WO2015056766A1 - 多機能金属ナノ構造体及びその製造方法 - Google Patents

多機能金属ナノ構造体及びその製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2015056766A1
WO2015056766A1 PCT/JP2014/077633 JP2014077633W WO2015056766A1 WO 2015056766 A1 WO2015056766 A1 WO 2015056766A1 JP 2014077633 W JP2014077633 W JP 2014077633W WO 2015056766 A1 WO2015056766 A1 WO 2015056766A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
metal nanostructure
multifunctional
multifunctional metal
functional molecule
colloid
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/077633
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
雄貴 市川
芝　清隆
Original Assignee
アイシン精機株式会社
公益財団法人がん研究会
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アイシン精機株式会社, 公益財団法人がん研究会 filed Critical アイシン精機株式会社
Priority to US15/029,462 priority Critical patent/US20160258940A1/en
Priority to EP14854622.9A priority patent/EP3059589A4/en
Priority to JP2015542672A priority patent/JPWO2015056766A1/ja
Publication of WO2015056766A1 publication Critical patent/WO2015056766A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G01N33/553—Metal or metal coated
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5748—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving oncogenic proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/587—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/82—Translation products from oncogenes

Definitions

  • the present invention relates to a medical multifunctional metal nanostructure used for diagnosis and treatment of diseases. That is, a method for coating the surface of a metal nanostructure with a plurality of functional molecules to produce a stable colloidal dispersion, a multifunctional metal nanostructure by the method, and the multifunctional metal nanostructure Containing products.
  • metal nanostructures such as metal nanoparticles and rods
  • biomolecules such as peptides and nucleic acids, biocompatible polymers, and functional molecules such as fluorescent molecules are bound to the surface of metal nanostructures for use in disease detection, etc.
  • functional molecules such as fluorescent molecules
  • gold nanostructures using gold as a metal component have been widely developed because gold is stable as a substance and has low toxicity.
  • Colorimetric sensors using the optical properties of gold nanostructures and sensors using surface plasmon resonance are used in various tests such as a home pregnancy test kit.
  • metal nanostructures are coated with specific molecules on the surface, and are also used as probes for dark field microscopes and electron microscopes. Furthermore, attempts have been made to coat the surface of a gold nanostructure with a target molecule that recognizes a specific cell such as a cancer cell and a therapeutic agent and use it as a therapeutic carrier.
  • the functionalization of the surface of these metal nanostructures is carried out by mixing functional molecules in a colloidal solution in which the metal nanostructures serving as nuclei are dispersed in a liquid medium such as water, and then spontaneously changing pH or Modification is performed by using a metal nanoparticle-functional molecule binding reaction caused by an external stimulus such as temperature change.
  • one end of a biocompatible polymer such as polyethylene glycol (PEG) is first bonded to the surface of the nanostructure, and the entire nanostructure is modified. Since repulsion between particles occurs due to steric hindrance by the polymer, the colloid is stabilized and aggregation is suppressed.
  • PEG polyethylene glycol
  • target functional molecule is bonded to the other end of polymer by chemical reaction. That is, this is a method in which a target functionalized molecule is bonded to the outer layer of a polymer via a polymer (Non-Patent Document 1).
  • the second method is a method in which the pH of a colloid solution is adjusted in accordance with a specific protein or peptide to be surface-modified, and surface modification is performed under the specific pH (Non-patent Document 2).
  • Patent Document 1 discloses a method for modifying a functional molecule by adjusting the surface coverage, and stabilized colloidal nanoparticles obtained by the modification.
  • colloidal particles described in Patent Document 1 are stabilized colloidal nanoparticles, they are not optimized for use in therapeutic and diagnostic applications by binding peptides, aptamers, and the like.
  • Sensitivity and accuracy are required to detect biomolecules such as specific proteins for therapeutic and diagnostic purposes.
  • biomolecules such as specific proteins for therapeutic and diagnostic purposes.
  • biomolecules are diverse, there are also various functional molecules that bind to them. It is necessary to further optimize the surface modification method in order to apply it to various biomolecules and use it for treatment and diagnosis.
  • the multifunctional metal nanostructure of the present invention comprises at least one colloid-stabilized functional molecule covering 30 to 90% of the surface of the metal nanostructure, and at least one biological molecule having an amino acid at the terminal.
  • the surface of the metal nanostructure is covered with a functional molecule.
  • Colloid-stabilized functional molecules suppress the aggregation of metal nanostructures, and bind to target molecules with biological functional molecules that are reactive with in vivo molecules. This is because it can be applied.
  • the entire region of the surface of the metal nanoparticle is not covered by the colloid-stabilized functional molecule but is partially covered. Covering with a colloid-stabilized functional molecule ensures dispersibility in aqueous solution and is a partial coating. Molecules can bind.
  • the coverage of the colloid-stabilized functional molecule is less than 30%, the metal nanostructures tend to aggregate and cannot be obtained as a stable colloid. Moreover, since the area
  • Biologically functional molecules having an amino acid at the terminal include various peptides such as antibodies, synthetic peptides and peptide hormones that bind to specific molecules. Further, peptide nucleic acid (PNA) or a molecule in which a linker is bound to nucleic acid is included, and the linker is not particularly limited as long as it is a compound containing an amino group.
  • PNA peptide nucleic acid
  • the linker is not particularly limited as long as it is a compound containing an amino group.
  • the colloid-stabilized functional molecule is represented by the following general formula (1).
  • n represents an integer of 1 or more. It is characterized by including the compound represented by these.
  • the multifunctional metal nanostructure of the present invention is characterized in that the compound of the general formula (1) is polyethylene glycol or a derivative thereof.
  • polyethylene glycol Since polyethylene glycol has good biocompatibility, it can be administered to a living body by binding a therapeutic agent for a specific target such as cancer cells.
  • the multifunctional metal nanostructure of the present invention is characterized by having a thiol group or a disulfide group at at least one end of the colloid-stabilized functional molecule.
  • colloid-stabilized functional molecule By using one end of the colloid-stabilized functional molecule as a functional group having thiol (-SH) or disulfide (-SS-), it is easily bonded to the metal substrate. Therefore, it is possible to reliably coat the metal nanostructure with the colloid-stabilized functional molecule.
  • the multifunctional metal nanostructure of the present invention comprises a functional group having thiol (-SH) or disulfide (-SS-) at one end of the colloid-stabilized functional molecule, and the other end has a methoxy group. And at least one of an amino group, a carboxy group, an acyl group, an azo group, and a carbonyl group.
  • a peptide that is a biological functional molecule can bind to a colloid-stabilized functional molecule. As a result, the surface area to which the biological functional molecule can bind is expanded.
  • the multifunctional metal nanostructure of the present invention is a metal nanoparticle, which is a noble metal nanoparticle or an alloy nanoparticle containing a noble metal.
  • the metal nanostructure is a noble metal nanoparticle such as platinum or an alloy containing a noble metal, it has a large scattering coefficient with respect to radiation, and therefore can be used as a contrast agent for X-rays, particle beams and the like.
  • the multifunctional metal nanostructure of the present invention is characterized in that the metal nanoparticles are gold nanoparticles or alloy nanoparticles containing gold.
  • the target cells can be killed by accumulating in target cells such as cancer cells using biological functional molecules and generating heat by electromagnetic waves.
  • the multifunctional metal nanostructure of the present invention is characterized in that the biologically functional molecule contains at least a peptide.
  • a peptide having a molecular weight of 200 or more and 10,000 or less that binds to a target molecule can efficiently coat the metal nanostructure. Therefore, it is possible to detect the target molecule with high sensitivity, and it can be expected to obtain a high effect even when used for treatment.
  • the present invention is characterized in that it is a dispersion liquid in which the multifunctional metal nanostructure is dispersed in a liquid.
  • the multifunctional metal nanostructure of the present invention has a surface coated with a colloid-stabilized functional molecule, so it is very stably dispersed in the liquid. Therefore, it is very easy to handle.
  • a biological functional molecule is bound, it can be provided in a form that can be used immediately in the field of diagnosis and treatment.
  • the present invention is a lyophilized product containing the multifunctional metal nanostructure, wherein the dispersion is frozen.
  • freeze-dried product By using a freeze-dried product, long-term storage and transportation stability can be ensured, and even when biological functional molecules such as peptides are bound, it can be supplied as a stable product.
  • the diagnostic and / or therapeutic composition of the present invention is characterized by including the multifunctional metal nanostructure.
  • the multifunctional metal nanostructure of the present invention is a metal nanostructure to which a biological functional molecule is bound, it can be accumulated in a desired organ, an affected area, and the like. It can also be used for hyperthermia. Moreover, it can be used as what is called an imaging agent which detects a cancer cell etc. by couple
  • multifunctional metal nanostructures combined with anticancer agents and cytostatic agents can be accumulated in target cells, and treatment with few side effects can be achieved. Can be done.
  • the method for producing a multifunctional metal nanostructure according to the present invention includes a step of preparing a metal nanostructure dispersed in water or an electrolyte, and a surface coverage of the metal nanostructure is measured by a physical quantity, and the metal nanostructure
  • the method includes a step of coating 30 to 90% of the body surface with a colloid-stabilized functional molecule, and a step of coating the surface of the metal nanostructure with one or more biological functional molecules.
  • the surface coating amount of the metal nanostructure can be monitored by measuring a physical quantity. Therefore, it is possible to first coat the colloid-stabilized functional molecule with a controlled coverage, and then coat the biological functional molecule while monitoring the coverage as well. Therefore, it is possible to coat the colloid-stabilized functional molecule and the biological functional molecule at an optimum ratio.
  • the coverage of the surface of the metal nanostructure can be obtained in advance under predetermined coating conditions, and the colloid-stabilized functional molecule can be coated on the basis thereof.
  • the surface of the metal nanostructure can be coated with a desired coverage with good reproducibility by determining and coating the conditions.
  • the method for producing a multifunctional metal nanostructure of the present invention is characterized in that the electrical conductivity of a dispersion liquid in which the metal nanostructure is dispersed in water or an electrolyte is about 25 ⁇ S / cm or less.
  • each step The surface coating amount of the metal nanostructure is adjusted by a physical quantity, and the first biological functional molecule to the (N-1) th biological functional molecule as the biological functional molecule , In turn, each step of partially covering not to occupy all of the effective surface area, and surface coverage by the Nth biological functional molecule until the effective area of the metal nanostructure surface is saturated It is characterized by doing.
  • the coating can be performed while adjusting the amount of coating. It is possible to coat with.
  • the method for producing a multifunctional metal nanostructure of the present invention is characterized by including a step of removing excess molecules that do not bind to the metal nanostructure after each step.
  • the method for producing a multifunctional metal nanostructure of the present invention is characterized in that the step of removing excess molecules is centrifugation or dialysis.
  • the surplus molecules can be easily removed by removing the surplus molecules by centrifugation. Further, by removing excess molecules by dialysis, a drug that can be safely administered as a contrast agent or a therapeutic agent can be produced.
  • the kit for producing the multifunctional metal nanostructure of the present invention comprises a metal nanostructure partially coated with at least one colloid-stabilized functional molecule, and a biological functional molecule. And a buffer solution for coating.
  • the multifunctional metal nanostructure of this invention is shown typically.
  • the increase in hydrodynamic particle radius in mixed solutions with different ratios of PEG molecules and gold nanoparticles is shown.
  • the modification rate of the gold nanoparticle surface by the ratio of the number of different PEG molecules and the number of gold nanoparticles is shown. It shows that aggregation of gold nanoparticles coated with PEG is suppressed.
  • Cell staining image with multifunctional gold nanoparticles modified with plectin-binding peptide The figure which shows the fluorescence intensity of a fluorescence label multifunctional gold nanoparticle.
  • colloid stabilizing functional molecule of the present invention any molecule may be used as long as it has an effect of preventing aggregation of colloidal particles.
  • the particles are less likely to come closer than a certain distance due to steric hindrance due to the coated molecules, so that the particles are less likely to aggregate. Therefore, any polymer that can coat the metal surface may be used.
  • polyethylene glycol PEG
  • polyacrylamide polysaccharide
  • polydecyl methacrylate polymethacrylate
  • polystyrene polycaprolactone
  • PLA polylactic acid
  • PLGA poly (lactic-co-glycolic acid)
  • polyglycol examples thereof include acids (PGA), polyhydroxybutyric acid (PHB), polymer hydrocarbons, and derivatives and copolymers thereof.
  • proteins such as dendrimers, aptamers, DNA, RNA, peptides, antibodies, albumin and the like.
  • aptamers and proteins become molecules that cause aggregation.
  • some aptamers and proteins do not cause aggregation and induce only steric hindrance, and some of them can act as colloid-stabilizing functional molecules.
  • SDS sodium® Dodecyl® Sulfate
  • LDS® Lithium® Dodecyl® Sulfate
  • Tween 20 Tween 80
  • Triton-X100 surfactants such as cholic acids, polyvinylpyrrolidone (PVP), and the like may be used.
  • the colloid-stabilized functional molecule is coated in a controlled amount so that the metal nanoparticle surface is partially coated, as schematically shown in FIG. This is very important.
  • FIG. 1 shows an example of PEG
  • the colloid is stabilized.
  • biological functional molecules examples of peptides are shown in FIG. 1
  • bond includes all bond forms such as a covalent bond, a hydrogen bond, an ionic bond, and a van der Waals bond.
  • the PEG suitably used in the present invention preferably has a molecular weight of about 500 to 100,000, although it depends on the molecular weight of the biological functional molecule to be bound as the second functional molecule.
  • Any biologically functional molecule of the present invention may be used as long as it is a molecule that is reactive with a biomolecule.
  • nucleic acids and peptides that specifically bind to specific molecules such as antibodies and aptamers can be used.
  • a linker having an amino group may be added as described above.
  • the molecular weight is in the range of 200 or more and 10,000 or less, it can be expected to efficiently bind to the metal nanostructure.
  • the present invention is not limited to peptides having a molecular weight of 200 or more and 10,000 or less, and various molecules including antibodies having a molecular weight exceeding 100,000 can be envisaged. Synthetic peptides that bind to specific molecules, various peptides such as peptide hormones, and their derivatives can also be mentioned as the biological functional molecules.
