CN115554314B - 用于抗肝纤维化的蛋白锰组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种蛋白锰组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用，所述蛋白锰组合物为蛋白包裹的疏水的二价锰纳米粒。本发明的蛋白锰组合物纳米粒具有靶向性好，显著延长的肝脏富集时间，性质稳定，生物安全性高等优点。

Description

用于抗肝纤维化的蛋白锰组合物

技术领域

本发明涉及纳米生物医药领域，具体涉及用于抗肝纤维化的蛋白锰组合物及其制备方法。

背景技术

慢性组织损伤导致了持续的瘢痕反应，逐渐破坏正常的细胞功能单位，最终导致肝、肺和肾等多个上皮器官衰竭，据估计，这占全世界死亡人数的三分之一。继发于任何病因的反复肝损伤都会导致进行性纤维化，最终导致肝硬化。研究表明全世界有8.44亿人患有慢性肝病，每年有200万人死亡，而且发病率还在上升。目前尚缺乏直接针对和逆转晚期肝纤维化的获批的治疗方法，终末期肝病患者最有效的治疗方法依然是肝移植。针对肝纤维化的药物研发仍然是重中之重。

衰老在正常发育和健康中起着关键作用，急性细胞衰老和衰老相关分泌表型（SASP）与组织修复、免疫招募及细胞重塑等过程息息相关。然而，在慢性衰老中，作为慢性炎症的一个来源，SASP也促进组织老化和年龄相关的疾病，包括组织纤维化。在肝纤维化背景下，衰老的活化肝星状细胞（aHSCs）显示出与细胞周期退出、细胞外基质（ECM）分泌减少、基质金属蛋白酶（MMPs）分泌增强和免疫监测增强相一致的基因表达谱，这表明了aHSCs的衰老对肝纤维化治疗具有重要的意义。同时，SASP的产生和分泌可能是募集免疫细胞的有效手段。针对不同的应激源，衰老细胞通过分泌SASP募集巨噬细胞，自然杀伤（NK）细胞，嗜中性粒细胞和T淋巴细胞来清除衰老细胞，但是衰老细胞也可以与免疫细胞相互作用以避免被清除，随着时间的推移，衰老细胞的免疫逃逸会导致其在组织中的积累，并引起慢性炎症，加重与衰老有关的疾病。

研究表明，清除衰老细胞有助于缓解衰老相关疾病。因此，目前许多研究致力于开发清除衰老细胞的药物“senolytics”，然而，这些药物也会带来受损的组织修复和免疫监测等副作用。尽管后来出现的选择性抑制SASP而不影响衰老相关生长阻滞的药物“senomorphics”展现出了较少的副作用，但如何在不影响免疫监测的同时清除衰老细胞仍然是一个亟待解决的科学问题。

目前，在肝纤维化领域，研究报道的诱导HSCs衰老的方法主要有作用于PPARγ/P53信号通路的姜黄素、作用于P21/53BP1的依托泊苷、作用于STAT3/P53通路的IL10、作用于STAT3/SOC3/P53通路IL22、以及作用于SKP2/P27通路的日本血吸虫卵抗原p40等。但这些研究都局限于简单的诱导HSCs衰老，而忽视了衰老细胞的清除这一重要方面，使其在临床转化过程中不能达到满意的效果，导致转化失败。此外，细胞因子类型的药物，如白细胞介素的缺点是成本昂贵。

最近，研究表明cGMP-AMP合成酶（cGAS）-干扰素基因刺激因子（STING）信号通路是SASP的重要调节因子。敲除STING基因可减少HSCs中SASP因子的产生，并减弱小鼠模型中肥胖相关HCC的发展。然而，也有研究表明，抑制cGAS-STING信号通路会损害衰老肝细胞和癌前肝细胞的免疫监视，导致肝脏肿瘤发生。因此，cGAS‐STING通路的功能似乎取决于生物环境。虽然短期暴露于SASP因子可以促进免疫监测和预防肿瘤发生，但持续暴露于SASP因子可能导致组织损伤和与肿瘤生长相关的慢性炎症。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种用于抗肝纤维化的蛋白锰组合物及其制备方法。本发明利用Mn²⁺增强cGAS-STING介导的免疫反应，且Mn²⁺可以不依赖DNA直接激活cGAS，通过Mn²⁺激活cGAS-STING信号通路，在诱导活化的HSCs衰老的同时，使“慢性炎症急性化”，利用增强的免疫清除作用解除SASP的持续暴露状态。

