１０分、次いで１０℃保留。ＰＣＲ産物をＰＡＧＥにより分析した。ＤＮＡをアガロースから、Gene Clean IIキットにより溶出する。弱いＤＮＡバンドを、同じプロトコールにより再増幅する。増幅ＰＣＲ産物の典型的収量は、５０μl Ｈ２Ｏ中約８μg ＤＮＡである。本ＰＣＲ産物は、５'−ＦＸａ部位特異的Ｅ２配列−ＦＬＡＧ標識−３'から成る。２回目のＤＮＡ増幅を、最初のＰＣＲ反応からの１００ng鋳型ＤＮＡ、各１００pmoleのＰＣＲプライマーＡＴＴＢ１ＦＸＡ２(GGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC TTA GCT GGT ATC GAA GGT CGT ATG(配列番号４７))およびＡＴＴＢ２ＦＬＡＧ(GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTA TCA CTT GTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC(配列番号４８))、各２０nmoleのｄＮＴＰ、２mM ＭｇＳＯ４、１０％ＤＭＳＯ、１００μl緩衝液(１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８.８、２５mM ＫＣｌ、５mM(ＮＨ４)ＳＯ４)中２.５ＵのＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、サーモサイクラー・ブロック中、１００μl鉱油と重層して行う。ＰＣＲサイクリング条件は下記の通りである：９４℃で２分、［９４℃で１分、６５℃で１分、７２℃で１分］２サイクル、［９４℃で１分、６０℃で１分、７２℃で１分］２サイクル、［９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分］３０サイクル、７２℃で２分、次いで１０℃保留。ａｔｔ−ＰＣＲ産物をＰＡＧＥで分析する。ＤＮＡを、PCR Purificationキット(Qiagen)でクローニングのために精製した。典型的に、増幅ａｔｔ−ＰＣＲ産物の収量は、５０μl Ｈ２Ｏ中７−８μg ＤＮＡである。ａｔｔ−ＰＣＲ産物は、５'−ＡＴＴＢ１−ＦＸａ部位特異的Ｅ２配列−ＦＬＡＧ標識−ＡＴＴＢ２−３'から成る。ａｔｔ−ＰＣＲ産物を、GatewayＴＭドナーベクターｐＤＯＮＲ２０１にクローン化する。BP ClonaseＴＭ酵素混合物は、部位特異的および配向特異的インビトロ組み換え反応を、ａｔｔＢ１／Ｂ２(ＰＣＲ産物)およびａｔｔＰ１／Ｐ２(ベクター)部位を介して触媒する。本反応混合物(２０μL)は、ＢＰ緩衝液(提供された通り)、２００ng ａｔｔ−ＰＣＲ ＤＮＡ、３００ng ｐＤＯＮＲ２０１ベクターおよび４μL BP ClonaseＴＭ酵素混合物を含む。１時間、２５℃の後、プロテイナーゼＫ(２μg／μL)を添加し、サンプルを１０分、３７℃でインキュベートする。１μLを、コンピテントＤＨ５ａ大腸菌細胞の形質転換に使用する。形質転換体をカナマイシン(５０mg／Ｌ)添加ＬＢプレートで選択する。クローンを、制限酵素を使用しておよびＤＮＡ配列決定により特徴付けする。適当なクローンをｐＢＭ２５３７／ＮＰＬ００２９８１と命名する。
１２. Ｅ２−ＥＰＦ５ｃＤＮＡのGateway ＴＭ 発現ベクターｐＤＥＳＴ１２.２へのクローニング
ClonaseＴＭ LR酵素混合物は、GATEWAY LR組み換え反応を、ａｔｔＬ１／Ｌ２(ｐＢＭ２５３７エントリークローン)およびａｔｔＲ１／Ｒ２(ｐＤＥＳＴ１２.２ベクター)部位を介して介在する。本反応混合物(２０μL)は、ＬＲ緩衝液(製造業者により提供されたまま)、２００ngエントリークローン(ｐＢＭ２５３７)ＤＮＡ、３００ng発現ベクター(ｐＤＥＳＴ１２.２、GIBCO-BRL-Invitrogen Corp)および４μL LR ClonaseTＭ酵素混合物を含む。１時間、２５℃後、プロテイナーゼＫ(２μg／μL)を添加し、サンプルを１０分、３７℃インキュベートする。１μLをコンピテントＤＨ５ａ細胞の形質転換に使用した。形質転換体を、アンピシリン(５０mg／Ｌ)添加ＬＢプレートで選択する。クローンを、制限酵素を使用しておよびＤＮＡ配列決定により特徴付けする。適当なクローンをｐＤＥＳＴ−ＥＰＦ５／ＮＰＬ００６６５３と命名する。