  • a multifunctional metal nanostructure in which a fluorescent agent, a dye, or the like is bound together with an antibody or aptamer for binding to a target exhibits power in diagnosis and treatment using an endoscope.
  • a target cell can be treated by binding a compound such as an anticancer agent together with a target molecule.
  • a peptide having affinity for EpCAM Epidermal cell adhesion ⁇ molecule
  • a cancer stem cell surface marker is used as a biological functional molecule to bind a colloid-stabilized functional molecule To the metal nanostructure.
  • this multifunctional metal nanostructure is administered in vivo, the multifunctional metal nanostructure binds to the cancer lesion site.
  • the cancer lesion site is depicted with the gold nanocolloid with an image diagnostic apparatus such as an X-ray examination, thereby enabling diagnosis.
  • endoscopic mucosal resection EMD
  • ESD endoscopic submucosal dissection
  • endoscopic resection polypectomy
  • a fluorescent dye is further bound to the multifunctional metal nanostructure, it is widely administered to the surgical field under the endoscope and irradiated with a fluorescence excitation laser, the cancer lesion site is fluorescent. It can be recognized as a site, and the surgical resection site can be specified.
  • the metal nanostructure is excited by injecting some external physical energy such as electromagnetic waves such as microwaves and light, and ultrasonic waves.
  • some external physical energy such as electromagnetic waves such as microwaves and light, and ultrasonic waves.
  • heat there is a method of applying heat locally to the affected area.
  • any energy level such as electron transition, lattice vibration, energy related to motion such as vibration / rotation of nanostructures, etc., as well as any combination of these energy levels is used. be able to.
  • gold nanoparticles have plasmon resonance due to localized electron collective vibration modes, gold nanoparticles are selectively irradiated by irradiating laser light having a wavelength corresponding to this resonance energy. Excitation of energy.
  • the temperature around the gold nanoparticles becomes high due to the thermal energy converted through the electron-lattice interaction and the lattice-lattice interaction. Since the cancer cells are killed at 42 ° C. or higher, they can be used for so-called hyperthermia of cancer.
  • an anticancer drug can be further bound to the cancer stem cell as a drug delivery system targeting cancer stem cells.
  • new blood vessels in cancer tissue are generally weaker and more permeable to substances than capillaries, so that the multifunctional metal nanostructure is easily accumulated in cancer tissue.
  • the anticancer drug bonded to the metal nanostructure has a certain mass and reduces protein interaction, so it reacts with cells and tissues other than the target site and diffuses widely in the body. Is suppressed. For this reason, accumulation at the target site is performed, and as a result, an effect of suppressing dilution of side effects and medicinal effects can be expected.
  • an amino acid cleaved by an intracellular protease such as cathepsin is used as a linker that binds the drug to the metal nanostructure. This is possible by using a linker containing the sequence.
  • the material permeability of neovascularization of cancer tissue is larger than that of normal blood vessels, so delivery to normal tissue can be achieved by adjusting the size of the metal nanostructure. As a result, it is possible to increase the delivery to cancer tissue, and as a result, it is possible to develop a technique having few side effects and high effectiveness.
  • HER2 human EGFR-related 2
  • MUC1 mimembrane growth factor 1
  • FGFR2 fibroblast growth factor receptor 2
  • CD44 CD59, CD133, CD81
  • VEGFR vascular endothelial growth factor GF receptor-GF 1R
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • IL-10 receptor IL-11 receptor
  • IL-4 receptor PDGF (Platelet-Derived Growth factor) receptor
  • chemokine receptor Molecules E-cadherin, integrin, claudin, Fzd10, plectin (Plectin), TAG-72, Prestin, Clusterin, Nestin, Slectin, Tenascin C, Vimentin and other molecules are expressed in specific cancer cells or cancer stem cells It is known. Therefore, antibodies, aptamers and the like that bind to these molecules can be usefully used for diagnosis and treatment by binding to the metal nanostructure of the present invention.
  • nucleic acid molecules such as antisense nucleic acid and decoy nucleic acid are linked to the metal nanostructure of the present invention by a linker and delivered into cells, which is useful for diagnosis and treatment. be able to.
  • an amino acid at the end of the biologically functional molecule enables stable binding to the metal nanostructure, but the amino acid does not need to have a thiol group, that is, cysteine.
  • the multifunctional metal nanostructure of the present invention can be provided as a dispersion or as a lyophilized product. If it is in the form of a dispersion, it can be used immediately, and if it is a lyophilized product, it can be stored for a long time.
  • kits including a metal nanostructure partially covered with a colloid-stabilized functional molecule and a buffer for binding the biological functional molecule is provided.
  • a metal nanostructure partially coated with a colloid-stabilized functional molecule the user can bind and use a desired biological functional molecule.
  • the present invention will be described in detail below with reference to examples.
  • Example 1 Surface coating of metal nanoparticles (1) Surface coating of partial metal nanoparticles with a first functional molecule, colloid-stabilized functional molecule of metal nanoparticles as the core of a multifunctional metal nanostructure
  • a colloidal solution a colloidal solution of about 15 nm gold nanoparticles prepared by laser ablation in liquid, i-colloid Au15 (manufactured by IMRA America, USA) was prepared and used as a precursor. The concentration of gold nanoparticles is about 2.8 nM.
  • the concentration of the total electrolyte contained in the colloid is preferably less impurity ions, and it is desirable that the electric conductivity is about 25 ⁇ S / cm or less.
  • Chemically synthesized gold nanoparticle colloidal solutions made by a widely used citric acid reduction method or the like generally contain a large amount of impurity ions such as reaction by-products, and therefore have an electric conductivity of 200 ⁇ S / cm to 300 ⁇ S / cm. cm or more.
  • These impurity ions may not only deteriorate the surface activity of the gold nanoparticles in the following surface coating process, but also the electrostatic repulsive force acting between the colloidal particles due to the presence of a large amount of impurity ions (electrolyte).
  • the electric double layer which is the origin, becomes thin, and as a result, problems such as particle aggregation may occur in the molecular surface coating process.
  • colloid-stabilized functional molecule thiolated methoxypolyethylene glycol having a molecular weight of about 5000, specifically mPEG-SH, 5k (CreativerePEGWorks) is dissolved in deionized water. Used.
  • the mixing ratio of PEG and gold nanoparticles suitable for partially coating the metal nanoparticles with the colloid-stabilized functional molecule, that is, PEG, is determined.
  • the ratio of PEG occupying the surface of the metal nanoparticles was estimated by the change in hydrodynamic particle size in dynamic scattering particle size measurement (DLS). Specifically, the particle diameter is measured using Zetasizer NanoZS (manufactured by Malvern, UK), and it is assumed that a value in which the amount of increase in radius is asymptotically approached is a saturated state with an occupation ratio of 100%. The rate of approaching this asymptote is defined as the coverage of the nanostructure surface.
  • Fig. 2 shows the increase in hydrodynamic particle radius in a mixed solution of different ratios of PEG molecules and gold nanoparticles measured by DLS.
  • the increase in hydrodynamic particle radius asymptotically approaches 10 nm with the increase in PEG relative to gold nanoparticles, and thus it is recognized that the vicinity of the radius increase of 10 nm is a saturated region close to 100% occupancy (FIG. 2 shown on the right vertical axis).
  • the value of the ratio of the number of gold nanoparticles to the number of PEG molecules showing a sudden increase in hydrodynamic particle radius is 600 or less, for example, 100/1, 200 / At the point of 1,300 / 1, the state of partial surface coating by PEG shown in FIG. 1 is realized.
  • the colloid-stabilized functional molecule covers about 30% or more of the metal surface. It seems necessary to do.
  • the coverage was about Since the color change due to particle aggregation was confirmed with a colloid having a ratio value of 100/1 corresponding to 30%, it is considered necessary to cover the surface of the colloidal particles by about 30% or more.
  • the ratio of the number of PEG molecules to the number of gold nanoparticles was changed from 10/1 (PEG amount 10 times) to 750/1 (PEG amount 750 times), and gold nanoparticles were coated with PEG in the same manner as described above.
  • the surface modification rate was about 38% when the number of PEG molecules was 80 times the number of gold nanoparticles, and the surface modification rate was about 74% when 200 times.
  • the surface-coated gold nanoparticles were then suspended in 10% NaCl close to the physiological salt concentration, and the aggregation of the gold nanoparticles was measured by absorbance ( FIG. 3B). It was revealed that aggregation of gold nanoparticles can be suppressed when the number of PEG molecules is more than 80 times the number of gold nanoparticles. Therefore, if the surface of the metal nanostructure is covered by 40% or more, a metal nanostructure with suppressed aggregation can be obtained.
  • EpCAM-binding peptide KHLQCVRNICWSGGK (SEQ ID NO: 1, hereinafter referred to as EP114) in which a fluorescent molecule fluorescein (FITC) was bonded to the amino terminus was used.
  • EpCAM is an antigen that is recognized to be expressed on the surface of cancer cells.
  • Gold nanoparticles partially coated with PEG which is a colloid-stabilizing functional molecule, at a ratio of the number of PEG molecules to the number of gold nanoparticles of 100/1, 200/1, 300/1 were prepared.
  • PEG which is a colloid-stabilizing functional molecule
  • an EP114 peptide solution adjusted in concentration so that the number of EP114 peptides with respect to the final number of gold nanoparticles in the mixed solution is 2000 is added to the PEG / gold nanoparticle mixture and mixed.
  • the peptide can be bound to PEG / gold nanoparticles by standing for about 12 to 24 hours.
  • excess functional molecules can be removed using a conventional method such as centrifugation or dialysis.
  • each mixture is placed in a centrifuge tube, centrifuged at 16,000 g for 90 minutes at 4 ° C., the supernatant is removed, deionized water is added, and after washing by centrifugation again, Cell culture medium was added. As a result, an EP114 / PEG / gold nanoparticle composite dispersed in a cell culture medium was obtained.
  • the final dispersion in the solution can be appropriately selected by the user depending on the purpose of using the multifunctional metal nanostructure.
  • Example 2 Cell staining using a multifunctional metal nanostructure coated with EpCAM-binding peptide A colon cancer cell line, HT29, was used to conduct uptake into cells. First, spheroids of HT29 cells were formed using a 96-well type spheroid culture plate, EZ-Sphere TM (Asahi Glass Co., Ltd.).
  • HT29, 4 ⁇ 10 5 cells were placed in 3 ml of D-MEM / F-12 medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 1: 1 Mixture, manufactured by GIBCO) at 20 ng / ml human EGF (Miltenyi Biotec), 20 ng / ml human FGF-2 (Miltenyi Biotec), 1/50 B-27 supplement ⁇ 50 (GIBCO), 1/100 Penicillin-Streptomycin Solution ⁇ 100 Suspended in a medium supplemented with Koganei Pharmaceutical Co., Ltd., dispensed into 200 ⁇ l of each well, and cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 72 hours.
  • D-MEM / F-12 medium Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 1: 1 Mixture, manufactured by GIBCO
  • EpCAM-binding peptide EP114 peptide, amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1
  • EP114 control peptide amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2
  • a part (about 20 ⁇ l) of spheroid and gold particle peptide complex is placed on a glass bottom dish (D110300, manufactured by Hamamatsu Nami Glass Industrial Co., Ltd.), and an inverted confocal laser microscope (FLUOVIEW® FV1000IX81 type, manufactured by Olympus Co., Ltd.) ) was irradiated with a 488 nm laser with a 40 ⁇ objective lens and observed using a filter for Alexa488.
  • a glass bottom dish D110300, manufactured by Hamamatsu Nami Glass Industrial Co., Ltd.
  • FLUOVIEW® FV1000IX81 type manufactured by Olympus Co., Ltd.
  • the multifunctional metal nanostructure coated with the EpCAM-binding peptide or control peptide used was prepared by using multifunctional metal nanoparticles according to the method described in Example 1. That is, the ratio of the number of PEG molecules to the number of gold nanoparticles is 100/1, 200/1, 300/1, and after the gold nanoparticles are partially coated, the number of each peptide corresponds to the number of gold nanoparticles. Multifunctional metal nanoparticles were prepared by mixing to 2000.
  • a metal nanostructure with a peptide or antibody that binds to a surface antigen expressed in cancer cells, such as EpCAM, as a biologically functional molecule.
  • a surface antigen expressed in cancer cells such as EpCAM
  • Example 3 Cell staining using multifunctional metal nanostructures coated with plectin-binding peptide Plectin has recently been reported as a biomarker of pancreatic duct cancer, and its localization was detected by a peptide that binds to plectin. (Non-Patent Documents 3 and 4). Then, the binding evaluation experiment of the gold nanoparticle surface-modified with the peptide was performed using the plectin binding peptide.
  • Colloid solution of gold nanoparticles i-colloid Au15 (manufactured by IMRA America) and FITC-PEG-SH (manufactured by NANOCOS) so that the ratio of the number of PEG molecules to the number of gold nanoparticles is 200/1. And coated.
  • the modification rate was about 50%.
  • the plectin-binding peptide obtained by amidating the C powder was coated so that the ratio of the number of peptides to the number of gold nanoparticles was adjusted to 600/1.
  • two types of plectin-binding peptides were prepared, which were not given a linker having the following amino acid sequence.
  • Bio Coat Poly-D-Lisine 8-well slide (Becton Dickinson) was inoculated with MIAPaCa2 at a concentration of 2.5 ⁇ 10 4 cells / well and cultured for 24 hours at 37 ° C. and 5% CO 2 conditions. did.
  • the plate was washed twice with PBS, and encapsulated using Prolong gold antifade reagent with DAPI special packaging (Invitrogen).
  • the specimen was observed using a dark field microscope (DMLP-Polarizing microscope, manufactured by LEICA) equipped with an HRA nano-imaging adapter (CytoVIVA). The results are shown in FIG.
  • FIG. 5 shows the results using only PEG-coated gold nanoparticles, (b) using gold nanoparticles coated with a plectin-binding peptide with linker, and (c) using gold nanoparticles coated with a lectin-binding peptide without a linker.
  • Indicates As is clear from these micrographs, compared to the gold nanoparticles (a) not modified with the plectin-binding peptide, in the gold nanoparticles (b) and (c) modified with the peptide, the scattered light signal from the gold nanoparticles is expressed in cells. Observed on the surface. In addition, as indicated by arrows, a strong signal is observed between cells, but it has been reported that plectin is released outside the cell, and it is considered that extracellular plectin is detected.
  • Example 4 The application of the metal nanostructure modified by the present invention to flow cytometry was also examined. Gold nanoparticles only, gold nanoparticles coated with PEG, gold nanoparticles used in Example 3 coated with FITC-bound PEG, FITC-PEG-SH, and peptide further bound thereto The fluorescence intensity was measured using a sample.
  • the excitation wavelength was 495 nm and the measurement fluorescence wavelength was set to 519 nm.
  • Example 3 since the scattered light from the gold nanoparticles can be observed, the binding can be confirmed even using a detector that detects the scattered light, such as a dark field microscope.
  • the method of the present invention can be used not only for EpCAM and plectin as described above, but also for cancer cells by arbitrarily selecting proteins expressed on the cell surface as biological functional molecules.
  • various cells can be used for diagnosis and treatment as targets.
  • the multifunctional metal nanostructure of the present invention can be used for various applications by binding arbitrary antibodies, aptamers, etc. for research, diagnosis, and therapeutic purposes.