本发明抗肝纤维化的蛋白锰组合物形成的纳米粒在水溶液中稳定，粒径分布均匀，能够显著延长锰在肝脏富集时间，具有器官、细胞双重选择性，生物安全性高。

为了实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：

一种蛋白锰组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用，所述蛋白锰组合物为蛋白包裹的疏水的二价锰纳米粒。疏水的二价锰除了能够与蛋白形成稳定的纳米粒复合物之外，疗效和安全性也更高。

优选的，所述疏水二价锰和所述蛋白的质量比为0.02%~11%:1；优选为2%~6%:1。

优选的，所述纳米粒的粒径为10nm~1000nm，优选为50nm~500nm。

优选的，所述蛋白为白蛋白、转铁蛋白、膜铁转运蛋白、α-2-巨球蛋白、γ-球蛋白、二价金属转运蛋白1、血红蛋白、肌红蛋白、免疫球蛋白、纤维连接蛋白、纤层蛋白、胶原蛋白中的一种或几种。优选为白蛋白、转铁蛋白、膜铁转运蛋白、α-2-巨球蛋白或γ-球蛋白中的一种或几种。

优选的，所述疏水的二价锰为氢氧化锰、碳酸锰、磷酸锰、硫化锰或草酸锰中的一种或几种。优选为氢氧化锰。

所述蛋白锰组合物是由如下制备方法之一得到的：

其一：将含有能够形成疏水的二价锰的阴离子的第二溶液加入到含有蛋白和二价锰离子的第一溶液中，使二价锰形成疏水颗粒并与蛋白自组装形成所述纳米粒；

其二：将疏水的二价锰纳米粒的悬浊液与蛋白混合并超声处理，即得。

优选的，所述第一溶液的溶剂为水。所述第一溶液中还可以含有NaCl（即以生理盐水为溶剂）、N-乙酰色氨酸钠、辛酸钠、糖、冻干保护剂或蛋白稳定剂。

所述的冻干保护剂是磷酸盐、醋酸盐、甘氨酸或三羟甲基氨基甲烷中的一种或几种。

所述的蛋白稳定剂是海藻糖、甘露醇、蔗糖、乙酰色氨酸或辛酸钠中的一种或几种。

优选的，所述二价锰离子源自氯化锰、硫酸锰、碘化锰或硝酸锰中的一种或几种。优选为氯化锰。

优选的，所述能够形成疏水的二价锰的阴离子为氢氧根、碳酸根、磷酸氢根、硫离子或草酸根中的一种或几种。优选为氢氧根。

优选的，所述制备方法还包括将得到的纳米粒在超声条件下处理的步骤。超声可使纳米粒粒径分布更均匀。

优选的，所述制备方法还包括将得到的反应混合物透析除去小分子化合物或者浓缩的步骤。

优选的，所述制备方法还包括将得到的纳米粒经过脱水步骤制备成药物制剂的步骤。

优选的，所述的脱水步骤为冷冻干燥、减压蒸馏或喷雾干燥。

本发明所述的抗肝纤维化包括诱导肝星状细胞衰老、抗肝星状细胞活化、抑制细胞外基质合成、增强自然杀伤细胞活性和/或细胞毒性、改善肝脏的病理或改善血清学肝功能指标。

与现有诱导肝星状细胞衰老药物相比，本发明有如下优点：

第一、本发明提供了一种全新的诱导肝星状细胞衰老的方法，丰富了抗肝纤维化治疗的理论基础；

第二、本发明提供的蛋白锰组合物赋予了锰特异性递送的能力。比如，当用白蛋白作为载体时，该组合物可以靶向到肝脏，延长锰在肝脏的蓄积时间，减少锰在脑部的蓄积；同时对肝星状细胞具有选择性，不影响肝细胞。

第三、本发明提供的蛋白锰能够增强免疫，促进衰老细胞的清除。

第四、本发明提供的蛋白锰组合物具有性质稳定，生物安全性高，无免疫原性等特点。

附图说明

下面通过对本发明的详细描述以及附图来清楚地说明本发明前面叙述的方面以及其他方面。为了举例说明本发明，在附图中的实施方案是目前优选的，然而，可以理解，本发明并不限于所公开的特定实施方案。