１３. ＮＣＩ−Ｈ１２９９のｐＤＥＳＴタイプ発現プラスミドでのトランスフェクション
培地、胎児ウシ血清(ＦＣＳ)、ヴェルセン、リポフェクチン、ジェネテシンをLife Sciences Inc.から購入する。使用する細胞培養ペトリ皿(ｄ＝８cm)は、Falcon type 3003であり、６ウェル、２４ウェルおよび９６ウェルマルチディッシュをNunc(Life Sciences Inc.)から得る。ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞(ＣＲＬ−５８０３)はAmerican Type Culture Collection(ATCC)から得ることができる。細胞を３７℃で５％ＣＯ２含有加湿雰囲気中、１０％ＦＣＳおよび６０μg／mlゲンタマイシン添加ＲＰＭＩ１６４０中に維持する。培養物を繁殖させるために、細胞を毎週分ける：すなわちヴェルセンで２回洗浄し、５分、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で処理し、元の培地容量の１５倍に希釈し、１０ml／８cm組織培養皿または２０ml／７５cm２ Ｔ−フラスコに再播種する。３−４日間後、０.５容量の培地を、栄養源を補充するために添加する。ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞を、リポフェクタミンプラス試薬(Life Sciences-Invitrogen Corp.)を使用してトランスフェクトする。簡単に言うと、細胞を６ウェルマルチディッシュに６ウェル当たり１×１０５で播き、１日増殖させる。９６ウェルプレート中２ウェルで、２μg プラスミドＤＮＡ(ｐＤＥＳＴ−１２.２またはｐＤＥＳＴ−ＥＰＦ５)を１００μlのオプティメムおよび１５μlのプラス試薬と混合し、室温で１５分インキュベートする。並行して、１０μlのリポフェクタミンを１００μlのオプティメム培地と混合し、また１５分、室温でインキュベートする。その後、ＤＮＡをリポフェクタミン溶液に添加し、よく混合し、再び室温で１５分インキュベートする。その間に、ＦＣＳ含有培地を細胞から吸引し、細胞を１ml／ウェル オプティメムで濯ぎ、次いで１mlのオプティメムを各ウェルに添加する。次に、１００μlのプラスミド／プラス試薬／リポフェクタミン複合体を培地に添加し、細胞(ここでは１１５０μlの培地中)を４時間、３７℃で、加湿インキュベーター中、５％ＣＯ２下にインキュベートする。この時点で、ＤＮＡ−リポソーム混合物を細胞から除去し、２mlの新鮮ＲＰＭＩ１６４０培地(１０％ＦＣＳおよび６０μg／mlゲンタマイシン含有)を添加する。
翌日、細胞を上記の通りトリプシン処理し、３ml ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、３００、１５０、６０または３０μlの細胞懸濁液を１０％ＦＣＳおよび６０μg／mlゲンタマイシン添加した１０mlのＲＰＭＩ１６４０を含む８cmペトリ皿に播種する。翌日、１.０mg／ml ジェネテシンを添加する。週に２回、選択培地(ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳ＋１mg／ml ジェネテシン)を新鮮培地に置き換える。コロニーが２−３週間後に現れる。十分に分離した、ｐＤＥＳＴ−ＥＰＦ５で形質転換した増殖しているコロニーを含むプレートから、２４個を１００μlチップを付けたピペッターで掻き取り、同時に掻き取った細胞をチップ内に吸引する。次いで、チップからの細胞を、２４ウェルプレートに移し、０.５ml選択培地を添加する。５−１０日間後、クローン化細胞はコンフルエント単層を形成している。このようなコンフルエント２４ウェルからの細胞をトリプシン処理し、２個の２４ウェルおよび１個の６ウェルの“ウェル”に分ける。数日後、全ＲＮＡを各クローンの２４ウェルの１個から単離し、Ｅ２−ＥＰＦ５ ｍＲＮＡレベルを、実施例５に記載の通り、ＲＴ−ＰＣＲで測定する。