Abstract

　生体分子と反応する機能性分子により表面修飾した場合に、凝集を起こさない安定した金属ナノ構造体を提供する。 少なくとも１種以上のコロイド安定化機能性分子によって、金属ナノ構造体を３０～９０％被覆し、さらに１種以上の生物学的機能性分子によって金属ナノ構造体を被覆する。

Description

多機能金属ナノ構造体及びその製造方法
　本発明は、病気の診断や治療に用いる医療用の多機能金属ナノ構造体に関する。すなわち、金属ナノ構造体の表面を複数の機能性分子で被覆し、安定したコロイド分散液を作製するための方法、及び該方法による多機能金属ナノ構造体、及び該多機能金属ナノ構造体を含む製品に関する。
　金属ナノ粒子やロッド等の金属ナノ構造体を用いたいわゆるナノテクノロジーは、近年、研究・産業分野で重要な技術となっている。特に、医療、診断分野で、金属ナノ構造体の表面に、ペプチドや核酸等の生体分子、生体適合性のあるポリマー、蛍光分子のような機能性分子を結合させて、疾患の検出等に利用されてきている。
　特に金属成分として金を用いる金ナノ構造体は、金が物質として安定しており、毒性が低いことから、幅広く展開されてきている。金ナノ構造体の光学的性質を利用した比色センサや、表面プラズモン共鳴を利用したセンサは、例えば家庭用妊娠検査キット等、様々な検査で用いられている。
　また、金属ナノ構造体は、表面を特定の分子でコーティングし、暗視野顕微鏡や、電子顕微鏡用のプローブとしても用いられている。さらには、金ナノ構造体の表面にがん細胞等、特定の細胞を認識する標的分子と治療薬とをコーティングし、治療用キャリヤーとして用いることが試みられている。
　通常、これらの金属ナノ構造体の表面の機能化は、核となる金属ナノ構造体が水などの液体媒質中に分散されたコロイド溶液に、機能性分子を混合し、自発的あるいはｐＨ変化や温度変化などの外的刺激によって起こる、金属ナノ粒子-機能性分子間の結合反応を利用して修飾する。
米国特許出願公開第２０１２／０２２５０２１号公報
G. Luo et al.,International Journal of Pharmaceutics, 2010,Vol. 385, p.150-156, G. F. Paciotti et al., Drug Delivery, 2004, Vol.11, p.169-183 K. A. Kelly et al., PLOS Medicine, 2008, Vol.5, Issue 4, e45 S. J. Shin, et al., PNAS, 2013, Vol.110, No.48, p.19414-19419
　しかしながら、金属ナノ構造体を機能化する際に、金属ナノ構造体のコロイド溶液と、生体分子と反応性を有する機能性分子を混合すると、コロイド状態の不安定化を引き起こし、金属ナノ構造体の凝集を誘発することがある。一度ナノ構造体の凝集が起こると再分散させることは難しい。特に、分子量がおよそ３０００以下のペプチドのような荷電性官能基を有する分子の場合に凝集が頻発する。そのため、バイオ、医療用途での利用が困難であるという問題が生じていた。
　上記問題を回避するために、以下のアプローチがある。第１の方法は、最初にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの生体適合性のある高分子の一端をナノ構造体の表面に結合させ、ナノ構造体全体を表面修飾する。高分子による立体障害によって粒子間反発が起きるため、コロイドが安定化し凝集が抑制される。
　高分子で表面修飾後、高分子の他端に目的の機能化分子を化学反応により結合させる。すなわち、ナノ構造体に高分子を介して目的の機能化分子を高分子の外層に結合させる方法である（非特許文献１）。
　しかし、外側に層を重ねていくことで表面修飾後のナノ構造体全体のサイズが大きくなってしまう問題や、機能化分子を化学結合で結合させることから、あらかじめ高分子と機能化分子双方に結合させるための官能基を導入しておく必要がある。そのため、これらの分子の合成自体が複雑化し、コストがかかってしまうという問題があった。
　第２の方法は、表面修飾する特定のタンパク質、あるいはペプチドに合わせて、コロイド溶液のｐＨを調整し、その特定のｐＨ下で表面修飾を行う方法である（非特許文献２）。
　しかしながら、この方法では、タンパク質あるいはペプチドに固有の最適ｐＨに合わせて反応を行う必要がある。そのため、個々のタンパク質あるいはペプチドに応じて、最適ｐＨを求めなければならない。したがって、一般化した表面修飾方法を確立することができず、タンパク質、ペプチドごとにｐＨを最適化するための時間が必要となる。
　また、特許文献１には、表面被覆率を調節して機能性分子を修飾する方法、及び修飾することによって得られる安定化コロイドナノ粒子が開示されている。生物学的又は医療用途への応用の示唆はあるが、金ナノ粒子表面にポリエチレングリコールを結合させた安定化コロイド粒子が開示されているだけであり、ペプチド、アプタマー等、生体分子に特異的に結合する分子によって修飾した応用技術に関する記載はない。
　したがって、特許文献１に記載されているコロイド粒子は、安定化コロイドナノ粒子ではあるものの、ペプチド、アプタマー等を結合させ、治療、診断用途に用いるための最適化がなされているわけではない。
　治療、診断目的で特定のタンパク質等の生体分子を検出するためには、感度と精度が求められる。そのためには、高密度でペプチド、アプタマー等生体分子と結合する機能性分子で金属ナノ構造体を修飾する必要がある。また、生体分子は多様であるため、これと結合する機能性分子も多様である。多様な生体分子に適用し、治療、診断用に使用するためには表面修飾法をさらに最適化する必要がある。
　本発明の多機能金属ナノ構造体は、金属ナノ構造体表面の３０～９０％を被覆する少なくとも１種以上のコロイド安定化機能性分子と、末端にアミノ酸を有する少なくとも１種以上の生物学的機能性分子とにより金属ナノ構造体表面が被覆されていることを特徴とする。
　コロイド安定化機能性分子によって、金属ナノ構造体が凝集することを抑制し、生体内の分子と反応性を有する生物学的機能性分子によって、標的分子と結合し、診断・治療用の素材として応用できるからである。
　ここで、コロイド安定化機能性分子によって、金属ナノ粒子表面の全領域が被覆されているのではなく、部分的に被覆されていることが重要である。コロイド安定化機能性分子によって、被覆されていることによって、水溶液中での分散性を確保するとともに、部分的な被覆であることから、コロイド安定化機能性分子の間隙部分に生物学的機能性分子が結合することができる。
　コロイド安定化機能性分子の被覆率が３０％未満であると、金属ナノ構造体の凝集が起こりやすく、安定したコロイドとして得ることができない。また、コロイド安定化機能性分子の被覆率が９０％を超えると生物学的機能性分子が被覆する領域が少なくなるため、生体分子との反応性が低下する。
　末端にアミノ酸を有する生物学的機能性分子としては、抗体をはじめ、特定の分子に結合する合成ペプチド、ペプチドホルモン等様々なペプチドが含まれる。また、ペプチド核酸（ＰＮＡ）や核酸にリンカーを結合させた分子が含まれ、リンカーはアミノ基を含む化合物であれば特に限定されない。これら分子を生物学的機能性分子として多機能金属ナノ構造体に結合させることにより、診断・治療、研究分野等、幅広い応用が期待できる。
　また、本発明の多機能金属ナノ構造体は、前記コロイド安定化機能性分子が下記一般式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （式中ｎは１以上の整数を表す。）
で表される化合物を含むことを特徴とする。
　上記化合物を含むことにより、金属ナノ構造体がコロイドとして安定化するからである。
　さらに、本発明の多機能金属ナノ構造体は、前記一般式（１）の化合物がポリエチレングリコール又はその誘導体であることを特徴とする。
　ポリエチレングリコールは生体適合性が良いことから、がん細胞等特定の標的に対する治療薬を結合させて、生体に投与することが可能となる。
　本発明の多機能金属ナノ構造体は、コロイド安定化機能性分子の少なくとも１つの末端にチオール基又はジスルフィド基を有することを特徴とする。
　コロイド安定化機能性分子の一端をチオール（‐ＳＨ）又はジスルフィド（‐Ｓ‐Ｓ‐）を有する官能基とすることにより、金属基材と容易に結合する。したがって、確実にコロイド安定化機能性分子で金属ナノ構造体を被覆することが可能となる。
　また、本発明の多機能金属ナノ構造体は、コロイド安定化機能性分子の一端に、チオール（‐ＳＨ）又はジスルフィド（‐Ｓ‐Ｓ‐）を有する官能基を備え、他端は、メトキシ基、アミノ基、カルボキシ基、アシル基、アゾ基、カルボニル基の少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする。
　メトキシ基、アミノ基、カルボキシ基、アシル基、アゾ基、カルボニル基のいずれか１つを含むことにより、生物学的機能性分子であるペプチドがコロイド安定化機能性分子とも結合可能となる。そのため生物学的機能性分子が結合可能な表面領域が拡大する。
　さらに、本発明の多機能金属ナノ構造体は、金属ナノ粒子であって、貴金属ナノ粒子又は貴金属を含む合金ナノ粒子であることを特徴とする。
　金属ナノ構造体が、白金等の貴金属ナノ粒子、又は貴金属を含む合金であれば、放射線に対する散乱係数が大きいので、Ｘ線、粒子線等の造影剤として用いることができる。
　さらにまた、本発明の多機能金属ナノ構造体は、前記金属ナノ粒子が金ナノ粒子、又は金を含む合金ナノ粒子であることを特徴とする。
　貴金属の中でも金は安定であり、担体としてすでに診断・治療に用いられており、すでに幅広い用途が確立しているからである。また、生物学的機能性分子によってがん細胞のような標的細胞に集積させ、電磁波により熱を生成させることによって、該標的細胞を死滅させることが可能となる。
　本発明の多機能金属ナノ構造体は、生物学的機能性分子が少なくともペプチドを含むことを特徴とする。