图1为实施例1中制得的白蛋白锰纳米粒的粒径分布图；

图2为实施例1中制得的白蛋白锰纳米粒的透射电子显微镜和能谱图；

图3为实施例1中制得的白蛋白锰纳米粒在肝星状细胞和肝细胞摄取的荧光图；

图4为实施例1中制得的白蛋白锰纳米粒诱导肝星状细胞衰老的SA-β-半乳糖苷酶染色图；

图5为实施例1中制得的白蛋白锰纳米粒抑制肝星状细胞活化和胶原生成的结果统计图；

图6为实施例1中制得的白蛋白锰纳米粒和对照游离锰在体内代谢的核磁共振图；

图7为实施例1中制得的白蛋白锰纳米粒和对照游离锰在脑内的蓄积情况统计图；

图8为实施例1中制得的白蛋白锰纳米粒和对照游离锰的体内抗肝纤维化血清学表征肝功能效果统计图；

图9为实施例1中制得的白蛋白锰纳米粒和对照游离锰的体内抗肝纤维化肝组织切片病理结果，包括马松染色、天狼星红染色；

图10为实施例1中制得的白蛋白锰纳米粒和对照游离锰在体内对自然杀伤细胞的活化和毒性的影响流式及统计图。

图11为实施例2中制得的组合物纳米粒的电镜图。

图12为实施例3中制得的组合物纳米粒的电镜图。

图13为实施例4中制得的组合物纳米粒的电镜图。

图14为实施例5中制得的组合物纳米粒的电镜图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案做进一步说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

下述实施例中所述室温指的是25~28℃。

下述实施例中采用的小鼠为BALB/c，购自扬州大学比较医学中心。

所有统计学分析采用GraphPad Prism 8进行单因素方差分析。

实施例1

1. 白蛋白锰纳米粒（Mn@ALB NPs）的合成：

200 mg 人血清白蛋白（HSA）溶于20 mL pH6的含0.5 mg/mL EDTA和0.05 M巯基乙醇的磷酸盐缓冲液，55℃反应持续两小时，结束后用5%的三氯乙酸沉淀并洗涤蛋白，加入3mL水得到蛋白溶液。向所述蛋白溶液中加入0.2 mL 1M的氯化锰溶液，在室温下混合5分钟，然后逐滴加入0.4 mL1M的氢氧化钠溶液，接着搅拌3分钟，得到透光悬液。冰浴超声纳米溶液使纳米粒分布更均匀。样品在水中透析24小时，所得样品冻干48小时。所得冻干后的样品能够很容易的用水或生理盐水复溶为原溶液，且纳米粒径保持不变。如图1所示，得到的白蛋白锰纳米粒的平均粒径为100 ~ 200 nm（DLS, Brookhaven 90 plus Zeta）。用湿法消解法和电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）检测锰的包封率，结果表明本实验的锰包封率约为30% ~ 50%。

2. 取制得的白蛋白锰纳米粒的溶液20微升滴在铜网上，吸附5分钟并晾干铜网，透射电镜（FEI-TALOS-F200X）观察形貌和能谱扫描元素如图2所示。结果显示：Mn@ALB NPs为球形且直径为100 ~ 200 nm左右的纳米粒。

3. 为进一步检测本实施例中制备得到的用于抗肝纤维化的蛋白锰组合物的性能，分别进行如下测试：

（1）白蛋白锰纳米粒体外细胞选择性测试：

将Dio染料预先加入蛋白溶液中，在室温下避光搅拌5分钟，加入0.2 mL 1M的氯化锰溶液，在室温下混合5分钟，然后逐滴加入0.4 mL1M的氢氧化钠溶液，接着搅拌3分钟，得到透光悬液。冰浴超声纳米溶液使纳米粒分布更均匀。用培养基将纳米粒稀释至合适的浓度，分别与肝星状细胞和肝细胞孵育2、4、8h，进行激光共聚焦（OLYMPUS FV3000 LSCM）拍摄如图3。