このＲＴ−ＰＣＲは、ｐＤＥＳＴ−ＥＰＦ５の統合されたコピー(または複数のコピー)および未処置内因性Ｅ２−ＥＰＦ５ ｍＲＮＡからの、組み換えＥ２−ＥＰＦ５ ｍＲＮＡの複合レベルを測定する。ｐＤＥＳＴ−ＥＰＦ５で十分形質転換されたＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞において、複合Ｅ２−ＥＰＦ５ ｍＲＮＡは、未処置Ｈ１２９９細胞またはｐＤＥＳＴ１２.２で形質転換した細胞より２.５倍高い。３個の独立したＮＣＩ−Ｈ１２９９／ｐＤＥＳＴ−ＥＰＦ５クローンをさらに増幅する(番号１、５、および１５)。ＮＣＩ−Ｈ１２９９／ｐＤＥＳＴ−ＥＰＦ５細胞による組み換えＥ２−ＥＰＦ５の発現を、抗ＦＬＡＧエピトープ抗体(Sigma)を使用して、実施例６に記載の通りウェスタン・ブロットで確認する。コントロールとして、ｐＤＥＳＴ１２.２で形質転換したＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞の約２００コロニーを含む数個の８cmペトリ皿を、ＮＣＩ−Ｈ１２９９／ｐＤＥＳＴ−ＥＰＦ５細胞での実験のネガティブコントロールとして使用するためにトリプシン処理し、繁殖させる。
１３. ｐＤＥＳＴ−ＥＰＦ５ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞系における増加したＶＥＧＦ分泌
Ｅ２−ＥＰＦ５−ＦＬＡＧの強制的な過剰発現の効果を決定するために、実施例１２に記載の細胞系を、２４ウェルプレートに２０'０００細胞／ウェルで播種する。２０時間後、培地をＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ＦＣＳまたはＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ＦＣＳ＋１５０μM ＤＦＯに置き換える。６時間後、培地を回収し、分泌ＶＥＧＦタンパク質レベルの決定のために凍結させ(実施例７)、一方細胞から全ＲＮＡを単離し、一組のｍＲＮＡ種のレベルをＲＴ−ＰＣＲで試験する(実施例５)。上昇したレベルのＥ２−ＥＰＦ５を発現するｐＤＥＳＴ−ＥＰＦ５形質転換ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞により分泌されたＶＥＧＦタンパク質の量は、正常Ｅ２−ＥＰＦ５レベルを発現するｐＤＥＳＴ１２.２−細胞により分泌された量より、著しく多い(２±０.３倍多い)(表７)。対照的に、ＤＦＯによる誘発は本質的に未変化である(表７)。しかしながら、上昇した、基底ＶＥＧＦレベルとの組み合わせて同等なＤＦＯ誘発が、ＤＦＯ誘発後の絶対的ＶＥＧＦレベルが、上昇したレベルを発現しないＥ２−ＥＰＦ５細胞におけるＮＣＩ−Ｈ１２９９よりも２倍高いことを意味する。
Figure 2008516953
 表７：親ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞におけるレベルと比較した、ｐＤＥＳＴ１２.２およびｐＤＥＳＴ−ＥＰＦ５形質転換ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞の６時間馴化培地中のＶＥＧＦタンパク質レベル
１４. ｐＤＥＳＴ−ＥＰＦ５ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞系中のメッセンジャーＲＮＡレベル
プラスミド形質転換ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞(実施例１３)から単離された総ＲＮＡを使用して、数個のｍＲＮＡ種のレベルをＲＴ−ＰＣＲ(実施例５)により決定する。Ｅ２−ＥＰＦ５ ｍＲＮＡレベル(組み換え＋未処置Ｅ２−ＥＰＦ５ ｍＲＮＡ)は、親ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞よりも２.３−３倍高いｐＤＥＳＴ−ＥＰＦ５で形質転換した細胞中である(表８)。これは、３種の既知ＨＩＦ調節遺伝子：ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ(３８±１０％増加)、ヘキソキナーゼ−２ ｍＲＮＡ(ＨＫ２、４.