　標的分子に結合する分子量２００以上１００００以下のペプチドは、効率良く金属ナノ構造体を被覆することができる。そのため、感度良く標的分子を検出することが可能であり、また、治療に用いる場合にも、高い効果を得ることが期待できる。
　さらに、本発明は、前記多機能金属ナノ構造体を液体中に分散した分散液であることを特徴とする。
　本発明の多機能金属ナノ構造体は、コロイド安定化機能性分子で表面を被覆しているために、非常に安定して液体中に分散する。したがって、非常に扱いやすい。また、生物学的機能性分子を結合していることから、診断・治療の現場において、すぐに使用する形態で提供できる。
　さらに、本発明は、前記多機能金属ナノ構造体を含む凍結乾燥品であって、前記分散液を凍結することを特徴とする。
　凍結乾燥品とすることによって、長期保存と輸送安定性の確保が可能となり、ペプチド等の生物学的機能性分子が結合した状態であっても、安定した製品として供給可能となる。
　また、本発明の診断用及び／又は治療用組成物は、前記多機能金属ナノ構造体を含むことを特徴とする。
　本発明の多機能金属ナノ構造体は、生物学的機能性分子が結合している金属ナノ構造体であることから、所望の器官、患部等に集積させることが可能であり、造影剤や、温熱療法にも用いることができる。また、蛍光色素等の色素を結合させることによって、がん細胞等の検出を行う、いわゆるイメージング剤として使用することができる。
　さらに、抗がん剤のキャリヤーとしても用いることができる。すなわち、生物学的機能性分子の他に、抗がん剤や細胞増殖抑制剤を結合させた多機能金属ナノ構造体とすることによって、標的細胞に集積させることができ、副作用の少ない治療を行うことが可能となる。
　本発明の多機能金属ナノ構造体の製造方法は、水あるいは電解液中に分散された金属ナノ構造体を用意する工程と、物理量により金属ナノ構造体の表面被覆量を測定し、金属ナノ構造体表面の３０～９０％をコロイド安定化機能性分子によって被覆する工程と、一種以上の生物学的機能性分子によって、金属ナノ構造体表面を被覆する工程とを含むことを特徴とする。
　金属ナノ構造体の表面被覆量は物理量を測定することによってモニターすることが可能である。したがって、最初にコロイド安定化機能性分子による被覆率を調節して被覆し、次に、生物学的機能性分子を同様に被覆率をモニターしながら被覆することができる。そのためコロイド安定化機能性分子と生物学的機能性分子とを最適比率で被覆することが可能である。
　また、予め所定の被覆条件によって、金属ナノ構造体表面の被覆率を求めておき、それに基づいてコロイド安定化機能性分子を被覆することもできる。特に、ＰＥＧ等特定のコロイド安定化機能性分子を用いる場合には、条件を決めて被覆することにより、再現性良く所望の被覆率で金属ナノ構造体表面を被覆することができる。
　本発明の多機能金属ナノ構造体の製造方法は、前記金属ナノ構造体が水あるいは電解液中に分散された分散液の電気伝導度が２５μＳ／ｃｍ程度以下であることを特徴とする。
　不純物イオンは、表面被覆工程における金ナノ粒子の表面活性を悪くする可能性があるためである。
　本発明の多機能金属ナノ構造体の製造方法は、一種以上の前記生物学的機能性分子がＮ種類（Ｎは整数を表す。）の生物学的機能性分子である場合において、各工程において前記金属ナノ構造体の表面被覆量を物理量によって調節し、前記生物学的機能性分子として、第１番目の生物学的機能性分子から第（Ｎ－１）番目の生物学的機能性分子まで、順番に各々有効表面積の全てを占有しないように部分的に被覆する各工程と、Ｎ番目の生物学的機能性分子によって、前記金属ナノ構造体表面の有効領域が飽和状態になるまで表面被覆することを特徴とする。
　本発明の多機能金属ナノ構造体の製造方法によれば、複数の生物学的機能性分子を結合させる場合であっても、その被覆量を調節しながら被覆することができるため、各々最適比率で被覆することが可能である。
　また、本発明の多機能金属ナノ構造体の製造方法は、各工程の後に金属ナノ構造体に結合しない余剰分子を除去する工程を含むことを特徴とする。
　余剰分子の除去工程を含むことにより、より正確に金属ナノ構造体表面の被覆率を測定することが可能である。
　本発明の多機能金属ナノ構造体の製造方法は、余剰分子を除去する工程が遠心分離又は透析であることを特徴とする。
　余剰分子を遠心分離により除去することにより、簡便に余剰分子の除去を行うことができる。また、透析による余剰分子の除去を行うことにより、造影剤や治療薬として安全に投与可能な薬剤を製造することができる。
　さらに、本発明の多機能金属ナノ構造体を製造するためのキットは、少なくとも１種以上のコロイド安定化機能性分子により部分的に被覆された金属ナノ構造体と、生物学的機能性分子を被覆するための緩衝液とを含むことを特徴とする。
　コロイド安定化機能性分子を部分的に被覆し、研究者が所望の生物学的機能性分子を適宜被覆できるようにすることによって、各自の研究目的、あるいは、診断目的に沿った試薬を調整することが可能となる。
本発明の多機能金属ナノ構造体を模式的に示す。 異なるＰＥＧ分子数と金ナノ粒子数の比の混合溶液での流体力学的粒子半径の増加量を示す。 異なるＰＥＧ分子数と金ナノ粒子数の比による金ナノ粒子表面の修飾率を示す。 ＰＥＧにより被覆された金ナノ粒子の凝集が抑制されることを示す。 ＥｐＣＡＭペプチドで修飾した多機能金ナノ粒子による細胞染色像。 プレクチン結合ペプチドで修飾した多機能金ナノ粒子による細胞染色像。 蛍光標識多機能金ナノ粒子の蛍光強度を示す図。
　本発明のコロイド安定化機能性分子としては、コロイド粒子が凝集することを防止する効果を備えている分子であればどのようなものを使用してもよい。
　高分子により表面を被覆すると、被覆した分子による立体的障害により、粒子同士が一定の距離より近づきにくくなるため、凝集しにくくなる。したがって、金属表面を被覆可能な高分子であれば、どのようなものを使用してもよい。
　例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド、ポリサッカライド、ポリデシルメタクリレート、ポリメタクリレート、ポリスチレン、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ＰＬＧＡ(poly(lactic-co-glycolic acid))、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）、高分子炭化水素、及びこれらの誘導体や共重合体が挙げられる。また、デンドリマー、アプタマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、抗体、アルブミンなどのタンパク質も挙げられる。
　一般にアプタマーやタンパク質は凝集を引き起こす分子になるが、特定のアプタマーやタンパク質によっては凝集を引き起こさず、立体的障害のみを誘導することから、コロイド安定化機能性分子として作用し得るものも存在する。
　さらに、ＳＤＳ（Sodium Dodecyl Sulfate）、ＬＤＳ (Lithium Dodecyl Sulfate)、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ１００、コール酸類等の界面活性剤、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等を用いてもよい。
　生物学的機能性分子を被覆するために、コロイド安定化機能性分子は、図１に模式的に示すように、金属ナノ粒子表面が部分的に被覆されるように量を調節して被覆することが重要である。
　図１に示すように、コロイド安定化機能性分子（図１ではＰＥＧの例を示している。）によって完全に表面被覆されると、コロイドとしては安定化する。しかしながら、生物学的機能性分子（図１ではペプチドの例を示している。）がコロイド安定化機能性分子の間隙に入り込む余地がなく、ペプチド等の生物学的機能性分子の結合が妨げられる。したがって、部分的にコロイド安定化機能性分子によって被覆されていることが、コロイドの安定化、生物学的機能性分子の結合の２つを達成するためには重要である。
　本明細書では、「結合」とは、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス結合等、あらゆる結合形式が含まれる。
　また、本発明で好適に用いられるＰＥＧについては、第２の機能性分子として結合させる生物学的機能性分子の分子量にもよるが、分子量５００～１０００００程度のものが好ましい。
　また、本発明の生物学的機能性分子としては、生体分子と反応性を有する分子であれば、どのようなものを用いてもよい。例えば、抗体、アプタマーのような特定の分子に特異的に結合する核酸やペプチドを用いることができる。核酸の場合には、上述のようにアミノ基を有するリンカーを付加すればよい。
　また、ペプチドの場合、分子量が２００以上１００００以下の範囲であれば、効率良く金属ナノ構造体に結合することが期待できる。しかし、分子量が２００以上１００００以下のペプチドに限定するものではなく、分子量が１０００００を超える抗体をはじめ、様々な分子を想定することができる。特定の分子に結合する合成ペプチドや、ペプチドホルモン等様々なペプチドおよびそれらの誘導体も、前記生物学的機能性分子として挙げることができる。
　また、複数の生物学的機能性分子を結合させることで、診断・治療用途での様々な応用が考えられる。例えば、標的に結合させるための抗体やアプタマーとともに、蛍光剤や色素等を結合させた多機能金属ナノ構造体は、内視鏡を用いた診断・治療に威力を発揮する。また、標的分子とともに、抗がん剤等の化合物等を結合させることにより特定の細胞を標的とした治療も可能となる。
　診断・治療用途に用いる場合には、例えば、がん幹細胞表面マーカーであるＥｐＣＡＭ（Epithelial cell adhesion molecule）に親和性のあるペプチドを生物学的機能性分子として、コロイド安定化機能性分子を結合させた金属ナノ構造体に結合させる。この多機能金属ナノ構造体を生体内に投与すると、がん病巣部位に当該多機能金属ナノ構造体が結合する。これによって、Ｘ線検査などの画像診断装置でがん病巣部位が金ナノコロイドで描出され、診断が可能となる。