结果显示：肝星状细胞在2h即摄取Dio标记的纳米粒，至8h大量摄取纳米粒，而肝细胞直至8h无摄取。表明纳米粒具有肝星状细胞选择性。

（2）白蛋白锰纳米粒诱导肝星状细胞衰老测试：

将不同浓度的纳米粒与肝星状细胞共孵育24小时，然后进行SA-β-半乳糖苷酶染色（北京索莱宝），染色步骤按照SA-β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明书进行，结果如图4所示。

结果显示：纳米粒能够显著诱导肝星状细胞衰老。

（3）白蛋白锰纳米粒抑制肝星状细胞活化和胶原生成测试：

将不同浓度的纳米粒与肝星状细胞共孵育24小时，提取蛋白和RNA分别进行Western Blot和Real-Time PCR实验，检测激活标志物α-SMA和胶原标志物COL1A的表达，检测结果如图5。

结果显示：纳米粒可以明显抑制肝星状细胞的活化水平和胶原的产生。

（4）白蛋白锰纳米粒体内器官选择性测试：

取制得的Mn@ALB NPs，用生理盐水稀释10倍，以同等锰浓度的氯化锰溶液作为对照，小鼠尾静脉注射0.2 mL，分别在注射前、注射后0.5h、3h、6h、12h各时间点进行小动物活体磁共振（Bruker 9.4T）成像如图6。

结果显示：Mn@ALB NPs在肝脏中的持续时间比氯化锰更长。注射Mn@ALB NPs后，肝脏直到12小时仍表现出较高的信号，而氯化锰在0.5小时表现出轻微的信号，在3小时衰减。氯化锰和Mn@ALB NPs都通过肾脏代谢，但氯化锰表现出更快速的肾脏清除。表明Mn@ALBNPs在肝脏聚集的时间较长。

（5）白蛋白锰纳米粒体内器官选择性对照测试：

取制得的Mn@ALB NPs，用生理盐水稀释配制成锰含量为0.38mg/kg的溶液，并配制同等锰浓度的氯化锰溶液。取28只小鼠，分成4组：玉米油对照组，四氯化碳诱导的肝纤维化造模组，氯化锰治疗组，纳米粒治疗组。

治疗组分别尾静脉注射200ul纳米粒与氯化锰，每周两次，持续两周。结束后，取小鼠脑组织，用ICP-MS检测脑组织的锰含量。检测结果如图7所示。

结果显示：纳米粒可以减少锰的脑内流。

（6）白蛋白锰纳米粒体内药效（血清学水平）测试：

取上述4组实验小鼠血清，进行肝功能ALT、AST检测，该检测在南京市鼓楼医院检验科进行，检测结果如图8所示。

结果显示：造模组血清ALT、AST均较玉米油对照组升高，纳米粒治疗组减少了血清ALT、AST水平，而氯化锰治疗组未显示出改善肝功能的效果。

（7）白蛋白锰纳米粒体内药效（组织病理学）测试（马松染色）：

取上述4组实验小鼠肝组织，在中性组织固定液中浸泡48h进行组织固定，使用石蜡切片对组织包埋，之后进行肝组织切片，行马松染色。

其中，马松染色的具体步骤包括：

a. 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 20min-二甲苯Ⅱ 20min-无水乙醇Ⅰ 5min-无水乙醇Ⅱ 5min-95%酒精 5min-90%酒精 5min-80%酒精 5min-70%酒精 5min-蒸馏水洗；

b. 重铬酸钾染液：2.5%重铬酸钾50°3h或室温过夜，自来水冲洗洗；

c. 丽春红染液：将切片浸入丽春红溶液10min，自来水冲洗；

d. 苯胺蓝染液：将切片放入磷钼酸15-20S后，不水洗直接放入苯胺蓝染色8min，自来水冲洗；

e. 分化：冲洗后用0.2%冰醋酸分化2秒；

f. 脱水封片：将切片依次放入95%酒精II 15min-无水乙醇Ⅰ 10min -无水乙醇Ⅱ10min -二甲苯Ⅰ 10min -二甲苯Ⅱ 10min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片；

g. 显微镜镜检，使用扫描仪（3D histech，Pannoramic MIDI）进行图像采集分析，结果如图9所示。

白蛋白锰纳米粒体内药效（组织病理学）测试（天狼星红染色）：

取上述4组实验小鼠肝组织，在中性组织固定液中浸泡48h进行组织固定，使用石蜡切片对组织包埋，之后进行肝组织切片，行天狼星红染色。

其中，天狼星红染色的具体步骤包括：

a. 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 20min-二甲苯Ⅱ 20min-无水乙醇Ⅰ 5min-无水乙醇Ⅱ 5min-95%酒精 5min-90%酒精 5min-80%酒精 5min-70%酒精 5min-蒸馏水洗；