９±２.５倍増加)およびＧＬＵＴ−１ ｍＲＮＡ(３.８±０.２倍増加)のｍＲＮＡの著しく上昇したｍＲＮＡにより達成される。対照的に、ＨＩＦにより調節されない多くの遺伝子のｍＲＮＡの基底レベルは、著しい変化はしない(β−アクチン、Ｂｃｌ−ｘＬ、ＣＹＰＡおよびＨＩＦ１ａ)。ＤＦＯによるＨＩＦ調節遺伝子の誘導の割合は、Ｅ２−ＥＰＦ５過剰発現細胞により変化されないが、より高い基底ｍＲＮＡレベルと正常ＤＦＯ−誘導の組合せ効果は、それにも係わらず余分なＥ２−ＥＰＦ５を発現しないＤＦＯ刺激ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞で観察されるよりも高いレベルのこれらのＨＩＦ応答ｍＲＮＡをもたらす。
Figure 2008516953
 表７：ｐＤＥＳＴ１２.２およびｐＤＥＳＴ−ＥＰＦ５形質転換ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞系中のｍＲＮＡ発現レベル(ｎ.ｄ.＝測定せず)
１５. 大腸菌中の組み換えＥ２−ＥＰＦ５−ＦＬＡＧタンパク質の産生
プラスミドｐＢＭ２５３７／ＮＰＬ００２９８１からの挿入物(実施例１１)を、GatewayＴＭシステムマニュアルに従い、ベクターｐＤＥＳＴ１７(Invitrogen Corｐ)で組み換えし、プラスミドＥ２−１２−ｆｌａｇ−ｐＤＥＳＴ１７／ＮＰＬ００６７８２を得る。本組み換えＥ２−ＥＰＦ５タンパク質のコード化アミノ酸配列は：
ＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨＬＥＳＴＳＬＹＫＫＡＧＬＩＥＧＲＭＮＳＮＶＥＮＬＰＰＨIIＲＬＶＹＫＥＶＴＴＬＴＡＤＰＰＤＧＩＫＶＦＰＮＥＥＤＬＴＤＬＱＶＴＩＥＧＰＥＧＴＰＹＡＧＧＬＦＲＭＫＬＬＬＧＫＤＦＰＡＳＰＰＫＧＹＦＬＴＫＩＦＨＰＮＶＧＡＮＧＥＩ
ＣＶＮＶＬＫＲＤＷＴＡＥＬＧＩＲＨＶＬＬＴＩＫＣＬＬＩＨＰＮＰＥＳＡＬＮＥＥＡＧＲＬＬＬＥＮＹＥＥＹＡＡＲＡＲＬＬＴＥＩＨＧＧＡＧＧＰＳＧＲＡＥＡＧＲＡＬＡＳＧＴＥＡＳＳＴＤＰＧＡＰＧＧＰＧＧＡＥＧＰＭＡＫＫＨＡＧＥＲＤＫＫＬＡＡＫＫＫＴＤＫＫＲＡＬＲＡＬＲＲＬＤＹＫＤＤＤＤＫ(配列番号４９)である。
このプラスミドを、大腸菌中での組み換えＥ２−ＥＰＦ５の発現に使用する。Ｎ末端６−ＨＩＳ標識を介して、それは標準金属−キレート親和性クロマトグラフィーにより精製でき、これにより標識されたＥ２−ＥＰＦ５の９５％を超える純度の調製物をもたらす。これはインビトロ自己ユビキチン化アッセイにおいて活性であり、Ｃ末端ＦＬＡＧ−標識ペプチド配列(ＤＹＫＤＤＤＤＫ)に対する抗体を使用して検出できる。
１６. 組み換えＥ２−ＥＰＦ５−ＦＬＡＧタンパク質に対するウサギ抗体の産生
ウサギを０.２mgの大腸菌由来組み換えＥ２−ＥＰＦ５(実施例１５)のフロインド完全アジュバントとの皮下注射、続く０.１mg タンパク質とフロインド不完全アジュバントでの１週間間隔でのブーストにより免疫化する。２０−３０ml血液を５、６、７、８および９週間後に採取し、その後、１０週間後に１００−１２０ml血液の最終採血をして、それから血清を調製する。最終採血した血清から、ポリクローナル抗Ｅ２−ＥＰＦ５抗体を、固定化組み換えＥ２−ＥＰＦ５上の親和性クロマトグラフィーにより精製する。簡単に言うと: Harlow, E. and Lane, D. Using Antibodies: A Laboratory Manual, (1999) Cold Spring Harbor NY Cold Spring Harbor Press, pp. 522-523に記載の通り、組み換え大腸菌由来(ＦＬＡＧ標識)Ｅ２ＥＰＦ５(実施例１５)を、抗ＦＬＡＧセファロースに、ホウ酸緩衝液中のジメチルピメリミデート中共有結合させた。Ｅ２−ＥＰＦ５特異的抗体を単離するために、１.５ml粗ウサギ抗Ｅ２−ＥＰＦ５血清をＰＢＳで平衡化した１５０マイクロリットル包装ビーズに適用する。非結合抗体を過剰のＰＢＳで除去する。抗Ｅ２−ＥＰＦ５抗体をグリシン−ＨＣｌ ０.２Ｍ(ｐＨ２.５)を使用して溶出し、直ぐに１／１０容量のＴｒｉｓ−ＨＣｌ １Ｍ ｐＨ９の添加により中和して、４℃で貯蔵する。