　また、近年利用増加が著しい内視鏡手術においては、胃の粘膜がんに対して、内視鏡的粘膜切除術（ＥＭＤ）や内視鏡的粘膜下層剥離術（ＥＳＤ）が第一選択となっている。また、大腸のポリープに対しても内視鏡的切除術（ポリペクトミー）が一般的治療として広く行われている。これらの診断または治療の際に、当該多機能金属ナノ構造体にさらに蛍光色素を結合させ、内視鏡下で術野領域に広く投与して蛍光励起レーザーを照射すると、がん病巣部位を蛍光部位として認知できるようになり、手術切除部位を特定することができる。
　さらに、治療を目的とした利用方法として、当該多機能金属ナノ構造体を投与後に、マイクロ波や光などの電磁波、超音波など、何らかの外的物理エネルギーを注入することによって金属ナノ構造体を励起し、患部に局所的に熱をかける方法がある。エネルギー励起としては、電子遷移、格子振動、ナノ構造体の振動・回転など運動に関するエネルギー等、当該ナノ構造体に固有なエネルギー準位であれば、あらゆるエネルギー準位、またそれらの組み合わせを利用することができる。例えば、金ナノ粒子の場合、局在化した電子の集団振動モードに起因するプラズモン共鳴を有するので、この共鳴エネルギーに対応する波長のレーザー光などを照射することで、金ナノ粒子を選択的にエネルギー励起する。その結果、電子‐格子相互作用、格子‐格子相互作用を通じて変換された熱エネルギーによって金ナノ粒子周辺は高温となる。４２°Ｃ以上ではがん細胞は死滅することから、いわゆるがんの温熱療法に利用することができる。
　あるいは、さらに抗がん剤を結合させ、がん幹細胞を標的としたドラッグデリバリーシステムとしてがん治療に用いることもできる。この場合、がん組織の新生血管は、一般に毛細血管に比べて脆弱で物質透過性が高いことから、当該多機能金属ナノ構造体はがん組織に集積されやすい。また、金属ナノ構造体に結合させた抗がん剤は、一定の質量を有し、タンパク質相互作用が少なくなるために、標的部位以外の細胞や組織と反応することや体内に広く拡散することが抑えられる。そのため標的部位への集積が行われることから、結果として副作用や薬効の希釈が抑制される効果も期待できる。当該多機能金属ナノ構造体が細胞内に取り込まれた後、細胞内に薬剤を放出させるためには、薬剤を金属ナノ構造体に結合させるリンカーに、カテプシンなどの細胞内プロテアーゼで切断されるアミノ酸配列を含むリンカーを用いることにより可能となる。
　また、がんの診断・治療に使用する場合、がん組織の新生血管の物質透過性は正常血管のそれより大きいことから、金属ナノ構造体のサイズを調整することにより、正常組織へのデリバリーよりもがん組織へのデリバリーの方を多くすることができ、結果として副作用が少なく、有効性が大きい手法を開発することができる。
　ＥｐＣＡＭ以外にも、ＨＥＲ２ (human EGFR-related 2)、ＭＵＣ１(mucin core protein 1)、ＦＧＦＲ２ (fibroblast growth factor receptor 2)、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ１３３、ＣＤ８１、ＶＥＧＦＲ (vascular endothelial growth factor receptor)、ＩＧＦ－１Ｒ (Insulin-like growth factor 1 receptor)、ＥＧＦＲ(Epidermal growth factor receptor)、ＩＬ－１０受容体、ＩＬ－１１受容体、ＩＬ－４受容体、ＰＤＧＦ（Platelet-Derived Growth Factor）受容体、ケモカイン受容体、Ｅ－カドヘリン、インテグリン、Claudin、Ｆｚｄ１０、プレクチン（Plectin）、ＴＡＧ－７２、Prestin、Clusterin、Nestin、Slectin、Tenascin C、Vimentin等の分子は特定のがん細胞、あるいはがん幹細胞で発現することが知られている。したがって、これら分子に結合する抗体、アプタマー等を本発明の金属ナノ構造体に結合させることによって、診断、治療に有用に用いることができる。
　さらに核酸医薬領域においては、細胞内に特定の核酸を送達する技術が必要であり、このデリバリーシステムのキャリヤーとしても利用することができる。すなわち、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡのほか、アンチセンス核酸やデコイ核酸などの核酸分子を、リンカーによって本発明の金属ナノ構造体に結合させ、細胞内に送達することによって、診断、治療に有用に用いることができる。
　また、生物学的機能性分子の末端にアミノ酸が存在することにより、安定して金属ナノ構造体に結合することができるが、当該アミノ酸がチオール基を有すること、すなわちシステインである必要はない。
　本発明の多機能金属ナノ構造体を利用する場合の製剤化としては、分散液として、又は凍結乾燥品として提供することができる。分散液の形態であれば、すぐに使用することが可能であるし、凍結乾燥品であれば、長期保存が可能となる。
　さらに、コロイド安定化機能性分子によって部分的に被覆された金属ナノ構造体と、生物学的機能性分子を結合させるための緩衝液を含むキットを提供する。部分的にコロイド安定化機能性分子によって被覆された金属ナノ構造体を用いることによって、使用者が所望の生物学的機能性分子を結合させて用いることが可能となる。本発明を実施例を交えながら以下詳細に説明する。
　［実施例１］金属ナノ粒子の表面被覆
　（１）第１の機能性分子、コロイド安定化機能性分子による部分的金属ナノ粒子の表面被覆
　多機能金属ナノ構造体の核となる金属ナノ粒子のコロイド溶液として、液中レーザーアブレーションで作製された約１５ｎｍの金ナノ粒子のコロイド液、i-colloid Au15（米国IMRA America社製）を用意し、前駆体として用いた。金ナノ粒子の濃度は約２．８ｎＭである。
　コロイドに含まれる総電解質の濃度としては、不純物イオンが少ない方が好ましく、電気伝導度が２５μＳ／ｃｍ程度以下であることが望ましい。一般的に広く使われているクエン酸還元法などで作られた化学合成製の金ナノ粒子コロイド溶液は、反応副産物等の不純物イオンを多く含むため、その電気伝導度は２００μＳ／ｃｍから３００μＳ／ｃｍあるいはそれ以上である。これらの不純物イオンは、以下の表面被覆工程における金ナノ粒子の表面活性を悪くする可能性があるだけでなく、多量の不純物イオン（電解質）の存在により、コロイド粒子間に働く静電反発力の起源である電気二重層の層厚が薄くなり、結果、分子表面被覆工程で粒子凝集等の問題を招く可能性もある。
　第１の機能性分子であるコロイド安定化機能性分子としては、ここでは分子量約５０００のチオール化メトキシポリエチレングリコール、具体的にはｍＰＥＧ-ＳＨ、５ｋ（Creative PEGWorks社製）を脱イオン水に溶解して用いた。
　まず、コロイド安定化機能性分子、すなわちＰＥＧによって、金属ナノ粒子を部分的に表面被覆するために好適なＰＥＧと金ナノ粒子の混合する割合を求める。
　金ナノ粒子とＰＥＧとの比率を少しずつ変えた混合液を用意し、良く混和した後２４時間静置する。金ナノ粒子表面上にチオール-金の化学結合が形成されることによって、ＰＥＧが金に結合する。
　金属ナノ粒子の表面をＰＥＧが占有する割合は、動的散乱粒子サイズ測定（ＤＬＳ）における流体力学的粒径変化によって見積もった。具体的にはZetasizer NanoZS（英国Malvern社製）を用いて粒子径を測定し、半径増加量が漸近的に近づいていく値を占有率が１００％の飽和状態であると仮定する。この漸近線に近付いていく割合をナノ構造体表面の被覆率と定義する。
　図２にＤＬＳで測定した、異なるＰＥＧ分子数と金ナノ粒子数の比の混合溶液での流体力学的粒子半径の増加を示す。金ナノ粒子に対するＰＥＧの増加とともに、流体力学的粒子半径の増加量は漸近的に１０ｎｍに近付いていくことから、半径増加量１０ｎｍ近傍が占有率１００％に近い飽和領域であると認められる（図２右縦軸で示す。）。図２のグラフにおいて、急激に流体力学的粒子半径が増加を示すＰＥＧ分子数に対する金ナノ粒子数の比の値が６００以下の領域、例えば図２中、矢印で示した１００／１、２００／１、３００／１の点においては、図１に示すＰＥＧによる部分的表面被覆の状態が実現されている。
　ＰＥＧ分子等のコロイド安定化機能性分子が結合した金属ナノ構造体が、凝集せずに安定して分散体として存在するためには、コロイド安定化機能性分子によって金属表面を約３０％以上被覆することが必要だと考えられる。別の実験では、上記の異なる比率（１００／１、２００／１、３００／１）でｍＰＥＧ-ＳＨ、５ｋを部分被覆したコロイドに対し、例えば、ＲＡＤペプチドの溶液を混ぜた場合、被覆率約３０％に対応する比の値１００／１のコロイドで、粒子凝集による変色が確認されたことから、コロイド粒子の表面を約３０％以上被覆することが必要だと考えられる。
　次に、コロイド安定化機能性分子の被覆によって、ナノ構造体の凝集がおこりにくくなることを確認した。ＰＥＧ分子数と金ナノ粒子数の比の値を１０／１（ＰＥＧ量１０倍）から７５０／１（ＰＥＧ量７５０倍）まで変えて、上記と同様にして金ナノ粒子をＰＥＧで被覆した。図３Ａに示すようにＰＥＧ分子数が金ナノ粒子数に比べ８０倍のときに、約３８％の表面修飾率、２００倍のときに約７４％の表面修飾率であった。
　ＰＥＧ分子数と金ナノ粒子数の比を変えて、表面を被覆した金ナノ粒子を次に生理的な塩濃度に近い１０％ＮａＣｌ中に懸濁し、金ナノ粒子の凝集を吸光度で測定した（図３Ｂ）。ＰＥＧ分子数が金ナノ粒子数に比べ８０倍以上で被覆した場合には、金ナノ粒子の凝集が抑えられることが明らかとなった。したがって、金属ナノ構造体の表面が４０％以上被覆されていれば、凝集が抑制された金属ナノ構造体を得ることができる。
　（２）第２の機能性分子、生物学的機能性分子による金属ナノ粒子の表面被覆
　次に、第２の機能性分子である生物学的機能性分子として、ペプチドを結合させた例を示す。ペプチドとしては、アミノ末端に蛍光分子フルオレセイン（ＦＩＴＣ）を結合させたＥｐＣＡＭ結合ペプチド、ＫＨＬＱＣＶＲＮＩＣＷＳＧＧＫ（配列番号１、以下、ＥＰ１１４という。）を用いた。なお、ＥｐＣＡＭはがん細胞でその細胞表面に発現していることが認められている抗原である。