b. 天狼猩红染液：天狼猩红染液孵育20-30min，纯酒精冲洗；

c. 脱水封片：将切片依次放入95%酒精II 15min-无水乙醇Ⅰ 10min -无水乙醇Ⅱ10min -二甲苯Ⅰ 10min -二甲苯Ⅱ 10min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片；

d. 显微镜镜检，使用扫描仪（3D histech，Pannoramic MIDI）进行图像采集分析，结果如图9所示。

结果显示：造模组有明显的胶原蛋白沉积（蓝色、红色部分），但在正常组几乎没有。与造模组相比，氯化锰治疗组和纳米粒治疗组均观察到了明显的胶原蛋白减少，且纳米粒组显示出更少的小叶间胶原沉积。这些结果证实，Mn@ALB纳米粒可以减少四氯化碳诱导的肝纤维化的发展。

（8）白蛋白锰纳米粒体内药效（增强自然杀伤细胞活性和毒性）测试：

取上述4组实验小鼠肝组织，分离肝脏非实质细胞，进行自然杀伤细胞的流式分析。

其中，细胞分离和染色的具体步骤包括：

a. 小鼠门静脉灌注20ml PBS；

b. 取部分肝脏组织(约6 x 10^6个细胞)，使用手术剪或刀片将组织切成2-4mm的小块，置于5-6倍体积消化缓冲液（15ml离心管）[Hank’s钙镁平衡盐溶液(HBSS) + 0.5 mg/mL胶原酶IV (Sigma)和100 μg/mL DNase(罗氏，巴塞尔)]中，37℃孵育40 min；

c. 研磨肝脏，细胞悬浮液通过70um的过滤网，过滤两次，收集到15ml离心管内；

d. 4℃，300 g离心5 min，收集细胞，用含2% FCS的RPMI1640重悬以灭活酶；

e. 50g离心3 min，离心3次，去除肝细胞；

f. 剩余细胞用30% Percoll (Solarbio, Beijing)重悬，450 g离心20分钟去除细胞碎片；

g. 红细胞裂解；

h. 将剩余的HNPCs洗净重悬、计数以作进一步分析；

i. 在100μl PBS中加入1 μg BD anti-mouse CD16/32 mouse Fc blocker/10^6细胞，4°C孵育10分钟；

j. 用50μl PBS重悬10^6细胞，加入适量的特异性单克隆荧光抗体，4°C孵育30分钟；

k. 加入适量PBS清洗细胞2次 (试管1ml/次)，250g离心细胞；

l, 充分重悬细胞，加入适量（试管250μl/管）Fixation/Permeabilizationsolution，4°C孵育20分钟。350g 5min离心；

m. 用1× BD Perm/Wash™ buffer清洗细胞2次 (试管1ml/次)（10x稀释），350g5min；

n. 取适量细胞因子荧光抗体或阴性对照，用BDPerm/Wash™ buffer1x稀释至50μl。用此抗体稀释液充分重悬已固定破膜的细胞，4°C避光孵育30分钟；

o. 1× BD Perm/Wash™ buffer （试管1ml/次）清洗细胞2次，然后用500ul PBS重悬，上流式细胞仪（FACS Aria，BD Biosciences）检测；NK细胞定义为HNPCs中的CD49b⁺CD3e^-细胞，活化的NK细胞定义为CD314⁺CD49b⁺CD3e^-细胞，细胞毒NK细胞定义为Granzyme B⁺CD49b⁺CD3e^-细胞和Perforin⁺CD49b⁺CD3e^-细胞。结果如图10所示。

结果显示：与造模组相比，氯化锰治疗组和纳米粒治疗组均提高了NK 细胞的活性和杀伤毒性，增强了清除衰老细胞的能力。

实施例2

将200 mg膜铁转运蛋白溶于含有辛酸钠的生理盐水中制得蛋白溶液。向蛋白溶液中加入0.22 mL 1M的硫酸锰水溶液，在室温下混合5分钟，然后逐滴加入0.4 mL1M的碳酸钠溶液，搅拌得到透光悬液。冰浴超声纳米溶液使纳米粒分布更均匀。样品在水中透析24小时，所得样品冻干48小时。所得冻干后的样品能够很容易的用水或生理盐水复溶为原溶液，且纳米粒径保持不变。如图11所示，得到的组合物纳米粒的粒径为50 ~ 200 nm。