１７. マウス腫瘍組織中のＥ２−ＥＰＦ５の検出
染色に使用した腫瘍は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで増殖させたＢ１６ＢＬ６黒色腫である。体重１７〜２０ｇの雌、黒色、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをIffa Credo(L'Arbresle, France)動物繁殖施設から得る。それらを尾の印により識別し、通常の条件下でグループ(６−７動物／ケージ)のままにし、毎日観察する。処置群あたり、６匹のマウスを使用する。メラニンを産生するマウス黒色腫腫瘍細胞系Ｂ１６／ＢＬ６は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの自発的腫瘍由来であり、非常に特徴付けされており、Dr. Isaiah J.Fidler, Texas Medical Center, Houston, USAから得ている。全実験において使用した培養した腫瘍細胞は、マイコプラズマが存在しない。それらを３７℃および５％ＣＯ２でＭＥＭ(MEM EBS, AMIMED, Allschwil)中、５％胎児ウシ血清、１％ピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸および２％ビタミンを添加した安定なグルタミンと共に培養し、コンフルエンシーまで増殖させる。その後、それらを０.２５％トリプシン−０.０２％ＥＤＴＡ(２分、３７℃)で離し、次いで処理する。生存能をトリパンブルー排泄により評価し、＞９０％生存能の懸濁液のみを使用する。腫瘍細胞をハンクス緩衝液に再懸濁し、５×１０４細胞／μlの懸濁液を免疫コンピテント同系Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスの耳に皮内(ｉ.ｄ.)注射する。腫瘍細胞注射のために、麻酔を３％イソフルラン(Forene, Abbott AG, Cham, Switzerland)吸入により誘導する。動物を、３９℃の温度に維持した、温めた手術場所に置き、両面スティッカーを貼ったスチール製コーン上に耳を優しく広げる。顕微鏡の助けを借りて、３０Ｇ皮下針を次いで耳の末端に入れ、皮下平面中に４−５mm奥まで進み、腫瘍細胞の針挿入点から遠位の部位への送達を可能にする。注射部位は、第一および第二神経血管束の間の耳の背側に常に位置する。マイクロリットルシリンジ(２５０μl、Hamilton, Bonaduz, Switzerland)を使用して、１μlの腫瘍細胞懸濁液(５×１０４細胞)をマウス耳の皮下平面に注射し、２×２mm 皮下水疱を形成させる。１週間後、原発腫瘍は発育し始め、黒色斑点を耳の中程に容易に見ることができる。原発腫瘍サイズを７、１４および２１日目にモニターした。３週間後(２１日目)、動物をＣＯ２吸入により殺し、頸部リンパ節を秤量し、４.２％ホルムアルデヒド中に固定し、パラフィン中に包埋する。
５μm パラフィン切片(Microtome, MICROMで調製)をSuperFrost+(Menzel)スライド・ガラス上に置き、一晩３７℃で乾燥させ、５分、５９℃でホットプレート上で加熱する。切片をキシレン中２回脱蝋し、漸減エタノール溶液(１００％、９５％、９０％、７０％)中で再水和し、ｄｄ水で濯ぎ、その後高温抗原非マスキング法に付す。切片を０.１ｍ クエン酸Ｎａ ｐＨ６.０中、マイクロ波処理(１４分間、９８℃まで加熱、１０分間、９８℃に維持；Milestone #T/TMEGA)する。切片を室温に冷却し、２回蒸留水(ｄｄＨ２Ｏ)中で濯ぎ、ＰＢＳに浸す。内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックするために、切片を３０分、０.３％Ｈ２Ｏ２のＰＢＳ溶液中でインキュベートし、ＰＢＳで濯ぐ。非特異的抗体結合をブロックするために、切片を２０分、１.５％ヤギ血清(Vector Laboratories)含有ＰＢＳと室温で、加湿チャンバー中インキュベートする。ブロッキング血清を吸い取り(blotted off)、切片を、１時間、０.