　コロイド安定化機能性分子であるＰＥＧによって、ＰＥＧ分子数と金ナノ粒子数の比の値が１００／１、２００／１、３００／１で部分的に被覆された金ナノ粒子を用意した。次に、混合溶液中の最終的な金ナノ粒子数に対するＥＰ１１４ペプチド数が２０００になるように濃度を調整したＥＰ１１４ペプチド溶液を、ＰＥＧ／金ナノ粒子混合液に加え混合する。余剰の生物学的機能性分子を加えることによって、コロイド安定化機能性分子によって部分的に被覆されている金ナノ粒子の被覆されていない部分を被覆することが可能となる。
　混合後、１２～２４時間程度静置することによって、ペプチドをＰＥＧ／金ナノ粒子に結合させることができる。
　金属ナノ粒子の被覆完了後、遠心分離、透析などの定法を用いて、余剰の機能性分子を除去することができる。
　ここでは、ペプチドＥＰ１１４によって被覆後、各混合液を遠心分離用チューブに入れ、１６，０００ｇ、４℃で９０分間遠心分離し、上清を除去後脱イオン水を加え、再度遠心により洗浄後、細胞用培地を加えた。これにより、細胞用培地中に分散されたＥＰ１１４／ＰＥＧ／金ナノ粒子複合体を得た。
　最終的にどのような溶液中に分散するかは、多機能金属ナノ構造体をどのような目的で使用するかによって、使用者が適宜選択することができるのは言うまでもない。
　［実施例２］ＥｐＣＡＭ結合ペプチドにより被覆した多機能金属ナノ構造体を用いた細胞染色
　大腸癌細胞株、ＨＴ２９を用い、細胞への取り込み実験を行った。まず、９６穴タイプのスフェロイド用培養プレート、ＥＺ－ＳｐｈｅｒｅＴＭ（旭硝子株式会社製）を使用して、ＨＴ２９細胞のスフェロイドを形成させた。
　具体的には、ＨＴ２９、４ｘ１０５細胞を３ｍｌのＤ－ＭＥＭ／Ｆ－１２培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 1:1 Mixture, GIBCO社製）に２０ｎｇ／ｍｌのヒトＥＧＦ(Miltenyi Biotec社製)、２０ｎｇ／ｍｌのヒトＦＧＦ－２(Miltenyi Biotec社製)、１／５０量のB-27 supplement×50(GIBCO社製)、１／１００量のPenicillin-Streptomycin Solution×100(和光純薬工業株式会社製)を加えた培地中に懸濁し、懸濁液を各ウェル２００μｌに分注し、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、７２時間培養した。その後、スフェロイドを含まない、上澄部分１５０μｌを除去し、下部に沈殿している５０μｌ中のスフェロイドに、ＥｐＣＡＭ結合ペプチド（ＥＰ１１４ペプチド、アミノ酸配列は、配列番号１に示す。）、ＥｐＣＡＭに結合しないペプチド（ＥＰ１１４コントロールペプチド、アミノ酸配列は、配列番号２に示す。）により被覆した多機能金属ナノ構造体溶液５０μｌを加え、３７℃で１時間反応した。
　その後、一部（約２０μｌ）のスフェロイドと金粒子ペプチド複合体をガラスボトムディッシュ（D110300, 松浪硝子工業株式会社製）の上にのせ、倒立型共焦点レーザー顕微鏡(FLUOVIEW FV1000IX81タイプ、オリンパス株式会社製)を使用して、４０倍の対物レンズで４８８ｎｍのレーザーを照射し、Ａｌｅｘａ４８８用のフィルターを用いて観察した。
　用いたＥｐＣＡＭ結合ペプチド、あるいはコントロールペプチドにより被覆した多機能金属ナノ構造体は、実施例１で述べた方法に従い、多機能金属ナノ粒子を作成して用いた。すなわち、ＰＥＧ分子数と金ナノ粒子数の比の値が１００／１、２００／１、３００／１で、金ナノ粒子を部分的に被覆した後に、各ペプチド数が金ナノ粒子数に対して２０００になるように混合し、多機能金属ナノ粒子を作成した。
　図４に示すように、細胞表面のＥｐＣＡＭに多機能金属ナノ粒子が結合し、染色されているのが確認された。ＥｐＣＡＭ結合ペプチドを生物学的機能性分子として用いた場合には、蛍光顕微鏡検出においては、ＰＥＧ分子数と金ナノ粒子数の比の値が１００／１（ｂ、ｆ）、２００／１（ｃ、ｇ）、３００／１（ｄ、ｈ）のいずれの場合であっても、同等に検出することができる。なお、図４a、ｅはペプチドを被覆した金ナノ粒子の代わりに、ペプチド単独で細胞と反応させた結果を示している。
　上記示したように、ＥｐＣＡＭのようにがん細胞で発現している表面抗原に結合するペプチドや抗体を生物学的機能性分子として金属ナノ構造体を被覆することにより、特異的に染色することが可能となる。
　［実施例３］プレクチン結合ペプチドにより被覆した多機能金属ナノ構造体を用いた細胞染色
　プレクチンは膵管がんのバイオマーカーとして近年報告され、プレクチンに結合するペプチドによって、その局在の検出が行われている（非特許文献３、４）。そこで、プレクチン結合ペプチドを用いて、ペプチドで表面修飾されている金ナノ粒子の結合評価実験を行った。
　金ナノ粒子のコロイド液、i-colloid Au15（米国IMRA America社製）とＦＩＴＣ-ＰＥＧ-ＳＨ(NANOCOS社製)をＰＥＧ分子数と金ナノ粒子数の比の値が２００／１になるようにして被覆した。修飾率は約５０％であった。
　次に、Ｃ末をアミド化したプレクチン結合ペプチドをペプチド数と金ナノ粒子数の比の値が６００／１になるように調整して被覆した。なお、プレクチン結合ペプチドは、下記のアミノ酸配列のリンカーを付与したものとしていないものの２種類を用意した。
　プレクチン結合ペプチド配列
　リンカーあり：ＫＴＬＬＰＴＰＧＧＣ（配列番号３）
　リンカーなし：ＫＴＬＬＰＴＰ（配列番号４）
　上記の比率でペプチドを被覆することにより、ＰＥＧによって被覆されていなかった約５０％の部分が被覆され、金ナノ粒子の表面はほとんど被覆された状態となる。
　プレクチンが細胞表面に局在するとされるＭＩＡＰａＣａ２を用いて、プレクチン結合ペプチドで修飾された金ナノ粒子の結合評価実験を行った。
　Bio Coat Poly-D-Lisine 8-well スライド（ベクトン・ディッキンソン社製）にＭＩＡＰａＣａ２を２．５×１０４細胞／ｗｅｌｌの濃度で播種し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２条件化で培養した。
　２００μｌの４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて、室温で１０分間固定したのち、２５０μｌの１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ/ＰＢＳという。）で２回洗浄した。さらに、１％ＢＳＡ/ＰＢＳ中に室温で１時間静置することによりブロッキングし、２０ｎＭのプレクチン結合ペプチドにより修飾した金ナノ粒子を２００μｌ添加し、３時間静置した後、２５０μｌの１％ＢＳＡ/ＰＢＳで２回洗浄を行い、Prolong gold antifade reagent with DAPI special packaging（Invitrogen社製）を用いて封入した。検体は、ＨＲＡナノイメージングアダプター（CytoVIVA社製）を設置した暗視野顕微鏡（DMLP Polarizing microscope, LEICA社製）を用いて観察した。結果を図５に示す。
　図５（ａ）はＰＥＧで被覆した金ナノ粒子のみ、（ｂ）はリンカー付きプレクチン結合ペプチドで被覆した金ナノ粒子、（ｃ）はリンカーなしプレクチン結合ペプチドで被覆した金ナノ粒子を用いた結果を示す。これら顕微鏡写真より明らかなように、プレクチン結合ペプチドで修飾していない金ナノ粒子（ａ）に比べ、ペプチドで修飾した金ナノ粒子（ｂ）、（ｃ）では金ナノ粒子による散乱光シグナルが細胞表面に観察される。また、矢印で示したように、細胞間に強いシグナルが観察されるが、プレクチンは細胞外に放出されることが報告されており、細胞外のプレクチンを検出しているものと考えられる。
［実施例４］
　本発明によって修飾した金属ナノ構造体のフローサイトメトリーへの適用についても検討を行った。金ナノ粒子のみ、金ナノ粒子にＰＥＧを被覆したもの、実施例３で用いた金ナノ粒子をＦＩＴＣが結合しているＰＥＧ、ＦＩＴＣ-ＰＥＧ-ＳＨで被覆したもの、これにさらにペプチドを結合させたものを用いて蛍光強度を測定した。
　サンプルをＯＤ５２０＝１になるように精製水で希釈し、分光蛍光光度計　FP-6500（日本分光株式会社製）を用い、測定条件＝Response：1 sec, Band width(Ex)：５ｎｍ, Band width(Em)：５ｎｍ, Sensitivity：mediumで蛍光を測定した。励起波長は４９５ｎｍで、測定蛍光波長は５１９ｎｍに設定した。
　図６に示すように、ブランク（精製水）（１）、ＦＩＴＣが結合していないＰＥＧで被覆したもの（２）では、ほとんど蛍光が観察されないのに対し、ＦＩＴＣ-ＰＥＧ-ＳＨで被覆したもの（３）、ＦＩＴＣ-ＰＥＧ-ＳＨで被覆し、さらにペプチドで被覆したもの（４）は有意に蛍光強度の増強が観察された。
　コロイド安定化機能性分子として、ＦＩＴＣが結合しているＰＥＧを用いることによって、どのような生物学的機能性分子で修飾しても蛍光観察を行うことが可能となる。すなわち、用いるペプチド、アプタマー等の生物学的機能性分子毎に標識することなく、コロイド安定化機能性分子が蛍光色素等で標識されているものを用いることによって、ＦＡＣＳ、蛍光顕微鏡を用いた検出が可能となる。
　また、上記実施例３で示したように、金ナノ粒子による散乱光を観察できることから、暗視野顕微鏡等、散乱光を検出する検出器を用いても結合を確認することができる。
　本発明の方法は、上記示してきたようなＥｐＣＡＭやプレクチンだけではなく、生物学的機能性分子として、細胞表面上に発現しているタンパク質等を任意に選択することによって、がん細胞のみならず、様々な細胞を標的として診断、治療に使用することが可能である。
　以上、示してきたように、本発明の多機能金属ナノ構造体は、研究、診断、治療目的に任意の抗体、アプタマー等を結合させることによって、多様な用途に使用することができる。