实施例3

将200 mg免疫球蛋白溶于含有甘氨酸的磷酸缓冲溶液中制得蛋白溶液。向蛋白溶液中加入0.7μL 1M的硝酸锰水溶液，在室温下混合5分钟，然后逐滴加入0.1 mL1M的磷酸氢钠溶液，搅拌得到透光悬液。冰浴超声纳米溶液使纳米粒分布更均匀。样品在水中透析24小时，所得样品冻干48小时。所得冻干后的样品能够很容易的用水或生理盐水复溶为原溶液，且纳米粒径保持不变。如图12所示，得到的组合物纳米粒的粒径为10 ~ 150 nm。

实施例4

将200 mgα-2-巨球蛋白溶于含有三羟甲基氨基甲烷的磷酸缓冲溶液中制得蛋白溶液。向蛋白溶液中加入0.07 mL 1M的碘化锰水溶液，在室温下混合5分钟，然后逐滴加入0.3 mL1M的硫化钠溶液，搅拌得到透光悬液。冰浴超声纳米溶液使纳米粒分布更均匀。样品在水中透析24小时，所得样品冻干48小时。所得冻干后的样品能够很容易的用水或生理盐水复溶为原溶液，且纳米粒径保持不变。如图13所示，得到的组合物纳米粒的粒径为150 ~250 nm。

实施例5

将200 mgγ-球蛋白溶于生理盐水中制得蛋白溶液。向蛋白溶液中加入0.18 mL1M的氯化锰水溶液，在室温下混合5分钟，然后逐滴加入0.4 mL1M的草酸钠溶液，搅拌得到透光悬液。冰浴超声纳米溶液使纳米粒分布更均匀。样品在水中透析24小时，所得样品冻干48小时。所得冻干后的样品能够很容易的用水或生理盐水复溶为原溶液，且纳米粒径保持不变。如图14所示，得到的组合物纳米粒的粒径为200 ~ 500 nm。

实施例6

将200 mg转铁蛋白溶于含有N-乙酰色氨酸钠的磷酸缓冲溶液中制得蛋白溶液。超声条件下，向蛋白溶液中加入含有22mg氢氧化锰纳米颗粒的悬浊液，加完后持续搅拌。样品在水中透析24小时，所得样品冻干48小时。所得冻干后的样品能够很容易的用水或生理盐水复溶为原溶液，且纳米粒径保持不变。得到的组合物纳米粒的粒径为700 ~ 1000 nm。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (11)

1.一种蛋白锰组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用，其特征在于，所述蛋白锰组合物为蛋白包裹的疏水的二价锰纳米粒；

所述疏水二价锰中锰元素和所述蛋白的质量比为0.02%~11%:1；

所述纳米粒的粒径为10nm~1000nm；

所述蛋白为白蛋白。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述疏水二价锰中锰元素和所述蛋白的质量比为2%~6%:1。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纳米粒的粒径为50nm~500nm。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述疏水的二价锰为氢氧化锰、碳酸锰、磷酸锰、硫化锰或草酸锰中的一种或几种。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述疏水的二价锰为氢氧化锰。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白锰组合物是由如下制备方法之一得到的：

其一：将含有能够形成疏水的二价锰的阴离子的第二溶液加入到含有蛋白和二价锰离子的第一溶液中，使二价锰形成疏水颗粒并与蛋白自组装形成所述纳米粒；将得到的纳米粒在超声条件下处理；

其二：将疏水的二价锰纳米粒的悬浊液与蛋白混合并超声处理，即得。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述第一溶液的溶剂为水。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述二价锰离子源自氯化锰、硫酸锰、碘化锰或硝酸锰中的一种或几种。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述二价锰离子源自氯化锰。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述能够形成疏水的二价锰的阴离子为氢氧根、碳酸根、磷酸氢根、硫离子或草酸根中的一种或几种。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述能够形成疏水的二价锰的阴离子为氢氧根。