１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで希釈した一次抗体(０.５−１.０μg／ml ポリクローナルウサギ抗ＥＰＦ５)とインキュベートする。切片を、ＰＢＳで３回、２分洗浄し、その後１.５％ブロッキング血清含有ＰＢＳで希釈した二次連結抗体(ビオチニル化ヤギ抗ウサギＩｇＧ、Vector Laboratories)とインキュベートする。切片をＰＢＳで３×２分濯ぎ、３０分、室温でアビジンホースラディッシュＨ複合体(VECTASTAIN Elite ABC kit PK-6101)とインキュベートする。切片をＰＢＳで３×２分洗浄し、５〜１０分、ベクターNovaRed(ペルオキシダーゼのための基質キット、Vector Laboratories #SK-480)で染色し、ｄｄＨ２Ｏで３×２分濯ぐ。切片を、次いで３０秒、マイヤーのヘマトキシリン(Fluka #51275)中で対比染色し、５分、水道水の流水で濯ぎ、ｄｄＨ２Ｏで濯ぎ、空気乾燥させる。切片をEukitt(Fluka #03989)でマウントし、明視野顕微鏡で分析する。
Ｂ１６ＢＬ６リンパ節転移の試験は、腫瘍の壊死の核に直ぐに隣接した腫瘍細胞の著しく強い染色を確認する。これらは、供給血管から最も遠い生存腫瘍細胞であり、これはおそらく低酸素領域である。この領域の上昇したＥ２−ＥＰＦ５タンパク質レベルは、故に腫瘍細胞の低酸素応答におけるＥ２−ＥＰＦ５の役割と一致する。低酸素応答が腫瘍細胞の生存に非常に重要であるため、Ｅ２−ＥＰＦ５の阻害は、腫瘍の増殖を妨害することが期待され、治療的に活用できる効果である。
１８. マウス眼疾患モデルにおける新血管形成の領域中のＥ２−ＥＰＦ５の検出
虚血性網膜症をＣ５７／ＢＬ６Ｊマウスで産生する(Smith et al.1994, Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci 35: 101-111.)。簡単に言うと、７日齢マウスおよびそれらの母親を、気密性インキュベーターに入れ、７５±３％酸素の雰囲気に５日間曝す(高酸素)。インキュベーター温度を２３±２℃に維持し、酸素を、酸素アナライザーで８時間毎に測定する。５日後、マウスを該インキュベーターから出し、部屋の空気中に置き、５日間、Ｐ１７の後、マウスを殺し、眼を直ぐに摘出し、最適切断温度温度の包埋化合物(OCT; Miles Diagnostics, Elkhart, IN)中で凍結し、４％リン酸緩衝化ホルムアルデヒド中に固定し、パラフィンに包埋する。高酸素に曝さなかった同じ性別かつ年齢のＣ６７ＢＬ６Ｊマウスは、コントロールとして役立つ。それらを媒体の胃管栄養法により処置し、５日後、それらを殺し、眼を凍結またはパラフィン切片のために処理する。５μm凍結切片を空気乾燥させ、１０分、４℃で乾燥アセトン中固定し、ＰＢＳで濯ぐ。内因性組織ペルオキシダーゼ活性を、切片を３０分、０.３％Ｈ２Ｏ２のＰＢＳ溶液でインキュベートすることによりブロックする。切片を濯ぎ、２０分、１.５％ヤギ血清含有ＰＢＳとインキュベートする。その後の続く免疫染色工程は、１７に記載の通りに行う。パラフィン切片中のＥＰＦ５の免疫染色は、１７に記載の通りに行う。組織スライドの試験は、血管細胞それ自体を含むＲＯＰ眼における病的新血管形成の領域における高レベルのＥ２−ＥＰＦ５染色を確認するが、コントロール眼における対応する領域にはない。低酸素に応答した組織中の上昇したレベルのＥ２−ＥＰＦ５タンパク質の観察は、細胞低酸素応答におけるＥ２−ＥＰＦ５の役割と一致する。逆に、マウスが、高いないし通常の酸素レベルから移されたときに経験した相対的低酸素のために、網膜の異常な血管形成が起こる。この未熟児網膜症モデル(ＲＯＰ)は、広く使用されている網膜血管形成モデルである。Ｅ２−ＥＰＦ５の阻害が、この低酸素応答を妨害し、この効果はいくつかの疾患状態に有用であると考えられる。
配列番号１
Figure 2008516953
 配列番号２
Figure 2008516953

Claims (19)