Claims (17)

  1. 　多機能金属ナノ構造体であって、
    　金属ナノ構造体表面の３０～９０％を被覆する少なくとも１種以上のコロイド安定化機能性分子と、
    　末端にアミノ酸を有する少なくとも１種以上の生物学的機能性分子とにより金属ナノ構造体表面が被覆されていることを特徴とする多機能金属ナノ構造体。
  2. 　請求項１記載の多機能金属ナノ構造体であって、
    　前記コロイド安定化機能性分子が下記一般式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中ｎは１以上の整数を表す）
    で表される化合物を含むことを特徴とする多機能金属ナノ構造体。
  3. 　請求項２記載の多機能金属ナノ構造体であって、
    　前記一般式（１）の化合物がポリエチレングリコール又はその誘導体であることを特徴とする多機能金属ナノ構造体。
  4. 　請求項１記載の多機能金属ナノ構造体であって、
    　前記コロイド安定化機能性分子の少なくとも１つの末端にチオール（‐ＳＨ）又はジスルフィド（‐Ｓ‐Ｓ‐）を有する官能基を有することを特徴とする多機能金属ナノ構造体。
  5. 　請求項４に記載の多機能金属ナノ構造体であって、
    　前記コロイド安定化機能性分子の一端が、チオール（‐ＳＨ）又はジスルフィド（‐Ｓ‐Ｓ‐）を有する官能基であり、
    　他端は、メトキシ基、アミノ基、カルボキシ基、アシル基、アゾ基、カルボニル基の少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする多機能金属ナノ構造体。
  6. 　請求項１に記載の多機能金属ナノ構造体であって、
    　前記金属ナノ構造体が金属ナノ粒子であって、
    　該金属ナノ粒子が、貴金属ナノ粒子又は貴金属を含む合金ナノ粒子であることを特徴とする多機能金属ナノ構造体。
  7. 　請求項６に記載の多機能金属ナノ構造体であって、
    　前記金属ナノ粒子が金ナノ粒子、又は金を含む合金ナノ粒子であることを特徴とする多機能金属ナノ構造体。
  8. 　請求項１記載の多機能金属ナノ構造体であって、
    　前記生物学的機能性分子がペプチドを含むことを特徴とする多機能金属ナノ構造体。
  9. 　多機能金属ナノ構造体を液体中に分散した分散液であって、
    　請求項１記載の多機能金属ナノ構造体を含むことを特徴とする分散液。
  10. 　多機能金属ナノ構造体を含む凍結乾燥品であって、
    　請求項９記載の分散液を凍結することを特徴とする多機能金属ナノ構造体を含む凍結乾燥品。
  11. 　多機能金属ナノ構造体を含む診断用及び／又は治療用組成物であって、
    　請求項１記載の多機能金属ナノ構造体を含むことを特徴とする診断用及び／又は治療用組成物。
  12. 　多機能金属ナノ構造体の製造方法であって、
    　水あるいは電解液中に分散された金属ナノ構造体を用意する工程と、
    　物理量により金属ナノ構造体の表面被覆量を測定し、金属ナノ構造体表面の３０～９０％をコロイド安定化機能性分子によって被覆する工程と、
    　一種以上の生物学的機能性分子によって、金属ナノ構造体表面を被覆する工程とを含むことを特徴とする多機能金属ナノ構造体の製造方法。
  13. 　請求項１２記載の多機能金属ナノ構造体の製造方法であって、
    　前記金属ナノ構造体が水あるいは電解液中に分散された分散液の電気伝導度が２５μＳ／ｃｍ程度以下であることを特徴とする多機能金属ナノ構造体の製造方法。
  14. 　請求項１２記載の多機能金属ナノ構造体の製造方法であって、
    　一種以上の前記生物学的機能性分子がＮ種類（Ｎは整数を表す。）の生物学的機能性分子である場合において、
    　各工程において前記金属ナノ構造体の表面被覆量を物理量よって調節し、
    　前記生物学的機能性分子として、第１番目の生物学的機能性分子から第（Ｎ－１）番目の生物学的機能性分子まで、順番に各々有効表面積の全てを占有しないように部分的に被覆する各工程と、
    　Ｎ番目の生物学的機能性分子によって、前記金属ナノ構造体表面の有効領域が飽和状態になるまで表面被覆することを特徴とする多機能金属ナノ構造体の製造方法。
  15. 　請求項１２に記載の多機能金属ナノ構造体の製造方法であって、
    　各工程の後に前記金属ナノ構造体に結合しない余剰分子を除去する工程を含むことを特徴とする多機能金属ナノ構造体の製造方法。
  16. 　請求項１５に記載の多機能金属ナノ構造体の製造方法であって、
    　余剰分子を除去する工程が遠心分離又は透析であることを特徴とする多機能金属ナノ構造体の製造方法。
  17. 　請求項１記載の多機能金属ナノ構造体を製造するためのキットであって、
    　少なくとも１種以上のコロイド安定化機能性分子により部分的に被覆された金属ナノ構造体と、
    　生物学的機能性分子を被覆するための緩衝液とを含むことを特徴とする多機能金属ナノ構造体を製造するキット。
PCT/JP2014/077633 2013-10-18 2014-10-17 多機能金属ナノ構造体及びその製造方法 WO2015056766A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15/029,462 US20160258940A1 (en) 2013-10-18 2014-10-17 Multifunctional metal nanostructure and method for producing same
EP14854622.9A EP3059589A4 (en) 2013-10-18 2014-10-17 Multifunctional metal nanostructure and method for producing same
JP2015542672A JPWO2015056766A1 (ja) 2013-10-18 2014-10-17 多機能金属ナノ構造体及びその製造方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/057,609 US20150110882A1 (en) 2013-10-18 2013-10-18 Multifunctional metallic nanostructure and method for manufacturing the same
US14/057,609 2013-10-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015056766A1 true WO2015056766A1 (ja) 2015-04-23