  1. ユビキチン結合酵素Ｅ２−ＥＰＦ５をコードする遺伝子の発現を阻害するかまたはＥ２−ＥＰＦ５遺伝子産物の活性を阻害する有効量の薬剤を投与することを含む、異常な新血管形成に関連する疾患の処置法。
  2. 該異常な新血管形成がＶＥＧＦ依存性血管形成である、請求項１に記載の方法。
  3. 該ＶＥＧＦ依存性血管形成が腫瘍における血管形成、リウマチ性関節炎における滑膜血管形成、糖尿病性網膜症で観察される眼新血管形成、乾癬における皮膚血管形成、または肝硬変における低酸素誘発血管形成である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 該薬剤が、ユビキチン結合酵素Ｅ２−ＥＰＦ５を特異的に阻害できる阻害性核酸である、請求項１、２または３に記載の方法。
  5. 該阻害性核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡである、請求項４に記載の方法。
  6. 該薬剤が、ユビキチン結合酵素Ｅ２−ＥＰＦ５に特異的に結合する抗体である、請求項１、２または３に記載の方法。
  7. ユビキチン結合酵素Ｅ２−ＥＰＦ５をコードする遺伝子の発現を阻害するかまたはＥ２−ＥＰＦ５遺伝子産物の活性を阻害する有効量の薬剤および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  8. 該Ｅ２−ＥＰＦ５阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡである、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 該Ｅ２−ＥＰＦ５阻害剤がユビキチン結合酵素Ｅ２−ＥＰＦ５に特異的に結合する抗体である、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. (ａ)ユビキチン結合酵素Ｅ２−ＥＰＦ５と試験化合物を接触させ
    (ｂ)ユビキチン結合酵素Ｅ２−ＥＰＦ５生物活性の調節を検出する
    工程を含む、異常な新血管形成の阻害に有用な化合物の同定法。
  11. ｉ)試験化合物とユビキチン結合酵素Ｅ２−ＥＰＦ５を、Ｅ２−ＥＰＦ５生物活性に許容的なサンプル条件下で接触させ；
    ii)該少なくとも１種のＥ２−ＥＰＦ５生物活性を測定し；
    iii)該レベルを、該試験化合物を欠くコントロールサンプルと比較し；そして、所望により、
    iv)血清グルコース調節不全または代謝障害を伴う疾患の予防的および／または治療的処置のための治療剤としての可能性についてさらに試験するために、該レベルの変化をもたらす試験化合物を選択する
    工程を含む、異常な新血管形成に関連する疾患の処置に有用な化合物の同定法。
  12. 該Ｅ２−ＥＰＦ５生物活性が減少する、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 異常な血管形成が腫瘍における血管形成、リウマチ性関節炎における滑膜血管形成、糖尿病性網膜症で観察される眼新血管形成、乾癬における皮膚血管形成、または肝硬変における低酸素誘発血管形成である、請求項１２に記載の方法。
  14. 請求項１０から１３の何れか１項に記載の方法により同定された、化合物。
  15. ユビキチン結合関連酵素Ｅ２−ＥＰＦ５の発現の阻害を含む、ＨＩＦ−１調節発現の阻害法。
  16. 該ＨＩＦ−１調節遺伝子がＧＬＵＴ−１、ＧＬＵＴ−３、ＨＫ２、ＥＰＯ、ＮＯＳ２、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、ＶＥＧＦＲ−２、Ｃ−Ｍｅｔ、ＵＰＡＲ、ＣＸＣＲ４、炭酸脱水酵素IX(ＣＡＩＸ)から成る群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 該ＨＩＦ−１調節遺伝子がＶＥＧＦである、請求項１５に記載の方法。
  18. ユビキチン結合関連酵素Ｅ２−ＥＰＦ５の発現阻害を含む、腫瘍血管形成の阻害法。
  19. 該阻害が阻害性核酸または抗体を介して行われる、請求項１５に記載の方法。
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