Family

ID=52826398

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2014/077633 WO2015056766A1 (ja) 2013-10-18 2014-10-17 多機能金属ナノ構造体及びその製造方法

Country Status (4)

Country Link
US (2) US20150110882A1 (ja)
EP (1) EP3059589A4 (ja)
JP (1) JPWO2015056766A1 (ja)
WO (1) WO2015056766A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7469107B2 (ja) 2020-03-31 2024-04-16 株式会社アルバック 金ナノ粒子の凝集体、金ナノ粒子分散液、放射線治療用増感剤及び金ナノ粒子分散液の製造方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016514195A (ja) * 2013-01-25 2016-05-19 イムラ アメリカ インコーポレイテッド 貴金属ナノ粒子の水性懸濁液を調製する方法
WO2019035623A2 (ko) * 2017-08-14 2019-02-21 중앙대학교 산학협력단 렉틴이 결합된 나노입자를 이용한 암 진단 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120225021A1 (en) 2011-03-02 2012-09-06 Wei Qian Stable colloidal gold nanoparticles with controllable surface modification and functionalization

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010523983A (ja) * 2007-04-02 2010-07-15 エモリー ユニバーシティ ｉｎｖｉｖｏにおける腫瘍ターゲティングおよび表面増強ラマンナノ粒子タグによる分光学的検出

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120225021A1 (en) 2011-03-02 2012-09-06 Wei Qian Stable colloidal gold nanoparticles with controllable surface modification and functionalization

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTINA M. ET AL.: "Polymer-coated surface enhanced Raman scattering(SERS) gold nanoparticles for multiplexed labeling of chronic lymphocytic leukemia cells", PROGRESS IN BIOMEDICAL OPTICS AND IMAGING, vol. 8212, 2012, pages 821203.1 - 821203.11, XP060023160 *
G. F. PACIOTTI ET AL., DRUG DELIVERY, vol. 11, 2004, pages 169 - 183
G. LUO ET AL., INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICS, vol. 385, 2010, pages 150 - 156
K. A. KELLY ET AL., PLOS MEDICINE, vol. 5, no. 4, 2008, pages E45
S.J. SHIN ET AL., PNAS, vol. 110, no. 48, 2013, pages 19414 - 19419
See also references of EP3059589A4 *
TIANQING LIU ET AL.: "A solution to the PEG Dilemma: Efficent Bioconjugation of Large Gold Nanoparticles for Biodiagnostic Applications using Mixed Layers", LANGMUIR, vol. 28, no. 44, pages 15634 - 15642, XP055339707 *
YUKIO NAGASAKI ET AL.: "PEG/Tanpakushitsu Misseiso o Yusuru Kin Nano Ryushi no Sekkei to Kino", SYMPOSIUM ON MACROMOLECULES YOKOSHU, vol. 54, no. 2, 5 September 2005 (2005-09-05), pages 3040 - 3041, XP008183089 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7469107B2 (ja) 2020-03-31 2024-04-16 株式会社アルバック 金ナノ粒子の凝集体、金ナノ粒子分散液、放射線治療用増感剤及び金ナノ粒子分散液の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3059589A4 (en) 2017-05-10
US20160258940A1 (en) 2016-09-08
US20150110882A1 (en) 2015-04-23
JPWO2015056766A1 (ja) 2017-03-09
EP3059589A1 (en) 2016-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Khalid et al. Advanced in developmental organic and inorganic nanomaterial: a review
Chan et al. Cancer-cell-specific mitochondria-targeted drug delivery by dual-ligand-functionalized nanodiamonds circumvent drug resistance
Whitlow et al. Multifunctional nanodiamonds in regenerative medicine: Recent advances and future directions
Sekhon et al. Inorganic nanomedicine—part 2
Li et al. Plant protein-directed synthesis of luminescent gold nanocluster hybrids for tumor imaging
Zou et al. Superparamagnetic iron oxide nanotheranostics for targeted cancer cell imaging and pH-dependent intracellular drug release
Mokhtarzadeh et al. Aptamers as smart ligands for nano-carriers targeting
Patil et al. Nanotechnology derived nanotools in biomedical perspectives: An update
Praveen et al. Fibrin nanoconstructs: a novel processing method and their use as controlled delivery agents
Chen et al. Rational design of multifunctional gold nanoparticles via host–guest interaction for cancer-targeted therapy
Mao et al. Gold nanospheres and nanorods for anti-cancer therapy: comparative studies of fabrication, surface-decoration, and anti-cancer treatments
Liu et al. Engineering monovalent quantum dot− antibody bioconjugates with a hybrid gel system
Grumezescu et al. Nanostructures for Cancer Therapy
Jin et al. One-step in situ synthesis of polypeptide–gold nanoparticles hybrid nanogels and their application in targeted photoacoustic imaging
Alsharif et al. Functionalization of magnetic nanowires for active targeting and enhanced cell-killing efficacy
Noh et al. Cyclic RGD-conjugated hyaluronate dot bearing cleavable doxorubicin for multivalent tumor targeting
Dong et al. pHe-induced charge-reversible NIR fluorescence nanoprobe for tumor-specific imaging
Han et al. Fate of antibody-targeted ultrasmall gold nanoparticles in cancer cells after receptor-mediated uptake
WO2015056766A1 (ja) 多機能金属ナノ構造体及びその製造方法
Notabi et al. Antibody conjugated lipid nanoparticles as a targeted drug delivery system for hydrophobic pharmaceuticals
Singh et al. Functional nanomaterials for multifarious nanomedicine
KR102036711B1 (ko) 줄기세포-나노 복합체의 제조방법
Baig et al. Treatment of Wilms’ nephroblastoma cancer cells via EGFR targeting of dactinomycin loaded DNA-nanowires
Jain et al. Nanopharmaceuticals
Pal’tsev et al. Nanotechnology in medicine

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14854622

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015542672

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15029462

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2014854622

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2014854622

Country of ref document: EP